CN103484495A - 盐芥dreb2a基因在培育耐高盐耐干旱玉米中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用盐芥转录因子基因DREB2A基因创制高耐盐耐干旱玉米的技术方法。将从盐芥中克隆的DREB2A基因以正义形式导入玉米基因组，在含盐量为1.0%~2.0%的盐碱土/盐碱地中进行种植和筛选，获得在盐碱土/盐碱地中可以完成过正常发育过程的高耐盐碱耐干旱性的玉米新品系。通过转TsDREB2A基因途径可以提高植物的耐盐碱耐干旱能力，可用于植物抗性改良和抗逆植物新种质的创制。

Description

盐芥DREB2A基因在培育耐高盐耐干旱玉米中的应用

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过将盐芥TsDREB2A基因导入玉米、改变玉米抗逆性的方案及用途。 

背景技术

转录因子也称反式作用因子（trans-acting factor），是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，编码转录因子的基因即是转录因子基因。转录因子基因通过激活或抑制其他基因的转录，从而启动特定基因的表达，进而实现细胞对内外信号的应答反应。简单地说，转录因子基因是可以调节其他基因表达的一类基因，其表达产物可以调节几个个或多个被调控的其他基因。 

DREB(Dehydration responsive element binding protein)即干旱应答元件结合蛋白,含有一个AP2-DNA结合域（AP2 Domain），能特异性结合启动子中的DRE/CRT ( dehydration responsive element)顺式元件( 核心基序为TACCGACAT)。当植物受到外界环境胁迫时,DREB类基因表达产生的转录因子与DRE顺式作用元件结合, 启动受其调控的多个胁迫耐受基因的表达，如rd17、rd29A、kin1、erd10、cor15a、cor78a等，并最终使植物的抗逆性获得增强。DREB类基因属于AP2/EREBP转录因子家族，在拟南芥中这类转录因子已发现5种，分别为DREBlA，DREBlB，DREBlC，DREB2A，DREB2B。其中DREBl类转录因子主要受冷胁迫信号的诱导，DREB2类转录因子主要受干旱胁迫信号诱导，其中DREB2A基因主要受干旱与高盐胁迫诱导。研究表明这类转录因子在逆境诱导基因的表达调控中具有非常重要的作用，因此，通过转基技术使某个或某些特定转录因子在作物体内表达,就可通过它调控多个功能基因,从而达到综合改良作物性状的效果。至目前，AP2/EREBP转录因子家族（AP2／ERF家族）的多个成员已被用于改良植物抗逆性的植物基因工程应用，详情见表1。 

不论是DREB1还是DREB2都能特异性结合DRE/CRT元件，而且它们启动转录的功能在植物原生质体和酵母系统中都已经得到了证实。Haake等研究发现， DREBlA／CBF3基因及另外两个同源基因都能被低温诱导但是不能被干旱诱导，而DREB2A和DREB2B则能够被干早胁迫诱导 (Haake et a1．，2002)；在胁迫应答反应中，CBF2／DREBlC是作为CBFl/DREBlB和CBF3/DREB1A的一个负调控因子而起作用 (Novillo et a1.，2004)。虽然liu等研究认为过量表达DREB2不能提高拟南芥的抗逆性， DREB2基因需要经过转录后修饰才能行使其功能(liu et a1.，1998)，但近年来的最新研究发现，过表达DREB2A的转基因拟南芥获得了明显的抗干旱胁迫能力，基因芯片技术及RNA凝胶杂交分析显示，这种抗旱性的获得是通过DREB2A调控多个水胁迫诱导基因的表达而实现的（Sakuma et a1.，2006）。最近的研究还发现，一些基因通过与DREB2A的相互作用，可以降低受DREB2A调控的干旱及盐胁迫应答基因的表达（Feng et a1.，2008；Kim et a1.，2012），提示DREB2A基因产物可以促进干旱胁迫及盐胁迫应答基因的表达，但是在干旱及盐胁迫应答途径中除了DREB2A基因之外还有更多的基因参与其中并承担着不同角色。 

