CN108812321B - 一种滇黄精的组培快繁方法 - Google Patents

一种滇黄精的组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药种植领域，具体涉及一种滇黄精的组培快繁方法。本发明采用滇黄精的幼嫩块茎为材料，优化了组培培养基配方，提高了滇黄精的繁殖效率，将滇黄精种苗成本降到最低，达到快速高效的滇黄精种苗生产要求，适合滇黄精种苗的规模化生产。

Description

一种滇黄精的组培快繁方法
技术领域
本发明属于中药种植领域，具体涉及一种滇黄精的组培快繁方法。
背景技术
滇黄精Polygonatum kingianum coll.et Hemsl.是百合科Liliaceae黄精属Polygonatum植物，主要分布于西南地区，根茎具有抗菌、降压的功效，用于治疗肺结核、胃病、癣菌病等症。滇黄精与同属的黄精Polygonatum sibiricum、多花黄精Polygonatumcyrtonema一起被中国药典收录为中药黄精的基源植物。中医认为黄精有补中益气，润心肺，强筋骨的功效。滇黄精主要以根茎入药，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾功能。用于治疗脾胃虚弱，体倦乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，内热消渴等症，对于糖尿病很有疗效。
黄精在新药研发及保健品开发领域有广阔的前景，人们对黄精的需求量日益增加，野生资源日趋枯竭，已经不能满足市场需求。滇黄精的繁殖方式有块茎和种子繁殖两种。滇黄精的块茎繁殖需要消耗大量块茎，块茎同时又是商品，造成用种成本高。同时，块茎繁殖过程中容易造成腐烂，种植风险较高。滇黄精种子繁殖是常规繁殖方式，但是种子繁殖生长速度慢，一般第一年只有一片叶子，三年后才会长到十几公分，田间管理费用较高，如除草等农事操作需要大量人工。
近年来有不少黄精的组培快繁技术的出现，但是专门针对滇黄精的较少。而且其他黄精组培技术大多程序复杂，繁殖效率低，没能达到规模化生产的技术要求。
因此开发一种滇黄精的组培快繁方法。
发明内容
目前滇黄精的人工种植主要以分块繁殖为主，对根茎需求量大，经济效益低，难以形成大规模种植。滇黄精种苗问题成为制约滇黄精规模化种植的瓶颈。
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于滇黄精组织培养的组合物，其中愈伤组织诱导培养基能同时实现愈伤组织诱导和继代增殖的作用，具有良好的快繁效果。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于滇黄精组织培养的组合物，其包含外植体处理培养基、愈伤组织诱导培养基和成苗培养基；
所述外植体处理培养基在MS培养基的基础上分别添加6-苄氨基腺嘌呤、蔗糖和琼脂；
所述愈伤组织诱导培养基在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂；
所述成苗培养基在1/2MS培养基的基础上添加萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、蔗糖和琼脂。
MS培养基为组织的生长提供所需的碳源、氮源、水、无机物和生长因子。
所述MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机化合物，所述1/2MS培养基为MS培养基中大量元素减半，其他不变，MS培养基具体的配方如下：
大量元素的组分及其对应的浓度为：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、二水氯化钙440mg/L；
微量元素的组分及其对应的浓度为：碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L；
铁盐的组分及其对应的浓度为：七水硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠浓度为37.3mg/L；
有机化合物的组分及其对应的浓度为：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L。
所述6-苄氨基腺嘌呤(Benzylaminopurine)，简称6-Ba，是人工合成的细胞分裂素。6-Ba具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，以及将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能。6-苄氨基腺嘌呤作为一种植物生长调节剂，具有促进促进外植体形成丛生芽的作用。
萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid)，简称NAA，是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根的作用。萘乙酸可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植物体内，随同营养流输导到作用部位。
2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)，简称2,4-D，是一种人工合成的植物激素，具有与生长素(IAA)相似的生理效应。可用作植物生长调节，同时也是一种常用除草剂。
蔗糖为细胞的分裂、扩大、增至提供必要的能量。
