KR101197246B1 - 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 유래의 ｓｔｆ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 유래의 ｓｔｆ 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 유래의 STF 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 유래의 STF(S1 domain-containing Transcription Factor) 단백질, 상기 STF 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자를 침묵시켜 식물체 잎의 황색화를 유발시키는 방법, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 유전자를 식물체에서 과발현시켜 염 스트레스에 대한 내성이 증진된 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 증진된 식물체, 상기 식물체의 종자 및 STF 유전자를 포함하는, 식물체의 염 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 유래의 ＳＴＦ 유전자 및 이의 용도{STF gene from Nicotiana benthamiana involved in development of chloroplast and mitochondria in plant and uses thereof}
본 발명은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 유래의 ＳＴＦ 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 중요한 역할을 수행하는 식물의 STF 유전자의 새로운 정보를 제공할 수 있고, 또한 상기 STF 유전자 과발현 식물체를 통하여 염 스트레스에 내성이 증진된 품종의 개량 및 육종의 방법을 제공할 수 있다.
엽록체 유전자들의 전사는 최소 두 종류의 RNA 중합효소에 의해 수행되는데 한가지는 PEP (plastid-encoded multimeric RNA polymerase)이고, 또 하나는 NEP (nucleus-encoded phage-type RNA polymerase)이다. PEP는 엽록체에 유전자들이 있는 α2ββ'β"의 핵심 복합체(core complex)와 핵에 유전자가 있는 시그마 인자(sigma factor)의 결합체이며, 시그마 인자가 핵심 복합체에게 프로모터 특이성을 준다. 세포질에서 만들어져 소기관으로 이동하는 NEP 중합체는 최소 3개가 있는데, 한 개는 엽록체로 한 개는 미토콘드리아로 이동하며 나머지 하나는 두 소기관 모두로 이동한다. 엽록체 유전자들은 PEP만, NEP만, 또는 NEP 및 PEP 모두가 인지하는 프로모터를 가져 RNA 중합효소에 특이적으로 전사가 일어난다.
애기장대 엽록체에서 전사 복합체 (transcription complex)를 분리하여 질량 분석기를 이용하여 분석한 결과 PEP 서브유닛(subunit)들이 포함되어 있었고 그 외에도 40 내지 60개의 단백질이 포함되어 있었다. 그 중 하나의 단백질은 S1 도메인(domain)을 가지고 있었으며 흥미롭게도 이 단백질은 담배에서 PEP 복합체를 순수분리 하였을 때 그 안에도 포함되어 있었다. 이 단백질을 STF (S1 domain-containing Transcription Factor)로 명명하였으며, S1 도메인은 RNA 결합에 관련된 도메인이므로 STF가 RNA에 결합하는 능력이 있을 것으로 생각되었다. RNA에 결합하여 엽록체에서 기능을 하는 단백질들이 엽록체 내 RNA 프로세싱(processing), RNA 에디팅(editing), RNA 안정화 그리고 번역의 개시 및 신장 등에 관련되어 있음이 최근 발표되었다. 그러나 식물 세포에서 STF 단백질의 생화학적, 생리적 기능은 밝혀지지 않았다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 담배(Nicotiana benthamiana)에서 STF 유전자의 VIGS (virus-induced gene silencing), co-suppression 및 과발현을 통하여 STF 유전자의 세포 내 기능을 조사하였다. STF의 VIGS 또는 co-suppression으로 인한 유전자 침묵은 엽록체 발달의 이상을 초래하여 잎의 황색화를 유도하였고, STF co-suppression 개체는 암 조건에서 키운 뒤 빛으로 옮겼을 때 야생형이나 과발현체와는 달리 황색체(etioplast)에서 광합성능을 가진 엽록체로의 발달이 저해되었으며, 자엽에 저장된 영양분의 분해/이동도 비정상적이었다. 결국, STF의 지속적인 결핍은 틸라코이드막의 분해 등의 엽록체의 붕괴를 유발시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, STF의 과발현체는 고염 (high salinity)에 대해 내성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명은 식물의 STF 유전자의 전사를 조절하여 엽록체 및 미토콘드리아 발달에 관여하는 중요한 역할을 수행하는 새로운 정보를 확인하였고, 또한 상기 STF 유전자의 식물체 내의 과발현을 통하여 염 스트레스에 내성이 증진된 품종의 개량 및 육종 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 유래의 STF(S1 domain-containing Transcription Factor) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 STF 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 VIGS(Virus-Induced Gene Silencing)를 이용하여 식물체에서 침묵시켜 식물체 잎의 황색화를 유발시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 식물체에서 과발현시켜 염 스트레스에 대한 내성이 증진된 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 STF 유전자를 포함하는, 식물체의 염 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명을 통하여 엽록체 및 미토콘드리아 발달에 중요한 역할을 수행하는 식물의 STF 유전자의 새로운 정보를 제공할 수 있고, 또한 상기 STF 유전자 과발현 식물체를 통하여 염 스트레스에 내성이 증진된 품종의 개량 및 육종의 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 STF 및 STF와 연관된 단백질들의 서열을 정렬한 그림이다. 니코티아나 벤타미아나 STF와 애기장대 (STF-At 진뱅크 등록 번호 AY128335, At3g48500), 토마토 (STF-Le AK328494) 및 벼 (STF-Os AP003791)로부터의 상동체(homologs)의 단백질 서열이다.