表1 转DREB /CBF基因植物及其抗逆性情况表（Taishi et al. 2006；李科友等，2011） 

发明内容

针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种转盐芥（Thellungiella salsuginea L.）DREB2A基因（以下用“TsDREB2A基因”表示）改变玉米(Zea Mays L.)抗性 (包括抗干旱性、抗盐碱性等)的应用。 

本发明所述的转TsDREB2A基因改变玉米(Zea Mays L.)抗旱抗盐性的应用方法是，将从盐芥（Thellungiella salsuginea L.）中克隆的TsDREB2A以正义形式重组到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测被转入目标基因的表达和在盐碱土及盐碱地中进行转基因植物的种植进行抗逆性鉴定，从中筛选出抗旱抗盐性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出在玉米育种中有应用前景的新种质和新品种。 

其中，所述转TsDREB2A基因来自盐生植物盐芥，有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列以正义形式构建成融合基因并转入植物细胞内。用于构建成融合基因的TsDREB2A基因可为基因的全长序列，也可以为部分序列，也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸；转基因方法是通过转TsDREB2A基因或依据TsDREB2A基因序列设计的多核苷酸序列而确定。 

本发明所说的转TsDREB2A基因克隆于不同生态型的盐生植物盐芥，彼此序列有高的相似性。该基因一般以cDNA形式或基因组基因形式克隆，以正向形式插入并正向重组到植物表达载体中；在植物表达载体中，该基因转录可由原启动子启动，或由来自其它基因的植物特异的启动子肩动，编码区后为植物基因的3’尾巴区。产生的融合基因应能在植物细胞中实现有效表达。 

本发明所说的基因正向形式插入是指在植物的启动子序列后面正确连接上TsDREB2A基因的完整编码框，即第一个密码子紧靠启动子，转录产物为正义mRNA。要求转录产物在细胞内基本稳定，不受制于是组成型启动子或诱导型启动子。 

本发明所说的植物抗逆性是指植物在整株、器官和／或细胞水平上表现出的耐 (抗)早性、耐(抗)盐性、耐冷性、抗寒性、抗(耐)辐射性、抗病性、抗虫性、抗除草剂等特性及其组合。这种抗(耐)性在植株水平表现在某些发育阶段或全生育期，可通过多种指标衡量和评价。 

与转入单个抗逆逆相关功能基因相比，转入一个逆境诱导的转录因子可以调控多个与抗逆有关基因的表达，本发明所述的从盐生植物盐芥中克隆的TsDREB2A基因既是一个受干旱和盐胁迫诱导的转录因子基因。将该转录因子基因采用农杆菌介导法或基因枪轰击法等转入玉米，对其后代植株进行分子检测和抗旱抗盐性鉴定以及相关的生理指标测定，验证TsDREB2A是否有着DREB转录因予家族成员的功能，和在转基因植株内表达达能否提高植株的耐早性和耐盐性，以及过表达TsDREB2A基因的转基因玉米植株是否在耐干早耐盐碱性上比对照植株明显提高的同时也能够保持其生长发育正常。 

该发明筛选出了抗逆性好的转基因玉米株系，为利用转基因技术培育玉米抗逆新品种的工作奠定了基础；所获得的转基因植株，还可以用于研究植物对胁迫反应的信号转导 网络及基因表达的变化，为揭示植物的耐旱耐盐机制提供有用的研究材料。     

TsDREB2A序列的基本特征 

TsDREB2A基因注册号为：GI:45356796。通过NCBI中的ORF finder在线分析发现，在我们所测序的1459核苷酸中，1到242为该基因的5’非翻译区；243到1265为蛋白质编码区，该基因编码一个含有339个氨基酸的蛋白质序列；1266到1459为3’非翻译区和部分poly A+尾巴。通过Blast比对分析发现其基因序列与拟南芥的DREB2A基因序列有85％的相似性，其蛋白质序列与拟南芥AtDREB2A基因产物之间存在71%的相似性。通过Clustal W进行聚类分析，表明克隆的TsDREB2A基因与拟南芥的DREB2B、DREB2A有较近的进化关系。 

