BR112016011487B1 - Método de produção de 2,3-butanodiol - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL É descrito um método de produção de 2,3-butanodiol por meio de fermentação microbiana, utilizando um micro-organismo biologicamente seguro. O método de produção de 2,3-butanodiol inclui as etapas de: cultivo de um micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter em um material de partida de fermentação que contém uma fonte de carbono (Etapa A); e purificação de 2,3-butanodiol do líquido de cultivo obtido nesta etapa (Etapa B). Também é descrito este método, no qual a fonte de carbono contém pentose e o micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter possui capacidade de metabolizar pentose.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método de produção de 2,3-butanodiol por meio de fermentação microbiana.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] 2,3-Butanodiol (que pode ser denominado a seguir “2- 3BDO”) é um composto útil que é empregado como material intermediário para produtos farmacêuticos e cosméticos e como material para tintas, perfumes, cristais líquidos, inseticidas, agentes amaciantes, explosivos, plastificantes e similares. Mais especificamente, por exemplo, 2,3-butanodiol pode ser utilizado como material para metil etil cetona (Documento não patentário 1) ou 1,3- butadieno (Documento não patentário 2). Industrialmente, 2,3-BDO é produzido por meio de um método no qual óxido de 2-buteno é hidrolisado em solução aquosa de ácido perclórico. Nos últimos anos, a fim de solucionar os problemas de esgotamento de recursos petrolíferos e aquecimento global, é necessário atingir-se uma sociedade sustentável e orientada para a reciclagem. Também na indústria química, vem sendo intensivamente estudada a substituição de materiais de petróleo por materiais derivados de biomassa. Sob essas circunstâncias, métodos de produção de 2,3-butanodiol por meio de fermentação microbiana começaram a chamar a atenção.

[003] Exemplos conhecidos de micro-organismos capazes de produzir eficientemente 2,3-butanodiol por meio de fermentação incluem enterobactérias tais como Klebsiella pneumoniae (Documento não patentário 3) e Klebsiella oxytoca (Documento não patentário 4). Como esses microorganismos não necessitam de vitamina, aminoácido específico ou similar para a fermentação, o seu uso é vantajoso porque os processos necessários para o isolamento/purificação de 2,3-butanodiol do líquido de fermentação podem ser reduzidos. Esses micro-organismos são, entretanto, patogênicos e sabe-se que eles causam infecções respiratórias e similares. Em casos em que o cultivo em larga escala desses micro-organismos de fermentação é conduzido para fins de produção industrial de 2,3-butanodiol, são necessárias instalações de controle rigoroso e o custo consequentemente aumenta.

[004] Existem métodos descritos que utilizam micro-organismos de fermentação de 2,3-butanodiol biologicamente seguros que exibem alta eficiência de fermentação, tais como bactérias pertencentes à família Bacillaceae, incluindo Bacillus licheniformis (Documento não patentário 5) e Bacillus amyloliquefaciens (Documento não patentário 6). A fermentação de 2,3- butanodiol por Bacillus licheniformis necessita, entretanto, do uso de um extrato animal, que é caro, como fonte de nutrientes para promover a fermentação. A fermentação de 2,3-butanodiol por Bacillus amyloliquefaciens necessita do uso de citrato de amônio para promoção da fermentação. Como o ponto de ebulição de ácido cítrico é próximo de 2,3-butanodiol, isolamento/purificação de 2,3- butanodiol é difícil em casos em que o ácido cítrico permanece no líquido de cultura.

[005] Por outro lado, como matéria-prima de fermentação para fermentação microbiana, não apenas açúcares convencionais derivados de biomassa comestível, mas também açúcares derivados de biomassa não comestível, estão chamando a atenção. Em casos de uso de açúcar derivado de biomassa não comestível como matéria-prima de fermentação, celulose, semicelulose e similares contidos na biomassa não comestível são decompostos em açúcares utilizando uma enzima de sacarificação. Neste processo, são obtidas pentoses como xilose, além de hexoses tais como glicose. Vem se exigindo, portanto, o desenvolvimento de um método de fermentação eficiente para materiais que contêm pentose.

[006] Exemplos conhecidos de micro-organismos capazes de produzir eficientemente 2,3-butanodiol a partir de pentose por meio de fermentação incluem enterobactérias tais como Klebsiella oxytoca (Documento não patentário 3). Como esses micro-organismos não necessitam de vitamina, aminoácido específico ou similar para a fermentação, o seu uso é vantajoso porque os processos necessários para a purificação de 2,3-butanodiol do líquido de fermentação podem ser reduzidos. Esses micro-organismos são, entretanto, patogênicos e sabe-se que eles causam infecções respiratórias e similares. Em casos em que o cultivo em larga escala desses micro-organismos de fermentação é conduzido para fins de produção industrial de 2,3-butanol, portanto, são necessárias instalações de controle rigoroso e o custo consequentemente aumenta.

[007] Por outro lado, são descritos métodos que utilizam micro-organismos biologicamente seguros, capazes de produzir 2,3-butanodiol a partir de pentose por meio de fermentação, tais como bactérias pertencentes à família Bacillaceae, incluindo Bacillus licheniformis (Documento não patentário 9) e Paenibacillus polymyxa (Documento não patentário 10). Em fermentação de 2,3- butanodiol utilizando esses micro-organismos, entretanto, é necessário utilizar um material auxiliar caro tal como extrato de levedura ou hidrolisato de proteína animal, de forma que o custo é alto.

[008] Existem micro-organismos transformados conhecidos pertencentes ao gênero Zymobacter, que possuem a capacidade de metabolizar pentose, em que esses micro-organismos foram preparados por meio da introdução de genes exógenos que codificam xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase em micro-organismos pertencentes ao gênero Zymobacter (Documento de Patente 1, Documento de Patente 2). Embora os Documentos de Patente 1 e 2 descrevam que esses micro-organismos transformados possuem capacidade de produzir etanol, entretanto, não há descrição nem sugestão da capacidade de produzir 2,3-butanodiol a partir de pentose por meio de fermentação. DOCUMENTOS DO ESTADO DA TÉCNICA DOCUMENTOS DE PATENTE -Documento de Patente 1: JP 2005-261421 A; -Documento de Patente 2: US 2007/0298476 A. DOCUMENTOS NÃO DE PATENTE - Documento não patentário 1: A. N. Bourns, The Catalytic Action of Aluminium Silicates, Canadian J. Res. (1947); - Documento não patentário 2: Nathan Shlechter, Pyrolysis of 2,3- Butylene Glycol Diacetate to Butadiene, Indu. Eng. Chem. 905 (1945); - Documento não patentário 3: Ma, C. Q., Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiella pneumoniae SDM, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 82: 49-57; - Documento não patentário 4: Ji, X. J., Engineering Klebsiella oxytoca for efficient 2,3-butanediol production through insertional inactivation of acetaldehyde dehydrogenase gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010; 85: 17518; - Documento não patentário 5: S. S. Nilegaonkar, Potential of Bacillus licheniformis for the production of 2,3-butanediol, Journal of Fermentation and Bioengineering, Volume 82, Edição 4, 1996, págs. 408-410; - Documento não patentário 6: Yang, T., Optimization and scale-up of 2,3-butanediol production by Bacillus amyloliquefaciens B10-127, World J. Microbiol. Biotechnol., abril de 2012; 28 (4): 1563-74; - Documento não patentário 7: Okamoto, T., Zymobacter palmae gen. nov., sp. nov., a new ethanol-fermenting peritrichous bacterium isolated from palm sap, Arch. Microbiol. 1993; 160 (5): 333-7; - Documento não patentário 8: Jansen, N. B., Production of 2,3- butanediol from D-xylose by Klebsiella oxytoca ATCC 8724, Biotechnol Bioeng. abril de 1984; 26 (4): 362-9; - Documento não patentário 9: Wang, Q., Metabolic engineering of thermophilic Bacillus licheniformis for chiral pure D-2,3-butanediol production, Biotechnol. Bioeng. julho de 2012; 109 (7): 1610-21; -Documento não patentário 10: Marwoto, B., Metabolic analysis of acetate accumulation during xylose consumption by Paenibacillus polymyxa, Appl. Microbiol. Biotechnol. março de 2004; 64 (1): 112-9;

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA PRESENTE INVENÇÃO

[009] Conforme descrito acima, em casos em que um microorganismo biologicamente seguro é utilizado em um método convencional de produção de 2,3-butanodiol por meio de fermentação microbiana, o custo é alto ou a separação de um subproduto é difícil, o que é problemático.

[010] Consequentemente, um objeto da presente invenção é o estabelecimento de um método de produção de 2,3-butanodiol por meio de fermentação microbiana, utilizando um micro-organismo biologicamente seguro. Outro objeto da presente invenção é o estabelecimento de um método econômico de produção de 2,3-butanodiol a partir de uma matéria-prima de fermentação que contém pentose como fonte de carbono, por meio de fermentação microbiana, utilizando um micro-organismo biologicamente seguro.

MEIOS DE SOLUÇÃO DOS PROBLEMAS

[011] Como resultado de estudo intensivo para solucionar os problemas descritos acima, os inventores do presente descobriram que bactérias pertencentes ao gênero Zymobacter, que não foram conhecidas como microorganismos de fermentação de 2,3-butanodiol, possuem capacidade de fermentação de 2,3-butanodiol, de forma a completar a presente invenção. Além disso, os inventores do presente descobriram que 2,3-butanodiol pode ser produzido a partir de pentose utilizando uma bactéria Zymobacter que possui capacidade de metabolizar pentose.

