CN114097609A - 一种植物组织培养时外植体灭菌方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物组织培养时外植体灭菌方法。属于植物组织培养技术领域。包括如下步骤：将外植体使用水冲洗→使用质量浓度75％的酒精灭菌→无菌水清洗→使用质量浓度5～10％的次氯酸钠溶液浸泡30～50min或使用质量浓度0.1～0.2％的升汞溶液浸泡20～30min→无菌水清洗。与现有技术相比，本发明通过方法的改进避免了外植体表面残留酒精对细胞的脱水作用，使次氯酸钠或者升汞灭菌时间延长，表面灭菌更彻底，且不会使外植体灭菌致死。提高了灭菌效率的同时保证了材料的存活，同时次氯酸钠溶液或者升汞溶液可多次循环使用，大大减少了废液处理的次数，降低了对环境污染的可能性。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体的说是涉及一种植物组织培养时外植体灭菌方法。
背景技术
在进行植物组织培养时，外植体的灭菌是必不可少的。一般的灭菌方法包括如下步骤：外植体的清洗→质量浓度为70～75％的酒精灭菌10s左右→质量浓度5～10％的次氯酸钠溶液中浸泡15～30min或质量浓度0.1～0.2％的升汞溶液中浸泡5～10min，对表面不光滑和有毛的外植体添加吐温80在次氯酸钠或升汞溶液中→无菌水清洗3～5次。
然而上述方法存在如下缺陷：(1)使用次氯酸钠溶液或升汞溶液灭菌时间不能太长，否则外植体会灭菌致死，然而短时间灭菌可能存在灭菌不彻底的风险；(2)次氯酸钠溶液或者升汞溶液被当做废液需要统一回收和处理，特别是升汞有很强的毒性，不进行固化处理会严重污染环境。
综上，如何提供一种灭菌时间长、灭菌溶剂可重复利用的植物组织培养时外植体灭菌方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种植物组织培养时外植体灭菌方法。该方法可以使灭菌时间延长，外植体表面灭菌更彻底，同时实现次氯酸钠溶液和升汞溶液的循环使用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种植物组织培养时外植体灭菌方法，包括如下步骤：
(1)将外植体用水冲洗；
(2)使用质量浓度75％的酒精灭菌；
(3)无菌水清洗；
(4)使用质量浓度5～10％的次氯酸钠溶液浸泡30～50min或使用质量浓度0.1～0.2％的升汞溶液浸泡20～30min；
(5)无菌水清洗。
所取得的有益效果：在现有技术常用的灭菌方案中，由于外植体表面残留有酒精，植物细胞在酒精和次氯酸钠溶液或升汞溶液的共同作用下极易脱水和中毒而死，所以灭菌时间一般控制在10min左右，导致灭菌不彻底，灭菌效率低。另外由于次氯酸钠溶液或升汞溶液中有了酒精就不能重复使用，需要当做废液进行处理，特别是升汞对环境有很大的污染，需要用Na2S进行固化处理。本发明技术方案与现有技术常用的灭菌方案相比，仅在酒精灭菌后增加了无菌水清洗，但却实现了次氯酸钠和升汞的重复使用，并大大提高了灭菌效率，对于表面光滑的植物外植体可以做到100％彻底表面灭菌。
进一步的，所述步骤(2)中灭菌时间为10～30s。
进一步的，所述步骤(3)和步骤(5)需清洗2～3遍。
进一步的，还包括在步骤(2)之后使用吐温80溶液进行浸泡。
所取得的有益效果：对于表面有绒毛的外植体材料可以在酒精溶液灭菌后在无菌水中添加吐温80进行浸泡和水洗，然后再进行次氯酸钠溶液或升汞溶液的灭菌。
进一步的，所述外植体为红掌、魔芋、滇黄精、竹叶兰或狗脊的外植体。
进一步的，所述步骤(2)～(5)均在超净工作台中进行。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：通过方法的改进避免了外植体表面残留酒精对细胞的脱水作用，使次氯酸钠或者升汞灭菌时间延长，表面灭菌更彻底，且不会使外植体灭菌致死。提高了灭菌效率的同时保证了材料的存活。同时次氯酸钠溶液或者升汞溶液可多次循环使用，减少了废液处理的次数，降低了对环境污染的可能性。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1红掌的外植体灭菌
取红掌新长出的幼叶(未开展)和叶柄，将一片叶切成2-4块，叶柄切成3cm左右的切段，自来水冲洗干净，质量浓度75％酒精灭菌15-20s，无菌水冲洗2次，质量浓度0.1％升汞灭菌30min，无菌水冲洗2次，切除边缘后进行培养基接种，表面灭菌成功率可以达到100％，成活100％。
实施例2魔芋和滇黄精的外植体灭菌
取魔芋和滇黄精新长出的幼芽为外植体，并将芽缘和最外面的包叶去除，自来水冲洗干净，质量浓度75％酒精灭菌15-20s，无菌水冲洗2次，质量浓度0.1％升汞灭菌30min，无菌水冲洗2次。表面灭菌成功率可以达到100％，如果外植体足够大，成活100％。
实施例3竹叶兰的外植体灭菌
取竹叶兰的完整无病虫害斑点的果荚为外植体进行表面灭菌，去除两头不易灭菌的部分，自来水冲洗干净，质量浓度75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗 2次，质量浓度0.2％升汞灭菌30min，无菌水冲洗2次。表面灭菌成功率可以达到100％，成活100％。
实施例4狗脊的外植体灭菌
狗脊的带有成熟孢子囊的叶片为外植体，自来水冲洗干净，质量浓度75％酒精灭菌15-20s，无菌水冲洗2次，质量浓度0.1％升汞灭菌30min,，无菌水冲洗2次。表面灭菌成功率可以达到100％，成活100％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一种植物组织培养时外植体灭菌方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将外植体用水冲洗；
(2)使用质量浓度75％的酒精灭菌；
(3)无菌水清洗；
(4)使用质量浓度5～10％的次氯酸钠溶液浸泡30～50min或使用质量浓度0.1～0.2％的升汞溶液浸泡20～30min；
(5)无菌水清洗。
2.如权利要求1所述的一种植物组织培养时外植体灭菌方法，其特征在于，所述步骤(2)中灭菌时间为10～30s。
3.如权利要求1所述的一种植物组织培养时外植体灭菌方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(5)需清洗2～3遍。
4.如权利要求1所述的一种植物组织培养时外植体灭菌方法，其特征在于，还包括在步骤(2)之后使用吐温80溶液进行浸泡。
5.如权利要求1所述的一种植物组织培养时外植体灭菌方法，其特征在于，所述外植体为红掌、魔芋、滇黄精、竹叶兰或狗脊外植体。
6.如权利要求1所述的一种植物组织培养时外植体灭菌方法，其特征在于，所述步骤(2)～(5)均在超净工作台中进行。
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