도 2는 녹색형광단백질 (GFP)과 융합된 STF 단백질 (STF:GFP)의 엽록체 내의 위치를 관찰한 그림이다. A, 담배 원형질체를 총 길이의 STF의 GFP 융합 구축물(STF:GFP) 및 STF의 N-말단 영역(STF-N:GFP) 구축물로 형질전환시켰고, 형광 신호의 위치는 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 엽록체는 엽록소 자가 형광을 보여준다. 밝은 영역 이미지, GFP 및 엽록소 자가 형광이 관찰되었다. B, 관찰 전에 담배 원형질체를 STF:GFP 및 SiR:RFP 융합 구축물로 동시-형질전환시켰다. SiR (sulfite reductase)은 엽록체 핵양체(nucleoids)와 연관이 있고, 스트로마에 존재한다(Sato et al., 2001, FEBS Lett. 487:347-350).
도 3은 VIGS 구조물, TRV:STF VIGS 개체의 표현형, STF 과발현 및 co-suppression 식물체의 표현형과 내생 유전자의 발현억제 정도를 관찰한 그림이다. A, STF 구조 및 VIGS 구축물에서 사용된 cDNA 영역의 모식도. 박스는 S1 도메인을 포함하는 STF의 단백질 코딩 영역을 나타낸다. 세개의 VIGS 구축물은 바(bar)로 표시하였다. 반정량적 RT-PCR 분석을 위한 프라이머 세트의 위치를 나타낸다. aa, 아미노산. B, TRV 대조군 및 TRV:STF 형질전환 식물체의 VIGS 표현형. 식물체는 침윤 후 20일째 사진을 찍었다. C, 발아 후 2주째 야생형, STF-과발현 (OE5) 및 co-suppression (CS1 및 CS2) 형질전환 식물체로부터의 유묘의 형태. 스케일 바 = 3 mm. D, TRV, TRV:STF(N) 및 TRV:STF(C) 형질전환 식물체로부터 침윤된 잎 위의 4번째 잎의 형태 및 CS1 형질전환 식물체의 자손에서 끝으로부터 다섯번째 잎의 형태. E, 파종 후 2달째의 식물 형태. F, STF-A 및 STF-B 프라이머를 이용한 STF 전사체 수준의 반정량적 RT-PCR 분석. 그래프는 TRV:STF(N) 및 TRV:STF(C) 형질전환 식물체에서 TRV 대조군과 비교하여 STF 전사체 수준을 보여준다. G, STF-C 프라이머를 이용한 STF 전사체 수준의 반정량적 RT-PCR 분석. 그래프는 OE1, OE5, OE11, CS1 및 CS2 형질전환 식물체에서 야생형과 비교하여 STF 전사체 수준을 보여준다.
도 4는 야생형, TRV 대조군과 TRV:STF VIGS, STF 과발현 및 co-suppression 개체의 엽록체의 수 및 크기를 관찰한 그림이다. A, TRV 및 TRV:STF 형질전환 식물체로부터 잎 절편을 광학현미경으로 관찰하였다. 스케일 바 = 100 μm. B, TRV, TRV:STF, 야생형, OE5 및 CS1 형질전환 식물체로부터 잎 원형질체를 광학현미경으로 관찰하였다. C, 잎 원형질체에서 엽록체 (위) 및 미토콘드리아 (아래)의 각각 엽록소 자가형광(pseudo-colored purple) 및 TMRM 염색을 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. E, TRV 및 TRV:STF 형질전환 식물체로부터 개별적인 잎 원형질체에서 평균 엽록소 자가형광 및 TMRM 형광은 공초점 현미경으로 정량하였다. 데이터 포인트는 30개의 개별적인 원형질체의 평균±표준편차를 나타내는데, TRV 대조군의 퍼센트로 표현하였다. F-G, 야생형, OE5 및 CS1 형질전환 식물체로부터 개별적인 원형질체에서 엽록소 자가형광 (F) 및 TMRM (G)의 평균 형광을 공초점 현미경으로 정량하였다. 데이터 포인트는 30개의 개별적인 원형질체의 평균±표준편차를 나타내는데, TRV 대조군의 퍼센트로 표현하였다.
도 5는 야생형, TRV 대조군과 TRV:STF VIGS, STF 과발현 및 co-suppression 개체의 광합성 관련 단백질의 축적과 광합성 효율을 측정한 그림이다. A-B, 엽록체 단백질의 면역블럿 분석(A) 및 이 데이터의 정량(B). 야생형, CS1, OE5, TRV 및 TRV:STF 형질전환 식물체의 잎으로부터 분리된 총 단백질(15 ㎍)은 SDS-PAGE로 분리하였고, RbcL, Cyt f, D1, AtpB 및 PsaA에 대한 항체를 이용하여 면역블럿을 수행하였다(A). 상대적인 밴드 강도는 야생형의 밴드와 비교하여 계산하였다(B). C-D, 야생형, OE5 및 CS1 유묘에 대한 분광측정 및 형광측정 데이터. 각 값은 실험마다 3번 반복한 평균±표준편차를 나타낸다. PSII의 최대 양자 수율의 지시자로 최대 형광에 대한 다양한 형광의 비율인 Fv/Fm (C) 및 PSII를 통한 전자 수송 흐름(ETR)(D)을 측정하였다.