[012] Isso significa que a presente invenção é descrita em (1) a (16) abaixo; 1. Método de produção de 2,3-butanodiol, que compreende as etapas de: - cultivo de um micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter em uma matéria-prima de fermentação que contém uma fonte de carbono (Etapa A); e - purificação de 2,3-butanodiol a partir do líquido de cultura obtido na etapa acima (Etapa B); 2. Método de acordo com 1, em que o micro-organismo é Zymobacter palmae; 3. Método de acordo com 1 ou 2, em que a Etapa A é cultivo sob condições aeradas; 4. Método de acordo com qualquer um dentre 1 a 3, em que a Etapa A é o cultivo em coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) de não menos de 9 h-1; 5. Método de produção de 2,3-butanodiol de acordo com qualquer um dentre 1 a 4, em que a Etapa A é o cultivo sob pH de 5 a 7; 6. Método de acordo com qualquer um dentre 1 a 5, em que a Etapa A é o cultivo em um meio cuja concentração de açúcar total é de não menos de 20 g/L; 7. Método de acordo com qualquer um dentre 1 a 6, em que a fonte de carbono contém pentose e o micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter possui capacidade de metabolizar pentose; 8. Método de acordo com qualquer um dentre 1 a 7, em que o micro-organismo é um micro-organismo transformado pertencente ao gênero Zymobacter, no qual é introduzido um ou mais genes exógenos que codificam pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase; 9. Método de acordo com 8, em que o micro-organismo é um micro-organismo transformado pertencente ao gênero Zymobacter, no qual são introduzidos genes exógenos que codificam xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase; 10. Método de acordo com qualquer um dentre 7 a 9, em que a pentose contida na matéria-prima de fermentação na Etapa A é xilose; 11. Método de acordo com qualquer um dentre 7 a 10, em que a abundância de xilose com relação ao açúcar total na matéria-prima de fermentação é de 5 a 100%; 12. Método de acordo com qualquer um dentre 7 a 11, em que a matéria-prima de fermentação contém um líquido de açúcar derivado de biomassa; 13. Método de acordo com qualquer um dentre 1 a 12, em que a matéria-prima de fermentação na etapa A contém milhocina; 14. Método de acordo com qualquer um dentre 1 a 13, em que a Etapa B compreende um processo de destilação; 15. Método de acordo com 14, que compreende um processo de dessalinização antes do processo de destilação; 16. Método de acordo com 15, que compreende um processo de troca iônica como processo de dessalinização.

EFEITO DA INVENÇÃO

[013] Segundo a presente invenção, em um método de produção de 2,3-butanodiol a partir de uma matéria-prima de fermentação por meio de fermentação microbiana, 2,3-butanodiol pode ser obtido de forma mais segura e econômica em comparação com métodos convencionais. Mesmo em casos em que a matéria-prima de fermentação contém pentose como fonte de carbono, 2,3-butanodiol pode ser obtido de forma segura e econômica a partir de pentose. MODO DE CONDUÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

[014] Etapa A: Etapa de fermentação de 2,3-butanodiol.

[015] A presente invenção é caracterizada porque uma bactéria pertencente ao gênero Zymobacter é utilizada como micro-organismo de fermentação de 2,3-butanodiol (que pode ser denominado a seguir “2,3-BDO”). O micro-organismo utilizado pode ser um micro-organismo isolado do ambiente natural ou pode ser um micro-organismo cujas propriedades são parcialmente modificadas por meio de mutação ou recombinação genética. Exemplos específicos das bactérias pertencentes ao gênero Zymobacter que possuem capacidade de fermentação de 2,3-BDO incluem Zymobacter palmae, que é preferencialmente utilizado do ponto de vista da capacidade de fermentação de 2,3-BDO.

[016] O material de parida de fermentação é preferencialmente um meio líquido comum que contém, conforme apropriado, uma ou mais fontes de carbono metabolizáveis, fontes de nitrogênio metabolizáveis, sais inorgânicos e, se necessário, aminoácidos e micronutrientes orgânicos tais como vitaminas. A matéria-prima de fermentação pode também conter um agente antiespumante conforme apropriado para o propósito de fermentação eficiente.

[017] Exemplos específicos das fontes de carbono metabolizáveis incluem açúcares tais como glicose, manose, galactose, frutose, sacarose, amido e melaço residual; ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico, ácido succínico e ácido acético; e álcoois, tais como glicerol e etanol. Açúcares são preferidos. Em casos de uso de açúcar, a concentração do açúcar no meio normalmente é de não menos de 15 g/L, preferencialmente não menos de 20 g/L, do ponto de vista de condução eficiente da etapa posterior de purificação de 2,3-butanodiol. A concentração total de açúcar na matéria-prima de fermentação como meio é normalmente de 15 a 500 g/L, preferencialmente 20 a 300 g/L. Em casos em que a concentração total de açúcar é de não mais de 15 g/L, o efeito do aumento da produção da fonte de carbono pode ser reduzido. Em casos em que a concentração total de açúcar é baixa, a eficiência de produção de 2,3-BDO também é reduzida.

[018] Exemplos específicos das fontes de nitrogênio metabolizáveis incluem gás de amônia, amônia aquosa, sais de amônio, ureia, nitratos e aminoácidos; e fontes de nitrogênio orgânico que podem ser utilizadas de forma suplementar, tais como aglomerados de óleo, hidrolisados de soja, hidrolisados de caseína, hidrolisados de tecidos animais, milhocina, leveduras ou extratos de leveduras, extratos de carne, células de micro-organismos de fermentação e seus hidrolisados. Dentre esses, como fontes de nitrogênio orgânico, hidrolisados de soja e milhocina são preferidos. Milhocina é de maior preferência. A concentração da milhocina contida na matéria-prima de fermentação não é limitada. A concentração normalmente é, por exemplo, de 2,5 g/L a 35 g/L, preferencialmente de 5 g/L a 25 g/L, de maior preferência de 10 g/L a 20 g/L em termos do teor de sólidos contido na milhocina. O método de medição do teor de sólidos contido na milhocina não é limitado. O teor de sólidos pode ser calculado, por exemplo, por meio de determinação do teor de água com base na diferença entre o peso antes da secagem a quente e o peso após a secagem a quente e subtração do teor de água do peso antes da secagem. Exemplos de sais inorgânicos que podem ser adicionados conforme apropriado incluem sais de ácido fosfórico, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro e sais de manganês.

[019] Além disso, ácido nicotínico pode ser adicionado ao meio conforme apropriado, dependendo do crescimento do micro-organismo. Pode também ser adicionado um agente antiespumante conforme apropriado.

[020] A temperatura de cultivo não é limitada, desde que seja uma temperatura em faixa que permita o crescimento do micro-organismo. O cultivo é conduzido sob temperatura de, normalmente, 20 a 50 °C, preferencialmente 25 a 40 °C. O período de cultivo pode ser um período durante o qual 2,3-BDO acumula-se no meio em quantidade que permita a purificação do 2,3-BDO. O período de cultivo pode ser adequadamente definido por meio de monitoramento da concentração da fonte de carbono ou da concentração de 2,3-BDO produzido no meio ao longo do tempo. O período de cultivo não é limitado e, normalmente, é de uma hora a trezentas horas, preferencialmente de quatro horas a 150 horas.

[021] O pH do meio durante o cultivo é mantido dentro da faixa de, normalmente, 4 a 8 utilizando um ácido orgânico ou inorgânico, substância alcalina, ureia, carbonato de cálcio, gás amônia e/ou similares. O pH durante o cultivo é preferencialmente ajustado em 5 a 7. O pH é, de maior preferência, de não menos 5 e menos de 6.

[022] O modo de cultivo do micro-organismo não é limitado. O cultivo é conduzido, por exemplo, por meio de cultivo em bateladas, fermentação em bateladas alimentadas ou cultivo contínuo.

[023] Na presente invenção, o micro-organismo é preferencialmente cultivado sob condições aeradas. A aeração na presente invenção indica que um gás que contém oxigênio é mantido em fluxo para um recipiente de cultivo. Exemplos do método de aeração incluem, mas sem limitações, um método no qual um gás que contém oxigênio passa através do meio de cultivo e aeração da superfície superior na qual a camada de ar sobre o líquido de cultura é substituída por um gás que contém oxigênio. Exemplos de aeração da superfície superior incluem um método no qual um gás que contém oxigênio é soprado para o recipiente de cultivo e um método no qual é gerado um fluxo de ar sobre o líquido de cultura por meio de agitação do líquido de cultura em um estado no qual o líquido de cultura é exposto à atmosfera, de forma a fornecer oxigênio para o líquido de cultura. Na presente invenção, a aeração é preferencialmente conduzida por meio de um método no qual um gás que contém oxigênio passa através do líquido de cultura.

[024] No cultivo de um micro-organismo, as condições de fornecimento de oxigênio para o meio podem ser adequadamente definidas por meio de combinação de aeração e agitação. As condições são expressas pelo coeficiente de transferência de oxigênio volumétrico, kLa (h-1) (denominado simplesmente a seguir kLa) para água sob pressão normal a 30 °C. kLa representa capacidade de produção de oxigênio dissolvido por meio da transferência de oxigênio de uma fase de gás para uma fase líquida em uma unidade de tempo sob aeração e agitação e é definida de acordo com a Equação (1) abaixo (Laboratory Manual for Bioengineering, The Society for Biotechnology, Ed. japonesa, Baifukan Co., Ltd., pág. 310 (1992)): dC/dt = kLa x (C* - C)... Equação (1)

[025] Nessa equação, C representa o nível de oxigênio dissolvido DO (ppm) no líquido de cultura; C* representa o nível de oxigênio dissolvido DO (ppm) no estado de equilíbrio com a fase de gás na ausência de consumo de oxigênio pelo micro-organismo; e kLa representa o coeficiente de transferência de oxigênio volumétrico (h-1). Como a Equação 2 a seguir é derivada da Equação 1 acima, kLa pode ser determinado por meio de plotagem do logaritmo de C* - C contra o período de aeração: In(C*- C) = -kLa x t ... Equação (2)

[026] kLa na presente invenção é um valor medido por meio do método de substituição de gases (método dinâmico). No método de substituição de gases (método dinâmico), água é alimentada a um aparelho de cultivo de agitação/aeração, no qual é inserido um eletrodo de nível de oxigênio dissolvido e o oxigênio no líquido é substituído por nitrogênio para reduzir a concentração de oxigênio no líquido. Em seguida, o gás nitrogênio é comutado para ar comprimido e o processo de aumento do oxigênio dissolvido é medido em taxa de aeração, velocidade de agitação e temperatura previamente determinadas, de forma a calcular kLa.

[027] O kLa definido para o cultivo na presente invenção não é limitado e, preferencialmente, é de não menos de 9 h-1. O limite superior de kLa não é limitado e o kLa é preferencialmente de não mais de 200 h-1.

[028] No método de acordo com a presente invenção, a matéria- prima de fermentação contém pentose como fonte de carbono metabolizável. Por meio do cultivo de um micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter que possui capacidade de metabolizar pentose, 2,3-butanodiol pode ser produzido utilizando a pentose como material. Neste caso, a bactéria pertencente ao gênero Zymnobacter pode ser uma bactéria isolada do ambiente natural ou pode ser uma bactéria cujas propriedades foram parcialmente modificadas por meio de mutação ou recombinação genética. Exemplos específicos das bactérias pertencentes ao gênero Zymobacter que possuem capacidade de fermentação de 2,3-butanodiol incluem Zymobacter palmae, que é preferencialmente utilizada do ponto de vista da capacidade de fermentação de 2,3-butanodiol. Normalmente, Zymobacter palmae não metaboliza pentose. A capacidade de metabolizar pentose pode ser fornecida, entretanto, por meio da introdução de um ou mais genes envolvidos em metabolismo de pentose.

