CN105400804B

CN105400804B - 一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因及其应用

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Publication number: CN105400804B
Application number: CN201510970988.9A
Authority: CN
Inventors: 李田; 孙景宽; 陆兆华; 刘京涛; 夏江宝; 宋爱云
Original assignee: Binzhou University
Current assignee: Binzhou University
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2035-12-22
Also published as: CN105400804A

Abstract

本发明涉及一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因及其应用。一种控制绒毛白蜡耐盐特性的FvNCED3基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明首次从绒毛白蜡中发现了与增强植物耐盐性相关的绒毛白蜡FvNCED3基因，经试验证明绒毛白蜡FvNCED3基因具有较好的应用前景，尤其对于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潜在应用价值，同时为研究整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，为利用植物基因工程的方法改良作物抗逆性，创造新的抗逆树种提供基因基础。

Description

一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

绒毛白蜡(Fraxinus velutina Torr.)是优良的盐碱地造林绿化和城市园林绿化树种，也是常用的固沙树种，具有耐盐、抗旱、耐寒及抗病虫害等优点，是重要的林木种质资源。但目前有关绒毛白蜡耐逆分子机制的研究鲜有报道，从中分离得到的天然优良基因更少，其大部分基因的功能仍处于未知状态。因此，有必要加强对绒毛白蜡等代表性木本植物的分子生物学研究，挖掘其中的关键耐逆基因，从而为植物耐逆性状的遗传改良提供理论依据及新的基因资源。

脱落酸(ABA)是一种重要的植物激素，在盐胁迫响应中具有重要作用。盐胁迫引起的植物内源ABA水平的提高，是植物对外界环境刺激积极适应的表现，这是因为ABA不仅可作为细胞信号物质通过调节气孔关闭以降低蒸腾作用来介导植株的耐盐响应，还可作为系统逆境信号诱导许多抗逆基因的表达，近而发挥其耐盐调控作用。ABA通过上述途径诱导植物向耐盐代谢调节途径转化，最终增强植物对外界盐胁迫的适应性。因此关于ABA与植物耐盐性关系的研究一直是植物耐盐机制研究中的热点之一。

ABA可参与调控植物对多种逆境胁迫的应答，目前通过多种途径证实了ABA在高盐引起的渗透胁迫中的重要调控作用。盐胁迫下，植物体内ABA含量增加，盐胁迫诱导ABA合成主要通过调节ABA合成基因的转录水平来实现，高盐环境诱导ABA合成相关基因的表达量上调，从而大量合成ABA促进植物对外界胁迫的适应。对耐盐性不同的植物，如棉花、大麦、番茄等的研究表明，ABA可调节这些植物对长期盐胁迫的适应性，且外施ABA可增强植物对盐胁迫的耐受性。此外，对拟南芥aba1、aba2、aba3突变体的研究发现，高盐处理下，上述ABA缺失突变体比野生型植株更容易枯萎和死亡，而拟南芥超敏感突变体era1对高盐干旱等胁迫的抗性增强。上述研究表明了ABA在植物耐盐调控中所发挥的关键作用，因此进一步加强木本植物中ABA信号通路相关基因克隆及功能研究尤为必要。

盐胁迫会引起一系列的信号转导过程，其中ABA信号转导途径在盐胁迫的应答反应中起关键作用。通过复杂的信号网络系统，ABA可诱导一系列与盐胁迫相关基因的表达来增强植物的耐盐性，其中一类为离子转运基因、渗透调节基因、晚期胚胎丰富蛋白基因以及抗氧化物酶等功能基因，另一类为转录因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶等调控基因。许多盐胁迫应答基因受ABA的调控而表达，属于ABA依赖型胁迫应答基因。目前发现的ABA诱导所必需的顺式调控序列主要包括：ABRE元件，CE3序列，RY/Sph元件及MYB和MYC识别序列。此外，拟南芥中还发现了许多与ABA信号途径有关的基因，如AREB、SnRK2、PP2C、ABI1、ABI2、RD29等。其中AREB/ABFs是一类ABRE结合蛋白-bZIP类转录因子，而SnRK2和PP2C在ABA信号途径中则分别作为正向和反向调控因子发挥作用。结合上述研究基础，分析转基因植株中ABA信号途径相关基因的表达变化对于揭示绒毛白蜡NCED基因在ABA信号途径中的作用及其耐盐机制具有重要的研究意义。

