CN105793429B

CN105793429B - 2,3-丁二醇的制造方法

Info

Publication number: CN105793429B
Application number: CN201480063541.7A
Authority: CN
Inventors: 矶部匡平; 泽井健司; 河村健司; 山田胜成; 簗濑英司
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2034-11-19
Also published as: EP3072974A4; MY179877A; EP3072974A1; US10072275B2; TW201525139A; EP3072974B1; BR112016011487A2; BR112016011487B1; WO2015076279A1; SG11201604094VA; ES2742418T3; CN105793429A; US20160298144A1

Abstract

本发明公开了通过利用生物上安全的微生物的微生物发酵来制造2,3‑丁二醇的方法。2,3‑丁二醇的制造方法包括在含有碳源的发酵原料中培养发酵细菌(Zymobacter)属微生物的步骤(步骤A)，以及从该步骤所得的培养液中提纯2,3‑丁二醇的步骤(步骤B)。在该方法中，还公开了碳源含有五碳糖、且发酵细菌属微生物具有同化五碳糖的能力。

Description

2,3-丁二醇的制造方法

技术领域

本发明涉及一种利用了微生物发酵的2,3-丁二醇的制造方法。

背景技术

2,3-丁二醇(以下有时称为“2,3-BDO”)是可用作药品和化妆品的中间体原料、以及墨水、香水、液晶、杀虫剂、软化剂、炸药、增塑剂等的原料的有用的化合物，作为具体的例子，可以成为甲乙酮 (非专利文献1)和1,3-丁二烯(非专利文献2)的原料。2,3-BDO 在工业上通过将2-环氧丁烷在高氯酸水溶液中水解的方法制造。另外，近年来，作为对石油资源的枯竭和变暖问题的应对，被迫向可持续的循环型社会转变，在化学工业中也积极地进行从石油原料向源于生物质的原料转移的研究，其中利用微生物发酵法制造2,3-丁二醇的方法正受到关注。

高效发酵生产2,3-丁二醇的微生物中已知的有Klebsiella pneumoniae(非专利文献3)、Klebsiella oxytoca(非专利文献4)等肠内细菌。由于这些微生物在发酵中无需特定的维生素和氨基酸等，因此有从发酵液中分离提纯2,3-丁二醇时必要步骤少的优点。然而，已知这些微生物有病原性，会引起呼吸道感染等。因此在为了产业化制造2,3-丁二醇而大量培养这些发酵菌的情况下，需要用于严格控制的设备，导致成本增加。

作为生物上安全且发酵效率良好的2,3-丁二醇发酵微生物，已经公开了使用(例如)Bacillus licheniformis(非专利文献5)、Bacillus amyloliquefaciens(非专利文献6)等芽孢杆菌科细菌的方法。然而，在利用Bacillus licheniformis进行的2,3-丁二醇发酵中，作为用于促进发酵的营养源，必须使用昂贵的动物提取物。另外，在利用Bacillusamyloliquefaciens进行的2,3-丁二醇发酵中，为了促进发酵使用了柠檬酸铵，而柠檬酸与2,3-丁二醇沸点相近，因此残留在培养液中的情况下2,3-丁二醇难以分离提纯。

另一方面，作为微生物发酵的发酵原料，除了传统的源于食用生物质的糖之外，源于不可食用的生物质的糖受到关注。使用源于不可食用的生物质的糖作为发酵原料时，不可食用的生物质中所含的纤维素、半纤维素等通过糖化酶分解成糖，此时不仅得到了葡萄糖等六碳糖，同时也得到了木糖等五碳糖。因此，人们寻求含五碳糖原料的高效的发酵技术的开发。

由五碳糖高效发酵生产2,3-丁二醇的微生物已知Klebsiella oxytoca(非专利文献3)等肠内细菌。由于这些微生物在发酵中无需特定的维生素和氨基酸等，因此有从发酵液中提纯2,3-丁二醇时必要步骤少的优点。然而，已知这些微生物有病原性，会引起呼吸道感染等。因此在为了产业化制造2,3-丁二醇而大量培养这些发酵菌的情况下，需要用于严格控制的设备，导致成本增加。

另一方面，作为生物上安全、且将五碳糖发酵为2,3-丁二醇的微生物，已经公开了使用(例如)Bacillus licheniformis(非专利文献 9)或Paenibacillus polymyxa等芽孢杆菌科细菌(非专利文献10)的方法。然而，在使用了这些微生物的2,3-丁二醇发酵中，由于使用酵母提取物或动物性蛋白水解物等昂贵的副原料，因此成本增加。

另外，已知有向发酵细菌(Zymobacter)属微生物引入编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的外源基因而具有同化五碳糖能力的发酵细菌属的转化微生物(专利文献1、专利文献2)。然而，专利文献1和2记载了该转化微生物具有乙醇生产性，但对于将五碳糖发酵为2,3-丁二醇的能力既没有记载也没有暗示。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2005-261421号公报

专利文献2：美国专利申请公开2007/0298476号

非专利文献

非专利文献1：A.N.Bourns,The Catalytic Action Of Aluminium Silicates,Canadian J.Res.(1947年)

非专利文献2：Nathan Shlechter,Pyrolysis of 2,3-butylene GlycolDiacetate to Butadiene,Indu.Eng.Chem.905(1945年)

非专利文献3：Ma CQ,Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiellapneumoniae SDM.Appl Microbiol Biotechnol 2009； 82:49-57

非专利文献4：Ji XJ,Engineering Klebsiella oxytoca for efficient 2,3-butanediol production through insertional inactivation of acetaldehydedehydrogenase gene.Appl Microbiol Biotechnol 2010； 85:1751-8.

非专利文献5：S.S.Nilegaonkar,Potential of Bacillus licheniformis forthe production of 2,3-butanediol.Journal of Fermentation and BioengineeringVolume 82,Issue 4,1996,Pages 408-410

非专利文献6:Yang T,Optimization and scale-up of 2,3-butanediolproduction by Bacillus amyloliquefaciens B10-127. World J MicrobiolBiotechnol.2012Apr；28(4):1563-74

非专利文献7:Okamoto T,Zymobacter palmae gen.nov.,sp.nov., a newethanol-fermenting peritrichous bacterium isolated from palm sap. ArchMicrobiol.1993；160(5):333-7.

非专利文献8:Jansen NB,Production of 2,3-butanediol from D-xylose byKlebsiella oxytoca ATCC 8724.Biotechnol Bioeng.1984 Apr；26(4):362-9.

非专利文献9:Wang Q,Metabolic engineering of thermophilic Bacilluslicheniformis for chiral pure D-2,3-butanediol production. BiotechnolBioeng.2012Jul；109(7):1610-21.

非专利文献10:Marwoto B,Metabolic analysis of acetate accumulationduring xylose consumption by Paenibacillus polymyxa. Appl MicrobiolBiotechnol.2004Mar；64(1):112-9.