[029] Como o gene a ser introduzido na presente invenção, pode- se utilizar um gene para uma enzima que isomerize aldopentose em cetopentose. Exemplos do gene incluem genes para pentose isomerase, pentose reductase e pentol desidrogenase.

[030] Pentose isomerase é definida como uma enzima que catalisa a isomerização de aldopentose e cetopentose, que são isômeros estruturais de pentose. A pentose isomerase utilizada na presente invenção não é limitada, desde que possua atividade de catalisação da isomerização direta de pentose. Exemplos da pentose isomerase incluem xilose isomerase (EC 5.3.1.5) e arabinose isomerase (EC 5.3.1.3). Dentre estes, xilose isomerase é uma enzima que catalisa a isomerização direta de xilose (aldopentose) em xilulose (cetopentose) e/ou sua reação reversa, também conhecida como xilose cetoisomerase. A isomerização direta indica isomerização em uma etapa catalisada por pentose isomerase, que é diferente da conversão em duas etapas por meio de um intermediário de álcool de açúcar catalisado por pentose reductase e pentol desidrogenase.

[031] Pentose reductase é uma enzima redutora e indica uma enzima que possui atividade de conversão de aldopentose em um álcool de açúcar utilizando NADH ou NADPH como coenzima. EC 1.1.1.307 e EC 1.1.1.21, por exemplo, correspondem a xilose reductase, que é uma enzima que converte xilose em xilitol. EC 1.1.1.21, por exemplo, corresponde a arabinose reductase, que é uma enzima que converte arabinose em arabitol. Enzimas que não são classificadas com os números EC descritos acima também são incluídas na pentose reductase de acordo com a presente invenção, desde que as enzimas possuam as atividades descritas acima.

[032] Pentol desidrogenase é uma desidrogenase e indica uma enzima que converte pentol em cetopentose utilizando NAD+ como coenzima. EC 1.1.1.9 e EC 1.1.1.10, por exemplo, correspondem a xilitol desidrogenase, que é uma enzima que converte xilitol em xilulose. EC 1.1.1.11 e EC 1.1.1.12, por exemplo, correspondem a arabitol desidrogenase, que é uma enzima que converte arabitol em ribose. Enzimas que não são classificadas em pentol desidrogenase também são incluídas na pentol desidrogenase na presente invenção, desde que as enzimas possuam as atividades descritas acima.

[033] A reação catalisada por pentose reductase e pentol desidrogenase isomeriza aldopentose em cetopentose, de forma similar à reação por pentose isomerase.

[034] Dentre as enzimas que catalisam a isomerização de aldopentose e cetopentose, pode ser preferencialmente utilizada pentose isomerase de pentose. Xilose isomerase é utilizada de maior preferência.

[035] O gene para a xilose isomerase utilizada não é limitado e pode apresentar-se na forma, por exemplo, de DNA genômico ou cDNA. O gene pode ser derivado de qualquer um dos organismos que incluem animais, plantas, fungos (leveduras, mofos e similares) e bactérias. Informações sobre esse gene podem ser facilmente conhecidas por meio de pesquisa em um banco de dados publicado em um Web site, por exemplo, do NCBI. Uma sequência base do gene xilose isomerase em Escherichia coli que pode ser preferencialmente utilizada na presente invenção é descrita, por exemplo, em Acesso GenBank n° NC_007779 REGIÃO: 3909650..3910972.

[036] A atividade de xilose isomerase pode ser confirmada por meio da realização de reação enzimática na presença de xilose e medição em seguida, por meio de HPLC ou similar, de xilulose produzida por meio de isomerização. A atividade de xilose isomerase pode ser medida, por exemplo, por meio do método descrito em JP 2008-79564 A.

[037] Exemplos de organismos que podem ser utilizados como doadores da xilose isomerase incluem micro-organismos pertencentes à família de enterobactérias, tais como os gêneros Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Erwinia e Salmonella; actinomicetes tais como os gêneros Actinoplanes, Arthrobacter e Streptomyces; e os gêneros Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Staphylococcus, Thermoanaerobacter, Thermus, Xanthomonas, Rhizobium, Pseudomonas, Clostridium e Bacteroides. São preferidos micro-organismos pertencentes ao gênero Escherichia. Escherichia coli é de maior preferência.

[038] Como o gene a ser introduzido na presente invenção, pode- se utilizar um gene para uma enzima que possui atividade de catalisação da fosforilação de cetopentose. Exemplos da enzima que possui atividade de catalisação da fosforilação de cetopentose incluem xiluloquinase (EC 2.7.1.17) e ribuloquinase (EC 2.7.1.16). Xiluloquinase pode ser preferencialmente utilizada.

[039] O gene para a xiluloquinase utilizada não é limitado e pode apresentar-se na forma, por exemplo, de DNA genômico ou cDNA. O gene pode ser derivado de qualquer um dos organismos que incluem animais, plantas, fungos (leveduras, fungos e similares) e bactérias. Informações sobre esse gene podem ser facilmente conhecidas por meio de pesquisa em um banco de dados publicado em um Web site, por exemplo, do NCBI. Uma sequência base do gene xiluloquinase em Escherichia coli que pode ser preferencialmente utilizada na presente invenção é descrita, por exemplo, em Acesso GenBank n° NC_007779 REGIÃO: 3911044..3912498.

[040] A atividade de xiluloquinase pode ser confirmada por meio da realização de reação enzimática na presença de xilulose e medição em seguida, por meio de HPLC ou similar, de 5-fosfato de xilulose produzido por meio de fosforilação ou medição de aumento de NADPH ou similar utilizando uma reação enzimática auxiliar. A medição pode ser conduzida, por exemplo, por meio do método descrito em Feldmann, S. D., Sahm, H., Sprenger, G. A., Cloning and expression of the genes for xylose isomerase and xylulokinase from Klebsiella pneumoniae 1033 in Escherichia coli K12, Mol. Gen. Genet., agosto de 1992; 234 (2): 201-10.

[041] Exemplos de organismos que podem ser utilizados como doadores da xiluloquinase incluem micro-organismos pertencentes à família de enterobactérias, tais como os gêneros Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Erwinia e Salmonella; bactérias de ácidos lácticos, tais como os gêneros Bacteroides e Lactobacillus; actinomicetes, tais como os gêneros Actinoplanes, Arthrobacter e Streptomyces; e os gêneros Bacillus, Paenibacillus, Staphylococcus, Thermoanaerobacter, Xanthomonas, Rhizobium, Pseudomonas e Clostridium. São preferidos micro-organismos pertencentes ao gênero Escherichia. Escherichia coli é de maior preferência.

[042] Como o gene a ser introduzido na presente invenção, pode- se utilizar um gene para uma enzima que possui atividade de transcetolase e/ou transaldolase.

[043] Transcetolase é definida como enzima que catalisa uma reação de conversão de 5-fosfato de xilulose e 4-fosfato de eritrose em 6-fosfato de frutose e 3-fosfato de gliceraldeído e sua reação reversa e/ou catalisa uma reação de conversão de 5-fosfato de ribose e 5-fosfato de xilulose em 7-fosfato de sedo-heptulose e 3-fosfato de gliceraldeído e sua reação reversa. A transcetolase utilizada na presente invenção não é limitada, desde que possua a atividade catalítica descrita acima. EC 2.2.1.1, por exemplo, corresponde à transcetolase.

[044] O gene transcetolase e/ou o gene transaldolase utilizados no presente não é(são) limitado(s) e pode(m) apresentar-se, por exemplo, na forma de DNA genômico ou cDNA. Cada gene pode ser derivado de qualquer um dos organismos que incluem animais, plantas, fungos (leveduras, mofos e similares) e bactérias. Informações sobre esses genes podem ser facilmente conhecidas por meio de pesquisa em um banco de dados publicado em um Web site, por exemplo, do NCBI. Uma sequência base do gene transcetolase em Escherichia coli que pode ser preferencialmente utilizada na presente invenção é descrita, por exemplo, em Acesso GenBank n° NC_007779 REGIÃO: complemento (3078300..3080291). Uma sequência base do gene transaldolase em Escherichia coli que pode ser preferencialmente utilizada na presente invenção é descrita, por exemplo, em Acesso GenBank n° NC_007779 REGIÃO: 8238..9191.

[045] A atividade de transcetolase pode ser confirmada por meio da realização de reação enzimática na presença de 5-fosfato de xilulose e 4- fosfato de eritrose e medição em seguida, por meio de HPLC ou similar, de 3- fosfato de gliceraldeído produzido ou medição da redução de NADPH ou similar utilizando uma reação enzimática auxiliar. A medição pode ser conduzida, por exemplo, por meio do método descrito em Sprenger, G. A., Schorken, U., Sprenger, G., Sahm, H., Transketolase A of Escherichia coli K12, Purification and properties of the enzyme from recombinant strains, Eur. J. Biochem. 1° de junho de 1995; 230 (2): 525-32.

[046] Transaldolase é definida como uma enzima que catalisa uma reação de conversão de 7-fosfato de sedo-heptulose e 3-fosfato de gliceraldeído em 4-fosfato de eritrose e 6-fosfato de frutose e sua reação reversa. A transaldolase utilizada na presente invenção não é limitada, desde que possua a atividade catalítica descrita acima. EC2.2.1.2, por exemplo, corresponde à transaldolase.

[047] A atividade de transaldolase pode ser confirmada por meio da realização de reação enzimática na presença de 6-fosfato de frutose e 4- fosfato de eritrose e medição em seguida, por meio de HPLC ou similar, de 3- fosfato de gliceraldeído produzido ou medição de redução de NADPH ou similar utilizando uma reação enzimática auxiliar. A medição pode ser conduzida, por exemplo, por meio do método descrito em G. A. Sprenger, U. Schorken, G. Sprenger e H. Sahm, Transaldolase B of Escherichia coli K-12: cloning of its gene, talB, and characterization of the enzyme from recombinant strains (J. Bacteriol., 1995, 177: 20: 5930-6).

