CN108651279B - 一种用于竹子组织培养的种胚消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种用于竹子组织培养的种胚消毒方法，包括如下步骤：(1)剥除竹子种胚外稃；(2)28～32℃恒温浸泡种胚30～48h，期间6h换水1次；(3)流水冲洗1～3h；(4)在超净工作台中，先用酒精浸泡种胚，再用无菌水冲洗4～6次，然后用0.8～1.6％甲醛溶液消毒处理3～5h，(5)解剖：在超净工作台中，切除具芒的竹子种胚尾部。本发明提出的消毒方法，操作简单，核心步骤使用了毒性相对较小的甲醛溶液，且解决了竹子种胚组织培养过程中内生菌污染这一难题，大大降低了污染率，极大地促进了毛竹种胚的组织培养工作。本发明为毛竹实生苗育苗，为分子育种的愈伤诱导再生体系的建立等奠定技术基础。

Description

一种用于竹子组织培养的种胚消毒方法

技术领域

本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种组织培养过程中的种胚消毒方法。

背景技术

竹子属禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物，是极其重要的非木质可再生林业资源，也是重要的园林绿化植物。世界有竹类植物70余属，1200余种，主要分布于热带和亚热带地区，少数种类分布于温带和寒带。我国竹资源十分丰富，是世界上最重要的竹子栽培和生产国，有竹类植物39属500余种，竹林面积601万公顷 ，约占世界竹林面积1/4以上，约占全国森林总面积的4％（3.8%）；年产鲜竹笋170万吨，2015年竹业年产值达1845亿元。竹林作为可持续发展资源，具有良好的直接经济效益和生态效益，可以竹代木而减少木材消耗量，广泛用于建筑、桥梁、造纸、包装、化工、食品等领域。社会、经济的快速发展将消耗越来越多的自然资源，因此，提高竹子繁殖效率、增加产量对竹资源的可持续利用具有重要意义。

毛竹(Phyllostachys edulis)别名楠竹、江南竹、茅竹等，属禾本科竹亚科刚竹属（Phyllostachys)，主要分布于秦岭、汉水流域至长江流域以南的亚热带地区，是我国分布范围最广、面积最大、经济价值最高的竹种。我国毛竹栽培面积高达445万公顷，每年可提供1.8亿根竹子，有效缓解木材供应缺口。毛竹竿型粗大，供建筑、编织、造纸原料，笋味鲜美，鲜食或加工制成玉兰片、笋干、笋衣等，是重要经济作物之一。

毛竹产业给国民经济创造价值的同时，近年来毛竹林成片开花的现象给竹产业发展敲响了警钟。毛竹开花具稀少性、随意性和不确定性等特点。毛竹开花后地下鞭根腐烂，地上竹竿成片死亡，由此造成巨大经济损失和生态安全问题。因此，实生苗造林的重要性凸显而出。

毛竹种子为颖果，长椭圆形，长10.0~11.0 mm，表面具明显纵沟槽（即种脐），成熟果为褐色或深褐色，顶端具芒，芒长4~5 mm。毛竹种胚无休眠期，寿命较短，在自然条件下1~2个月即失去发芽力。由于种子不易长期储存且种子繁殖的低效率性，因此通过组织培养技术可提高种子繁殖效率，解决种子发芽率低的问题。

组织培养技术作为一种植物生物学研究的基本方法，1968年，Trione首次以禾本科小麦根为外植体诱导出愈伤组织。同年，Alexander和Rao首先进行竹子合子胚的组织培养。随后，竹类研究者在竹子组培方面取得突出成绩，一些竹种如牡竹、麻竹、孝顺竹、慈竹等丛生竹成功通过愈伤组织获得再生植株。而我国最重要的经济竹种—毛竹的组织培养尚未成功,毛竹种胚消毒就是其中一大难题。以往的消毒方法要么污染率难以控制，要么毒性较高。种胚是最常见的组培外植体之一，毛竹种胚具纵沟槽和芒，表面极易附着细菌和真菌，前期研究表明，不仅种子表面附着大量的细菌、真菌，而且种子内生真菌种类繁多，极难消毒。在初代培养中，如果外植体表面消毒不彻底，3~5 d后即会出现白、黄色绒毛状真菌性污染物和水渍状、干缩状细菌性污染物；5 d以后陆续出现细菌性污染物，则是外植体自身携带的内生细菌引起的污染。

发明内容

针对本领域存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种竹子种胚在组织培养中的低毒高效消毒方法，以最大程度降低污染率从而提高种胚诱导成功率。