TsDREB2A基因的重组 

采用常规分子克隆技术将TsDREB2A基因的全长序列重组入植物双元表达载体pROK或pCam系列等植物表达载体中获得正向插入的重组质粒。可根据受体植物和所需的TsDREB2A基因表达强度及可调控程度，融合基因可选用分别适合于单、双子叶植物和不同低等生物的启动子，可选择植物器官或发育阶段特异性的启动子，或对特异信号 (包括逆境信号、化学信号等)发生反应的诱导型启动子。融合基因可选择不同3 ^，尾巴区，也可插入增强子序列，也可在编码区插入不同内含子。重组质粒可分别导入大肠杆菌或农杆菌中增殖或/和保存。 

用含有TsDREB2A基因的植物表达载体转化玉米(Zea Mays L.)，具体所使用的玉米品系为昌7-2自交系和郑58自交系，并获得了耐盐耐旱的转基因玉米植株。根据转基因受体材料的不同可选用不同转基因方法获得转基因植物。 

常用的将外源DNA导入植物受体细胞的方法主要有三种：①载体介导转化法，包括农杆菌介导法、病毒介导法等；②DNA直接导入法，包括基因枪法、电击法、聚乙二醇(PEG)法、超声波法等；③种质系统转化法，包括花粉管通道法、子房注射法、生殖细胞浸泡法等。目前在玉米转基因育种研究中主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法。本发明中以玉米无菌苗茎尖为材料，采用农杆菌介导法进行遗传转化并获得耐旱耐盐性明显提高的转基因玉米株系及其后代，为盐碱地适用玉米种质培育提供了可用的材料。 

这里应特别指出的是，虽然在本发明的下述实施例中以转基因玉米(包括昌7-2自交系和郑58自交系两种类型)的产生及检测举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味着本发明制备的TsDREB2A基因及其所用的植物表达载体只用于转化和产生表达TsDREB2A基因编码蛋白的玉米，还包括其它其他植物如小麦等重要农作物。因为本领域的技术人员可以利用本专利构建好的TsDREB2A基因表达载体并利用本专利提供的植物遗传转化方法转化其它植物特别是重要经济植物。 

玉米无菌苗茎尖的遗传转化 

玉米种子（包括昌7-2自交系和郑58自交系）经70％乙醇浸泡5~10min，无菌水洗涤三次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡7~10min，然后用无菌水洗涤3至5遍。灭菌期间不断搅拌种子以保证种子表面灭菌彻底。灭菌后的种子放在可保持湿润的无菌罐头瓶内或将其放 在MS培养基上黑暗条件(23±2℃)下培养3~5天，待胚芽伸长至2~5cm时，用解剖刀剥去无菌苗的胚芽鞘及幼叶，使芽尖暴露，再用解剖刀从中部纵向切伤茎尖生长点。切伤茎尖的无菌苗用于农杆菌转化。 

将带有目的质粒的根癌农杆菌LBA4404在附加抗生素的YEP培养基中28℃下震荡培养，使细菌处于对数生长期，震荡速率为180rpm。然后在3000rpm下离心5分钟，弃上清液。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮(acecosyringone，As)的MS液体培养基重悬。然后将菌液倒在直径5cm的培养皿中，倾斜培养皿，使已被切伤的无菌苗茎端浸泡在菌液中，抽真空（0.05MPa)并使之感染7～10min。 