[048] Exemplos de organismos que podem ser utilizados como doadores da transaldolase e/ou transcetolase incluem micro-organismos pertencentes à família de enterobactérias, tais como os gêneros Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Erwinia e Salmonella; actinomicetes tais como os gêneros Actinoplanes, Arthrobacter e Streptomyces; e os gêneros Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Staphylococcus, Thermoanaerobacter, Thermus, Xanthomonas, Rhizobium, Pseudomonas, Clostridium e Bacteroides. São preferidos micro-organismos pertencentes ao gênero Escherichia. Escherichia coli é de maior preferência.

[049] Desde que a bactéria pertencente ao gênero Zymobacter possua capacidade de metabolizar pentose, ela pode ter pelo menos qualquer um dos genes descritos acima nela introduzido. Preferencialmente, são introduzidos genes exógenos que codificam (1) xilose isomerase, (2) xiluloquinase e (3) pelo menos um dentre transaldolase e transcetolase. De maior preferência, são introduzidos genes exógenos que codificam (1) xilose isomerase, (2) xiluloquinase e (3) ambos, transaldolase e transcetolase.

[050] Um micro-organismo diferente dos descritos acima pode também ser utilizado como doador em casos em que o micro-organismo possui capacidade de decompor xilose ou em casos em que o micro-organismo não possua capacidade de decompor xilose devido, por exemplo, a uma anormalidade em um local promotor ou local de ligação de ribossomos, mas possui DNA que codifica um ou mais genes xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e/ou transcetolase.

[051] Pode ser introduzida uma combinação de genes derivados de uma série de doadores. Esses genes podem ser incorporados ao DNA genômico da bactéria pertencente ao gênero Zymobacter a ser utilizado como hospedeiro ou podem estar presentes em um ou mais vetores.

[052] O método de introdução do(s) gene(s) não é limitado. Como o método de introdução do(s) gene(s) presente(s) no(s) vetor(es), por exemplo, pode ser utilizado o método descrito no Documento de Patente 1 e no Documento de Patente 2. Isso significa que cada gene é inserido no local de múltipla clonagem de um vetor de clonagem de plasmídeos disponível comercialmente para E. coli (por exemplo, pUC1118) e E. coli é transformado em seguida com o plasmídeo resultante, seguido por manutenção em crescimento do transformador, gerando o produto de cada gene. A partir do transformador cultivado, o plasmídeo é recuperado e a região na qual cada gene é introduzido é dividida, seguida por inserção do fragmento resultante no local de múltipla clonagem de um plasmídeo vetor de ampla faixa de hospedeiros (tal como pMFY31 (Agric. Biol. Chem., Vol.49 (9), 2719-2724, 1985)). Transformando-se uma bactéria pertencente ao gênero Zymobacter com o vetor de plasmídeo recombinante resultante, pode-se preparar um transformador pertencente ao gênero Zymobacter que possui capacidade de metabolizar pentose. Como o plasmídeo de vetor de ampla faixa de hospedeiro, pode-se também utilizar um produto disponível comercialmente. Métodos de transformação intrínsecos são bem conhecidos. Conforme descrito no Documento de Patente 1 e no Documento de Patente 2, por exemplo, células competentes podem ser preparadas por meio de cultivo em um meio tal como meio T suplementado com íons de magnésio (2,0% em peso de glicose; 1,0% em peso de extrato de bactolevedura; 1,0% em peso de di-hidrogênio fosfato de potássio; 0,2% em peso de sulfato de amônio; 0,05% em peso de hepta-hidrato sulfato de magnésio, pH 6,0). Em seguida, pode-se conduzir transformação por meio de um método convencional tal como eletroporação. Um transformador que possui capacidade de metabolizar xilose pode ser obtido por meio de cultivo em um meio que contém xilose como a única fonte de carbono, em que as bactérias são submetidas ao tratamento de transformação.

[053] Em casos em que cada gene a ser introduzido é incorporado ao DNA genômico, pode ser utilizado um método descrito, por exemplo, em Kirill, A., Datsenko e Barry L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., seis de junho de 2000; 97 (12): 6640-6645.

[054] Mesmo em casos em que a matéria-prima de fermentação contém pentose, a matéria-prima de fermentação pode conter hexose além de pentose.

[055] Pentose contém cinco carbonos que constituem o açúcar e também é denominado açúcar de cinco carbonos. Pentose pode ser dividida em aldopentose, que contém um grupo aldeído na posição 1, e cetopentose, que contém um grupo cetona na posição 2. Exemplos de aldopentose incluem xilose, arabinose, ribose e lixose e exemplos de cetopentose incluem ribulose e xilulose. A pentose utilizada na presente invenção pode ser qualquer pentose, desde que possa ser metabolizada por um micro-organismo e, em vista da abundância na natureza, disponibilidade e similares, xilose e arabinose são preferidas, enquanto xilose é de maior preferência.

[056] Hexose contém seis carbonos que constituem o açúcar e também é denominada açúcar com seis carbonos. Hexose pode ser dividida em aldose, que contém um grupo aldeído na posição 1, e cetona, que contém um grupo cetona na posição 2. Exemplos de aldose incluem glicose, manose, galactose, alose, gulose e talose e exemplos de cetose incluem frutose, psicose e sorbose. A hexose utilizada na presente invenção pode ser qualquer hexose, desde que possa ser metabolizada por um micro-organismo e, em vista da abundância na natureza, disponibilidade e similares, glicose, manose e galactose são preferidas, enquanto glicose é de maior preferência.

[057] A matéria-prima de fermentação que contém pentose e hexose não é limitada e é preferencialmente um líquido de açúcar derivado de uma biomassa que contém celulose que é conhecida por conter hexose e pentose. Exemplos da biomassa que contém celulose incluem biomassas herbáceas tais como bagaço, Panicum virgatum, palha de milho, palha de arroz e palha de trigo; e biomassas lenhosas tais como árvores e materiais de construção de resíduos. Biomassas que contêm celulose contêm celulose e/ou hemicelulose, que são polissacarídeos produzidos por meio da condensação de açúcares por meio de desidratação. Hidrolisando-se esses polissacarídeos, podem ser produzidos líquidos de açúcar que podem ser utilizados como materiais de partida de fermentação. O método intrínseco de preparação de um líquido de açúcar derivado de uma biomassa que contém celulose é bem conhecido e pode ser qualquer método. Exemplos de métodos descritos de produção desse açúcar incluem um método no qual é produzido um líquido de açúcar por meio de hidrólise de ácidos de uma biomassa utilizando ácido sulfúrico concentrado (Pedido de Patente PCT Japonês em Aberto Traduzido n° 11-506934, JP 2005-229821 A) e um método no qual uma biomassa é submetida a tratamento por hidrólise utilizando ácido sulfúrico diluído e, em seguida, tratada enzimaticamente com celulase e/ou similares para produzir um líquido de açúcar (A. Aden et al, Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, NREL Technical Report (2002)). Além disso, exemplos adicionais de métodos de acordo com a presente invenção nos quais ácidos não são utilizados incluem um método no qual a biomassa é hidrolisada utilizando água subcrítica a cerca de 250 a 500 °C para produzir um líquido de açúcar (JP 2003-212888 A), um método no qual uma biomassa é submetida a tratamento com água subcrítica e, em seguida, enzimaticamente tratada para produzir um líquido de açúcar (JP 2001-95597 A) e um método no qual uma biomassa é submetida a tratamento com hidrólise com água quente pressurizada a 240 °C até 280 °C e, em seguida, enzimaticamente tratada para produzir um líquido de açúcar (JP 3041380 B). Estes tratamentos podem ser seguidos por purificação do líquido de açúcar obtido. Um exemplo do método é descrito em WO 2010/067785.

[058] A razão em peso entre a pentose e a hexose contida no açúcar misturado não é limitada e, preferencialmente, é de 1:9 a 9:1, conforme representado pela razão de (pentose):(hexose) em termos da razão em peso entre pentose e hexose no açúcar misturado. Espera-se essa razão de açúcar em casos em que o açúcar misturado é um líquido de açúcar derivado de biomassa que contém celulose.

[059] Assim que as faixas de concentração total de açúcar e a razão entre pentose e hexose descritas acima estiverem satisfeitas, a concentração de hexose contida na matéria-prima de fermentação utilizada na presente invenção não é limitada. Utilizando o método de produção de 2,3-BDO de acordo com a presente invenção, pode-se obter rendimento favorável mesmo com um líquido de açúcar misturado contendo hexose em concentração de não menos de 5 g/L.

[060] Mesmo em casos em que a matéria-prima de fermentação contém pentose, a matéria-prima de fermentação pode conter, conforme descrito acima, além dos açúcares, uma ou mais das fontes de carbono metabolizáveis, fontes de nitrogênio metabolizáveis, sais inorgânicos e, se necessário, aminoácidos e micronutrientes orgânicos tais como vitaminas que agem favoravelmente sobre a fermentação pelo micro-organismo de fermentação de 2,3-butanodiol, conforme apropriado. A matéria-prima de fermentação pode também conter um agente antiespumante para o propósito de fermentação eficiente.

[061] Mesmo em casos em que a matéria-prima de fermentação contém pentose, exemplos específicos das fontes de nitrogênio metabolizáveis incluem, conforme descrito acima, gás de amônia, amônia aquosa, sais de amônio, ureia, nitratos e aminoácidos; e fontes de nitrogênio orgânico que podem ser utilizadas de forma suplementar tais como aglomerados de óleo, hidrolisados de soja, digestões de caseína, milhocina, leveduras ou extratos de leveduras, extratos de carne, peptídeos, incluindo peptona, e células de micro-organismos de fermentação e seus hidrolisados. Exemplos de sais inorgânicos que podem ser adicionados conforme apropriado incluem sais de ácido fosfórico, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e sais de zinco. Para a produção de 2,3-butanodiol por meio de fermentação de pentose, a matéria- prima de fermentação contém preferencialmente, entre esses componentes, um ou mais dentre milhocina, sais de amônio tais como sulfato de amônio e hidrogênio fosfato de amônio; sais de ácido fosfórico tais como di-hidrogênio fosfato de potássio, hidrogênio fosfato de potássio e hidrogênio fosfato de amônio; sais de cálcio tais como cloreto de cálcio; sais de ferro tais como sulfato ferroso; sais de manganês tais como sulfato de manganês; sais de zinco tais como sulfato de zinco; sais de magnésio tais como sulfato de magnésio; e EDTA e seus sais tais como EDTA dissódico.

[062] Mesmo em casos em que a matéria-prima de fermentação contém pentose, ácido nicotínico pode ser adicionado ao meio conforme apropriado, dependendo do crescimento do micro-organismo, conforme descrito acima. Pode também ser adicionado um agente antiespumante conforme apropriado.