도 6은 야생형, TRV 대조군과 TRV:STF VIGS, STF 과발현 및 co-suppression 개체의 엽록체 내 유전자들의 mRNA 수준을 측정한 그림이다. TRV (레인 1), TRV:STF (레인 2), 야생형 (레인 3), OE1 및 OE5 (레인 4 및 5), 및 CS1 (레인 6) 형질전환 식물체의 잎으로부터 분리된 총 RNA(레인마다 20 ㎍)로 각각의 cDNA 프로브를 이용하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. (A, E) PEP (색소체를 코딩하는 multimeric RNA 중합효소)-의존적 유전자의 노던 블럿 분석 (A), 및 야생형과 비교한 상대적인 전사체 수준의 정량(E). (B, F) NEP (nucleus-encoded phage-type RNA polymerase) 및 PEP-의존적 유전자의 노던 블럿 분석 (B), 및 야생형과 비교한 상대적인 전사체 수준의 정량(F). (C, G) NEP-의존적 유전자의 노던 블럿 분석 (C), 및 야생형과 비교한 상대적인 전사체 수준의 정량(G). D, 각 형질전환 식물체를 위한 리보좀 RNA 수준은 EtBr(ethidium bromide) 염색으로 측정하였다.
도 7은 야생형 대조군과 STF co-suppression 개체의 엽록체 내 유전자들의 전사 효율을 엽록체 런-온 분석법을 이용하여 측정한 그림이다. A, 야생형 및 CS1 형질전환 식물체에서 엽록체 런-온 전사 분석. 방사선 표지된 RNA는 펄스-표지 반응(pulse-labeling reaction) 이후 엽록체로부터 정제되었고, 표시된 색소체 유전자의 cDNA 절편을 포함하는 블럿에 혼성화하였다. 핵-암호화(n-e) 유전자인 니코티아나 벤타미아나 Rae1는 음성 대조군으로 제공되었다(Lee et al., 2009, Plant J. 59:278-291). 각각의 프로브는 중복으로 존재했다. B, CS1 샘플의 상대적인 평균 밴드 강도는 야생형과 비교하여 계산되었다.
도 8은 광에 의해 유도되는 황색체(etioplast)로부터 엽록체로의 발달을 초미세구조 분석을 이용하여 야생형 대조군과 STF 과발현 및 co-suppression 개체에서 관찰한 그림이다. A, 암배양(Dark), 또는 암 조건 이후 광 조건에서 3시간(DL 3h) 또는 16시간( DL 16 h) 배양시킨 야생형, OE5 및 CS1 형질전환 식물체로부터 유묘의 표현형. B-O, 황색체에서 엽록체로 전이되는 동안 야생형 (B-H) 및 CS1 (I-O) 형질전환 식물체로부터 자엽 엽록체의 초미세구조 변화를 투과 전자 현미경으로 조사하였다. 화살표는 퇴화하는 황색체를 나타낸다(K). PLB, prolamellar body.
도 9는 STF 과발현 개체가 보이는 고염에 대한 저항성을 관찰한 그림이다.
A, STF 과발현체 (#5, 7, 9)와 야생형의 100 mM과 150 mM NaCl 배지에서의 발아와 성장을 관찰하였다. B, STF 과발현체 (#5, 7, 9)와 야생형 종자를 MS 배지에서 발아시킨 뒤 150 mM NaCl 배지로 옮긴 경우와 (germination-MS) 와 150 mM NaCl 배지에서 직접 발아시킨 후 성장을 관찰한 경우 (germination-NaCl)를 분석하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 STF(S1 domain-containing Transcription Factor) 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 STF 단백질의 범위는 니코티아나 벤타미아나로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 식물의 식물의 엽록체 및 미토콘드리아 발달에 관여하는 활성을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 STF 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 STF 유전자는 식물의 엽록체 및 미토콘드리아 발달에 관여하는 특징이 있으며, 서열번호 1의 염기서열은 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 유래의 STF 유전자를 나타내는 염기서열이다. STF 유전자는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 VIGS(Virus-Induced Gene Silencing)를 이용하여 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 식물체 잎의 황색화를 유발시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 유전자의 침묵은 VIGS 방법 외에도, 유전자를 침묵시키기 위해 당업계에 일반적으로 이용되는 방법이면 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al., 1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물이 될 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 담배(Nicotiana benthamiana)이다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는 염 스트레스에 대한 내성이 증진된 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물체에서 STF 유전자를 과발현시키는 방법으로는 상기 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 상기 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 상기 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기에서 "유전자의 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 바이러스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 외피 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 STF 유전자를 과발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 식물체의 제조방법에서, 상기 염은 NaCl일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 염의 농도는 고염, 바람직하게는 120~250mM, 더욱 바람직하게는 140~160mM, 더 더욱 바람직하게는 150mM이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 STF 유전자를 포함하는, 식물체의 염 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 서열번호 1의 염기서열은 니코티아나 벤타미아나 유래의 STF 유전자를 나타내는 염기서열이다. 본 발명의 조성물에서, 상기 STF 유전자는 유전자 서열에서 특정 염기서열의 삽입, 치환, 결실된 것을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. STF 유전자 분리
담배(Nicotiana benthamiana) 잎에서 RNA를 추출하여 SMART RACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa)를 이용해 RACE (rapid amplification of cDNA ends) PCR 용 cDNA를 합성하였다. RACE PCR 을 위한 프라이머 5‘- ATCCTCGTCACGGTGAAATATAGGCGC(서열번호 3) - 3' 와 STF 유전자의 3‘ 말단을 포함하는 EST 조각을 이용하여 5’-RACE PCR을 수행한 결과 시작코돈을 포함하는 약 800bp 의 STF 유전자 5‘말단을 검출 하였으며, 이 염기서열을 토대로 담배식물의 cDNA로부터 2,040 bp의 STF open reading frame을 검출하였다.