浸染后的茎尖用无菌滤纸吸干，将小苗置于MS培养基上黑暗培养3天（共培养）。培养温度为22~24℃。3天后将暗培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层土壤的花盆中，并用松散湿润的蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，昼夜温度分别保持在22~28℃和l5~20℃。适度浇灌l／2MS培养基的无机盐溶液并精心管理，待小苗长至3叶期时均匀喷洒合适浓度的除草剂溶液进行初步筛选，除草剂的喷洒量以植株叶片掉液滴为宜，重复一次。喷洒后植株置温室或日光下生长，以白天温度不高于28℃、夜间温度不低于10℃为宜，日光照12h左右，每天浇水1次。移入田间时统计植株成活率，田间植株行常规田间管理。提取已成活苗的幼嫩叶片DNA进行PCR检测。 

以als为筛选标记基因的转化小苗用除草剂氯磺隆(chlorsulfuron)进行筛选，使用浓度为0.25％(w/v)。喷洒后未转基因对照植株几乎全部死亡，转基因植株表现出抗性。l5天后将转基因植株移栽到田间。喷洒除草剂后，转正义DREB2A基因的玉米株系的5叶期成活率可达到18%，非转基因对照株系的植株死亡率达99%以上。 

转基因植株耐盐耐旱性检测及其应用 

经过抗除草剂筛选和PCR检测筛选的T₀转化植株，经套袋自交授粉产生或姊妹自交授粉获得T1代种子，T1种子及非转基因对照种子播种在盛装盐碱土的花盆中或盐碱地中，施以同样的水肥管理，转基因植株可以在盐碱土或盐碱地中实现良好的生长发育，表现出比对照明显提高了的耐盐性。 

在5~7叶期或13叶期之前提取转基因植株叶片DNA和RNA，分别用于进行PCR、Southern-Blot和Northern-Blot检测。采用PCR检测转基因植株时，每株系每代随机取30个左右的个体进行检测，统计PCR检测阳性植株的比例。通过卡方检验推定外源基因在转基因植株中的遗传性为是否符合孟德尔遗传规律。 

PCR、Southern-Blot检测结果证明TsDREB2A基因已经转入玉米叶片细胞中，Northern杂交分析表明TsDREB2A基因在这些转基因植株中过表达，在未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株中TsDREB2A基因的表达水平无明显差异（不表达）。 

将转TsDREB2A基因玉米及非转基因植株的种子置于培养皿中，进行模拟干旱处理及盐胁迫处理下的萌发试验，结果显示即使在30%PEG（W/V）浇灌处理下，转基因种子仍可以吸涨并萌发，而对照种子已经不能萌发；在2%氯化钠（W/V）浇灌处理下，转基因种子仍可以萌发，而对照种子已经不能萌发。 

将转TsDREB2A基因玉米及非转基因植株的种子播种在花盆中，分别在苗期（3~7叶期）和开花前期（9~13叶期）、开花期进行干旱胁迫处理，检测干旱处理对转基因玉米生长发育的影响、细胞膜受损程度及其他主要经济性状，评价转基因植株的耐干旱性。 

综合多方面的测试结果，证明了转正义TsDREB2A基因玉米比对照玉米表现出在耐干旱性和耐盐碱性上有了明显提高。 

选出的耐盐碱耐干旱性优异的转基因植株进行套袋自交授粉，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因玉米自交系，用于耐盐玉米杂交种的培育。 

具体实施方式

实施例1  受体系统的建立  

以选用优良玉米自交系昌7-2和郑58等的自交系种子为材料，使之在无菌条件下萌发并获得健壮无菌幼苗。 

种子萌发及幼苗培养基成分：KNO₃ 1900mg/l,NH4NO3 1650 mg/l,CaCl2·2H2O 440 mg/l，MgSO4·7H2O 370 mg/l，KH2PO4 170 mg/l, FeSO4·7H2O 27.8 mg/l ,Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg/l,KI 0.83 mg/l，H3BO3 10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3 mg/l，ZnSO4·7H2O 10 mg/l，Na2MnO4·2H2O 0.25 mg/l，CuSO4·5H2O 0.025 mg/l，CoCl2·6H2O 0.025 mg/l, 盐酸硫胺素10.0 mg/l盐酸毗哆醇1.0 mg/l，烟酸1.0 mg/l，甘氨酸2.0 mg/l，生物素0.05 mg/l，酪蛋白水解物500.0 mg/l，蔗糖30.0g/l,, 琼脂粉6.5/L,培养基pH5.8~6.0。液体培养基中不加入琼脂粉。 