[063] Mesmo em casos em que a matéria-prima de fermentação contém pentose como fonte de carbono metabolizável e é cultivado um microorganismo pertencente ao gênero Zymobacter que possui capacidade de metabolizar pentose, a temperatura de cultivo, o pH durante o cultivo, o modo de cultivo do micro-organismo, as condições de aeração e as condições de fornecimento de oxigênio para o meio, incluindo as suas condições preferidas, são as mesmas descritas acima.

[064] O líquido de cultura obtido por meio da etapa de fermentação de 2,3-butanodiol contém não apenas 2,3-butanodiol, mas também impurezas derivadas da matéria-prima de fermentação e etanol como subproduto da fermentação. 2,3-Butanodiol contido no líquido de cultura necessita, portanto, ser purificado em um processo posterior.

ETAPA DE PURIFICAÇÃO

[065] A etapa de purificação de 2,3-butanodiol do líquido de cultura de 2,3-butanodiol não é limitada e pode ser conduzida por meio de um método conhecido dos técnicos no assunto. A presente invenção compreende preferencialmente um processo de destilação do líquido de cultura de 2,3- butanodiol.

[066] Na destilação do líquido de cultura de 2,3-butanodiol, 2,3- butanodiol é recuperado do lado do vapor. O método de destilação não é limitado e pode ser qualquer um dentre destilação simples, destilação de precisão, destilação atmosférica e destilação sob pressão reduzida, que são comumente aplicadas. O método pode também ser conduzido utilizando um aparelho selecionado, por exemplo, a partir de um aparelho de destilação de filme fino, aparelho de destilação do tipo bandeja e aparelho de destilação embalado. Pode-se aplicar um método contínuo ou método em bateladas à presente invenção. Destilação sob pressão reduzida é especialmente preferida porque, neste método, o ponto de ebulição pode ser reduzido para suprimir a geração de impurezas. Mais especificamente, o método é preferencialmente conduzido sob temperatura de aquecimento de 60 °C a 150 °C. Em casos em que a temperatura de aquecimento é de menos de 60 °C, a pressão necessita ser muito reduzida, de forma que a manutenção do aparelho é muito difícil em nível industrial. Em casos em que a temperatura de aquecimento é de mais de 150 °C, ocorre decomposição de uma pequena quantidade de açúcares e similares remanescentes na solução de 2,3-butanodiol, gerando produção de substâncias coloridas como subprodutos, o que não é preferido. O grau de redução da pressão é preferencialmente controlado, portanto, de forma que a destilação de 2,3-butanodiol ocorra dentro da faixa de temperatura de aquecimento descrita acima.

[067] Embora o líquido de cultura de 2,3-butanodiol possa ser submetido como se encontra para o processo de destilação, o líquido de cultura de 2,3-butanodiol é preferencialmente submetido a um processo de dessalinização e/ou processo de concentração antes do processo de destilação.

[068] Exemplos específicos do processo de dessalinização incluem um processo de troca iônica. O processo de troca iônica é um método de remoção de componentes iônicos no líquido de cultura de 2,3-butanodiol utilizando um trocador de íons. Exemplos de trocadores de íons que podem ser utilizados incluem resinas de troca iônica, membranas de troca iônica, fibras de troca iônica, papéis de troca iônica, trocadores de íons de gel, trocadores de íons de líquidos, zeólitos, trocadores de íons carbonáceos e montmorilonita. Na presente invenção, é preferencialmente empregado um processo que utiliza uma resina de troca iônica.

[069] Resinas de troca iônica podem ser divididas em resinas de troca de ânions fortes, resinas de troca de ânions fracas, resinas de troca de cátions fortes, resinas de troca de cátions fracas, resinas de troca de quelatos e similares, dependendo dos seus grupos funcionais. Uma forte resina de troca de ânions é selecionada, por exemplo, a partir de “Amberlite” IRA410J, IRA411 e IRA910CT, fabricadas pela Organo Corporation; e “DIAION” SA10A, SA12A, SA11A, NSA100, SA20A, SA21A, UBK510L, UBK530, UBK550, UBK535 e UBK555, fabricadas pela Mitsubishi Chemical Corporation. Exemplos de resinas de troca de ânions fracas incluem “Amberlite” IRA478RF, IRA67, IRA96SB, IRA98 e XE583, fabricadas pela Organo Corporation; e “DIAION” WA10, WA20, WA21J e WA30, fabricadas pela Mitsubishi Chemical Corporation. Exemplos de resinas de troca de cátions fortes incluem “Amberlite” IR120B, IR124, 200CT e 252, fabricadas pela Organo Corporation; e “DIAION” SK104, SK1B, SK110, SK112, PK208, PK212, PK216, PK218, PK220 e PK228, fabricadas pela Mitsubishi Chemical Corporation. Resinas de troca de cátions fracas podem ser selecionadas, por exemplo, a partir de “Amberlite” FPC3500 e IRC76, fabricadas pela Organo Corporation; e “DIAION” WK10, WK11, WK100 e WK40L, fabricadas pela Mitsubishi Chemical Corporation.

[070] Na presente invenção, resina(s) de troca de ânions e resina(s) de troca de cátions são preferencialmente utilizadas em combinação como a resina de troca iônica. Uma ou mais resinas aniônicas fortes e uma ou mais resinas catiônicas fortes são utilizadas, de maior preferência, pois elas podem remover vários íons. A resina de troca de ânions é preferencialmente regenerada com uma solução aquosa diluída de um álcali tal como hidróxido de sódio e utilizada como tipo OH. A resina de troca de cátions é preferencialmente regenerada com uma solução aquosa diluída de um ácido tal como ácido clorídrico e utilizada como tipo H. O método de dessalinização utilizando as resinas de troca iônica podem ser um método em bateladas ou um método de coluna e não é limitado, desde que seja possível dessalinização eficiente. No processo de produção, é preferencialmente empregado um método de coluna, pois o método permite uso repetido. A velocidade de fluxo é normalmente controlada com base em SV (velocidade de espaço) e SV é preferencialmente 2 a 50. SV é, de maior preferência, 2 a 10, em vista de atingir pureza mais alta. Resinas são disponíveis comercialmente nas formas de tipos de gel tais como tipo poroso, tipo poroso alto e tipo MR e as resinas de troca iônica podem estar em qualquer uma dessas formas. Resinas de troca iônica que possuem formas ideais podem ser selecionadas dependendo da qualidade da solução.

[071] Exemplos específicos do processo de dessalinização também incluem tratamento com membrana de nanofiltragem. No tratamento com membrana de nanofiltragem do líquido de cultura de 2,3-butanodiol, conforme descrito em JP 2010-150248 A, por exemplo, filtragem do líquido de cultura de 2,3-butanodiol através de uma membrana de nanofiltragem permite separação eficiente de 2,3-butanodiol para o lado permeado e sais inorgânicos, açúcares e componentes coloridos para o lado de alimentação.

[072] Exemplos do material da membrana de nanofiltragem incluem materiais de polímero tais como piperazino poliamida, poliamida, acetato de celulose, álcool polivinílico, póli-imida e poliéster; e materiais inorgânicos tais como cerâmica. Uma membrana de nanofiltragem é geralmente utilizada como elemento de membrana enrolado em espiral, como membrana plana ou como membrana de fibra oca. A membrana de nanofiltragem utilizada na presente invenção é preferencialmente um elemento de membrana enrolado em espiral.

[073] Exemplos específicos do elemento de membrana de nanofiltragem preferencialmente utilizado na presente invenção incluem “GEsepa”, que é uma membrana de nanofiltragem de acetato de celulose fabricada pela GE Osmonics; NF99 e NF99HF, que são membranas de nanofiltragem que possuem uma camada funcional composta de uma poliamida, fabricada pela Alfa-Laval; NF-45, NF-90, NF-200 e NF-400, que são membranas de nanofiltragem que possuem uma camada funcional composta de uma piperazino poliamida reticulada, fabricada pela Filmtec Corporation; e SU-210, SU-220, SU-600 e SU-610, que são elementos de membrana de nanofiltragem fabricados pela Toray Industries, Inc., contendo UTC60 elaborado pelo mesmo fabricante. Dentre estes, o elemento de membrana de nanofiltragem é, de maior preferência, NF99 ou NF99HF, que são membranas de nanofiltragem que possuem uma camada funcional composta de uma poliamida, fabricada pela Alfa-Laval; NF-45, NF-90, NF-200 ou NF-400, que são membranas de nanofiltragem que possuem uma camada funcional composta de uma piperazino poliamida reticulada, fabricada pela Filmtec Corporation; ou SU-210, SU-220, SU-600 ou SU-610, que são módulos de membrana de nanofiltragem fabricados pela Toray Industries, Inc., contendo UTC60 fabricado pelo mesmo fabricante. O elemento de membrana de nanofiltragem é, de preferência ainda maior, SU-210, SU-220, SU-600 ou SU-610, que são elementos de membrana de nanofiltragem fabricados pela Toray Industries, Inc., que contém UTC60 elaborado pelo mesmo fabricante, cujo componente principal é uma piperazino poliamida reticulada.

[074] A filtragem através de uma membrana de nanofiltragem pode ser conduzida sob pressão e a pressão de filtragem encontra-se preferencialmente dentro da faixa de 0,1 MPa a 8 MPa. Em casos em que a pressão de filtragem é de menos de 0,1 MPa, a taxa de permeação de membrana pode ser baixa e, em casos em que a pressão de filtragem é de mais de 8 MPa, a membrana pode ser danificada. Em casos em que a membrana é utilizada sob pressão de filtragem de 0,5 MPa a 7 MPa, o fluxo de permeação de membrana é alto, de forma que se possa permitir a permeação eficiente do líquido de fermentação de 2,3-butanodiol e a possibilidade de dano da membrana é pequena, o que é de maior preferência. A membrana é utilizada, de preferência especial, sob pressão e filtragem de 1 MPa a 6 MPa.

[075] A concentração de 2,3-butanodiol na solução de 2,3- butanodiol que deve ser filtrada através da membrana de nanofiltragem não é limitada. Em casos em que a concentração de 2,3-butanodiol na solução de 2,3- butanodiol é alta, a concentração de 2,3-butanodiol contida no permeado também é alta, de forma que a energia necessária para concentrar 2,3- butanodiol pode ser economizada e o custo pode, portanto, ser reduzido, o que é preferido.

