CN117757863A - 一种提高氨基酸发酵转化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种提高氨基酸发酵转化率的方法，属于生物工程技术领域。利用生物工程菌株，种子复壮后，经过种子罐种子扩大培养后，接入发酵罐中进行发酵，过程中以流加培养基的方式补充糖、硫酸铵、苏氨酸及营养维持剂，进行过程pH值调控，进行赖氨酸有氧发酵。本发明通过提高发酵中后期菌体代谢强度，减缓发酵OD下降趋势，提高了发酵产酸，实现发酵糖酸转化率的提升。此外该生产工艺流程易实现，对发酵设备和管路的腐蚀性小，适于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
背景技术
在赖氨酸发酵过程中，营养物质被不断消耗，同时在连续放出发酵液的过程中，罐内的营养物质被不断稀释，随发酵周期延长菌体耗糖及产酸能力不断下降，发酵OD也呈现出下降趋势，造成生产效率的下降。
甜菜碱磷酸盐集合了甜菜碱和磷酸盐的双重特性，在高赖氨酸环境下维持细胞渗透压稳定性，提高细胞耐渗能力，对稳定胞内酶活性和生物大分子的功能有益；而磷酸又能提高细胞氧化磷酸化水平，促进细胞代谢，维持发酵中后期细胞数量。此外甜菜碱磷酸盐对设备腐蚀性小，对生产设备更友好。
发明内容
本发明的目的在于提出一种提高氨基酸发酵转化率的方法，通过过程流加营养物质，减少发酵初期高营养环境下渗透压对菌体的不利影响，在发酵过程中流加营养维持剂，满足菌体发酵代谢需求，提高菌体发酵强度，并维持发酵中后期细胞数量减缓发酵OD下降趋势，同时提高细胞高渗透压耐受能力，维持较高强度的发酵产酸水平，提高现有氨基酸生产工艺中单批产酸量，实现氨基酸工业化生产上糖酸转化率的提高，为企业提供一种降低原料成本、提高生产强度的发酵生产方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种提高氨基酸发酵转化率的方法，利用生物工程菌株，种子复壮后，经过种子罐种子扩大培养后，接入发酵罐中进行发酵，过程中以流加培养基的方式补充糖、硫酸铵、苏氨酸及营养维持剂，进行过程pH值调控，进行赖氨酸有氧发酵。
作为本发明的进一步改进，所述生物工程菌株为MHZ-0914和/或MHZ-0912-6，所述工程菌株MHZ-0914，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为CGMCCNO.22648，保藏日期为2021年6月1日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；所述工程菌株MHZ-0912-6，分类命名为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，保藏编号为CGMCC NO.11942，保藏日期为2015年12月25日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
作为本发明的进一步改进，所述种子罐大小为8-12L，种子培养基包括：葡萄糖20-40g/L，酵母粉3-7g/L，MgSO4·7H2O 1-3g/L，K2HPO4 0.5-0.7g/L，蛋白胨10-20g/L，(NH4)2SO4 8-12g/L，FeSO4 1.8-2.2mg/L。
作为本发明的进一步改进，所述发酵罐大小为45-55L，发酵培养基包括：葡萄糖19-21g/L，KCl 0.4-0.6g/L，MgSO4 0.6-0.8g/L，糖蜜9-11g/L，玉米浆58-62g/L，豆粕水解液29-31g/L，MnSO4 1.8-2.2mg/L，FeSO4 1.8-2.2mg/L，生物素190-210μg/L，味精母液3-5g/L，接种比18-22％。
作为本发明的进一步改进，所述营养维持剂以烟酸、甜菜碱磷酸盐、硫酸镁、蛋氨酸、硫酸铜、硫酸锌配置成溶液，在发酵OD达到OD600＝25-35时，进行流加至发酵结束。
作为本发明的进一步改进，所述营养维持剂各物料的浓度为烟酸300-320mg/L、甜菜碱磷酸盐10-12g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、蛋氨酸0.8-1.2g/L、硫酸铜220-240mg/L、硫酸锌300-340mg/L。
作为本发明的进一步改进，在发酵至OD600不足30之前，发酵液中的残糖浓度控制在1-3g/L范围内；OD600达到30后，开始流加营养维持剂，发酵液中的残糖浓度控制在0.3-0.5g/L范围内；氨氮含量0.8-1.2g/L范围内。
作为本发明的进一步改进，所述种子扩大和发酵培养的条件为：温度控制在37±0.5℃，溶氧范围40±10％，pH控制在6.8±0.05；种子OD600达到20时停止培养，转接至发酵罐内；发酵培养周期为24-48h。
作为本发明的进一步改进，当发酵罐液位高于75％时，放出5％的发酵液继续进行流加发酵培养，过程放出的发酵液收集至缓存罐中后，最后与发酵液混合进入提取工序。
本发明具有如下有益效果：
本发明利用工程菌株经过逐级扩大培养进行微生物有氧发酵，过程中以流加培养基的方式补充糖、硫酸铵、苏氨酸及营养维持剂等成分，达到维持菌体代谢、繁殖以提高发酵中后期产酸的目的，期间控制菌体需求及消耗的平衡，维持偏亚适量状态，避免糖代谢流入其它路径造成糖损失。