种子灭菌和萌发方法：选用饱满的玉米自交系种子，玉米种子经70％乙醇浸泡5~10min，无菌水洗涤三次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡7~10min，然后用无菌水洗涤3至5遍。灭菌期间不断搅拌种子，以保证种子表面灭菌彻底。灭菌后的种子接种于MS培养基中进行暗培养，待胚芽长至2～3 cm后可作为转化受体使用。 

实施例2  携带TsDREB2A基因的植物表达载体的构建 

采用常规分子克隆技术将TsDREB2A基因的全长序列重组入植物双元表达载体pROK-pCam系列等植物表达载体中获得正向插入的重组质粒。具体做法是：将TsDREB2A基因连接到T/ A克隆载体pGEM-T easy载体上，用限制内切酶EcoRI 从带有TsDREB2A 基因的Pgem-T easy载体上切下TsDREB2A基因片段, 加EcoRI-KpnI 接头,在经过KpnI 酶切后,回收两侧带有KpnI 酶切位点的TsDREB2A 基因片段,将构建好的带有除草剂氯磺隆抗性基因als 和玉米ubiquitin 启动子( Pubi) 的植物表达载体用限制内切酶KpnI 酶切后,对载体片段的5′末端进行去磷酸化，然后将两侧带有KpnI 酶切位点的TsDREB2A基因片段与脱磷的载体进行连接，构建了将TsDREB2A基因置于玉米ubiquitin启动子（泛素蛋白基因的5’端调控区）的启动之下的、适合单子叶植物的连接产物（重组质粒）。将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，筛选正确的转化子。 

可根据受体植物和所需的TsDREB2A基因的表达强度及可调控程度，融合基因可 选用分别适合于单、双子叶植物或不同发育阶段特异性启动子，可选择植物器官或发育阶段特异性的启动子，或对特异信号(包括逆境信号、化学信号、物理信号等)发生反应的诱导型启动子。融合基因可选择不同的3’尾巴区，也可插入增强子序列，也可在编码区插入不同内含子。重组质粒可分别导入大肠杆菌或农杆菌中增殖或/和保存。 

实施例3   以无菌玉米苗为受体的转化和转基因植株初步筛选 

将携带重组质粒（Ti质粒带有选择标记基因和TsDREB2A正义基因）的根瘤农杆菌（如LBA4404）在添加抗生素的LB培养基上（每升培养基含：胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,PH7.0，热压灭菌20min）中28℃震荡培养，震荡速度为120rpm（转/分），使细菌处于对数生长期。取对数生长期的根瘤农杆菌并在3000 rpm（转/分）下离心10min，弃上清液，菌体用1/2种子萌发培养基（液体培养基）洗涤，然后离心收集菌体。将收集的菌体用添加100μml/l乙酰丁香酮（acetosyringone,as）的液体种子萌发培养基悬浮，稀释5~20倍后用于遗传转化。 

待无菌玉米苗的胚芽伸长至2~5cm时，用解剖刀剥去胚芽鞘及幼叶，使芽尖暴露，再用解剖刀从中部纵向切伤茎尖生长点，然后放入盛有对数生长期的根瘤农杆菌悬浮菌液的无菌培养皿，使茎尖生长点与根瘤农杆菌悬浮菌液充分接触，在0.5×10⁵Pa大气压下处理3-6min. 