2. RT -PCR( Reverse transcription - PCR )
반정량적 RT-PCR은 Ahn 등이 서술한 방법으로 바이러스에 감염된 네 번째 잎에서 분리한 5㎍의 총 RNA를 가지고 수행하였다(Ahn et al., 2004, Plant J. 38, 969-981).
3. 조직화학적 ( Histochemical ) 분석
조직 절단과 현미경의 사용방법은 Ahn 등이 기재한 대로 수행하였고, VIGS 개체로부터 바이러스에 감염된 네 번째 잎을 사용하였다(Ahn et al., 2004, Plant J. 38, 969-981).
4. 공초점 레이저 주사현미경 관찰( Confocal Laser Scanning Microscopy )
미토콘드리아에 TMRM (Tetramethylrhodamine methyl ester; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 염색을 하기 위해, TMRM의 최종 농도가 200 nM이 되도록 잎의 원형질체에 첨가하였다. 25℃에서 1 ~ 2분 배양한 후에 원형질체는 현미경 슬라이드 위의 웰에 옮기고, 적색 형광 프로브를 관찰하기 위하여 BP560-615 (543 nm 여기, 560-615 nm 발광) 필터를 이용하여 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 510)으로 조사하였다. 정량적 이미지를 얻은 후, 데이터는 LSM 510 소프트웨어 (version 2.8)를 이용하여 분석하였다. 엽록소 자가형광(Chlorophyll autofluorescence)은 LP650 (여기 488 nm, 발광 650 nm) 광학 필터를 이용하여 관찰하였다. Cho 등이 기재한 방법으로 원형질체는 MitoTracker Green FM (Molecular probes, USA)으로 염색하였고, 엽록체는 DAPI로 염색하였다(Cho et al., 2004, Plant Cell 16, 2665-2682).
5. 엽록체 런-온( Run - On ) 전사 분석법
엽록체 런-온 전사 분석법은 용해된(lysed) 엽록체를 사용하여 수행하였다(Mullet and Klein, 1987, EMBO J. 6:1571-1579). 엽록체를 포함하는 똑같은 2개의 샘플(duplicate samples)은 총 50 ㎕의 런-온 전사 완충액(50 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 10 mM MgCl2 , 25 mM 아세트산 칼륨, 10 mM DTT(dithiothreitol), 125 mM ATP, CTP 및 GTP, 그리고 50 μCi α-[32P]-UTP)에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 방사능 표지된 RNA는 QIAzol (QIAGEN)을 사용하여 분리하였고, 색소체 유전자인 psaB, psbA, rps14, rbcL, rpoB 및 ycf2와 핵 유전자인 니코티아나 벤타미아나 Rae1 (Nicotiana benthamiana Rae1 )의 선택된 코딩 영역을 나타내는 100 pmol의 PCR 산물을 변성 및 스팟팅함으로써 제조한 DNA 블롯(blot)에 혼성화하였다(Lee et al., 2009, Plant J. 59:278-291). 신호의 강도는 BAS-2500 bioimage analyzer (Fuji film)로 영상화하였고, Analysis Life Science Research imaging system (Olympus)을 이용하여 정량하였다.
6. VIGS ( Virus - Induced Gene Silencing )
다양한 STF cDNA 절편을 PCR로 증폭하였고, BamHI 및 ApaI 부위를 이용하여 TRV 게놈의 일부를 포함하는 pTV00 벡터로 클로닝하였다(Cho et al., 2004, Plant Cell 16, 2665-2682). 재조합 pTV00 플라스미드 및 바이러스 복제에 필요한 RNA1을 포함하는 pBINTRA6 벡터로 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101을 각각 형질시켰다. 아그로박테리움의 배양액은 앞서 기술한대로 침윤(infiltration)을 위해 준비하였다(Kim et al., 2006, Plant cell 18:2341-2355). 니코티아나 벤타미아나(3주 된)의 세 번째 잎은 상기 아그로박테리움 현탁액과 가압 침윤시켰다. 상기 침윤된 잎 위의 네 번째 잎은 반정량적 RT-PCR에 사용되었다.
