CN117603863A - 一种发酵生产l-丝氨酸的培养基及发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产L‑丝氨酸的培养基及发酵生产方法，包括果葡糖浆、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、柠檬酸、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、甲硫氨酸、柠檬酸铁和消泡剂。本发明通过用果葡糖浆作为发酵碳源，果糖代替部分葡萄糖，通过果糖进入糖酵解途径维持生物量增长，有利于产酸积累，提高了糖酸转化率。发明通过在发酵培养基中同时添加甲硫氨酸和柠檬酸铁，将发酵液中副产物乙酸积累量降低至0.5g/L以下，能提高发酵水平，减少了由于副产物乙酸高而造成的发酵倒罐。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种发酵生产L-丝氨酸的培养基及发酵生产方法。
背景技术
丝氨酸，又名β-羟基丙氨酸，化学式为C3H7NO3，因最早来源于蚕丝而得名，丝氨酸是中性脂肪族含羟基氨基酸，是一种非必需氨基酸，丝氨酸参与合成胞内生物物质嘌呤、嘧啶、磷脂等的重要前体，在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。主要用于复方氨基酸制剂中，用于补充氨基酸。L-丝氨酸作为一种组成蛋白的基本氨基酸广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。L-丝氨酸是复方氨基酸输液的原料，亦可作为轻化工业的原料。此外，因L-丝氨酸具有特殊的润湿性和保湿性，在国内外被大量用于高级化妆品中。生产方法通常有发酵法、蛋白质水解提取法、化学合成法、生物酶法等。后两种成本高，污染大，大规模应用受到限制。目前，发酵法生产L-丝氨酸已进入大规模工业化生产阶段，主要以大肠杆菌为生产菌生产L-丝氨酸，但该方法依然存在以下问题：
(1)L-丝氨酸的合成需要碳源进入糖酵解途径提供中间产物和通过TCA途径来提供能量，同时需要足够的碳源进入戊糖磷酸途径合成L-丝氨酸。传统发酵工艺底糖采用葡萄糖，但是高浓度葡萄糖会促进糖酵解途径代谢通量增加，使碳源大量进入糖酵解途径，生成乙酸等发酵副产物，而进入戊糖磷酸途径偏少。因此，传统工艺中高浓度葡萄糖不利于产酸积累，糖酸转化率低。
(2)用大肠杆菌发酵生成L-丝氨酸，中期很容易积累乙酸，乙酸浓度达到2g/L以上，发酵OD基本不增长，耗糖能力大幅度下降大肠杆菌是基因工程常用的宿主菌，但在大肠杆菌发酵培养过程中会产生一些有害的副产物，危害较大且最为常见的是乙酸。乙酸浓度达到2g/L以上，发酵OD基本不增长，耗糖能力大幅度。目前大肠杆菌发酵降低副产物乙酸的常用措施为控制溶氧水平、初糖浓度、补料的限制性流加方式等，这些措施在L-丝氨酸发酵控制过程中效果甚低。
发明内容
本发明的目的是要提供一种发酵生产L-丝氨酸的培养基及发酵生产方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明发酵生产L-丝氨酸的培养基包括果葡糖浆、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、柠檬酸、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、甲硫氨酸、柠檬酸铁和消泡剂。
进一步，培养基含果葡糖浆10-30g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2-6g/L，柠檬酸1-4g/L，硫酸镁2-6g/L，磷酸二氢钾3-8g/L，磷酸氢二铵2-5g/L，甲硫氨酸1-4g/L，柠檬酸铁0.1-0.3g/L，消泡剂0.2-0.7g/L。
优选的，所述果葡糖浆为F55型果葡糖浆。
本发明所述培养基发酵生产L-丝氨酸的方法，包括以下步骤：
S1：将L-丝氨酸生产菌种培育制备L-丝氨酸种子液：
将L-丝氨酸生产菌种接种至种子培养基中，制备成发酵种子液；将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到L-丝氨酸种子液；其中，培养温度为30-37℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa。
S2：将L-丝氨酸种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到L-丝氨酸发酵液；发酵过程控制溶氧在20-60％。具体为：将所述L-丝氨酸种子液以10-20％接种量接入所述发酵培养基中，培养温度为30-38℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；当所述发酵培养基中残糖水平低于20g/L时，开始流加果葡糖浆溶液，将残糖维持在0.5g/L以下，总发酵时间为36-48h，制备得到L-丝氨酸发酵液。
优选的，所述L-丝氨酸生产菌种为大肠杆菌。
本发明的有益效果是：
本发明是一种发酵生产L-丝氨酸的培养基及发酵生产方法，与现有技术相比，本发明通过用果葡糖浆作为发酵碳源，果糖代替部分葡萄糖，通过果糖进入糖酵解途径维持生物量增长，有利于产酸积累，提高了糖酸转化率。发明通过在发酵培养基中同时添加甲硫氨酸和柠檬酸铁，将发酵液中副产物乙酸积累量降低至0.5g/L以下，能提高发酵水平，减少了由于副产物乙酸高而造成的发酵倒罐。
具体实施方式
下面以及具体实施例对本发明作进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1：一种用于发酵生产L-丝氨酸的发酵培养基，其包括如下组分：F55型果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L。