浸染后的茎尖用无菌滤纸吸干，将小苗置于MS培养基上黑暗培养3天（共培养）。培养温度为22~24℃。3天后将暗培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层土壤的花盆中，并用松散湿润的蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，昼夜温度分别保持在22~28℃和l 5~20℃。适度浇灌l／2MS培养基的无机盐溶液并精心管理。 

待被转化玉米幼苗长至3叶期时，均匀喷洒合适浓度的除草剂溶液进行初步筛选，除草剂的喷洒量以植株叶片掉液滴为宜，重复一次。喷洒后植株置温室或日光下生长，白天温度不高于28℃，夜间温度不低于10℃为宜，日光照12h左右，每天浇水1次。移入田间时统计植株成活率，田间植株按照常规管理措施管理。 

实施例4 转基因植株的筛选定植及分子生理检测 

将经除草剂筛选后存活的转基因植株移栽至含正常壤土的花盆中或田间，定植并行常规田间管理，待玉米苗长到5~7叶期时或13叶期之前提取幼嫩叶片DNA和RNA，分别用于进行PCR、Southern-Blot和Northern-Blot检测。进行PCR检测、Southern-blotting检测及重要干旱生理指标检测。 

采用PCR检测转基因植株时，每株系每代随机取30个左右的个体进行检测，统计PCR检测阳性植株的比例。通过卡方检验推定外源基因在转基因植株中的遗传性为是否符合孟德尔遗传规律。 

PCR、Southern-Blot检测结果证明TsDREB2A基因已经转入玉米叶片细胞中，Northern杂交分析表明TsDREB2A基因在这些转基因植株中过表达，在未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株中TsDREB2A基因的表达水平无明显差异（不表达）。 

使转TsDREB2A基因玉米及非转基因植株的种子置于培养皿中进行模拟干旱处理 及盐胁迫处理下萌发试验，在30%PEG（W/V）浇灌处理下，转基因种子仍可以吸涨并萌发，而作为对照的非转基因种子的萌发力已经明显降低；在2%氯化钠（W/V）浇灌处理下，转基因种子仍可以萌发，而对照组非转基因种子已经不能萌发。 

将转TsDREB2A基因玉米及非转基因植株的种子播种在花盆中，分别在苗期（3~7叶期）和开花前期（9~13叶期）、开花期进行干旱胁迫处理，按照生物化学及植物生理学实验方法进行重要生理指标检测，检测干旱处理对转基因玉米生长发育的影响、细胞膜受损程度及其他主要经济性状，评价转基因植株的耐干旱性。 

检测数据和分析结果支持转TsDREB2A基因玉米在抗盐碱性和抗干旱性上明显好于对照非转基因植株。 

Claims (6)

1.一种转TsDREB2A基因改变玉米耐高盐耐干旱性的应用，其特征是：将从盐芥中克隆的TsDREB2A基因以正义形式重组到植物表达载体中，通过转基因技术将重组基因导入玉米细胞，获得转基因玉米；通过检测被转入目标基因的表达和在盐碱土及盐碱地中进行转基因植物的种植进行抗性鉴定，从中筛选耐盐碱耐干旱性被明显提高了的转基因植株及其后代，筛选出具有育种应用潜力的新种质和新品种。

2.如权利要求1所述转TsDREB2A基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述TsDREB2A基因有cDNA形式或基因组形式，其编码序列以正义形式构建成融合基因，或带有原有启动子并转入玉米体内。

3.如权利要求1所述转TsDREB2A基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述用于构建融合基因的TsDREB2A基因的形式为基因的全长序列，或根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸。

4.如权利要求1所述转TsDREB2A基因改变玉米耐盐碱耐干旱性的应用，其特征是，所述应用是通过转TsDREB2A基因或依据TsDREB2A基因序列设计的多核苷酸序列获得的耐盐碱耐干旱能力明显提高的转基因植物。

5.如权利要求1所述转TsDREB2A基因改变玉米耐高盐耐干旱性状的应用，其特征是，所述应用是通过转TsDREB2A基因获得的耐盐碱耐干旱能力明显提高的转基因玉米植株及后代。

6.如权利要求1所述转TsDREB2A基因改变玉米高耐盐耐干旱性的应用，其特征是，所述的玉米高耐盐耐干旱性包括玉米耐盐性和玉米耐干旱性。