本发明的第二个目的是提出所述消毒方法的应用。

实现本发明目的的技术方案为：

一种用于竹子组织培养的种胚消毒方法，包括如下步骤：

（1）剥壳：剥除竹子种胚外稃；

（2）浸泡：将种胚置于容器中，28~32℃恒温水浸泡种胚30~48 h，期间6 h换水1次；

（3）冲洗：在容器中添加0.2~5mL洗洁精或1~10滴吐温40，流水冲洗1~3 h；

（4）消毒：在超净工作台中，先用酒精浸泡种胚，再用无菌水冲洗4~6次，然后用0.8~1.6%甲醛溶液消毒处理3~5 h，消毒处理期间作1~2次/h手工震荡处理，消毒处理后用无菌水冲洗；

（5）解剖：在超净工作台中，切除具芒的竹子种胚尾部，切除部分大小为种胚长度的1/3~1/2，余下带胚芽部分作为组培外植体。

甲醛（CH₂O），无色气体，有特殊刺激气味，低浓度即可嗅到，对人眼、鼻等有刺激作用，皮肤直接接触甲醛可引起过敏性皮炎，易溶于水，水溶液的浓度通常是40%，俗称福尔马林。相对于现有的升汞消毒技术而言，以低浓度的甲醛溶液作为消毒剂更为安全。

优选地，步骤（2）中，用自来水恒温浸泡种胚，浸泡期间6 h换水1次。

其中，步骤（3）中，控制流水速度以翻起种胚、冲掉残留稃片。洗洁精或吐温的添加量按常规清洗方式添加，滴或毫升不需要准确。

进一步地，步骤（4）中，先用70%酒精浸泡种胚1~2 min，无菌水冲洗5次，然后用1.2%甲醛溶液消毒处理4 h，期间作1~2次/h手工震荡处理，最后无菌水冲洗5次。

本发明所述的消毒方法在竹子种胚组织培养中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的消毒方法，操作简单，核心步骤使用了毒性相对较小的甲醛溶液，且解决了竹子种胚组织培养过程中内生菌污染这一难题，大大降低了污染率，极大地促进了毛竹种胚的组织培养工作。本发明为毛竹实生苗育苗，为分子育种的愈伤诱导再生体系的建立等奠定技术基础。

本发明可将竹子种胚消毒成功率提高到90%以上，解决了外植体内生菌引起的后期污染问题，极大地提高了组培效率。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1：

以竹子当年生饱满、色泽鲜亮、无病虫害的健康种子为外植体，其消毒方法是对剥去外壳的裸露种子在组织培养之前所进行的无菌化处理方法，包括剥壳、浸泡、冲洗、消毒、解剖等步骤。

1、将毛竹种胚剥去外稃，放入带盖玻璃瓶中。

2、用自来水浸泡种胚，放入30℃恒温水浴锅，处理36 h,平均每6h换1次水。

3、将种胚置于烧杯中，蒙上纱布用流水冲洗1 h，除去残留稃片；添加适量洗洁精或数滴吐温40于烧杯中、蒙上纱布，继续流水冲洗1 h。流水速度以翻起种胚、冲掉残留稃片为宜。

4、在超净工作台中，先用70%酒精浸泡种胚1 min，无菌水冲洗5次，期间转入带盖无菌瓶中；然后用1.2%甲醛溶液消毒处理4 h，期间作1次/h手动震荡处理；最后用无菌水冲洗5次，期间将种胚再次转入带盖无菌瓶中。

5、在超净工作台中，切除具芒的毛竹种胚尾部，切除大小为种胚长度的1/3。处理过后的毛竹种胚即可接种到初代培养基上。

该实施例中，初期污染率控制在10%以下，最终污染率也能控制在15%以下。

实施例2

本实施例中，步骤2为，用自来水浸泡种胚，放入30℃恒温水浴锅，处理48h,平均每6h换1次水。

步骤4、在超净工作台中，先用70%酒精浸泡种胚1 min，无菌水冲洗5次，期间转入带盖无菌瓶中；然后用1.5%甲醛溶液消毒处理4 h，期间作1次/h手动震荡处理；最后用无菌水冲洗5次，期间将种胚再次转入带盖无菌瓶中。

其他操作同实施例1 。本实施例中，初期污染率控制在低达5%以下，最终污染率也在5%以下，但该例中种胚萌芽率和愈伤诱导率处在极低水平。说明甲醛浓度至1.5%会有损伤。