实施例2：利用实施例1中的发酵培养基发酵生产L-丝氨酸的方法，其包括如下步骤：
(1)将L-丝氨酸生产菌种培育制备L-丝氨酸种子液；具体包括：将L-丝氨酸生产菌种接种至种子培养基中，制备成发酵种子液；将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到L-丝氨酸种子液；其中，培养温度为37℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；其中，种子培养基包括如下组分：F55型果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L；本实施例中，L-丝氨酸生产菌种为大肠杆菌。种子罐培养基灭菌温度为123℃，时间25min。
(2)将L-丝氨酸种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到L-丝氨酸发酵液；具体包括：将L-丝氨酸种子液以15％接种量接入发酵培养基中，培养温度为35℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；当发酵培养基中残糖耗尽时，开始流加果葡糖浆溶液，将残糖维持在0.5g/L以下，总发酵时间为40h，制备得到L-丝氨酸发酵液；发酵过程控制溶氧在20-60％。发酵培养基包括如下组分：培养温度为35℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；其中，种子培养基包括如下组分：F55型果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L。本实施例所用果葡糖浆为F55型果葡糖浆，即果葡糖浆中含果糖的质量百分比浓度为55％。
按本实施例方法重复3次，测定发酵液中的L-丝氨酸含量，发酵指标见下表1。
实施例3：一种用于发酵生产L-丝氨酸的发酵培养基，其特征在于，其包括如下组分：F42果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L。
实施例4：利用实施例3中的发酵培养基发酵生产L-丝氨酸的方法，其包括如下步骤：
(1)将L-丝氨酸生产菌种培育制备L-丝氨酸种子液；具体包括：将L-丝氨酸生产菌种接种至种子培养基中，制备成发酵种子液；将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到L-丝氨酸种子液；其中，培养温度为37℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；其中，种子培养基包括如下组分：F42型果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L；本实施例中，L-丝氨酸生产菌种为大肠杆菌。种子罐培养基灭菌温度为123℃，时间25min。
(2)将L-丝氨酸种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到L-丝氨酸发酵液；具体包括：将L-丝氨酸种子液以15％接种量接入发酵培养基中，培养温度为35℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；当发酵培养基中残糖耗尽时，开始流加果葡糖浆溶液，将残糖维持在0.5g/L以下，总发酵时间为40h，制备得到L-丝氨酸发酵液；发酵过程控制溶氧在20-60％。发酵培养基包括如下组分：培养温度为35℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；其中，种子培养基包括如下组分：F55型果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L。本实施例所用果葡糖浆为F42型果葡糖浆，即果葡糖浆中含果糖的质量百分比浓度为42％。
按本实施例方法重复3次，测定发酵液中的L-丝氨酸含量，发酵指标见下表1。
实施例5：一种用于发酵生产L-丝氨酸的发酵培养基，其特征在于，其包括如下组分：F90果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L。
实施例6：利用实施例5中的发酵培养基发酵生产L-丝氨酸的方法，其包括如下步骤：
(1)将L-丝氨酸生产菌种培育制备L-丝氨酸种子液；具体包括：将L-丝氨酸生产菌种接种至种子培养基中，制备成发酵种子液；将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到L-丝氨酸种子液；其中，培养温度为37℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；其中，种子培养基包括如下组分：F90型果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L；本实施例中，L-丝氨酸生产菌种为大肠杆菌。种子罐培养基灭菌温度为123℃，时间25min。
(2)将L-丝氨酸种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到L-丝氨酸发酵液；具体包括：将L-丝氨酸种子液以15％接种量接入发酵培养基中，培养温度为35℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；当发酵培养基中残糖耗尽时，开始流加果葡糖浆溶液，将残糖维持在0.5g/L以下，总发酵时间为40h，制备得到L-丝氨酸发酵液；发酵过程控制溶氧在20-60％。发酵培养基包括如下组分：培养温度为35℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；其中，种子培养基包括如下组分：F55型果葡糖浆20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，甲硫氨酸2g/L，柠檬酸铁0.1g/L，消泡剂0.5g/L。本实施例所用果葡糖浆为F90型果葡糖浆，即果葡糖浆中含果糖的质量百分比浓度为90％。