[076] No processo de dessalinização, pode-se conduzir o tratamento de troca iônica ou o tratamento de membrana de nanofiltragem, ou ambos podem ser empregados em combinação. Prefere-se conduzir pelo menos o tratamento de troca iônica. Em casos em que o tratamento com membrana de nanofiltragem e o tratamento de troca iônica são empregados em combinação, a ordem desses tratamentos não é limitada. Preferencialmente, o líquido de cultura de 2,3-butanodiol é submetido ao tratamento de membrana de nanofiltragem e, em seguida, o líquido de cultura de 2,3-butanodiol que contém sais inorgânicos reduzidos obtidos do lado permeado é submetido ao tratamento de troca iônica. Desta forma, sais inorgânicos e ácidos orgânicos que passam parcialmente através da membrana de nanofiltragem podem ser removidos com a resina de troca iônica, de forma que a taxa de remoção de sais inorgânicos possa ser aumentada.

[077] O método de concentração do líquido de cultura de 2,3- butanodiol pode ser um método geral conhecido dos técnicos no assunto e exemplos do método incluem métodos que empregam uma membrana de osmose reversa e métodos de concentração a quente utilizando um evaporador. É preferencialmente aplicado um método que utiliza uma membrana de osmose reversa.

[078] No método que utiliza uma membrana de osmose reversa, uma solução de 2,3-butanodiol é filtrada através de uma membrana de osmose reversa para permitir a permeação de água para o lado permeado, enquanto 2,3- butanodiol é retido e concentrado no lado de alimentação da membrana. Exemplos de membranas de osmose reversa preferencialmente utilizadas na presente invenção incluem membranas compostas que possuem um polímero de acetato de celulose como camada funcional (também denominadas a seguir membranas de osmose reversa de acetato de celulose) e membranas compostas que possuem uma camada funcional de poliamida (também denominadas a seguir membranas de osmose reversa de poliamida). Neste ponto, exemplos do polímero de acetato de celulose incluem polímeros preparados com ésteres de ácidos orgânicos de celulose, tais como acetato de celulose, diacetato de celulose, triacetato de celulose, propionato de celulose e butirato de celulose, que podem ser utilizados individualmente ou como mistura ou éster misturado de dois ou mais destes. Exemplos da poliamida incluem polímeros lineares e polímeros reticulados constituídos por monômeros de diamina alifática e/ou aromática. Exemplos da forma da membrana que podem ser utilizados conforme apropriado incluem uma membrana plana, membrana enrolada em espiral e membrana de fibra oca.

[079] Exemplos específicos da membrana de osmose reversa utilizada na presente invenção incluem módulos de membrana de osmose reversa de poliamida fabricados pela Toray Industries, Inc., tais como módulos do tipo de baixa pressão SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-720L, SU- 720LF, SU-720R, SU-710P e SU-720P, bem como módulos do tipo de alta pressão SU-810, SU-820, SU-820L e SU-820FA; membranas de osmose reversa de acetato de celulose elaboradas pelo mesmo fabricante SC-L100R, SC-L200R, SC-1100, SC-1200, SC-2100, SC-2200, SC-3100, SC-3200, SC- 8100 e SC-8200; NTR-759HR, NTR-729HF, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U e LF10-D fabricados pela Nitto Denko Corporation; RO98pHt, RO99, HR98PP e CE4040C-30D fabricados pela Alfa-Laval; “GE Sepa” fabricado pela GE; BW30-4040, TW30-4040, XLE-4040, LP-4040, LE- 4040, SW30-4040 e SW30HRLE-4040, fabricados pela Filmtec Corporation.

[080] Na presente invenção, a concentração através de uma membrana de osmose reversa é conduzida sob pressão. A pressão de filtragem encontra-se preferencialmente na faixa de 1 MPa a 8 MPa, pois, em casos em que a pressão de filtragem é de menos de 1 MPa, a taxa de permeação de membrana pode ser baixa e, em casos em que a pressão de filtragem é de mais de 8 MPa, a membrana pode ser danificada. Em casos em que a pressão de filtragem se encontra na faixa de 1 MPa a 7 MPa, o fluxo de permeação de membrana é alto, de tal forma que a solução de 2,3-butanodiol aquosa possa ser eficientemente concentrada. A pressão de filtragem encontra-se, de preferência superior, na faixa de 2 MPa a 6 MPa, a fim de reduzir a possibilidade de danificar a membrana. Em casos de solução de 2,3-butanodiol sob baixa concentração, um método que utiliza uma membrana de osmose reversa é preferido em razão do custo.

[081] Antes do processo acima, é preferencialmente incluído um processo de separação de células bacterianas contidas no líquido de cultivo de 2,3-butanodiol. Exemplos de métodos que podem ser utilizados para o processo de separação de células bacterianas incluem centrifugação e separação de filtragem. Pode-se empregar um ou uma combinação desses métodos.

[082] O 2,3-butanodiol produzido pela presente invenção é caracterizado por possuir alta pureza. Exemplos de métodos de medição de impurezas contidas no 2,3-butanodiol incluem combinações de medição de pureza por meio de cromatografia de gases (GC), medição de pureza por meio de detecção de UV utilizando cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC) e/ou similares. Como estes são baseados na avaliação da razão da área de 2,3-butanodiol na área total de picos detectados, razão mais alta indica pureza mais alta de 2,3-butanodiol.

EXEMPLOS

[083] A presente invenção é descrita concretamente abaixo por meio de exemplos. Entretanto, a presente invenção não é limitada a estes exemplos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 - MEDIÇÃO DE KLA

[084] Um eletrodo de oxigênio dissolvido (fabricado pela ABLE Corporation) foi inserido em um aparelho de cultivo (fabricado pela ABLE Corporation; capacidade da jarra: 1,5 l) para medir o nível de oxigênio dissolvido sob várias condições de aeração/agitação e kLa foi determinado por meio do método dinâmico utilizando gás nitrogênio. Em primeiro lugar, no recipiente de cultivo, colocou-se 1 l de água e gás nitrogênio foi soprado suficientemente na água enquanto a temperatura da água era controlada a 30 °C e a água era agitada sob velocidade constante. Quando o valor do eletrodo tornou-se mínimo, conduziu-se calibragem zero do eletrodo de oxigênio dissolvido. Em seguida, o gás de aeração foi alterado de gás nitrogênio para ar ou gás nitrogênio em taxa de aeração previamente determinada e as alterações do nível de oxigênio dissolvido com o tempo a seguir foram medidas para determinar kLa. A Tabela 1 exibe kLa obtido para várias condições de aeração/agitação. TABELA 1

[085] A linhagem ATCC51623 de Zymobacter palmae (Z. palmae) foi submetida a cultivo estático em um tubo de ensaio contendo 5 ml de meio T (20 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de KH2PO4, 2 g/L de (NH4)2SO4, 0,5 g/L de MgSO4-7H2O, pH 6,0) a 30 °C por 24 horas, para realizar pré-pré-cultivo. O líquido pré-pré-cultivo integral foi adicionado em seguida a um frasco Erlenmeyer contendo 50 ml de meio T e o cultivo estático foi conduzido a 30 °C por dezesseis horas, para realizar cultivo prévio. O líquido pré-cultivo foi adicionado a 1 l do meio de fermentação de 2,3-butanodiol que possui a composição exibida na Tabela 2 e o cultivo foi realizado à temperatura de 30 °C em cada kLa descrito na Tabela 1, enquanto o pH foi mantido a 5,5 por meio de neutralização com hidróxido de potássio. A coleta do líquido de cultura foi conduzida utilizando um autoamostrador (fabricado pela ABLE Corporation) em intervalos de duas horas após o início do cultivo por até quarenta horas. Foram medidas a concentração de glicose e a concentração de 2,3-butanodiol no líquido de cultura coletado. TABELA 2

[086] Encontram-se a seguir as condições de medição de cada concentração por meio de cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC, fabricada pela Shimadzu Corporation). A concentração de 2,3-butanodiol, a concentração de glicose após a fermentação e o rendimento de fermentação foram determinados por meio dos métodos de medição a seguir. MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL - Coluna: Açúcar Shodex SH1011 (fabricado pela Showa Denko K. K.); - Temperatura da coluna: 65 °C; - Fase móvel: solução de 0,05 M de ácido sulfúrico aquoso, 0,6 ml/min. DETECÇÃO: RI MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE - Coluna: Açúcar Asahipak NH2P50 4E (fabricado pela Showa Denko K. K.); - Temperatura da coluna: 30 °C; - Fase móvel: água:acetonitrila = 1:3, 0,6 ml/min. DETECÇÃO: RI

RENDIMENTO DE FERMENTAÇÃO

[087] Com base na concentração de 2,3-butanodiol e na concentração de glicose medida por meio da análise de HPLC acima, o rendimento de fermentação foi calculado utilizando a equação a seguir.

[088] Rendimento de fermentação (%) = 100 x {(concentração de 2,3-butanodiol em líquido de cultura) - (concentração de 2,3-butanol no meio)} / {(concentração de glicose no meio) - (concentração de glicose em líquido de cultura)}.

[089] As concentrações de 2,3-butanodiol e glicose no líquido de cultura e o rendimento de fermentação no momento em que a concentração de glicose no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidas na Tabela 3. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol obtido foi recuperado e centrifugado a 4 °C a 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3-butanodiol foram obtidos como resultado. PURIFICAÇÃO DE TROCA DE ÍONS DE LÍQUIDO DE CULTIVO DE 2,3-BUTANODIOL

[090] O líquido de cultura obtido por meio do teste de fermentação descrito acima foi submetido a remoção de íons residuais por meio de tratamento de troca iônica. Foram utilizadas uma resina de troca de ânions forte IRA120J (fabricada pela Organo Corporation) e uma resina de troca de cátions forte IR410 (fabricada pela Organo Corporation) que foram regeneradas com 1 N hidróxido de sódio ou 1 N ácido clorídrico no tipo OH ou tipo H, respectivamente. A quantidade de resina foi calculada de tal forma que a quantidade total de sais inorgânicos e ácidos orgânicos fosse a mesma capacidade de troca da resina de troca iônica. As colunas foram cheias com as resinas de troca iônica e o líquido de cultura passou através da resina de troca de ânions e, em seguida, através da resina de troca de cátions em velocidade de fluxo SV de 5.