本发明通过提高发酵中后期菌体代谢强度，减缓发酵OD下降趋势，提高了发酵产酸，实现发酵糖酸转化率的提升。此外该生产工艺流程易实现，对发酵设备和管路的腐蚀性小，适于大规模工业化生产
本发明可以实现菌体代谢能力的长期稳定，避免出现在发酵中期后期因渗透压提高造成的细胞代谢水平降低以及菌体数量的快速下降，通过营养维持剂的补充，满足菌体发酵代谢需求，提高菌体发酵强度。
此外，该工艺可以实现发酵罐利用率的提高，发酵液位达到75％，进一步提高发酵体积对罐内传质、传热和溶氧条件具有挑战，不利于菌体有效生长繁殖和代谢产酸，通过流加和过程放料的方式，可以实现在舍弃部分发酵液发酵效力的同时，提高发酵液产量，实现在有限的发酵空间内产量的提升，实现发酵罐的高效利用。该生产工艺流程易实现，对发酵设备和管路的腐蚀性小，适于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明生物工程菌株MHZ-0914，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为CGMCC NO.22648，保藏日期为2021年6月1日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101
本发明生物工程菌株MHZ-0912-6，分类命名为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum，保藏编号为CGMCC NO.11942，保藏日期为2015年12月25日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
上述菌株均由廊坊梅花生物技术开发有限公司提供。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
赖氨酸生产菌株MHZ-0914经过种子罐扩培后，待OD600值达到20时接入50L发酵罐中进行发酵。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4 0.7g/L，糖蜜10g/L，玉米浆60g/L，豆粕水解液30g/L，MnSO4 2mg/L，FeSO4 2mg/L，生物素200μg/L，味精母液4g/L，接种比20％；
发酵OD达到OD600＝30时，开始流加营养维持剂，其浓度为烟酸310mg/L、甜菜碱磷酸盐11g/L、硫酸镁0.5g/L、蛋氨酸1g/L、硫酸铜230mg/L、硫酸锌320mg/L；
在发酵至OD600不足30之前，发酵液中的残糖浓度控制在1-3g/L范围内；OD600达到30后，开始流加营养维持剂，发酵液中的残糖浓度控制在0.3-0.5g/L范围内；氨氮含量0.8-1.2g/L范围内；
发酵培养条件为：温度控制在37±0.5℃，溶氧范围40±10％，pH控制在6.8±0.05；当发酵罐液位高于75％时，放出5％的发酵液继续进行流加发酵培养；发酵培养周期为36h。发酵结束后，测定单批放罐酸、有机酸，计算单批转化率。其结果见表1。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
按照实施例1的方法生产赖氨酸，发酵培养基一致，不同的是在发酵至OD600不足30之前，发酵液中的残糖浓度控制在1-3g/L范围内；OD600达到30后，开始流加营养维持剂，发酵液中的残糖浓度控制在5g/L以上；氨氮含量0.8-1.2g/L范围内；其他条件和实施例1一致，发酵时间36h，发酵结束后，测定单批放罐酸、有机酸，计算单批转化率。其结果见表1。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
按照实施例1的方法生产赖氨酸，发酵培养基和发酵条件一致，不同的是在发酵过程中，发酵溶氧始终维持在20％以下，其他条件和实施例1一致，发酵时间36h，发酵结束后，测定单批放罐酸、有机酸，计算单批转化率。其结果见表1。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
按照实施例1的方法生产赖氨酸，发酵条件一致，不同的是发酵培养基中的初始葡萄糖含量40g/L，其它配方成分和实施例1的配方一致，发酵过程控制条件和实施例1一致，发酵时间36h，发酵结束后，测定单批放罐酸、有机酸，计算单批转化率。其结果见表1。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
按照实施例1的方法生产赖氨酸，发酵培养基和发酵条件一致，不同的是当发酵罐中的培养液体积至发酵罐体积的80％时放料，放料体积为培养基体积的5％，其它条件和实施例1一致，发酵时间36h。发酵结束后，测定单批放罐酸、有机酸，计算单批转化率。其结果见表1。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
按照实施例1的方法生产赖氨酸，发酵培养基和发酵条件一致，不同的是赖氨酸生产菌株采用MHZ-0912-6。
实施例7
本实施例用于说明本发明提供的一种提高氨基酸发酵转化率的方法。
按照实施例1的方法生产赖氨酸，发酵培养基和发酵条件一致，不同的是赖氨酸生产菌株采用MHZ-0912-6和MHZ-0914，接种量之比为3:5。