发明内容

[发明要解决的问题]

如前所述，在通过传统的微生物发酵制造2,3-丁二醇的方法中使用生物上安全的微生物时，存在成本变高，或者与副产物的分离困难的问题。

因此本发明的目的在于建立通过利用了生物上安全的微生物的微生物发酵来制造2,3-丁二醇的方法。进而，本发明的目的还在于建立通过利用了生物上安全的微生物的微生物发酵由含有作为碳源的五碳糖的发酵原料来制造2,3-丁二醇的经济的方法。

[解决问题的方案]

本发明的发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，迄今为止作为2,3-丁二醇发酵微生物尚未为人所知的发酵细菌 (Zymobacter)属细菌具有2,3-丁二醇的发酵能力，从而完成了本发明。另外，发现通过使用具有同化五碳糖能力的细菌作为该发酵细菌属细菌，可以由五碳糖制造2,3-丁二醇。

即，本发明如以下(1)～(16)所述。

(1)一种2,3-丁二醇的制造方法，包括：

在含有碳源的发酵原料中培养发酵细菌(Zymobacter)属微生物的步骤(步骤A)，以及

从该步骤所得的培养液中提纯2,3-丁二醇的步骤(步骤B)。

(2)根据(1)所述的方法，其中，所述微生物为棕榈发酵细菌(Zymobacterpalmae)。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，所述步骤A是在通气条件下的培养。

(4)根据(1)至(3)中任意一项所述的方法，其中，所述步骤A是在体积氧传递系数(kLa)9h^-1以上的条件下的培养。

(5)根据(1)至(4)中任意一项所述的2,3-丁二醇的制造方法，其中，所述步骤A是在pH 5～7的条件下的培养。

(6)根据(1)至(5)中任意一项所述的方法，其中，所述步骤A是在总糖浓度20g/L以上的培养基中的培养。

(7)根据(1)至(6)中任意一项所述的方法，其中，所述碳源含有五碳糖，并且所述发酵细菌属微生物具有同化五碳糖的能力。

(8)根据(1)至(7)中任一项所述的方法，其中，所述微生物是引入了编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶中的至少一种酶的外源基因的发酵细菌属的转化微生物。

(9)根据(8)所述的方法，其中，所述微生物是引入了编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的外源基因的发酵细菌属的转化微生物。

(10)根据(7)至(9)中任意一项所述的方法，其中，所述步骤A的发酵原料中所含的五碳糖是木糖。

(11)根据(7)至(10)中任意一项所述的方法，其中，木糖相对于所述发酵原料中的总糖的存在比率为5～100％。

(12)根据(7)至(11)中任意一项所述的方法，其中，所述发酵原料含有源自生物质的糖液。

(13)根据(1)至(12)中任意一项所述的方法，其中，所述步骤A的发酵原料含有玉米浆。

(14)根据(1)至(13)中任意一项所述的方法，其中，所述步骤B包括蒸馏步骤。

(15)根据(14)所述的方法，其中，在所述蒸馏步骤前包括脱盐处理步骤。

(16)根据(15)所述的方法，其中，作为所述脱盐处理步骤包括离子交换处理步骤。

[本发明的效果]

根据本发明，在微生物发酵中从发酵原料制造2,3-丁二醇的方法可以比现有技术更安全且经济地得到2,3-丁二醇。另外，即使在发酵原料含有五碳糖作为碳源的情况下，也能安全且经济地从五碳糖得到2,3-丁二醇。

具体实施方式

步骤A：2,3-丁二醇发酵步骤

本发明的特征在于，使用发酵细菌(Zymobacter)属细菌作为 2,3-丁二醇(以下有时称为“2,3-BDO”)发酵微生物。所使用的微生物可以是从自然环境分离的微生物，也可以是通过突变或基因重组从而一部分性质发生改变的微生物。作为具有2,3-BDO发酵能力的发酵细菌属细菌的具体例子，从2,3-BDO发酵能力的观点来看优选使用棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)。

发酵原料可以是适当含有可同化的碳源、可同化的氮源、无机盐类、以及根据需要的氨基酸和维生素等有机微量养分的普通液体培养基。另外，为了高效地进行发酵也可以含有适当的消泡剂。

作为可同化的碳源的具体例子，可以使用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、淀粉(スターチ)、废糖蜜、淀粉(澱粉)等糖类，柠檬酸、琥珀酸、乙酸等有机酸，甘油、乙醇等醇，但优选使用糖类。为了高效地进行后续阶段的2,3-丁二醇的提纯步骤，使用糖类时培养基中的糖类浓度通常在15g/L以上，优选20g/L以上。培养基即发酵原料中的总糖浓度通常为15～500g/L，优选20～300g/L。总糖浓度在15g/L以下的话，改善从碳源的产率的效果有时会降低。另外，总糖浓度低的话2,3-BDO的生产效率也降低。

作为可同化的氮源的具体例子，可使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、氨基酸、其它辅助性使用的有机氮源如油渣、大豆水解物、酪蛋白水解物、动物组织水解物、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、各种发酵菌体及其水解物等。其中作为有机氮源优选大豆水解物或玉米浆，更优选玉米浆。发酵原料中所含玉米浆的浓度没有特别限定，例如作为玉米浆中所含的固体含量通常为2.5g/L～35 g/L，优选5g/L～25g/L，更优选10g/L～20g/L。作为玉米浆中所含的固体含量的测定方法没有特别限定，例如，可以将加热干燥时干燥前后的重量差设为水分含量，并将从干燥前的重量中减去水分含量的余量设为固体含量从而求得。

作为无机盐类，可以适当添加使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐等。

其它，根据微生物的生长也可以向培养基中适当添加使用烟酸，另外，也可以适当添加使用消泡剂。

培养温度只要是微生物的生长范围即可，没有特别限定，通常温度为20～50℃，优选在25～40℃的范围内进行。另外，培养时间只要是在培养基内积累可提纯量的2,3-BDO的时间即可，可通过随时间监控培养基中的碳源浓度或生成的2,3-BDO浓度进行适当设定，没有特别限定，但通常为1小时～300小时，优选为4小时～150小时。

培养时的培养基pH通过无机或者有机酸、碱性物质、此外尿素、碳酸钙、氨气等通常维持在pH 4～8的范围内，优选调节至pH 5～7 进行培养，更优选pH 5以上而不到6。

微生物的培养形态没有特别限制，通过分批培养、流加发酵、连续培养等进行。

本发明优选在在通气条件下培养微生物。本发明中的通气是指使含氧气体流入培养槽内部。作为通气方法没有特别限制，例如，除了使含氧气体通过培养液中的方法之外，也包括用含氧气体置换培养液上的空气层的上方通气。另外，上方通气中除了向培养槽吹入含氧气体的方法以外，也包括在大气开放的状态下通过搅拌培养液使培养液上产生空气流，从而向培养液中供给氧的方法。本发明中，优选通过使含氧气体通过培养液中的方法进行通气。

微生物的培养中向培养基的氧供给条件可以通过通气和搅拌的组合来适当设定，并用以常压下30℃的水为对象的情况下的体积氧传递系数kLa(h^-1)(以下简称为kLa)来表示。kLa是表示通气搅拌时单位时间内使氧从气相向液相移动而生成溶解氧的能力的参数，通过以下的式(1)定义。(生物工程实验手册，日本生物工程学会编，培风馆，p.310(1992))。

dC/dt＝kLa×(C^*-C)…式(1)

这里，C是培养液中的溶解氧浓度DO(ppm)，C^*是与微生物不消耗氧的情况下的气相平衡的溶解氧浓度DO(ppm)，kLa是体积氧传递系数(hr^-1)。由上述式(1)导出下述式(2)，因此通过将 C^*-C的对数对通气时间作图，可以求得kLa。

In(C^*-C)＝-kLa×t…式(2)

本发明中的kLa是通过气体置换法(动力学方法)测定的数值。气体置换法(动力学方法)是向插入有溶解氧浓度电极的通气搅拌培养装置中加入水，并将这些液体中的氧用氮气置换以使该液体的氧浓度降低，然后将氮气切换成压缩空气，并测定预定的通气速度、搅拌速度和温度下的溶解氧的上升过程从而计算kLa的方法。