PURIFICAÇÃO POR DESTILAÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL

[091] A solução de 2,3-butanodiol após o tratamento de troca iônica foi submetida a remoção de água com um evaporador de filme MF-10 (fabricado pela Tokyo Rikakikai). Nesse momento, permitiu-se a evaporação da água até grau de redução da pressão de 30 hPa e temperatura de aquecimento de 60 °C. A solução de 2,3-butanodiol concentrada foi destilada sob pressão reduzida (5 mmHg) para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos de medição a seguir.

PUREZA DE GC

[092] O 2,3-butanodiol após a destilação foi analisado por meio de cromatografia de gases (GC; fabricado pela Shimadzu Corporation) e a pureza de GC foi calculada de acordo com a equação a seguir com base na razão da área de pico de 2,3-butanodiol na área de pico detectada total: Pureza de GC (%) = 100 x (área de pico de 2,3-butanodiol) / (área de pico total detectada).

[093] As condições de análise para a cromatografia de gases foram as seguintes: - Coluna: RT-BDEXM (0,25 mm x 30 m, fabricado pela Restek) - Temperatura da coluna: 75 °C - Câmara de vaporização, temperatura do detector: 230 °C - Gás veículo: He - Velocidade linear: 35 cm/seg - Detecção: detector de ionização de chama (FID)

RENDIMENTO DE DESTILAÇÃO

[094] O rendimento de destilação foi calculado de acordo com a equação a seguir com base em: - quantidade de 2,3-butanodiol alimentada antes da destilação calculada a partir da concentração de 2,3-butanodiol medida por meio de análise de HPLC e da quantidade de líquido alimentado; e - recuperação de 2,3-butanodiol calculado a partir da quantidade de destilado após a destilação e da pureza de GC descrita acima. Rendimento de destilação (%) = 100 x {(quantidade de destilado após a destilação) x (pureza de GC)} / {(concentração de 2,3-butanodiol antes da destilação) x (quantidade de líquido alimentado antes da destilação)} RENDIMENTO TOTAL DE 2,3-BUTANODIOL

[095] O rendimento total de 2,3-butanodiol foi calculado de acordo com a equação a seguir com base no rendimento de fermentação calculado a partir dos resultados da etapa de fermentação e o rendimento de destilação é calculado a partir dos resultados da etapa de purificação. Os resultados sobre o rendimento total de 2,3-butanodiol são exibidos na Tabela 3. Rendimento total de 2,3-butanodiol (g/g de açúcar) = (rendimento de fermentação)/100 x (rendimento de destilação)/100 TABELA 3

EXEMPLOS 7 A 11 - PH

[096] A linhagem ATCC51623 de Z. palmae foi cultivada por meio do método de pré-pré-cultivo e do método de pré-cultivo descrito nos Exemplos 1 a 6. O líquido pré-cultivo foi adicionado a 1 l do meio de fermentação de 2,3-butanodiol que possui a composição exibida na Tabela 2 e o cultivo foi conduzido em taxa de aeração de 0,2 vvm, velocidade de agitação de 400 rpm e temperatura de 30 °C, mantendo-se o pH em um dentre 4,5, 4,8, 5,2, 5,5, 6,1 e 6,5 por meio de neutralização com hidróxido de potássio. A coleta do líquido de cultura foi conduzida utilizando um autoamostrador (fabricado pela ABLE Corporation) em intervalos de duas horas após o início do cultivo por até quarenta horas. A concentração de glicose e a concentração de 2,3-butanodiol no líquido de cultura coletado foram medidas de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 a 6. As concentrações de 2,3-butanodiol e glicose no líquido de cultura e o rendimento de fermentação no momento em que a concentração de glicose no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidos na Tabela 4. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol após o teste de fermentação foi recuperado e centrifugado a 4 °C e 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado em seguida através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3-butanodiol foram obtidos como resultado. O líquido de cultura obtido foi submetido a tratamento de dessalinização e destilação por meio dos métodos escritos nos Exemplos 1 a 6 para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos descritos nos Exemplos 1 a 6. Os resultados são exibidos na Tabela 4. TABELA 4

EXEMPLOS 12 A 16 - CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCAR

[097] A linhagem ATCC51623 de Z. palmae foi cultivada por meio do método de pré-pré-cultivo e do método de pré-cultivo descritos nos Exemplos 1 a 6. O líquido pré-cultivo foi adicionado a um litro do meio de fermentação de 2,3-butanodiol que possui a mesma composição exibida na Tabela 2, exceto porque a concentração de glicose foi ajustada em uma dentre 12, 20, 100, 180 e 250 g/L. O cultivo foi conduzido em seguida em taxa de aeração de 0,2 vvm, velocidade de agitação de 400 rpm e temperatura de 30 °C, enquanto o pH foi mantido em 5,5 por meio de neutralização com hidróxido de potássio. A coleta do líquido de cultura foi conduzida utilizando um autoamostrador (fabricado pela ABLE Corporation) em intervalos de duas a oito horas após o início do cultivo. A concentração de glicose e a concentração de 2,3-butanodiol no líquido de cultura coletado foram medidas de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 a 6. As concentrações de 2,3-butanodiol e glicose no líquido de cultura e no rendimento de fermentação no momento em que a concentração de glicose no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidas na Tabela 5. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol após o teste de fermentação foi recuperado e centrifugado a 4 °C e 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado em seguida através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3-butanodiol foram obtidos como resultado. O líquido de cultura obtido foi submetido a tratamento de dessalinização e destilação por meio dos métodos descritos nos Exemplos 1 a 6 para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos descritos nos Exemplos 1 a 6. Os resultados são exibidos na Tabela 5. TABELA 5

EXEMPLOS 17 A 31

[098] Confirmou-se a expressão de quatro tipos de genes de enzimas em células do transformador descrito no Documento de Patente 1 e no Documento de Patente 2. Este transformador foi depositado junto ao Depositário de Organismo de Patente Internacional, Instituto Nacional de Tecnologia e Ciência Industrial Avançada, com número de acesso FERM BP-10048 de trinta de junho de 2004, com base no Tratado de Budapeste. Como o Documento de Patente 2 é US 7.569.379 B, este transformador já está disponível.

EXEMPLOS 17 A 21 - KLA ERMENTAÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL

[099] Como micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter que possui capacidade de metabolização de xilose, utilizou-se Zymobacter palmae (pMFY31-xt) descrito nos Documentos de Patente 1 e 2. Zymobacter palmae (pMFY31-xt) é um transformador conhecido preparado por meio da transformação de Zymobacter palmae com um plasmídeo de vetor de ampla faixa de hospedeiros recombinante ao qual são introduzidos genes exógenos que codificam xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase. Conforme descrito acima, Zymobacter palmae (pMFY31-xt) foi depositado com número de acesso FERM BP-10048, com base no Tratado de Budapeste, e é disponível. Z. palmae (pMFY31-xt) foi submetido a cultivo estático em um tubo de ensaio contendo 5 ml de meio TX (40 g/L de xilose, 10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de KH2PO4, 2 g/L de (NH4)2SO4, 0,5 g/L de MgSO47H2O, pH 6,0) suplementado com 100 μg/ml de ampicilina a 30 °C por 24 horas. O líquido de cultura integral foi adicionado em seguida a um frasco Erlenmeyer contendo 50 ml de meio TX e o cultivo estático foi conduzido a 30 °C por 24 horas. O líquido de cultura integral foi adicionado a 1 l do meio de fermentação de 2,3- butanodiol que possui a composição exibida na Tabela 6 e o cultivo foi realizado à temperatura de 30 °C sob as condições de aeração e agitação descritas na Tabela 1, enquanto o pH foi mantido a 5,5 por meio de neutralização com hidróxido de potássio. O líquido de cultura foi coletado conforme apropriado durante o cultivo e foram medidas a concentração de xilose e a concentração de 2,3-butanodiol. TABELA 6

[0100] Encontram-se a seguir as condições de medição de cada concentração por meio de cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC, fabricada pela Shimadzu Corporation). A concentração de 2,3-butanodiol, a concentração de açúcar após a fermentação e o rendimento de fermentação foram determinados por meio dos métodos de medição a seguir.

[0101] Medição da concentração de 2,3-butanodiol: - Coluna: Açúcar Shodex SH1011 (fabricado pela Showa Denko K. K.); - Temperatura da coluna: 65 °C; - Fase móvel: solução de 0,05 M de ácido sulfúrico aquoso, 0,6 ml/min; - Detecção: RI.

[0102] Medição da concentração de açúcar: - Coluna: Asahipak NH2P50 4E (fabricado pela Showa Denko K. K.); - Temperatura da coluna: 30 °C; - Fase móvel: água:acetonitrila = 1:3, 0,6 ml/min; - Detecção: RI.

RENDIMENTO DE FERMENTAÇÃO

[0103] Com base na concentração de 2,3-butanodiol e na concentração de açúcar medida por meio da análise de HPLC acima, o rendimento de fermentação foi calculado utilizando a equação a seguir: Rendimento de fermentação (%) = 100 x {(concentração de 2,3-butanodiol em líquido de cultura) - (concentração de 2,3-butanodiol no meio)} / {(concentração de açúcar no meio) - (concentração de açúcar em líquido de cultura)}

[0104] As concentrações de 2,3-butanodiol e xilose no líquido de cultura e no rendimento de fermentação no momento em que a concentração de xilose no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidas na Tabela 7. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol obtido foi recuperado e centrifugado a 4 °C a 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado em seguida através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3-butanodiol foram obtidos como resultado.

PURIFICAÇÃO DE TROCA DE ÍONS DE LÍQUIDO DE CULTIVO DE 2,3-BUTANODIOL

[0105] O líquido de cultura obtido por meio do teste de fermentação descrito acima foi submetido a remoção de íons residuais por meio de tratamento de troca iônica: Foram utilizadas uma resina de troca de ânions forte IRA120J (fabricada pela Organo Corporation) e uma resina de troca de cátions forte IR410 (fabricada pela Organo Corporation) que foram regeneradas com 1 N hidróxido de sódio ou 1 N ácido clorídrico no tipo OH ou tipo H, respectivamente. A quantidade de resina foi calculada de tal forma que a quantidade total de sais inorgânicos e ácidos orgânicos fosse a mesma capacidade de troca da resina de troca iônica. As colunas foram cheias com as resinas de troca iônica e o líquido de cultura passou através da resina de troca de ânions e, em seguida, através da resina de troca de cátions em velocidade de fluxo SV de 5.