7. 니코티아나 벤타미아나에서 STF -과발현 형질전환 식물체의 제조
STF-과발현(OE) 식물체를 제조하기 위해, 총 길이의 STF 단백질-코딩 cDNA 영역이 CaMV35S 프로모터의 조절 하에 His tag으로 융합된 STF : His 구축물은 바이너리(binary) 벡터인 pCAMBIA1390로 클로닝하였다. STF : His 구축물을 포함하는 재조합 플라스미드는 아그로박테리움 투머파시엔스(LBA4404)로 도입시켰고, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용하여 니코티아나 벤타미아나를 형질전환시켰다. 형질전환 식물은 하이그로마이신(50 mg/L)을 포함하는 성장 배지에서 선발하였다.
8. STF 의 세포내 위치를 위한 공초점 현미경
총 길이의 코딩 영역(Met-1에서 Asp-680)에 해당하는 STF cDNA 및 N-말단 영역 (Met-1에서 Gln-199)은 STF:GFP 및 STF-N:GFP 융합 단백질을 만들기 위해 sGFP 플라스미드의 KpnI 및 SmaI 부위로 각각 클로닝하였다(Cho et al., 2004, Plant Cell 16, 2665-2682). 상기 GFP 융합 구축물은, SiR:RFP (Kang et al., 2010, Plant Mol . Biol. 72:569-583) 또는 STF-At:RFP와 단독 또는 조합으로, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환법에 의해 니코티아나 벤타미아나 유묘로부터 제조된 원형질체 내로 도입시켰다(Kim et al., 2006, Plant cell 18:2341-2355). 상기 GFP 및 RFP 융합 구축물의 발현은 앞서 기술한대로, 공초점 레이저 주사현미경(Carl Zeiss LSM 510)으로 형질전환 후 24시간에 모니터링 하였다(Cho et al, 2004, Plant Cell 16, 2665-2682).
9. 단백질 추출 및 면역블로팅( Immunoblotting )
잎 단백질 추출물은 추출 완충액(20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 및 프로테아제 저해제 칵테일)을 이용하여 제조하였고, 추출물의 단백질 농도는 단백질 분석 키트(Bio-Rad)로 측정하였다. 단백질 추출물(15㎍)은 SDS-PAGE로 분리한 후, 이동 완충액(10mM Tris, 192 mM 글리신 및 20% 메탄올)에서 Immobilon-P membrane(Millipore)으로 이동시켰다. 멤브레인(membrane) 준비 및 웨스턴 블로팅은 RbcL, Cyt f, D1, AtpB 및 PsaA (각각 1:5,000, 1:3,000, 1:10,000, 1:5,000 및 1:10,000 희석; Agrisera)에 대한 다클론 토끼 항체 및 호스래디쉬 퍼록시다제-콘쥬게이티드 염소 항-토끼 IgG 항체 (1:5,000 희석; GE Healthcare)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 신호는 ECL 화학발광 키트 (Amersham Pharmacia)를 사용하여 코닥 X-ray 필름으로 검출하였다. 신호 강도는 Analysis Life Science Research imaging system (Olympus)을 이용하여 정량하였다.
10. 노던 블롯 분석 및 반정량 RT - PCR
노던 블롯 분석을 위해, 총 RNA가 TRIzolTM 시약(Gibco-BRL)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 약 20 mg의 총 RNA를 5.1% (v/v) 포름알데히드를 포함하는 아가로스 겔에서 전기영동 시켰고, Zeta-probe GT 멤브레인 (BioRad)에 블로팅시켰다. 예비혼성화(prehybridization) 및 혼성화를 0.25 M 인산나트륨(pH 7.2) 및 7% SDS로 60℃에서 밤새 수행하였다. 상기 멤브레인은 20 mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 5% SDS로 실온에서 2번 세척하였고, 그 후 20 mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 1% SDS로 60℃에서 10분 동안 2번 세척하였다. 프로브에 대해, 필요한 cDNA는 공개된 서열을 기초로 하여 PCR로 증폭하였고, 서열 확인을 위해 클로닝하였다. 프로브는 Random Primer DNA Labeling Kit (TaKaRa)를 사용하여 표지하였다. 반정량적 RT-PCR를 5㎍의 총 RNA로 수행하였다(Kim et al., 2003, J. Biol . Chem . 278:19406-19415). 내인성 STF 전사체의 RT-PCR 검출에 사용된 프라이머 세트는 STF-A (5'-atgcaatttcttcaaacc-3'; 서열번호 4 및 5'-actaaaggcccagcccac-3'; 서열번호 5), STF -B (5'-atgtggatccaagtgct-3'; 서열번호 6 및 5'-atcctcaaacattccttc-3'; 서열번호 7) 및 STF-C (5'-atgcaatttcttcaaacc-3'; 서열번호 8 및 5'-atcctcaaacattccttc-3'; 서열번호 9)이다.