本发明中培养时设定的kLa没有特别限定，但优选为9h^-1以上。 kLa的上限没有特别限定，但优选为200h^-1以下。

本发明的方法中，发酵原料含有五碳糖作为可同化的碳源，并通过培养具有同化五碳糖的能力的发酵细菌(Zymobacter)属微生物，可以将该五碳糖作为原料制造2,3-丁二醇。在这种情况下，所使用的发酵细菌属细菌可以是从自然环境分离的细菌，也可以是通过突变或基因重组使一部分性质发生改变的细菌。作为具有2,3-丁二醇发酵能力的发酵细菌属细菌的具体例子，从2,3-丁二醇发酵能力的观点来看优选使用棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)。棕榈发酵细菌通常不同化五碳糖，但可以通过引入与五碳糖的同化相关的基因从而赋予。

作为本发明中引入的基因，可以使用将戊醛糖异构为戊酮糖的酶基因。作为使用的基因，可以列举(例如)戊糖异构酶、戊糖还原酶和/或五醇脱氢酶(ペントールデヒドロゲナーゼ)等。

戊糖异构酶定义为催化五碳糖(戊糖)中的结构异构体即戊醛糖和戊酮糖的异构化的酶。本发明中所用的戊糖异构酶只要具有催化五碳糖的直接异构化的活性即可，没有特别限制，可以列举(例如) 木糖异构酶(EC5.3.1.5)或阿拉伯糖异构酶(EC5.3.1.3)。其中，例如木糖异构酶是催化木糖(戊醛糖)为木酮糖(戊酮糖)的、和/ 或催化其逆反应的直接异构化的酶，还已知有木糖酮异构酶。直接异构化是指与通过戊糖还原酶和五醇脱氢酶催化的经糖醇中间体的两阶段转化不同，通过戊糖异构酶催化的一阶段的异构化。

戊糖还原酶是还原酶的一种，表示以NADH或NADPH为辅酶具有将戊醛糖转化为糖醇的活性的酶。例如，关于木糖还原酶，(例如)EC1.1.1.307或EC1.1.1.21符合，是将木糖转化为木糖醇的酶。关于阿拉伯糖还原酶，(例如)EC1.1.1.21符合，是将阿拉伯糖转化为阿拉伯糖醇的酶。另外，即使不是以上述EC编号分类的酶，只要是具有上述活性的酶，也包括在本发明的戊糖还原酶中。

五醇脱氢酶是脱氢酶的一种，是以NAD+作为辅酶将五醇转化为戊酮糖的酶。例如，关于木糖醇脱氢酶，(例如)EC1.1.1.9或 EC1.1.1.10符合，是将木糖醇转化为木酮糖的酶。关于阿拉伯糖醇脱氢酶，(例如)EC1.1.1.11或EC1.1.1.12符合，是将阿拉伯糖醇转化为核糖的酶。即使是分类上与五醇脱氢酶不同的酶，只要是具有上述活性的酶，也包括在本发明的五醇脱氢酶中。

戊糖还原酶和五醇脱氢酶的催化反应与戊糖异构酶相同，将戊醛糖异构化为戊酮糖。

上述催化戊醛糖与戊酮糖的异构化的酶当中，可优选使用戊糖的戊糖异构酶，更优选使用木糖异构酶。

使用的木糖异构酶基因没有特别限定，除了基因组DNA以外，也可以是cDNA等。另外，也可以是源于动物、植物、真菌(酵母、霉菌)、细菌等的任一生物的基因。与这些基因相关的信息可以简单地通过在NCBI等网页上公开的数据库中进行检索而得知。例如，可以在本发明中优选使用的大肠杆菌(Escherichia coli)的木糖异构酶基因的碱基序列记载在(例如)GenBank Accession No.NC_007779 REGION:3909650..3910972中。

木糖异构酶的活性可以通过在木糖存在下进行酶反应，并使用 HPLC等测定异构化的木酮糖来确认。木糖异构酶活性可以通过(例如)特开2008-79564中公开的方法来测定。

成为木糖异构酶的供给体的生物可以使用属于(例如)肠杆菌 (Enterobacter)属、埃希氏菌(Escherichia)属、克雷伯菌(Klebsiella) 属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙门氏菌(Salmonella)属等的肠内细菌科类，游动放线菌(Actinoplanes)属、节杆菌(Arthrobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属等的放线菌类，或者芽孢杆菌(Bacillus)属、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter) 属、栖热菌(Thermus)属、黄单胞菌(Xanthomonas)属、根瘤菌 (Rhizobium)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、拟杆菌(Bacteroides)属的微生物，优选为属于埃希氏菌属的微生物，更优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

另外作为本发明中引入的基因，也可以使用具有催化戊酮糖的磷酸化的活性的酶基因。作为具有催化戊酮糖的磷酸化的活性的酶，可以列举(例如)木酮糖激酶(EC2.7.1.17)或核酮糖激酶(EC 2.7.1.16)，并优选使用木酮糖激酶。

使用的木酮糖激酶基因没有特别限定，除了基因组DNA以外，也可以是cDNA等。另外，也可以是源于动物、植物、真菌(酵母、霉菌)、细菌等的任一生物的基因。与这些基因相关的信息可以简单地通过在NCBI等网页上公开的数据库中进行检索而得知。例如，可以在本发明中优选使用的大肠埃希氏菌的木酮糖激酶基因的碱基序列记载在(例如)GenBankAccession No.NC_007779REGION: 3911044..3912498中。

木酮糖激酶的活性可以通过在木酮糖存在下进行酶反应，并使用HPLC等测定磷酸化的木酮糖-5-磷酸，或使用辅助的酶反应测定 NADPH的增加来确认，例如可以通过Feldmann SD,Sahm H,Sprenger GA.Cloning and expression of the genes for xyloseisomerase and xylulokinase from Klebsiella pneumoniae 1033in Escherichia coliK12. Mol Gen Genet.1992Aug；234(2):201-10.中公开的方法来测定。

成为木酮糖激酶的供给体的生物可以使用属于(例如)肠杆菌 (Enterobacter)属、埃希氏菌(Escherichia)属、克雷伯菌(Klebsiella) 属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙门氏菌(Salmonella)属等的肠内细菌科细菌，拟杆菌(Bacteroides)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属等乳酸菌类，此外游动放线菌(Actinoplanes)属、节杆菌(Arthrobacter) 属、链霉菌(Streptomyces)属等的放线菌类，或者芽孢杆菌(Bacillus)属、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、嗜热厌氧肠杆菌(Thermoanaerobacter)属、黄单胞菌(Xanthomonas) 属、根瘤菌(Rhizobium)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属的微生物，优选为属于埃希氏菌属的微生物，更优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

此外，作为本发明中引入的基因，也可以使用具有转酮醇酶和/ 或转醛醇酶活性的酶基因。转酮醇酶定义为催化木酮糖-5-磷酸和赤藓糖-4-磷酸转化为果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸的反应及其逆反应、和/或核糖-5-磷酸和木酮糖-5-磷酸转化为景天庚酮糖-7-磷酸和甘油醛-3-磷酸的反应及其逆反应的酶。本发明中使用的转酮醇酶只要具有上述的催化活性即可，没有特别限制，例如EC2.2.1.1是符合的。

使用的转酮醇酶和/或转醛醇酶基因没有特别限定，除了基因组 DNA以外，也可以是cDNA等。另外，也可以是源于动物、植物、真菌(酵母、霉菌)、细菌等的任一生物的基因。与这些基因相关的信息可以简单地通过在NCBI等网页上公开的数据库中进行检索而得知。例如，可以在本发明中优选使用的大肠埃希氏菌的转酮醇酶基因的碱基序列记载在(例如)GenBank Accession No.NC_007779 REGION:complement(3078300..3080291)中。另外，例如可以在本发明中优选使用的大肠埃希氏菌的转醛醇酶基因的碱基序列记载在(例如)GenBank Accession No.NC_007779REGION:8238..9191中。