PURIFICAÇÃO POR DESTILAÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL

[0106] A solução de 2,3-butanodiol após o tratamento de troca iônica foi submetida a remoção de água com um evaporador de filme MF-10 (fabricado pela Tokyo Rikakikai). Nesse momento, permitiu-se a evaporação da água até grau de redução da pressão de 30 hPa e temperatura de aquecimento de 60 °C. A solução de 2,3-butanodiol concentrada foi destilada sob pressão reduzida (5 mmHg) para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos de medição a seguir.

PUREZA DE GC

[0107] O 2,3-butanodiol após a destilação foi analisado por meio de cromatografia de gases (GC; fabricado pela Shimadzu Corporation) e a pureza de GC foi calculada de acordo com a equação a seguir com base na razão da área de pico de 2,3-butanodiol na área de pico detectada total. Pureza de GC (%) = 100 x (área de pico de 2,3-butanodiol) / (área de pico total detectada)

[0108] As condições de análise para a cromatografia de gases foram as seguintes: - Coluna: RT-BDEXM (0,25 mm x 30 m, fabricado pela Restek) - Temperatura da coluna: 75 °C - Câmara de vaporização, temperatura do detector: 230 °C - Gás veículo: He - Velocidade linear: 35 cm/seg - Detecção: detector de ionização de chama (FID)

RENDIMENTO DE DESTILAÇÃO

[0109] O rendimento de destilação foi calculado de acordo com a equação a seguir com base em: - quantidade de 2,3-butanodiol alimentada antes da destilação calculada a partir da concentração de 2,3-butanodiol medida por meio de análise de HPLC e da quantidade de líquido alimentado; e - recuperação de 2,3-butanodiol calculada a partir da quantidade de destilado após a destilação e a pureza de GC descrita acima. Rendimento de destilação (%) = 100 x {(quantidade de destilado após a destilação) x (pureza de GC)} / {(concentração de 2,3-butanodiol antes da destilação) x (quantidade de líquido alimentado antes da destilação)}

RENDIMENTO TOTAL DE 2,3-BUTANODIOL

[0110] O rendimento total de 2,3-butanodiol foi calculado de acordo com a equação a seguir com base no rendimento de fermentação calculado a partir dos resultados da etapa de fermentação e o rendimento de destilação é calculado a partir dos resultados da etapa de purificação. Os resultados sobre o rendimento total de 2,3-butanodiol são exibidos na Tabela 7. Rendimento total de 2,3-butanodiol (g/g de açúcar) = (rendimento de fermentação)/100 x (rendimento de destilação)/100. TABELA 7

EXEMPLOS 22 A 25 pH

[0111] Z. palmae (pMFY31-xt) foi cultivado por meio do método descrito nos Exemplos 17 a 21. O líquido de cultura resultante, preparado por meio de cultivo em um frasco, foi adicionado a 1 l do meio de fermentação de 2,3-butanodiol que possui a composição exibida na Tabela 6 e o cultivo foi conduzido em taxa de aeração de 0,2 vvm, velocidade de agitação de 400 rpm e temperatura de 30 °C, mantendo-se o pH em um dentre 4,5, 4,8, 6,1 e 6,5 por meio de neutralização com hidróxido de potássio. O líquido de cultura foi coletado conforme apropriado durante o cultivo e foram medidas a concentração de xilose e a concentração de 2,3-butanodiol por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21. As concentrações de 2,3-butanodiol e xilose no líquido de cultura e no rendimento de fermentação no momento em que a concentração de xilose no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidas na Tabela 8. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol após o teste de fermentação foi recuperado e centrifugado a 4 °C e 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3- butanodiol foram obtidos como resultado. O líquido de cultura obtido foi submetido a tratamento de dessalinização e destilação por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21 para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21. Os resultados são exibidos na Tabela 8. TABELA 8

EXEMPLOS 26 A 28 - CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCAR

[0112] Z. palmae (pMFY31-xt) foi cultivado por meio do método descrito nos Exemplos 17 a 21. O líquido de cultura resultante, preparado por meio de cultivo em frascos, foi adicionado a 1 l do meio de fermentação de 2,3-butanodiol que possui a mesma composição exibida na Tabela 6, exceto pela concentração de xilose, que foi ajustada em um dentre 5,0, 15 e 100 g/L. O cultivo foi conduzido em seguida em taxa de aeração de 0,2 vvm, velocidade de agitação de 400 rpm e temperatura de 30 °C, enquanto o pH foi mantido em 5,5 por meio de neutralização com hidróxido de potássio. O líquido de cultura foi coletado conforme apropriado durante o cultivo e foram medidas a concentração de xilose e a concentração de 2,3- butanodiol por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21. As concentrações de 2,3-butanodiol e xilose no líquido de cultura e no rendimento de fermentação no momento em que a concentração de xilose no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidas na Tabela 9. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol após o teste de fermentação foi recuperado e centrifugado a 4 °C e 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3-butanodiol foram obtidos como resultado. O líquido de cultura obtido foi submetido a tratamento de dessalinização e destilação por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21 para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21. Os resultados são exibidos na Tabela 9. TABELA 9

EXEMPLOS 29 A 31 - Razão de Pentose

[0113] Z. palmae (pMFY31-xt) foi cultivado por meio do método descrito nos Exemplos 17 a 21. O líquido de cultura resultante, preparado por meio de cultivo em frascos, foi adicionado a 1 l do meio de fermentação de 2,3- butanodiol que possui a mesma composição exibida na Tabela 6, exceto pelas concentrações de xilose e glicose (g/L), que foram ajustadas em um dentre (40:20), (20:40) e (2:5:40), respectivamente. O cultivo foi conduzido em seguida em taxa de aeração de 0,2 vvm, velocidade de agitação de 400 rpm e temperatura de 30 °C, enquanto o pH foi mantido em 5,5 por meio de neutralização com hidróxido de potássio. O líquido de cultura foi coletado conforme apropriado durante o cultivo e foram medidas a concentração de açúcar e a concentração de 2,3-butanodiol por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21. A concentração de 2,3-butanodiol e a concentração de açúcar no líquido de cultura e no rendimento de fermentação no momento em que a concentração de açúcar no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidas na Tabela 10. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol após o teste de fermentação foi recuperado e centrifugado a 4 °C e 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3- butanodiol foram obtidos como resultado. O líquido de cultura obtido foi submetido a tratamento de dessalinização e destilação por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21 para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos descritos nos Exemplos 17 a 21. Os resultados são exibidos na Tabela 10. TABELA 10

EXEMPLOS 32 A 35 - FONTE DE NITROGÊNIO ORGÂNICO

[0114] A linhagem ATCC51623 de Z. palmae foi cultivada por meio do método de pré-pré-cultivo e do método de pré-cultivo descrito nos Exemplos 1 a 6. O líquido pré-cultivo foi adicionado a 1 l do meio de fermentação de 2,3- butanodiol que possui a mesma composição exibida na Tabela 2, exceto pela milhocina, que foi substituída por várias fontes de nitrogênio orgânico exibidas na Tabela 11. O cultivo foi conduzido em taxa de aeração de 0,2 vvm, velocidade de agitação de 400 rpm e temperatura de 30 °C, mantendo-se o pH em 5,5, por meio de neutralização com hidróxido de potássio. A coleta do líquido de cultura foi conduzida utilizando um autoamostrador (fabricado pela ABLE Corporation) em intervalos de duas a quatro horas após o início do cultivo. A concentração de glicose e a concentração de 2,3-butanodiol no líquido de cultura coletado foram medidas por meio dos métodos descritos nos Exemplos 1 a 6. As concentrações de 2,3-butanodiol e glicose no líquido de cultura e no rendimento de fermentação no momento em que a concentração de glicose no líquido de cultura fica mais perto de zero são exibidas na Tabela 12. O líquido de cultura de 2,3-butanodiol após o teste de fermentação foi recuperado e centrifugado a 4 °C e 8000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de microfiltragem (fabricada pela Toray Industries, Inc.) para remover as células bacterianas. Este processo foi conduzido duas vezes e, ao todo, dois litros de líquido de cultura de 2,3-butanodiol foram obtidos como resultado. O líquido de cultura obtido foi submetido a tratamento de dessalinização e destilação por meio dos métodos descritos nos Exemplos 1 a 6 para obter 2,3-butanodiol purificado. A pureza de GC e o rendimento de destilação do 2,3-butanodiol após a destilação foram determinados por meio dos métodos descritos nos Exemplos 1 a 6. Os resultados são exibidos na Tabela 12.

[0115] Poder-se-á obter bom rendimento de 2,3-BDO com qualquer uma das fontes de nitrogênio orgânico. O rendimento de 2,3-BDO mais alto poderá ser obtido no caso em que a milhocina foi utilizada conforme exibido no Exemplo 4.

APLICAÇÃO INDUSTRIAL

[0116] 2,3-Butanodiol (2-3BDO) obtido por meio do método de acordo com a presente invenção é um composto útil como material intermediário para produtos farmacêuticos e cosméticos e como material para tintas, perfumes, cristais líquidos, inseticidas, agentes amaciantes, explosivos, plastificantes e similares.

Claims (13)

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL, caracterizado por compreender as etapas de: - cultivar um micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter em uma matéria-prima de fermentação que contém uma fonte de carbono em um coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) maior ou igual a 9 h-1 e sob pH de 5 a 7 (Etapa A); e - purificar 2,3-butanodiol a partir do líquido de cultura obtido na etapa acima (Etapa B).

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo micro-organismo ser Zymobacter palmae.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela mencionada Etapa A ser cultivar em um meio cuja concentração total de açúcar é maior ou igual a 20 g/L.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela mencionada fonte de carbono conter uma pentose, e o mencionado micro-organismo pertencente ao gênero Zymobacter possuir capacidade de metabolizar a mencionada pentose.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo mencionado micro-organismo ser um micro-organismo transformado pertencente ao gênero Zymobacter, no qual um ou mais genes exógenos que codificam pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase, são introduzidos.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo mencionado micro-organismo ser um micro-organismo transformado pertencente ao gênero Zymobacter, no qual genes exógenos que codificam xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase são introduzidos.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pela mencionada pentose contida na mencionada matéria- prima de fermentação na mencionada Etapa A ser xilose.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pela abundância de xilose com relação ao açúcar total na mencionada matéria-prima de fermentação ser de 5 a 100%.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pela mencionada matéria-prima de fermentação conter um líquido de açúcar derivado de biomassa.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela mencionada matéria-prima de fermentação na mencionada etapa A conter milhocina.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela mencionada Etapa B compreender um processo de destilação.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender um processo de dessalinização antes do mencionado processo de destilação.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender um processo de troca iônica como mencionado processo de dessalinização.