琼脂因为有特殊的胶凝性质，尤其有显着的稳固性、滞度和滞后性，并且易吸收水分，有特殊的稳定效应；具有增量剂、增稠剂、乳化剂、胶凝剂、稳定剂、赋形剂、助悬剂、水分保持剂等功效。琼脂粉主要作用是固化培养基，起支撑作用。
作为优选的方案，所述外植体处理培养基中6-苄氨基腺嘌呤添加量为2.0-3.0mg/L，蔗糖添加量为20-30g/L。
作为优选的方案，所述外植体处理培养基还包含萘乙酸，添加量为0-0.5mg/L。
作为优选的方案，所述愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基腺嘌呤添加量为2.0-3.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸添加量为0.5mg/L，蔗糖添加量为20-30g/L。
作为优选的方案，所述成苗培养基中萘乙酸添加量为0.3-0.7mg/L，6-苄氨基腺嘌呤添加量为0-0.5mg/L，蔗糖添加量为20-30g/L。
作为优选的方案，所述外植体处理培养基、愈伤组织诱导培养基和成苗培养基中琼脂添加量为4-8g/L。
琼脂使用量的差异比较大，本发明研究人员一般采用添加量6.0-7.0g/L，但是不同品牌琼脂的使用量差异很大，所以本发明的培养基中琼脂使用量优选为4-8g/L，根据琼脂品牌和强度的不同按实际情况使用。
本发明的目的之二在于提供一种目的一的组合物用于滇黄精的组织培养的方法，其较常规方法操作简单，简化了扩大培养的操作，以及炼苗后可直接下地移栽于普通的肥沃、疏松土壤。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
目的一的组合物用于滇黄精的组织培养的方法，包括以下步骤：
1)选择滇黄精带隐芽的幼嫩块茎作为外植体，将所述外植体进行灭菌处理后切成外植体小块，然后接种到目的一所述外植体处理培养基上培养直至长出嫩芽；
2)将所述嫩芽切下，接种于目的一所述愈伤组织诱导培养基培养，所述嫩芽膨大形成愈伤组织；将所述愈伤组织切成小块，重新接种于所述愈伤组织诱导培养基培养形成愈伤组织，重复3-6次；
3)将所述愈伤组织切成愈伤组织小块，接种于目的一所述成苗培养基培养直至形成根茎叶齐全的滇黄精幼苗；
4)将所述滇黄精幼苗炼苗15天以上获得滇黄精种苗，下地移栽于疏松、肥沃土壤。
作为优选的方案，步骤1)、2)、3)所述培养的条件为：培养室温度23-27℃，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx。
进一步，温度为25℃。
作为优选的方案，步骤1)所述外植体小块具体为体积为0.3cm3-1cm3的带隐芽的小块。
进一步，优选为体积0.4cm3-0.6cm3。
作为优选的方案，步骤1)所述灭菌处理包括：清水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，在超净工作台上用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3—6次，无菌滤纸吸干表面水分，0.1％升汞溶液浸泡8—10分钟，无菌水冲洗3—6次，无菌滤纸吸干表面水分。
作为优选的方案，步骤1)所述培养时间为20-50天。
作为优选的方案，步骤2)所述培养时间为30-60天。
作为优选的方案，步骤2)所述愈伤组织切成的小块体积为0.3cm3-1cm3。
进一步，在实际操作中，愈伤组织小块体积比黄豆略大即可，约为0.4cm3。
作为优选的方案，步骤3)所述愈伤组织小块体积为0.3cm3-1cm3。
进一步，在实际操作中，愈伤组织小块体积比黄豆略大即可，约为0.4cm3。
作为优选的方案，步骤3)所述培养时间为60天以上。
本发明的步骤2)直接重复3-6次，愈伤组织的数量指数型扩增。扩大数量后的愈伤组织全部切成小块，接种于成苗培养基，后形成完整滇黄精幼苗。
步骤3)在经过15天以上的炼苗后，可以直接下地移栽，不需要特殊基质和设施，普通酥松透气的肥沃土壤即可。
综上，本发明的滇黄精的组织培养方法较常规方法操作更简单，减少了组培流程，缩短了培养周期，提高了成活率，能够在短时间内获得大量优质滇黄精种苗，达到快速高效的滇黄精种苗生产要求，适合滇黄精种苗的规模化生产。
本发明的有益效果在于：本发明提供的滇黄精的组培快繁方法：
1)优化了组培技术，通过减少组培流程、改进组培配方，提高了滇黄精的繁殖效率。愈伤组织诱导培养基能同时实现愈伤组织诱导和继代增殖的作用，具有良好的快繁效果，达到快速高效的滇黄精种苗生产要求，适合滇黄精种苗的规模化生产。
2)提高了滇黄精种苗质量和移栽成活率，成活率可达100％。且经过15天以上的炼苗后，可以直接下地移栽，不需要特殊基质和设施，普通酥松透气的肥沃土壤即可，简化了移栽条件。将滇黄精种苗成本降到最低。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
试剂购自：
成都市科龙化工试剂厂：硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、碘化钾、硼酸、六水氯化钴、七水硫酸亚铁、烟酸、盐酸吡哆醇、萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤。
国药集团化学试剂有限公司：七水硫酸镁、磷酸二氢钾、七水硫酸锌、四水硫酸锰、肌醇。
广东省化学试剂工程技术研究开发中心：二水钼酸钠、五水硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、盐酸硫胺素、甘氨酸、2,4-二氯苯氧乙酸。
实施例
1、外植体处理