ABA生物合成是ABA信号产生的基础，其中NCED是ABA生物合成的关键限速酶，因此ABA合成关键酶基因NCED的启动是操纵ABA信号产生的重要机制。鉴于NCED在ABA合成途径中的关键作用，因此克隆和分析与耐盐相关的各类NCED基因一直是植物耐盐分子研究领域的热点之一。目前已在多种植物中发现了参与调控植物耐盐性的NCED基因。草本植物中，拟南芥的AtNCED3和柱花草SgNCED均可受高盐等胁迫条件诱导，其中过表达AtNCED3可使拟南芥内源ABA水平提高，且转基因株系表现出呼吸速率降低等耐盐性状；而过表达SgNCED的转基因烟草则是通过增加内源ABA、H₂O₂、NO以及抗氧化酶的表达水平来增强植物耐盐等性状。此外，在藏红花中也发现了与调控植物耐盐抗旱等性状相关的CstNCED基因。近来有关NCED基因在木本植物中的耐盐调控研究也受到了人们的关注。其中海棠MhNCED3基因可被高盐等胁迫诱导，其内源ABA含量与基因表达呈正相关，过表达及恢复实验表明该基因具有调控植物耐盐方面的功能。而柑橘中受ABA等多种胁迫诱导的CrNCED1基因不仅可降低转基因烟草中H₂O₂和O₂ ^-的含量，还可显著上调参与ROS清除以及维持水分平衡相关基因(NtCAT、NtSOD、NtP5CS、NtLEA5、NtERD10C)的表达，从而使植株表现出较强的耐盐抗旱等特性。从上述NCED基因通过调控ABA的合成来增强植物的耐盐性研究来看，利用基因工程手段导入各类NCED基因将成为增强植物耐逆性的有效途径之一。

上述研究结果表明，9’-顺环氧类胡萝卜素双加氧化酶(NCED)作为调节ABA生物合成途径中的关键限速酶，通过提高该类NCED基因的表达水平可增强植物的耐盐抗旱等抗逆能力。但目前未见有关绒毛白蜡ABA生物合成途径及相关合成基因NCED的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因及其应用。

一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种由上述FvNCED3基因编码的多肽，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种插入上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。

一种重组细胞，插入了上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No.1序列的载体。

上述FvNCED3基因、载体或重组细胞在经济作物生产改良中的应用。

有益效果

本发明首次从绒毛白蜡中发现了与增强植物耐盐性相关的绒毛白蜡FvNCED3基因，qRT-PCR方法分析表明在200mM NaCl胁迫处理下，FvNCED3在24h时表达量最高；且FvNCED3基因的过量表达植株较野生型表现出较好的耐盐性。经试验证明绒毛白蜡FvNCED3基因具有巨大的应用前景，尤其对于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潜在应用价值，同时为研究整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，为利用植物基因工程的方法改良作物抗逆性，创造新的抗逆树种提供基因基础。

附图说明

图1是绒毛白蜡FvNCED3的进化树分析图；

图2是绒毛白蜡FvNCED3基因在盐胁迫处理下的表达模式qRT-PCR分析图；

图3是转基因植株的PCR检测电泳图；

其中：M、DL2000；1-8、FvNCED3转基因植株；9、野生型植株。

图4是FvNCED3转基因植株在盐胁迫下的根长及鲜重图；

其中：WT、野生型对照；OE2，OE5，OE7：转基因植株*表示差异达0.05显著水平,**表示差异达0.01显著水平。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例

1、实验方法与步骤

1.1材料的处理

以播种于相同基质中且长势一致的苗龄为1个月的绒毛白蜡幼苗为材料。分别用200mM NaCl处理绒毛白蜡幼苗0h，12h，24h，48h，每组3个生物学重复。荧光定量PCR法进行基因表达模式分析，2^-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

1.2基因的克隆

分别称取上述处理好的材料10mg放在液氮预冷过的研钵中充分研磨至粉末状；将研磨好的粉末移入加有提取液的1.5ml离心管。然后按照E.Z.N.A Total RNA Kit试剂盒说明书的操作要求分别提取上述处理好的绒毛白蜡各组织的总RNA。之后配制1.2wt％的琼脂糖凝胶电泳检测目的RNA的完整性。