按本实施例方法重复3次，测定发酵液中的L-丝氨酸含量，发酵指标见下表1。
实施例7：一种用于发酵生产L-丝氨酸的发酵培养基，与实施例1不同在于没有添加柠檬酸铁，其他组分及含量与实施例1完全相同。
实施例8：利用实施例7中的发酵培养基发酵生产L-丝氨酸的方法，与实施例2不同在于没有添加柠檬酸铁，其他操作步骤、相关参数及组分、含量与实施例2完全相同。
按本实施例方法重复3次，测定发酵液中的L-丝氨酸含量，发酵指标见下表1。
实施例9：一一种用于发酵生产L-丝氨酸的发酵培养基，与实施例1不同在于没有添加甲硫氨酸，其他组分及含量与实施例1完全相同。
实施例10：利用实施例7中的发酵培养基发酵生产L-丝氨酸的方法，与实施例2不同在于没有添加甲硫氨酸，其他操作步骤、相关参数及组分、含量与实施例2完全相同。
按本实施例方法重复3次，测定发酵液中的L-丝氨酸含量，发酵指标见下表1。
对比实施例：传统发酵生产L-丝氨酸的工艺，包括如下步骤：
(1)将L-丝氨酸生产菌种培育制备L-丝氨酸种子液；具体包括：将大肠杆菌菌种接种至种子培养基中，制备成发酵种子液；将发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到L-丝氨酸种子液；其中，培养温度为37℃，pH为6.5-6.7，罐压为0.05-0.12Mpa；其中，种子培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，消泡剂0.5g/L。种子罐培养基灭菌温度为123℃，时间25min。
步骤2)发酵培养：将L-丝氨酸种子液以15％接种量接入发酵培养基中，培养温度35℃，PH为6.5-7.5，罐压0.05-0.12Mpa。当培养基中残糖耗尽时，开始流加葡萄糖溶液，控制残糖0.5g/L以下，总发酵时间40h，制备得到L-丝氨酸发酵液；发酵过程控制溶氧在20-60％。发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵2g/L，消泡剂0.5g/L。
按本对比实施例方法重复3次，测定发酵液中的L-丝氨酸含量，发酵指标见下表1。
表1对比实施例与实施例2、4、6、8、10产酸和转化率对比
表2对比实施例与实施例2、4、6、8、10乙酸含量对比
结论：如表1与对照实验例相比，实施例10底糖不添加柠檬酸铁，实施例8不添加甲硫氨酸，实施例2同时增加了果葡糖浆、柠檬酸铁、甲硫氨酸。相比改进前的对比实施例，结果表明碳源用果葡糖浆有利于增加糖酸转化率，产酸由85g/L提高到120g/L，转化率由24.79提高到35％。增加柠檬酸铁和甲硫氨酸有利于减少乙酸积累，联合添加柠檬酸铁和甲硫氨酸两种物质提升效果明显高于分别单独添加，乙酸含量由3.53g/L降低到0.217g/L。实施例4、6在实施例2的基础上，考察了另外两类果葡糖浆：F42型(果糖42％)和F90型(果糖90％)，实验结果表明F55型(果糖55％)指标优于F42(果糖42％)型和F90型(果糖90％)。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种发酵生产L-丝氨酸的培养基，其特征在于：包括果葡糖浆、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、柠檬酸、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、甲硫氨酸、柠檬酸铁和消泡剂。
2.根据权利要求1所述的发酵生产L-丝氨酸的培养基，其特征在于：培养基含果葡糖浆10-30g/L，玉米浆5-10g/L，酵母粉2-5g/L，硫酸铵2-6g/L，柠檬酸1-4g/L，硫酸镁2-6g/L，磷酸二氢钾3-8g/L，磷酸氢二铵2-5g/L，甲硫氨酸1-4g/L，柠檬酸铁0.1-0.3g/L，消泡剂0.2-0.7g/L。
3.根据权利要求1或2所述的发酵生产L-丝氨酸的培养基，其特征在于：所述果葡糖浆为F55型果葡糖浆。
4.一种利用权利要求1或2所述培养基发酵生产L-丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将L-丝氨酸生产菌种培育制备L-丝氨酸种子液；
S2：将L-丝氨酸种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到L-丝氨酸发酵液；发酵过程控制溶氧在20-60％。
5.根据权利要求4所述生产L-丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤S1具体为：将L-丝氨酸生产菌种接种至种子培养基中，制备成发酵种子液；将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到L-丝氨酸种子液；其中，培养温度为30-37℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa。
6.根据权利要求5所述生产L-丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤S2具体为：将所述L-丝氨酸种子液以10-20％接种量接入所述发酵培养基中，培养温度为30-38℃，pH为6.5-7.5，罐压为0.05-0.12Mpa；当所述发酵培养基中残糖水平低于20g/L时，开始流加果葡糖浆溶液，将残糖维持在0.5g/L以下，总发酵时间为36-48h，制备得到L-丝氨酸发酵液。
7.根据权利要求6所述生产L-丝氨酸的方法，其特征在于：所述L-丝氨酸生产菌种为大肠杆菌。
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