11. 엽록소 형광 파라미터( parameter )의 결정
각 형질전환 식물체 유래의 잎 디스크(disk)는 잎 디스크 챔버(disk chamber)에서 10분 동안 실온에서 암 적응시켰고, 그 후 공기중에 5% 이산화탄소를 공급하면서 700μmol 광자/m2/s 만큼의 빛의 세기를 비추어 잎 디스크를 5분 동안 배양하였다. 조명을 주는 동안, 암 적응된 잎에서 PSII의 최대 효율(Fv/Fm) 및 PSII의 효과적 양자 수율(1-F/Fm')의 평가는 Xe-PAM fluorometer (Heinz Walz, Effeltrich, Germany)를 이용하여 실온에서 수행하였다 (Kooten and Snel, 1990, Photosynth . Res. 25: 147-150). PSII를 통한 전자의 흐름(ETR)은 (1-F/Fm') × 0.5 × 방사 조도 × 잎 흡수율로 계산하였으며, 여기에서 F는 정상 상태 형광, Fm'는 조명(700μmol 광자/m2/s) 동안 최대 형광 수율, 0.5는 PSII가 흡수된 광자의 절반을 받는다고 가정한 인자이며, 잎 흡수율은 0.9로 계산하였다.
12. 투과 전자현미경( TEM ) 관찰
자엽(cotyledon) 및 잎은 2.5% (v/v) 글루타르알데히드로 고정시킨 후, 1% 오스뮴 테트라옥시드(osmium tetraoxide)로 고정하였다. 이어서 에탄올 시리즈(series)로 탈수시켜 Spurr's resin (EM Sciences, USA)으로 포매시켰다. 얇은 섹션(section)은 LKB III 초마이크로톰(ultramicrotome)을 이용하여 제조하였고, 5% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 및 3% 구연산 납(lead citrate)을 이용하여 순차적으로 염색한 후, JEOL 1200 EXII 투과 전자현미경으로 관찰하였다.
13. TMRM 및 DAPI 염색
TMRM 및 DAPI 염색과 공초점 레이저 주사현미경에 의한 검출은 Cho 등(2004, Plant Cell 16, 2665-2682)에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다.
14. STF -과발현 형질전환 식물체의 고염에 대한 저항성 관찰
STF가 과발현된 형질전환체의 T2 종자를 20%의 치아염소산나트륨 (NaClO)을 이용하여 15분간 멸균, 소독한 뒤 증류수로 씻어주었다. 소독된 종자를 야생형 담배 식물의 종자와 함께 0 mM, 100 mM, 150 mM 의 염화나트륨(NaCl)이 포함되어 있는 MS (Murashige and skoog including vitamins; Duchefa) 고체배지에 치상하였고, 25℃, 16/8시간의 광주기 환경에서 배양하며 관찰하였다.
실시예 1: STF 의 분석
총 길이의 STF cDNA는 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)로 얻었다. STF은 680개의 아미노산을 암호화하고, 분자량은 80,019 Da이다. 담배(N. benthamiana) STF의 아미노산 서열을 다른 식물체의 관련 유전자와 서열정렬 하였다(도 1). STF는 애기장대(At3g48500)에서 하나의 유전자로 존재하였다. 담배(N. benthamiana) STF 유전자는 애기장대, 토마토 및 벼의 유전자와 높은 유사성을 나타내었다(도 1). STF 단백질은 N-말단에 긴 익스텐션(extension)을 포함하는데, 이것은 엽록체 타겟팅 신호이다. 애기장대에서 STF 유전자는 식물 지상부의 세포분열이 왕성한 조직에서 주로 발현하였고, 특이적으로 종자 및 종자의 발아 시에 발현량이 높았다.
실시예 2: STF 의 엽록체 내의 위치
녹색형광단백질 (GFP)과 융합된 STF 전체단백질 (STF:GFP)의 엽록체 내의 위치를 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였는데 엽록체 내의 특이적인 지역에 위치하였다(도 2A). 또한 STF의 N-말단의 수송 펩티드(transit peptide)만을 녹색형광단백질과 융합시켜 발현시켰을 때 엽록체 내에 넓게 퍼져 위치하였다. STF 단백질은 엽록체 핵양체(nucleoid) 단백질인 SiR (sulfite reductase)과 엽록체 내에 공위치(co-localization) 한다 (도 2B).
실시예 3: VIGS ( Virus - Induced Gene Silencing ) 및 co - suppression 을 이용한 STF 전사의 억제
STF 유전자의 침묵(silencing)을 유도하기 위하여, STF cDNA 유전자 각각의 절편들을 TRV에 기초한 VIGS용 벡터 pTV00에 클로닝하였고, 각각의 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움을 담배(N. benthamiana) 식물체에 침투시켰다(도 3). STF cDNA의 500 bp를 포함하는 N-말단과 380 bp를 포함하는 C-말단을 갖는 TRV:STF(N)와 TRV:STF(C)를 각각 제작하였고, 2.04 kb cDNA를 갖는 TRV:STF(F)를 제작하였다(도 3A). 이러한 구조물을 가진 VIGS 개체는 잎이 노랗게 변하는 반면, 대조군은 정상적이었다(도 3B). 내인성(endogenous) STF mRNA의 유전자 침묵(silencing)의 효과로써 STF의 전사체 발현 여부를 반정량적 RT-PCR로 조사하였다(도 3F). STF-A 프라이머(도 3A)를 이용한 RT-PCR의 결과는 TRV:STF(C) 개체로 감염된 노란 잎의 절편에서 PCR 산물의 감소를 나타내었다(도 3F). 같은 프라이머로 TRV:STF(N) 개체에서 STF의 N-말단을 포함하는 바이러스 게놈의 전사체를 탐지하였다. 유사하게도, STF-B 프라이머(도 3A)를 사용한 RT-PCR은 TRV:STF(N)으로부터 감염된 노란색 잎의 절편에서 감소된 PCR 산물이 만들어졌고, 반면에 같은 프라이머로 TRV:STF(C) 개체의 STF의 C-말단을 포함하는 형질전환체에서는 높은 수준으로 발현되는 것이 확인되었다(도 3F). 또한 STF 과발현체 및 co-suppression 개체를 제조하여 그 표현형을 관찰하였는데, STF 과발현체는 뚜렷한 표현형이 없었으나 co-suppression 개체에서는 잎의 황화가 일어났고, 식물의 생장도 저해되었다(도 3C 내지 E). STF 유전자 발현은 예측대로 과발현체에서는 과발현하였고, co-suppression 개체에서는 발현이 아주 낮았다(도 3G).