转酮醇酶的活性可以通过在木酮糖-5-磷酸和赤藓糖-4-磷酸存在下进行酶反应，并使用HPLC等测定生成的甘油醛-3-磷酸，或使用辅助的酶反应测定NADH的减少等来确认，例如，可以通过 Sprenger GA,Schorken U,Sprenger G,Sahm H.Transketolase A ofEscherichia coli K12.Purification and properties of the enzyme fromrecombinant strains.Eur J Biochem.1995Jun 1；230(2):525-32中公开的方法来测定。

转醛醇酶定义为催化景天庚酮糖-7-磷酸和甘油醛-3-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和果糖-6-磷酸的反应及其逆反应的酶。本发明中使用的转醛醇酶只要具有上述的催化活性即可，没有特别限制，例如 EC2.2.1.2是符合的。

转醛醇酶的活性可以通过在果糖-6-磷酸和赤藓糖-4-磷酸存在下进行酶反应，并使用HPLC等测定生成的甘油醛-3-磷酸，或使用辅助的酶反应测定NADH的减少等来确认，例如，可以通过 GA.Sprenger,U.Schorken,G.Sprenger&H.Sahm TransaldolaseB ofEscherichia coli K-12:cloning of its gene,talB,and characterization of theenzyme from recombinant strains).J.Bacteriol.,1995,177:20:5930-6)中记载的方法来测定。

成为转醛醇酶和/或转酮醇酶的供给体的生物可以使用(例如) 属于肠杆菌(Enterobacter)属、埃希氏菌(Escherichia)属、克雷伯菌(Klebsiella)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙门氏菌(Salmonella) 属等的肠内细菌科类，游动放线菌(Actinoplanes)属、节杆菌 (Arthrobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属等的放线菌类，或者芽孢杆菌(Bacillus)属、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属、乳酸杆菌 (Lactobacillus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、嗜热厌氧肠杆菌(Thermoanaerobacter)属、栖热菌(Thermus)属、黄单胞菌 (Xanthomonas)属、根瘤菌(Rhizobium)属、假单胞菌(Pseudomonas) 属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、拟杆菌(Bacteroides)属的微生物，优选为属于埃希氏菌属的微生物，更优选为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)。

发酵细菌属微生物只要具有同化五碳糖的能力即可，可以是引入了上述各基因中的至少一种的微生物，优选为引入了编码(1)木糖异构酶、(2)木酮糖激酶、以及(3)转醛醇酶和转酮醇酶中的至少一者的外源基因的微生物，更优选为引入了编码(1)木糖异构酶基因、(2)木酮糖激酶、以及(3)转醛醇酶和转酮醇酶两者的外源基因的微生物。

上述以外的微生物中具有木糖分解能力的微生物，此外虽因启动子部位或核糖体键合部位的异常等导致没有木糖分解能力、但其 DNA上编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶或转酮醇酶基因的微生物也可以用作供给体。

引入的基因也可以是不同的多种供给体的基因的组合。另外这些基因可以被引入到成为宿主的发酵细菌属细菌内的基因组DNA，也可以存在于载体上。

作为基因的引入方法没有特别限制，但作为存在于载体上的基因的引入方法，可以使用例如专利文献1和专利文献2中公开的方法。即，向市售的大肠菌用的克隆质粒载体(例如，pUC118等)的多克隆位点插入各基因，由此使转化大肠菌而产生各基因的产物的转化体增殖。从增殖的转化体回收质粒，将含有引入的各基因的区域切下，用插入于广宿主范围载体质粒(例如，pMFY31(Agric.Biol.Chem., Vol.49(9),2719-2724,1985等)的多克隆位点的质粒载体转化发酵细菌属细菌，从而可以制作具有同化五碳糖能力的发酵细菌属转化体。需要注意的是，作为广宿主范围载体质粒，也可以使用市售品。转化方法本身是公知的，例如，如专利文献1和专利文献2中所记载的，在含镁离子的T培养基(2.0重量％葡萄糖、1.0重量％Becto-酵母提取物、1.0重量％磷酸二氢钾、0.2重量％硫酸铵、0.05重量％七水硫酸镁、pH 6.0)等培养基中培养制成感受态细胞后，可通过电穿孔法等常规方法进行转化。具有木糖同化能力的转化体可以通过在以木糖为唯一的碳源的培养基中培养并选择转化处理后的细菌而得到。

在将引入基因引入至基因组DNA的情况下，可以使用例如Kirill A.Datsenko andBarry L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12using PCR products Proc Natl Acad Sci U S A.Jun 6,2000；97(12):6640-6645中公开的方法。

即使在发酵原料含五碳糖的情况下，除五碳糖以外也可以含有六碳糖。

五碳糖是构成糖的碳的个数为5的糖，也称为戊糖(Pentose)。有1位上带醛基的戊醛糖和2位上带酮基的戊酮糖。作为戊醛糖，可以列举木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖；作为戊酮糖，可以列举核酮糖、木酮糖。作为本发明中使用的五碳糖，只要微生物能同化即可，从在自然界的存在比率和获得难易度等观点来看，优选为木糖、阿拉伯糖，更优选为木糖。

六碳糖是构成糖的碳的个数为6的糖，也称为已糖(Hexose)。有1位上带醛基的醛糖和2位上带酮基的酮糖。作为醛糖，可以列举葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、古洛糖、塔罗糖等；作为酮糖，可以列举果糖、阿洛酮糖、山梨糖等。作为本发明中使用的六碳糖，只要微生物能同化即可，从在自然界的存在比率和获得难易度等观点来看，优选为葡萄糖、甘露糖、半乳糖，更优选为葡萄糖。

关于含五碳糖和六碳糖的发酵原料没有特别限定，优选使用已知含六碳糖和五碳糖两者的源于含纤维素生物质的糖液。含纤维素生物质中，作为例子可以列举甘蔗渣、柳枝稷、玉米秸秆、稻草、麦秸等草木类生物质，和树木、废建材等木质类生物质等。含纤维素生物质含有糖脱水缩合的多糖即纤维素或半纤维素，通过水解这样的多糖制造可用作发酵原料的糖液。源于含纤维素生物质的糖液的制造方法本身是公知的，任何方法皆可，作为这样的糖的制造方法，公开有使用浓硫酸将生物质酸水解来制造糖液的方法(特表平11-506934号公报、特开2005-229821号公报)、用稀硫酸水解处理生物质后进一步通过纤维素酶等的酶处理来制造糖液的方法(A.Aden等人、“LignocellulosicBiomass to Ethanol ProcessDesign and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis andEnzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002))。另外作为不使用酸的方法，公开有使用250～500℃左右的亚临界水将生物质水解从而制造糖液的方法(特开2003-212888号公报)，以及亚临界水处理生物质后进一步通过酶处理来制造糖液的方法(特开2001-95597号公报)，用240～280℃的加压热水水解处理生物质后，进一步通过酶处理制造糖液的方法(专利3041380号公报)。如上处理后，可提纯所得糖液。其方法在(例如)WO2010/067785中公开。

混合糖中所含的五碳糖和六碳糖的重量比没有特别限制，作为混合糖中的五碳糖和六碳糖的重量比若以(五碳糖):(六碳糖)表示的话，优选1:9～9:1。这是假设源于含纤维素生物质的糖液作为混合糖的情况下的糖比率。

本发明中使用的发酵原料所含的六碳糖浓度在上述的总糖浓度、五碳糖与六碳糖的比例的范围内没有特别限制，但使用本发明的 2,3-BDO的制造方法的话，含有浓度5g/L以上的六碳糖的混合糖液也可以得到良好的产率。