实施例3

本实施例中，步骤4为，在超净工作台中，先用70%酒精浸泡种胚1 min，无菌水冲洗5次，期间转入带盖无菌瓶中；然后用0.5%甲醛溶液消毒处理3 h，期间作1次/h手动震荡处理；最后用无菌水冲洗5次，期间将种胚再次转入带盖无菌瓶中。

其他操作同实施例1 。本实施例中，能够将初期污染率控制在20%以下，最终污染率可控制在30%以下。

对比例1

1、将毛竹种胚剥去外稃，放入带盖玻璃瓶中。

2、用自来水浸泡种胚，放入30℃恒温水浴锅，处理36 h,平均每6h换1次水。

3、将种胚置于烧杯中，蒙上纱布用流水冲洗1 h，除去残留稃片；添加适量洗洁精或数滴吐温40，继续流水冲洗1 h。流水速度以翻起种胚、冲掉残留稃片为宜。

流水冲洗后70%酒精消毒3 min，无菌水冲洗5次，期间将种胚再次转入带盖无菌瓶中。其他操作方法同实施例1。

本方法初期污染率高达50%，后期内生菌逐步显现，最终消毒失败。

对比例2

按照和实施例1步骤1-3相同方法操作，流水冲洗后先70%酒精消毒3 min再使用有效氯含量0.2%次氯酸钠溶液消毒20 min。其他操作同实施例1 。

本方法初期污染率可控制在35%以下，但内生菌污染仍不可避免，最终污染率高达50%以上。

对比例3

按照和实施例1步骤1-3相同方法操作，流水冲洗后先70%酒精消毒3 min后使用0.2%次氯酸钠溶液消毒20 min，再使用0.1%升汞（HgCl₂）溶液消毒30 min。其他操作同实施例1 。本方法能较好地控制污染率，特别是能较好地解决内生菌污染问题，但升汞作为剧毒性化合物，实际应用中存在诸多弊端。

以上每个实施例或对比例均设置30个平行样，以计算污染率。

经过实施例和对比例消毒后的毛竹种坯，接种于初代培养基上，统计污染率，用下式计算：

（污染种胚数÷种胚总数）×100%=污染率

初期污染率以4 d内出现的真菌性或细菌性污染种胚个数为统计对象，最终污染率以一个继代周期25 d内出现的所有污染种胚个数为统计对象。芽和愈伤诱导率是以有芽萌发、有原始细胞产生为正常。

表1：消毒效果比较

	消毒时间	初期污染率	最终污染率	芽和愈伤诱导率
					实施例1	1 min和4 h	10%	15%	正常
实施例2	1 min和4 h	5%	5%	最差
					实施例3	1 min和3 h	20%	30%	正常
对比例1	3 min	50%	100%	最差
					对比例2	3 min 和20 min	35%	50%	较差
对比例3	3 min, 20 min和30 min	15%	20%	正常

上表中消毒时间分别代表用酒精、次氯酸钠、甲醛或升汞消毒的时间。

升汞，白色结晶、颗粒或粉末，可通过呼吸道、消化道或皮肤吸收，立即或数小时后发生恶心、呕吐、严重腹痛、腹泻和便血，严重者可发生休克、昏迷。以升汞进行种胚消毒，可使污染率最终控制在20%以下，较好的解决了内生菌问题，但是步骤繁多，且升汞属于限制使用的剧毒药品，操作不当极易导致环境污染和人员中毒。相对于现有的升汞消毒技术而言，以低浓度的甲醛溶液作为消毒剂更为安全。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实例，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对本方法的判别模型作出一定的补充和优化。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种用于竹子组织培养的种胚消毒方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)剥壳：剥除竹子种胚外稃；

(2)浸泡：将种胚放入容器中，30℃恒温水浸泡种胚36h，期间6h换水1次；

(3)冲洗：在容器中添加0.2～5mL洗洁精或1～10滴吐温40，蒙纱布后流水冲洗1h，控制流水速度以翻起种胚、冲掉残留稃片；

(4)消毒：在超净工作台中，先用70％酒精浸泡种胚1min，无菌水冲洗5次，然后用1.2％甲醛溶液消毒处理4h，期间作1次/h手工震荡处理，最后用无菌水冲洗5次；

(5)解剖：在超净工作台中，切除具芒的竹子种胚尾部，切除部分大小为种胚长度的1/3，余下带胚芽部分作为组培外植体；

所述竹子品种为毛竹。

2.权利要求1所述的消毒方法在竹子种胚组织培养中的应用。