실시예 4: 엽록체와 미토콘드리아의 비정상적 발달
야생형, TRV 대조군, TRV:STF VIGS, STF 과발현 및 co-suppression 개체의 엽록체와 미토콘드리아 발달을 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscope)으로 관찰하였다(도 4). TRV:STF 잎의 횡단면(transverse sections)은 감소한 엽록체 수를 제외하면, TRV 대조군 잎에 비해 쌍자엽 식물의 전형적인 잎 구조를 나타내었다(도 4A). 잎 원형질체는 TRV, TRV:STF, 야생형, OE5 및 CS1 형질전환체에서 생성되었고, 광학현미경(도 4B) 및 공초점 레이저 주사현미경(도 4C)으로 조사하였다. 비록 엽록체의 크기 및 수가 TRV, 야생형 및 OE5 원형질체에서 비슷하였지만, TRV:STF 및 CS1 원형질체는 엽록체 수의 감소 및 엽록체 크기의 현저한 감소를 나타내었다(도 4B 및 C). 또한, 평균 엽록체 자가형광은 TRV:STF 및 CS1 원형질체에서 크게 감소하였다(도 4C, E 및 F). 잎 원형질체에서 미토콘드리아를 TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) 염색에 의해 조사하였다(도 4C 및 G). TMRM은 미토콘드리아 막 전위에 비례하여 미토콘드리아에 축적되는 친유성 양이온 염료이다. TRV:STF 및 CS1 원형질체에서 평균 TMRM 형광은 TRV, 야생형 및 OE5 원형질체에 비해 현저하게 감소하였다. 이는 상기 STF-침묵 형질전환체에 미토콘드리아 수 및/또는 미토콘드리아 막 전위에서 결함이 있음을 나타낸다 (도 4C, E 및 G).
실시예 5: 광합성 관련 단백질의 축적과 광합성 효율
야생형, TRV 대조군, TRV:STF VIGS, STF 과발현 및 co-suppression 개체의 광합성 관련 단백질의 축적 및 광합성 효율을 측정하였다(도 5). 극심한 잎의 황화(yellowing) 표현형은 STF-침묵 식물의 광합성 활성이 손상되었음을 나타낸다. 사실, 웨스턴 블롯 분석은 STF VIGS 형질전환체 및 CS1 형질전환체의 잎에서 색소체-암호화 광합성 단백질인 RbcL (Rubisco large subunit), Cyt f (Cyt b 6 f complex subunit), D1 (PSII reaction centre core subunit), AtpB (ATP synthase subunit) 및 PsaA (PSI core subunit)의 수준이 현저하게 감소한 것을 나타내었다. STF OE5 형질전환체는 상기 색소체-암호화 단백질의 축적 패턴이 TRV 대조군 및 야생형 식물과 유사하게 나타났다(도 5A 및 5B). 광합성 복합체 서브유닛의 축적은 고도로 조절되고 있으며(highly coordinated), 광합성 효소 복합체에서 임의의 단일 서브유닛의 결핍된 합성은 전체 복합체의 축적 결함을 야기한다고 보고되었다(Barkan, 1998, Meth . Enzymol. 297,38-57).
따라서, STF VIGS 형질전환체 및 CS1 형질전환체에서 각각의 핵심 서브유닛의 감소된 축적은 광합성 효소 복합체의 어셈블리 및 기능에서 전반적인 결함을 나타낸다.
결핍된 단백질 축적의 생리학적 영향을 이해하기 위해, 본 발명자들은 야생형, OE5 및 CS1 잎의 광합성능을 조사하였다(도 5C, D). 최대 형광에 대한 다양한 형광의 비율(F v/F m)은 광계 II의 최대 광화학적 효율을 반영한다(도 5C). CS1 잎에서 F v/F m 값은 광 성장 조건하에서 야생형 또는 OE5 잎과 비교하여 상당히 감소되었는데, 이것은 기능적 광계 II 중심에서 심각한 감소를 의미한다(도 5C). 또한, CS1 형질전환체에서 STF 결핍은 PSII을 통한 비순환 전자 수송 흐름인 전자수송율(ETR)에서의 감소를 야기했다(도 5D). 이러한 결과는 CS1 형질전환체의 광합성능은 심각하게 손상되었음을 의미한다.