在发酵原料含有五碳糖的情况下也与上述相同，发酵原料中，除了上述糖以外，也可以适当含有对2,3-丁二醇发酵微生物的发酵有好的作用的可同化的碳源、可同化的氮源、无机盐类、以及根据需要的氨基酸和维生素等有机微量养分。另外，为了高效地进行发酵也可以含有适当的消泡剂。

在发酵原料含有五碳糖的情况下，作为可同化的氮源的具体例子，与上述相同，可使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、氨基酸、其它辅助使用的有机氮源，如油渣、大豆水解液、酪蛋白水解物、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、蛋白胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。作为无机盐类，可以适当添加使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐、锌盐等。为了通过五碳糖的发酵制造2,3- 丁二醇，这些当中，优选玉米浆，硫酸铵或磷酸氢二铵这样的铵盐，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵这样的磷酸盐，氯化钙这样的钙盐，硫酸亚铁这样的铁盐，硫酸锰这样的锰盐，硫酸锌这样的锌盐，硫酸镁这样的镁盐，EDTA二钠盐这样的EDTA或其盐。

在发酵原料含有五碳糖的情况下，与上述相同，根据微生物的生长可向培养基中适当添加使用烟酸，另外，也可以适当添加使用消泡剂。

在发酵原料含有五碳糖作为可同化的碳源，且培养具有同化五碳糖能力的发酵细菌属微生物的情况下，培养温度、培养时的pH、微生物的培养形态、通气条件和向培养基供给氧的条件包括各自的优选条件在内均与上述相同。

在通过2,3-丁二醇发酵步骤得到的培养液中除了2,3-丁二醇还含有源于发酵原料的杂质或发酵副产物的乙醇等，因此后面的工序中提纯培养液中所含的2,3-丁二醇是必要的。

提纯步骤

从2,3-丁二醇培养液中提纯2,3-丁二醇的步骤没有特别限制，通过本领域技术人员公知的方法进行即可，本发明中优选包括蒸馏2,3- 丁二醇培养液的步骤。

在2,3-丁二醇培养液的蒸馏中，将2,3-丁二醇从蒸气侧回收。蒸馏法没有特别限定，可为通常使用的单蒸馏或精馏、常压蒸馏或减压蒸馏的任一种，可以选自薄膜蒸馏装置或板式(棚段式)蒸馏装置、填充式蒸馏装置等。另外，分批式和连续式均适用于本发明。其中优选的是减压蒸馏，由于可以降低沸点，因此能抑制杂质的产生。具体而言，优选在60℃以上150℃以下的加热温度下进行。不到60℃的情况必须显著降低减压度，因此工业水平下装置的维持变得非常困难。另外，高于150℃的情况下，2,3-丁二醇溶液中残留的微量的糖等发生分解，并产生着色性物质的副产物，故不优选。因此，以在上述加热温度范围内使得2,3-丁二醇蒸馏出来的方式调节减压度。

需要说明的是，2,3-丁二醇培养液可直接供给到蒸馏步骤，但优选在蒸馏步骤之前先供给脱盐步骤或浓缩步骤。

作为脱盐步骤的具体例子，可以列举离子交换处理。离子交换处理是使用离子交换体除去2,3-丁二醇培养液中的离子成分的方法。作为离子交换体，可以使用离子交换树脂、离子交换膜、离子交换纤维、离子交换纸、凝胶离子交换体、液体离子交换体、沸石、碳离子交换体、蒙脱石，但本发明中优选采用使用离子交换树脂的处理。

离子交换树脂中根据其官能团的不同，有强阴离子交换树脂、弱阴离子交换树脂、强阳离子交换树脂、弱阳离子交换树脂、螯合交换树脂等。例如，强阴离子交换树脂选自“オルガノ株式会社”制造的“アンバーライト”IRA410J、IRA411、IRA910CT或“三菱化学株式会社”制造的“ダイヤイオン”SA10A、SA12A、SA11A、NSA100、 SA20A、SA21A、UBK510L、UBK530、UBK550、UBK535、UBK555 等。另外，弱阴离子交换树脂有“オルガノ株式会社”制造的“アンバーライト”IRA478RF、IRA67、IRA96SB、IRA98、XE583或“三菱化学株式会社”制造的“ダイヤイオン”WA10、WA20、WA21J、WA30 等。另一方面，强阳离子交换树脂除了“オルガノ株式会社”制造的“アンバーライト”IR120B、IR124、200CT、252以外，还有“三菱化学株式会社”制造的“ダイヤイオン”SK104、SK1B、SK110、SK112、 PK208、PK212、PK216、PK218、PK220、PK228等；作为弱阳离子交换树脂，可以选自“オルガノ株式会社”制造的“アンバーライト”FPC3500、IRC76或“三菱化学株式会社”制造的“ダイヤイオン” WK10、WK11、WK100、WK40L等。

本发明中，作为离子交换树脂优选组合使用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂，其中，使用能除去多种离子的强阴离子交换树脂和强阳离子交换树脂较好。另外，阴离子交换树脂优选通过氢氧化钠等稀碱性水溶液再生，并作为OH型使用，阳离子交换树脂的情况下优选通过盐酸等稀酸性水溶液再生，并作为H型使用。利用离子交换树脂的脱盐方法可以是分批法也可以是柱式法，只要是能高效脱盐的方法即可，没有特别限制。然而，在制造过程中，优选采用容易反复使用的柱式法。通液速度通常用SV(空间速度)控制，优选SV＝2～50，更优选以能更高度提纯的SV＝2～10进行通液。树脂为市售的凝胶型、多孔型、高度多孔型、MR型等种类，这些离子交换树脂的形状可以是任意一种，可配合溶液的品质选择最合适的形状。

另外，作为脱盐步骤的具体例子也可以列举纳滤膜处理。2,3- 丁二醇培养液的纳滤膜处理如(例如)特开2010-150248号公报中公开的那样，通过使2,3-丁二醇培养液通过纳滤膜进行过滤，从而可以高效地分离为在透过液侧为2,3-丁二醇，而在非透过液侧为无机盐、糖类和着色成分。

作为纳滤膜的材料，除了哌嗪聚酰胺或聚酰胺、醋酸纤维素、聚乙烯醇、聚酰亚胺、聚酯等聚合物类材料以外，还可以使用陶瓷等无机材料。另外，纳滤膜通常除了螺旋型的膜元件以外，还用作平膜或中空纤维膜，但本发明中所用的纳滤膜优选使用螺旋型的膜元件。

作为本发明中使用的纳滤膜元件的优选的具体例子，可以列举 (例如)醋酸纤维素类的纳滤膜GE Osmonics社制造的纳滤膜“GEsepa”，将聚酰胺作为功能层的“アルファラバル社”制造的纳滤膜NF99或NF99HF，将交联哌嗪聚酰胺作为功能层的“フィルムテック社”制造的纳滤膜NF-45、NF-90、NF-200或NF-400，或包括“東レ株式会社”制造的UTC60在内的同一公司制造的纳滤膜元件SU-210、 SU-220、SU-600或SU-610，其中优选将聚酰胺作为功能层的“アルファラバル社”制造的纳滤膜NF99或NF99HF，将交联哌嗪聚酰胺作为功能层的“フィルムテック社”制造的纳滤膜NF-45、NF-90、NF-200 或NF-400，或包括“東レ株式会社”制造的UTC60在内的同一公司制造的纳滤膜组件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，更优选将交联哌嗪聚酰胺作为主成分的、包括“東レ株式会社”制造的UTC60在内的同一公司制造的纳滤膜元件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610。