采挖新鲜的滇黄精两年生种子苗5个，用清水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，每个分别在超净工作台上用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，0.1％升汞溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将块茎切成比黄豆略大的小块，将带有表皮和芽点的滇黄精块茎接种于外植体处理培养基上培养，每瓶一个小块茎，共20瓶。培养室温度25℃左右，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx，下同，培养30天。
外植体处理培养基：MS培养基+6-Ba3.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.0g/L。
2、愈伤组织诱导
将上述处理中长出嫩芽的滇黄精块茎嫩芽，在无菌条件下切下，接种于愈伤组织诱导培养基。培养了48天后，嫩芽基部膨大形成了直径1-2cm不等的愈伤组织。取一半愈伤组织在无菌条件下切成比黄豆略大的小块，重复本步骤，不断扩大培养。第一次转接10瓶转12瓶，每瓶接种4颗。每40-60天转接几次，每次增殖4-6倍，6个月以后达到1026瓶(每瓶4个愈伤组织)。
愈伤组织诱导培养基：MS培养基+6-Ba2.0mg/L+2，4-D0.5 mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.0g/L。
3、成苗
将上述嫩芽膨大形成的愈伤组织在无菌条件下切成比黄豆略大的小块，接种于成苗培养基。每瓶接种4颗，共计15瓶，培养65天，形成了根茎叶齐全的完整滇黄精植株60棵。
成苗培养基：1/2MS培养基+NAA0.5 mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.0g/L。
4、驯化移栽
将成苗后的滇黄精植株在炼苗棚内炼苗25天，打开瓶盖，取出滇黄精种苗，清洗干净培养基，阴干表面水分后种于酥松透气的肥沃土壤，每3天浇水1次，温度20-28℃，成活率100％，长势较好。
本发明优化了滇黄精的组培技术，通过减少组培流程、改进组培配方的方法提高了滇黄精的繁殖效率和成活率，将滇黄精种苗成本降到最低。其中愈伤组织诱导培养基能同时实现愈伤组织诱导和继代增殖的作用，具有良好的快繁效果，达到快速高效的滇黄精种苗生产要求，适合滇黄精种苗的规模化生产。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.滇黄精的组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）选择滇黄精带隐芽的幼嫩块茎作为外植体，将外植体进行灭菌处理后切成外植体小块，然后接种到所述外植体处理培养基上培养直至长出嫩芽；
2）将所述嫩芽切下，接种于愈伤组织诱导培养基培养，所述嫩芽膨大形成愈伤组织；将所述愈伤组织切成小块，重新接种于所述愈伤组织诱导培养基培养形成愈伤组织，重复3-6次；
3)将所述愈伤组织切成愈伤组织小块，接种于成苗培养基培养直至形成根茎叶齐全的滇黄精幼苗；
所述外植体处理培养基在MS培养基的基础上分别添加6-苄氨基腺嘌呤、蔗糖和琼脂；
所述愈伤组织诱导培养基在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂；
所述成苗培养基在1/2MS培养基的基础上添加萘乙酸、蔗糖和琼脂；所述萘乙酸添加量为0.3-0.7 mg/L，所述蔗糖添加量为20-30g/L；
4)将所述滇黄精幼苗炼苗15天以上获得滇黄精种苗，下地移栽于疏松、肥沃土壤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外植体处理培养基中6-苄氨基腺嘌呤添加量为2.0-3.0mg/L，蔗糖添加量为20-30g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外植体处理培养基还包含萘乙酸，添加量为0-0.5 mg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基腺嘌呤添加量为2.0-3.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸添加量为0.5 mg/L，蔗糖添加量为20-30g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外植体处理培养基、愈伤组织诱导培养基和成苗培养基中琼脂添加量为4-8g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）、2）、3）所述培养的条件为：培养室温度23-27℃，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述外植体小块具体为体积为0.3cm3-1cm3的带隐芽的小块。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述灭菌处理包括：清水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，在超净工作台上用75%酒精浸泡20-30秒，无菌水冲洗3—6次，无菌滤纸吸干表面水分，0.1%升汞溶液浸泡8—10分钟，无菌水冲洗3—6次，无菌滤纸吸干表面水分。
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