对比例1
按照实施例1的方法进行赖氨酸发酵，不同的是，不流加营养维持剂，在发酵至OD600不足30之前，发酵液中的残糖浓度控制在1-3g/L范围内；OD600达到30后，发酵液中的残糖浓度控制在0.3-0.5g/L范围内；氨氮含量0.8-1.2g/L范围内；其它条件和实施例1一致，发酵时间36h。发酵结束后，测定单批放罐酸、有机酸，计算单批转化率。其结果见表1。
对比例2
按照实施例1的方法进行赖氨酸发酵，不同的是，全程流加营养维持剂；其它条件和实施例1一致，发酵时间36h。发酵结束后，测定单批放罐酸、有机酸，计算单批转化率。其结果见表1。
按照实施例的方法生产赖氨酸，发酵培养36h后，测定单批放罐酸、有机酸，每个实施例进行3批次有效实验，计算平均转化率。其结果见表1。
表1
从表1可以看出，采用本发明方法，和初始发酵方法(对比例1、2)相比，放罐酸含量、提高，利用本发明方法可以有效提高发酵转化率。
实施例1、6、7可以得出，采用复合菌株的效果最佳，可见，两组菌株之间具有协同增效的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，利用生物工程菌株，种子复壮后，经过种子罐种子扩大培养后，接入发酵罐中进行发酵，过程中以流加培养基的方式补充糖、硫酸铵、苏氨酸及营养维持剂，进行过程pH值调控，进行赖氨酸有氧发酵。
2.根据权利要求1所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述生物工程菌株为MHZ-0914和/或MHZ-0912-6，所述工程菌株MHZ-0914，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为CGMCC NO.22648，保藏日期为2021年6月1日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；所述工程菌株MHZ-0912-6，分类命名为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，保藏编号为CGMCC NO.11942，保藏日期为2015年12月25日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
3.根据权利要求1所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述种子罐大小为8-12L，种子培养基包括：葡萄糖20-40g/L，酵母粉3-7g/L，MgSO4·7H2O 1-3g/L，K2HPO40.5-0.7g/L，蛋白胨10-20g/L，(NH4)2SO4 8-12g/L，FeSO4 1.8-2.2mg/L。
4.根据权利要求1所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述发酵罐大小为45-55L，发酵培养基包括：葡萄糖19-21g/L，KCl 0.4-0.6g/L，MgSO4 0.6-0.8g/L，糖蜜9-11g/L，玉米浆58-62g/L，豆粕水解液29-31g/L，MnSO4 1.8-2.2mg/L，FeSO4 1.8-2.2mg/L，生物素190-210μg/L，味精母液3-5g/L，接种比18-22％。
5.根据权利要求1所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述营养维持剂以烟酸、甜菜碱磷酸盐、硫酸镁、蛋氨酸、硫酸铜、硫酸锌配置成溶液，在发酵OD达到OD600＝25-35时，进行流加至发酵结束。
6.根据权利要求5所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述营养维持剂各物料的浓度为烟酸300-320mg/L、甜菜碱磷酸盐10-12g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、蛋氨酸0.8-1.2g/L、硫酸铜220-240mg/L、硫酸锌300-340mg/L。
7.根据权利要求1所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，在发酵至OD600不足30之前，发酵液中的残糖浓度控制在1-3g/L范围内；OD600达到30后，开始流加营养维持剂，发酵液中的残糖浓度控制在0.3-0.5g/L范围内；氨氮含量0.8-1.2g/L范围内。
8.根据权利要求1所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述种子扩大和发酵培养的条件为：温度控制在37±0.5℃，溶氧范围40±10％，pH控制在6.8±0.05；种子OD600达到20时停止培养，转接至发酵罐内；发酵培养周期为24-48h。
9.根据权利要求1所述提高氨基酸发酵转化率的方法，其特征在于，当发酵罐液位高于75％时，放出5％的发酵液继续进行流加发酵培养，过程放出的发酵液收集至缓存罐中后，最后与发酵液混合进入提取工序。
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