利用纳滤膜进行的过滤可以加压，其过滤压在0.1MPa以上8 MPa以下的范围内优选使用。过滤压低于0.1MPa的话膜透过速度低下，高于8MPa的话存在对膜的损伤有影响的担忧。另外，使用0.5 MPa以上7MPa以下的过滤压的话，膜透过通量高，因此可以高效地透过2,3-丁二醇发酵液，且对膜的损伤有影响的可能性小，故优选，特别优选在1MPa以上6MPa以下使用。

通过纳滤膜过滤的2,3-丁二醇溶液的2,3-丁二醇浓度没有特别限定，但高浓度的话透过液中所含的2,3-丁二醇浓度也高，因此可以减少浓缩时的能量，也适于削减成本。

脱盐步骤中，可进行离子交换处理或纳滤膜处理的任一种，也可以将它们组合使用，优选至少进行离子交换处理。另外，组合使用离子交换处理和纳滤膜处理的情况下的顺序没有特别限制，优选对从纳滤膜处理2,3-丁二醇培养液的透过液侧得到的无机盐减少了的2,3- 丁二醇培养液进行离子交换处理。由此，通过离子交换树脂除去部分通过纳滤膜的无机盐或有机酸，从而可以提高无机盐类的去除率。

作为2,3-丁二醇培养液的浓缩方法，本领域技术人员公知的一般方法即可，可以列举(例如)使用反渗透膜的方法、或通过蒸发器加热浓缩等，优选适用使用反渗透膜的方法。

使用反渗透膜的方法是这样的浓缩方法：将2,3-丁二醇溶液通过反渗透膜进行过滤从而使水透过到透过液一侧，而2,3-丁二醇保留在膜的非透过液一侧。作为在本发明中优选使用的反渗透膜，可以列举以醋酸纤维素类的聚合物作为功能层的复合膜(以下，也称为醋酸纤维素类的反渗透膜)或以聚酰胺作为功能层的复合膜(以下，也称为聚酰胺类的反渗透膜)。这里，作为醋酸纤维素类的聚合物，可以列举醋酸纤维素、二醋酸纤维素、三醋酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素等纤维素的有机酸酯自身，或使用了其混合物及混合酯的聚合物。作为聚酰胺，可以列举以脂肪族和/或芳香族的二胺为单体的线型聚合物或交联聚合物。作为膜形态，可以使用平膜型、螺旋型、中空纤维型等适合的形态。

作为在本发明中使用的反渗透膜的具体例子，可以列举(例如) “東レ株式会社”制造的聚酰胺类反渗透膜组件的低压型的SU-710、 SU-720、SU-720F、SU-710L、SU-720L、SU-720LF、SU-720R、SU-710P、 SU-720P，除此以外，高压型的SU-810、SU-820、SU-820L、SU-820FA，同一公司的醋酸纤维素类反渗透膜SC-L100R、SC-L200R、SC-1100、 SC-1200、SC-2100、SC-2200、SC-3100、SC-3200、SC-8100、SC-8200，“日東電工株式会社”制造的NTR-759HR、NTR-729HF、NTR-70SWC、 ES10-D、ES20-D、ES20-U、ES15-D、ES15-U、LF10-D，“アルファラバル”制造的RO98pHt、RO99、HR98PP、CE4040C-30D，GE制造的“GESepa”，Filmtec制造的BW30-4040、TW30-4040、XLE-4040、 LP-4040、LE-4040、SW30-4040、SW30HRLE-4040等。

利用反渗透膜进行的浓缩施加压力进行，其过滤压低于1MPa 的话膜透过速度低下，高于8MPa的话对膜的损伤有影响，因此优选为1MPa以上8MPa以下的范围。另外，若过滤压在1MPa以上 7MPa以下的范围，则膜透过通量较高，因此可以高效地浓缩2,3- 丁二醇溶液。从对膜的损伤有影响的可能性小的角度考虑，最优选为 2MPa以上6MPa以下的范围。对低浓度的2,3-丁二醇溶液而言使用反渗透膜的方法成本低，故优选。

此外，在上述步骤之前，优选包括分离2,3-丁二醇培养液中所含的菌体的步骤。作为菌体的分离步骤，可以使用(例如)离心分离、过滤分离等方法。这些方法可以仅使用任意一者，也可以组合使用。

由本发明制造的2,3-丁二醇溶液的特征为高纯度。作为测定2,3- 丁二醇中所含杂质的方法，可以组合使用利用气相色谱法(GC)进行的纯度测定和使用高效液相色谱法(HPLC)通过UV检测进行的纯度测定等进行评价，其以全部检测峰面积中的2,3-丁二醇面积的比例进行评价，因此比例越高意味着2,3-丁二醇纯度越高。

[实施例]

以下，列举实施例对本发明进行具体说明。然而，本发明并不限定于此。

参考例1 kLa测定

向培养装置(“エイブル株式会社”制造，罐容量1.5L)中插入溶解氧电极(“エイブル株式会社”制造)，测定各通气搅拌条件下的溶解氧浓度，并通过使用氮气的动力学方法求出kLa。首先，向培养槽中倒入1L水，一边将水温调节至30℃一边以一定的速度搅拌以将氮气充分吹入水中，在电极值为最低值时进行溶解氧电极的零点校准。其后在将通入气体从氮气切换成预定通气速度的空气或氮气后，测定溶解氧浓度随时间的变化从而求得kLa。所得的对应于各通气搅拌条件的kLa在表1中示出。

表1

通气速度(vvm)	搅拌速度(rpm)	kLa(h<sup>-1</sup>)
			0.1(氮气)	400	0
0.025	400	9
			0.2	400	17
0.6	400	28
			0.6	500	57

实施例1～6：kLa

<2,3-丁二醇发酵>

将棕榈发酵细菌(Z.palmae)ATCC51623株在加入了5mL T培养基(20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH₂PO₄、2g/L (NH₄)₂SO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、pH 6.0)的试管中于30℃下进行 24小时静置培养，作为预预培养。将该预预培养的培养液全部添加到加入了50mL T培养基的锥形瓶后，于30℃下进行16小时静置培养，作为预培养。将预培养液添加到1L表2所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中，并一边用氢氧化钾中和至pH成为5.5，一边于温度30℃下以表1记载的kLa进行培养。使用自动取样器(“エイブル株式会社”制造)自培养开始后每隔2小时进行培养液的采集，最大到40小时为止，并测定采集的培养液中的葡萄糖浓度和2,3-丁二醇浓度。

表2

单位(1/L)

下面示出利用高效液相色谱(HPLC，“株式会社島津製作所”制造)的各个浓度测定条件。发酵后的2,3-丁二醇浓度、葡萄糖浓度、发酵产率通过以下的测定方法求出。

2,3-丁二醇浓度测定

色谱柱：Shodex Sugar SH1011(“昭和電工株式会社”制造)

柱温：65℃

流动相：0.05M硫酸水溶液，0.6mL/min

检测：RI。

葡萄糖浓度测定

色谱柱：Asahipak NH2P50 4E(“昭和電工株式会社”制造)

柱温：30℃

流动相：水:乙腈＝1:3，0.6mL/min

检测：RI。

发酵产率

由利用上述HPLC分析测定的2,3-丁二醇浓度和葡萄糖浓度，用下式计算。

发酵产率(％)＝100×{(培养液中2,3-丁二醇浓度)-(培养基中2,3- 丁二醇浓度)}/{(培养基中葡萄糖浓度)-(培养液中葡萄糖浓度)}。

将培养液中的葡萄糖浓度最接近0的时刻的培养液中的2,3-丁二醇浓度和葡萄糖浓度、发酵产率示于表3中。回收所得的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15分钟后将上清液用微滤膜 (“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L的2,3-丁二醇培养液。