利用3’RACE方法扩增FvNCED3基因的cDNA序列。具体操作方法如下：

将mRNA反转录成第一链cDNA，使用Takara公司3’-Full Race试剂盒进行反转录，反应体系为10μl。

依次加入：

Total RNA(1μg/μl)5.5μl， 3’Race adaptor 1μl，

5×PrimerScript Buffer 2μl， dNTP Mixture(各10mM)1μl，

RNase Inhibitor 0.25μl， PrimerScript RTaes 0.25μl。

体系混匀后，按以下条件进行反转录：42℃60min，70℃15min。以第一链cDNA为模板进行3’RACE扩增，所用引物为：

FvNCED3 specific outer primer：5′-ATGGCTGCTGCTGTAACACCTTC-3′SEQ IDNO.3

3’Race outer primer：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′SEQ ID NO.4

50μlPCR反应体系中，依次加入：

cDNA 2μl， 1×cDNA dilution Buffer II 8μl，

FvNCED3 specific outer primer(10mM)2μl， 3’Race outer primer(10mM)2μl，

10×LAPCR Buffer II(Mg²⁺plus)4μl， Takara LA Taq 0.25μl，ddH₂O 31.75μl。

PCR反应条件：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃终延伸10分钟，4℃保存。

PCR产物采用1wt％重量比的琼脂糖凝胶进行电泳，按照胶回收试剂盒(OMEGA公司)进行回收，操作如下：

将包含PCR目的产物的琼脂糖凝胶切下放入小离心管中，加入3倍体积溶胶液后55℃水浴至胶完全融化。将混合液转入吸附柱内，于12000rpm离心1min，弃废液。加入600μl漂洗液漂洗吸附柱，于12000rpm离心1min，弃废液。重复漂洗一次，弃废液。12000rpm离心2min甩干吸附柱后2，将其移至1.5ml灭菌离心管中。加入30μl 65℃预热的Elution Buffer至吸附柱膜上，12000rpm离心1min回收DNA溶液，制得PCR产物。

回收后连接于T3 Easy vector(北京全式金生物技术有限公司)。

连接体系5μl：1μl T3 Easy vector，4μl PCR产物。

25℃连接20分钟，将连接产物转化DH5α感受态细胞。PCR筛选阳性克隆后送测序。利用ORF Finder对所获得的基因序列进行分析，表明其5'端包含FvNCED3基因的起始密码子ATG。将测序得到的3’RACE序列与其拼接得到FvNCED3的全长cDNA序列。

1.3基因的表达分析

通过qRT-PCR方法对FvNCED3进行了盐胁迫下的基因表达分析。具体方法如下：

分别对NaCl胁迫处理不同时间段的绒毛白蜡嫩叶组织提取后得到的总RNA进行反转录，获得其各自的cDNA模板，设计绒毛白蜡β-actin序列的特异引物，

β-actin-F：5'-GCACCACTCAACCCCAAGG-3', SEQ ID NO.5

β-actin-R：5'-TCACCCGAATCCAGCACAA-3' SEQ ID NO.6

根据Race方法克隆到的FvNCED3全长cDNA序列，设计qRT-PCR反应引物：

qRT-F：5′-ATTGCTTTTGCTTTCACCTCTG-3′， SEQ ID NO.7

qRT-R：5′-TGTTTCTGTTCACCATTCCTGC-3′ SEQ ID NO.8

以提取的绒毛白蜡各处理后叶片组织的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增。

qRT-PCR扩增体系包括：

SYBR Premix Ex Taq II 10μl，上下游特异性引物(10μM)各0.8μl，

cDNA模板2.0μl，加ddH₂O 6.4μl至总体系20μl。

扩增条件为：

95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；60℃收集荧光。采用2^一△△Ct相对定量的方法进行表达量的比较。

1.4植物表达载体的构建

通过构建pROKII-FvNCED3载体转化烟草进行基因功能的验证。具体操作方法如下：

设计包括开放阅读框的引物，上游引物引入BamHI(GGATCC)位点，下游引物引入SacI(GAGCTC)位点。采用引物：

FvNCED3-F：5’-CGCGGATCCATGGCTGCTGCTGTAACACCTTC-3’SEQ ID NO.9

FvNCED3-R：5’-GAGCTCTTAGGCTTGATTTGCTAGGTCG-3’SEQ ID NO.10

以包含目的基因的质粒为模板，进行PCR扩增获得包含相应酶切位点的FvNCED3基因。

PCR扩增体系包括：

10×PCR Buffer 2μl， 2.5mM dNTP 4μl，

cDNA 1μl，上下游引物各0.5μl(10mM)，

LA Taq DNA聚合酶0.1μl，加ddH₂O至20μl。

PCR反应条件：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

将PCR产物电泳回收后连于T3Easy克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。PCR筛选阳性克隆后送测序。