<2,3-丁二醇培养液的离子交换提纯>

通过离子交换处理对由上述发酵试验得到的培养液进行残留离子的除去。使用强阴离子交换树脂IRA120J(“株式会社オルガノ”制造)和强阳离子交换树脂IR410(“株式会社オルガノ”制造)，分别利用1N氢氧化钠和1N盐酸再生为OH型和H型使用。树脂量以各种无机盐和有机酸的总量与离子交换树脂的交换容量成为等量的方式算出。将上述离子交换树脂填充在色谱柱中，按照阴离子交换、阳离子交换的顺序以SV＝5的通液速度进行通液。

<2,3-丁二醇的蒸馏提纯>

离子交换处理后的2,3-丁二醇溶液通过薄膜浓缩装置MF-10 (“東京理化器械株式会社”制造)除去水。此时，在减压度为30hPa、加热温度为60℃下使水蒸发。减压蒸馏(5mmHg)浓缩后的2,3-丁二醇溶液，得到提纯的2,3-丁二醇。蒸馏后的2,3-丁二醇的GC纯度、蒸馏产率通过以下的测定方法求得。

GC纯度

利用气相色谱(GC、“株式会社島津製作所”制造)分析蒸馏后的2,3-丁二醇，由全部检测峰面积中的2,3-丁二醇峰面积的比例通过下式计算。

GC纯度(％)＝100×(2,3-丁二醇峰面积)/(全部检测峰面积)。

气相色谱的分析条件如下所示。

色谱柱：RT-BDEXM(0.25mm×30m，“Restek社”制造)

柱温：75℃

气化室、检测器温度：230℃

载气：He

线速度：35cm/sec

检测：氢火焰离子化检测器(FID)。

蒸馏产率

由通过HPLC分析测定的2,3-丁二醇浓度、从装填液体量算出的蒸馏前的2,3-丁二醇装填量，与蒸馏后的馏出液体量、及从上述的GC纯度算出的2,3-丁二醇回收量，通过下式计算。

蒸馏产率(％)＝100×{(蒸馏后的馏出液体量)×(GC纯度)}/{(蒸馏前2,3-丁二醇浓度)×(蒸馏前的装填液体量)}。

2,3-丁二醇总产率

由根据发酵步骤的结果算出的发酵产率和根据提纯步骤的结果算出的蒸馏产率，通过下式计算。结果在表3中示出。

2,3-丁二醇总产率(g/g糖)＝(发酵产率)/100×(蒸馏产率)/100。

表3

实施例7～11：pH

将Z.palmae ATCC51623株用实施例1～6记载的预预培养方法和预培养方法进行培养。将预培养液添加到1L表2所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中，并一边用氢氧化钾中和至pH分别为4.5、4.8、5.2、 5.5、6.1、6.5中的任一者，一边在通气速度0.2vvm、搅拌速度400rpm、温度30℃下进行培养。使用自动取样器(“エイブル株式会社”制造) 自培养开始后每隔2小时进行培养液的采集，最大到40小时为止，并用实施例1～6记载的方法测定采集的培养液中的葡萄糖浓度和2,3-丁二醇浓度。培养液中的葡萄糖浓度最接近0的时刻的培养液中的2,3- 丁二醇浓度和葡萄糖浓度、发酵产率在表4中示出。回收发酵试验后的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15分钟后将上清液用微滤膜(“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L的2,3-丁二醇培养液。对所得的培养液用实施例1～6记载的方法进行脱盐和蒸馏处理，得到提纯的2,3-丁二醇。将通过实施例1～6记载的方法求取蒸馏后的2,3-丁二醇的GC纯度、蒸馏产率的结果在表4中示出。

表4

实施例12～16：糖浓度

将Z.palmae ATCC51623株用实施例1～6记载的预预培养方法和预培养方法进行培养。将预培养液添加到1L葡萄糖浓度分别调节为 12、20、100、180、250g/L之一的表2所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中，并一边用氢氧化钾中和至pH成为5.5，一边在通气速度0.2vvm、搅拌速度400rpm、温度30℃下进行培养。使用自动取样器(“エイブル株式会社”制造)自培养开始后每隔2～8小时进行培养液的采集，并用实施例1～6记载的方法测定采集的培养液中的葡萄糖浓度和2,3- 丁二醇浓度。培养液中的葡萄糖浓度最接近0的时刻的培养液中的 2,3-丁二醇浓度和葡萄糖浓度、发酵产率在表5中示出。回收发酵试验后的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15分钟后将上清液用微滤膜(“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L的2,3-丁二醇培养液。对所得的培养液用实施例1～6记载的方法进行脱盐和蒸馏处理，得到提纯的2,3-丁二醇。将通过实施例1～6记载的方法求取蒸馏后的2,3-丁二醇的GC纯度、蒸馏产率的结果在表5中示出。

表5

实施例17～31

对在专利文献1和专利文献2中记载的转化株细胞内的4种酶基因的表达进行了确认。需要说明的是，该转化株根据布达佩斯条约自2004年6月30日起已保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，其保藏号为FERM BP-10048。由于专利文献2 已成为美国专利第7,569,379号，因而该转化株已经可以分售。

实施例17～21：kLa

<2,3-丁二醇发酵>

作为赋予了木糖同化的发酵细菌属微生物，使用了专利文献1 和2公开的Zymobacter palmae[pMFY31-xt]。Zymobacter palmae [pMFY31-xt]是利用引入了编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的外源基因的广宿主范围重组质粒载体对Zymobacter palmae进行转化而制造的公知的转化体，如上所述，已根据布达佩斯条约以FERM BP-10048的保藏号进行保藏，是可以分售的转化体。将Z.palmae[pMFY31-xt]在加入了5mL含100μg/mL氨苄青霉素的 TX培养基(40g/L木糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH₂PO₄、2g/L (NH₄)₂SO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、pH 6.0)的试管中于30℃下进行 24小时静置培养。将该培养液全部添加到加入了50mL TX培养基的锥形瓶后，于30℃下进行24小时静置培养。将该培养液全部添加到1 L表6所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中，并一边用氢氧化钾中和至 pH 5.5，一边于温度30℃下以表1记载的通气搅拌·条件进行培养。在培养中采集适当的培养液，并测定木糖浓度和2,3-丁二醇浓度。

表6

单位(1/L)

下面示出利用高效液相色谱(HPLC，“株式会社島津製作所”制造)的各个浓度测定条件。发酵后的2,3-丁二醇浓度、糖浓度、发酵产率通过以下的测定方法求出。

2,3-丁二醇浓度测定

色谱柱：Shodex Sugar SH1011(“昭和電工株式会社”制造)

柱温：65℃

流动相：0.05M硫酸水溶液，0.6mL/min

检测：RI。

糖浓度测定

色谱柱：Asahipak NH2P50 4E(“昭和電工株式会社”制造)

柱温：30℃

流动相：水:乙腈＝1:3，0.6mL/min

检测：RI。

发酵产率

由利用上述HPLC分析测定的2,3-丁二醇浓度和糖浓度，用下式计算。

发酵产率(％)＝100×{(培养液中2,3-丁二醇浓度)-(培养基中 2,3-丁二醇浓度)}/{(培养基中糖浓度)-(培养液中糖浓度)}。

培养液中的木糖浓度最接近0的时刻的培养液中的2,3-丁二醇浓度和木糖浓度、发酵产率在表7中示出。回收所得的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15分钟后将上清液用微滤膜(“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L的2,3-丁二醇培养液。

<2,3-丁二醇培养液的离子交换提纯>

通过离子交换处理对由上述发酵试验得到的培养液进行残留离子的除去。使用强阴离子交换树脂IRA120J(“株式会社オルガノ”制造)和强阳离子交换树脂IR410(“株式会社オルガノ”制造)，分别通过1N氢氧化钠和1N盐酸再生为OH型和H型使用。树脂量以各种无机盐和有机酸的总量与离子交换树脂的交换容量成为等量的方式算出。将上述离子交换树脂填充在色谱柱中，按照阴离子交换、阳离子交换的顺序以SV＝5的通液速度进行通液。

<2,3-丁二醇的蒸馏提纯>

GC纯度

用气相色谱(GC、“株式会社島津製作所”制造)分析蒸馏后的2,3-丁二醇，由全部检测峰面积中的2,3-丁二醇峰面积的比例通过下式计算。

GC纯度(％)＝100×(2,3-丁二醇峰面积)/(全部检测峰面积)。

气相色谱的分析条件如下所示。

色谱柱：RT-BDEXM(0.25mm×30m，“Restek社”制造)

柱温：75℃

气化室、检测器温度：230℃

载气：He

线速度：35cm/sec

检测：氢火焰离子化检测器(FID)。

蒸馏产率

由通过HPLC分析测定的2,3-丁二醇浓度、从装填液体量算出的蒸馏前的2,3-丁二醇装填量，与蒸馏后的馏出液体量及从上述的 GC纯度算出的2,3-丁二醇回收量，通过下式计算。

2,3-丁二醇总产率

由根据发酵步骤的结果算出的发酵产率和根据提纯步骤的结果算出的蒸馏产率，通过下式计算。结果在表7中示出。

2,3-丁二醇总产率(g/g糖)＝(发酵产率)/100×(蒸馏产率)/100。

表7

实施例22～25：pH

将Z.palmae[pMFY31-xt]用实施例17～21记载的方法进行培养。将烧瓶培养的培养液添加到1L表6所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中，并一边用氢氧化钾中和至pH分别为4.5、4.8、6.1、6.5中的任一者，一边在通气速度0.2vvm、搅拌速度400rpm、温度30℃下进行培养。在培养中采集适当的培养液，并用实施例17～21记载的方法测定木糖浓度和2,3-丁二醇浓度。培养液中的木糖浓度最接近0的时刻的培养液中的2,3-丁二醇浓度和木糖浓度、发酵产率在表8中示出。回收发酵试验后的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15 分钟后将上清液用微滤膜(“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L的2,3-丁二醇培养液。对所得的培养液用实施例17～21记载的方法进行脱盐和蒸馏处理，得到提纯的 2,3-丁二醇。将通过实施例17～21记载的方法求取蒸馏后的2,3-丁二醇的GC纯度、蒸馏产率的结果在表8中示出。

表8

实施例26～28：糖浓度

将Z.palmae[pMFY31-xt]用实施例17～21记载的方法进行培养。将烧瓶培养的培养液添加到1L木糖浓度分别调节为5.0、15、100g/L 之一的表6所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中，并一边用氢氧化钾中和至pH 5.5，一边在通气速度0.2vvm、搅拌速度400rpm、温度30℃下进行培养。在培养中采集适当的培养液，并用实施例17～21记载的方法测定木糖浓度和2,3-丁二醇浓度。培养液中的木糖浓度最接近0 的时刻的培养液中的2,3-丁二醇浓度和木糖浓度、发酵产率在表9中示出。回收发酵试验后的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15分钟后将上清液用微滤膜(“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L的2,3-丁二醇培养液。对所得的培养液用实施例17～21记载的方法进行脱盐和蒸馏处理，得到提纯的2,3-丁二醇。通过实施例17～21记载的方法求取蒸馏后的 2,3-丁二醇的GC纯度、蒸馏产率的结果在表9中示出。

表9

实施例29～31：五碳糖比率

将Z.palmae[pMFY31-xt]用实施例17～21记载的方法进行培养。将烧瓶培养的培养液添加到1L木糖和葡萄糖的浓度(g/L)分别调节为(40:20)、(20:40)、(2.5:40)之一的表6所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中，并一边用氢氧化钾中和至pH成为5.5，一边在通气速度0.2vvm、搅拌速度400rpm、温度30℃下进行培养。在培养中采集适当的培养液，并用实施例17～21记载的方法测定糖浓度和2,3-丁二醇浓度。培养液中的糖浓度最接近0的时刻的培养液中的2,3-丁二醇浓度和糖浓度、发酵产率在表10中示出。回收发酵试验后的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15分钟后将上清液用微滤膜(“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L 的2,3-丁二醇培养液。对所得的培养液用实施例17～21记载的方法进行脱盐和蒸馏处理，得到提纯的2,3-丁二醇。通过实施例17～21记载的方法求取蒸馏后的2,3-丁二醇的GC纯度、蒸馏产率的结果在表10 中示出。

表10

实施例32～35：有机氮源

将Z.palmae ATCC51623株用实施例1～6记载的预预培养方法和预培养方法进行培养。将预培养液添加到1L用表11所示的各种有机氮源替换表2所示组成的2,3-丁二醇发酵培养基中的玉米浆的培养基中，并一边用氢氧化钾中和至pH成为5.5，一边在通气速度0.2vvm、搅拌速度400rpm、温度30℃下进行培养。使用自动取样器(“エイブル株式会社”制造)自培养开始后每隔2～4小时进行培养液的采集，并用实施例1～6记载的方法测定采集的培养液中的葡萄糖浓度和2,3- 丁二醇浓度。培养液中的葡萄糖浓度最接近0的时刻的培养液中的 2,3-丁二醇浓度和葡萄糖浓度、发酵产率在表12中示出。回收发酵试验后的2,3-丁二醇培养液，并在4℃、8000rpm下离心15分钟后将上清液用微滤膜(“東レ株式会社”制造)过滤，除去菌体。将上述步骤进行2次，得到共计2L的2,3-丁二醇培养液。对所得的培养液用实施例1～6记载的方法进行脱盐和蒸馏处理，得到提纯的2,3- 丁二醇。通过实施例1～6记载的方法求取蒸馏后的2,3-丁二醇的GC 纯度、蒸馏产率的结果在表12中示出。

任意有机氮源均得到了良好的2,3-BDO产率，但使用了实施例 4中所示的玉米浆的情况下2,3-BDO产率最高。

表11

有机氮源	浓度(g/L，以固体含量计)
		大豆水解物	15
动物组织水解物	15
		酪蛋白水解物	15
酶提取物	15

表12

工业实用性

通过本发明的方法得到的2,3-丁二醇(2,3-BDO)是可用作药品和化妆品的中间体原料、以及墨水、香水、液晶、杀虫剂、软化剂、炸药、增塑剂等的原料的化合物。

Claims

1.一种2,3-丁二醇的制造方法，包括：

步骤A：在含有碳源的发酵原料中培养发酵细菌(Zymobacter)属微生物的步骤，以及

步骤B：从步骤A所得的培养液中提纯2,3-丁二醇的步骤，

所述步骤A是在体积氧传递系数(kLa)9h^-1以上以及pH 5～7的条件下的培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微生物为棕榈发酵细菌(Zymobacterpalmae)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤A是在总糖浓度20g/L以上的培养基中的培养。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述碳源含有五碳糖，并且所述发酵细菌属微生物具有同化五碳糖的能力。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述微生物是引入了编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶中的至少一种酶的外源基因的发酵细菌属的转化微生物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述微生物是引入了编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的外源基因的发酵细菌属的转化微生物。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤A的发酵原料中所含的五碳糖是木糖。

8.根据权利要求4所述的方法，其中，木糖相对于所述发酵原料中的总糖的存在比率为5～100％。

9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述发酵原料含有源自生物质的糖液。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤A的发酵原料含有玉米浆。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤B包括蒸馏步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述蒸馏步骤前包括脱盐处理步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，作为所述脱盐处理步骤包括离子交换处理步骤。