分别用BamHI和SacI快速酶(Fermantus公司)酶切包含目的基因片段的质粒和载体pROKII质粒，操作如下：

酶切体系各100μl，包括10μl 10×FD Green Buffer，40μl包含目基因的质粒/载体pROKII，5μl FD BamHI，5μl FD SacI和40μl ddH₂O。于37℃水浴15min。

将包含目的DNA片段及载体片段的琼脂糖凝胶依次切下，分别放入小离心管中。酶切产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，按照前面所述PCR产物胶回收操作进行。

将回收的基因片段连接入植物表达载体pROKII中，操作如下：

连接体系20μl，包括4μl回收的pROKII载体，8μl回收的基因片段，2μl 10×T4连接酶缓冲液和1μl T4连接酶，最后加ddH₂O至20μl，16℃过夜连接。

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆后，酶切鉴定并送测序。

1.5拟南芥的遗传转化

将构建好的pROKII-FvNCED3重组质粒转入农杆菌LBA4404(Biovector公司)，操作如下：

加1μl重组质粒至200μl感受态细胞中，冰浴30min。液氮冷冻1min；37℃水浴3min。加入800μl YEB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，pH＝7.2)，28℃摇菌4h，6000rpm离心5min；100μl YEB重悬沉淀后涂布于含100μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平的YEB平板上，28℃培养2～3天。待菌落长出后，挑取单菌落至含100μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平的10ml YEB液体培养基中，28℃，3000rpm摇菌4～6h后进行菌液PCR验证。

采用拟南芥浸花法进行农杆菌的转化。操作如下：

拟南芥转化植株的培养：

将4℃春花3-4天后的拟南芥种子，播种于蛭石:营养土＝3:1(质量比)的培养土中，待其萌发生长1周后，将其分株至装有上述培养土的小花盆中，每盆播种1株，共播种10盆。22℃，湿度60％条件下培养，直至其长出花序。侵染前1天，将拟南芥苗浇透。

浸花法农杆菌侵染菌液的制备：

挑取单菌落至含100μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平的10ml YEB液体培养基中，28℃，3000rpm摇菌过夜。将过夜活化后的菌液按1：400比例转至100ml YEP+Kan+Rif液体培养基中，3000rpm摇菌5-6h，测OD₆₀₀值。当菌液OD₆₀₀达到1.5～3.0时，灭菌离心管收集菌液，4℃，4000rpm离心15min。用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD₆₀₀为0.8～1.0。用200μl移液枪吸取少量重悬液，逐一滴在拟南芥花序上进行侵染。侵染完毕后，用黑色塑料袋罩住花序，留出通气孔后避光培养2～3天后，转入正常条件下生长。拟南芥接种前，每隔3～4天可重复侵染1次，以提高转化率。约30天后，收获种子。

转化后拟南芥种子的筛选：将转基因种子用10wt％NaClO消毒10min，无菌水冲洗5～6次，每次充分洗涤；用无菌水将转基因种子置于含50μg/ml Kan的1/2MS平板上，4℃暗培养1～2天后，转入22℃正常光照条件下生长。2周后观察生长状况，抗性种子可正常生长萌发而非转基因种子则不能萌发或无法生长。将筛选到的转基因幼苗小心移入培养土中，覆盖以保鲜膜培养4～5天后，转入正常培养条件，直至其开花结果。生长1个月后，收集其种子，进行筛选，直至筛选到T3代纯合体，用于后续试验。

1.6转基因植株的鉴定

以T1代拟南芥叶片为材料，进行转基因烟草的PCR检测。操作如下：

CTAB法提取转基因拟南芥叶片基因组DNA，以重组载体为阳性对照，野生型拟南芥基因组DNA和无菌双蒸水为阴性对照，用基因特异的引物进行PCR检测。

10μl PCR反应体系中，依次加入TaqMix 5μl，DNA模板1μl，FvNCED3-F和FvNCED3-R引物各0.5μl，dd H₂O 3μl。

PCR反应条件：

预变性94℃5分钟；变性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃1min 30s，32个循环；72℃终延伸10分钟，4℃保存。

1.0wt％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增获得与目的基因长度一致的长2087bp的片段，确定该植株为阳性转基因植株。

1.7 FvNCED3转基因植株的耐盐性鉴定

将FvNCED3转基因株系(OE2，OE5，OE7)及野生型拟南芥种子放置于滴加少量清水的培养皿中，4℃春化3天。将春花后的种子经NaClO消毒后，播于1/2MS培养基中，光照培养4天后，将萌发的种子转移至含有NaCl浓度分别为50、100和150mmol/L的MS培养基上，垂直培养7天，测量植物的根长及鲜重，每个株系重复测定3次。

2、实验结果

2.1 FvNCED3基因的克隆

对绒毛白蜡表达谱测序获得的NCED Unigene序列进行分析，发现其3’端不完整，在此基础上，设计基因特异性引物，通过3’RACE方法获得绒毛白蜡NCED基因的3’端，将其与已知5’端序列拼接后获得其基因全长，如图1所示。经NCBI数据库比对，将其命名为FvNCED3。该基因全长2132bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共编码573个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。序列分析结果显示，FvNCED3蛋白分子质量为64.46kDa，等电点为5.98。蛋白保守结构域分析表明FvNCED3编码的氨基酸序列包含RPE65保守结构域，因此属于典型的NCED蛋白家族。

将获得的绒毛白蜡FvNCED3氨基酸序列通过DNAMAN软件进行比对，结果表明其编码的蛋白与多种植物物种编码的NCED蛋白具有较高的相似性，其中与芝麻(Sesamumindicum，XP_011098124.1)编码的蛋白相似性最高，为77.19％，其次为黄岑(Scutellariabaicalensis，AGN03861.1)和咖啡(Coffea canephora，ABA43901.1)，其相似度分别为75.71％和72.91％。利用Mega4.0软件构建系统进化树，从图1中可知，FvNCED3编码的蛋白与芝麻和黄岑的亲缘关系最近，其次与咖啡的亲缘关系相对较近，与莴苣的亲缘关系较远。

2.2 FvNCED3基因的表达分析

利用白蜡β-actin基因作为内参对照基因，通过qRT-PCR方法，对盐胁迫(200mMNaCl)不同处理时间段(0h，12h，24h，48h)的绒毛白蜡幼苗的叶片组织中FvNCED3基因的表达量变化趋势进行了分析。qRT-PCR结果如图2所示，经NaCl处理12h后，白蜡叶片组织中FvNCED3基因的表达量增加，但较无盐胁迫条件下，其差异不显著；24h胁迫处理后，其表达量显著性增加，为对照的10.12倍；处理48h后，基因表达量较24h时有所降低，但仍显著高于对照。上述结果表明，FvNCED3基因可对盐胁迫予以响应，且随着盐胁迫处理时间的延长，其基因表达量整体呈增加趋势，但随着盐胁迫时间的延长，其表达水平有一定的波动。

2.3转基因种子的筛选及PCR鉴定

将侵染后成熟的T1代拟南芥种子收集后，于含Kan抗生素的1/2MS平板上进行筛选，其中含抗性基因的转基因种子能在培养基上正常生长，长出的叶片呈绿色，而非转基因种子则无正常萌发，或者萌发后叶片呈黄的，最后不能正常生长。

进一步通过PCR方法对抗性筛选到的转基因植株进行鉴定。CTAB法提取转基因植株和对照植株的DNA，采用目的基因引物，PCR方法检测外源基因的转入。如图3所示，在转基因植株中扩增出与预期大小相一致的约2000bp的目的片段，而对照非转基因植株则未见目的条带。上述结果表明FvNCED3基因已经转入到拟南芥中。

2.4 FvNCED3转基因植株的耐盐性分析

对种子萌发后生长7天的转基因拟南芥进行测定，结果发现在无盐胁迫处理条件下，FvNCED3转基因株系的鲜重和根长与野生型对照无显著性差异。不同盐浓度胁迫处理后，除盐浓度为50mM外，其余盐浓度条件下(100mM和200mM)，FvNCED3转基因株系的鲜重均显著高于野生型对照，分别为对照的1.43倍和2.06倍。不同盐浓度胁迫条件下，转基因植株的根长测定结果显示，其均显著长于对照(图4)。上述结果初步表明，FvNCED3基因的过量表达可提高转基因植株的耐盐能力。

Claims

1.一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种由权利要求1所述FvNCED3基因编码的多肽，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种插入SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。

4.一种重组细胞，插入了SEQ ID No.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No.1序列的载体。

5.权利要求1所述FvNCED3基因、权利要求3所述载体或权利要求4所述重组细胞在经济作物生产改良中的应用。