실시예 6: RNA 젤 블럿에 의한 엽록체 내 유전자들의 mRNA 수준 측정
야생형, TRV 대조군, TRV:STF VIGS, STF 과발현 및 co-suppression 개체의 엽록체 내 유전자들의 mRNA 수준을 노던 블럿으로 측정하였다 (도 6). STF가 RNA 결합 및 전이활성능(transactivation activities)을 가지고 있다는 사실은 본 발명자들에게 STF 결핍이 색소체를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 프로파일에 영향을 미치는지 조사를 수행하게 하였다. 총 RNA는 TRV, TRV:STF, 야생형, OE1, OE5 및 CS1 형질전환 식물체의 잎으로부터 제조하였고, rRNA 수준은 RNA 로딩을 위한 대조군으로 측정하였다(도 6D). TRV:STF 및 CS1 잎의 백색 및 황색 섹터가 심각하게 결함이 있는 엽록체를 포함하기 때문에, 본 발명자들은 RNA 제조를 위해 단지 엷은 녹색 섹터를 사용하였다. 노던 블럿 분석은 프로브로서 다양한 색소체를 코딩하는 유전자를 이용하여 수행하였는데, 이것은 PEP(plastid-encoded multimeric RNA polymerases)(도 6A), NEP (nucleus-encoded phage-type RNA polymerases) (도 6C), 또는 PEP와 NEP 모두(도 6B)에 의해 전사된 유전자들을 포함하였다. 상대적인 전사체 수준을 또한 정량하였다(도 6E-G). PEP-의존적 광합성 유전자 psbD, petB, psaB, psbA 및 rbcL(Hajdukiewicz et al., 1997, EMBO J. 16:4041-4048)의 정상 상태 전사체 수준은 TRV, 야생형 및 OE 형질전환식물체와 대조적으로 TRV:STF 및 CS1 형질전환 식물체에서 현저히 감소하였다(도 6A, E). TRV:STF 및 CS1 형질전환 식물체는 또한 atpA, atpB, clpP, ndhB 및 ndhF의 상당히 감소된 전사체 수준을 나타내었는데, 이것은 NEP 및 PEP 프로모터를 갖고 있다 (도 6B, F). 그러나, NEP-의존적 색소체 유전자들인 accD, rpoB, rpoA 및 ycf2 (Hajdukiewicz et al., 1997, EMBO J. 16:4041-4048)의 정상 상태 전사체 수준은 모든 여섯 개의 형질전환 식물체에서 일정하게 남아 있었다(도 6C, G). 따라서, STF의 결핍은 NEP-의존적 전사체 축적에 크게 영향을 주지 않고 PEP-의존적 유전자 발현의 현저한 하향조절을 야기했다. 이것은 STF가 PEP 전사 장치(machinery)의 올바른 기능을 위해 필요하다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 엽록체 런-온 분석법
야생형 대조군과 STF co-suppression 개체의 엽록체 내 유전자들의 전사 효율을 엽록체 런-온 분석법을 이용하여 측정하였다(도 7). STF-침묵 식물체(STF-silenced plants)에서 PEP-의존적 유전자 전사체의 감소된 축적은 PEP-매개 전사의 감소된 비율 또는 감소된 mRNA 안정성 때문일 수 있다. 이러한 가능성을 구별하기 위해, 본 발명자들은 엽록체 런-온 전사 분석법을 수행하였다(도 7A, B). 엽록체는 야생형의 성숙한 잎으로 준비하였고, CS1 잎의 엷은 녹색 섹터는 α-[32P]-UTP으로 펄스 표지하였고(pulse-labeled), 방사선 표지된 RNA는 정제하여 표시된 색소체 유전자 및 음성 대조군으로 핵을 코딩하는 유전자인 니코티아나 벤타미아나 Rae1 (N. benthamiana Rae1)의 PCR 산물로 스팟팅한 블럿에 혼성화하였다. 각각의 프로브는 2개로 수행하였다. PEP-의존적 유전자들인 psaB, psbA, rps14 및 rbcL의 신호 강도는 야생형보다 CS1 형질전환 식물체에서 상당히 더 낮았다. 반면에 NEP-의존적 색소체 유전자 rpoB 및 ycf2의 신호 강도에서는 형질전환 식물체 사이에서 확실한 차이점이 없었다(도 7A 및 B). 신호 강도의 정량은 CS1 형질전환 식물체에서 전사율의 감소가 mRNA 축적에서 감소와 관련된다는 것을 나타내었다(도 7B). 이것은 STF가 전사율을 촉진하기 위해 PEP를 양성적으로 조절한다는 것을 제안한다.
실시예 8: 황색체(etioplast)로부터 엽록체로의 발달의 초미세구조 분석
광에 의해 유도되는 황색체로부터 엽록체로의 발달을 초미세구조 분석을 이용하여 야생형 대조군, STF 과발현 및 co-suppression 개체에서 관찰하였다(도 8). 색소체 유전자 발현의 높은 수준은 황색체에서 엽록체로의 전이(transition)에 필요하기 때문에, 본 발명자들은 야생형, OE5 및 CS1 형질전환 식물체로부터의 유묘에서 이러한 전이 동안 표현형에 대한 STF 결핍의 영향을 조사하였다(도 8A). 유묘는 1주 동안 암배양하였고(Dark), 3 시간 (DL 3 h) 또는 16 시간 (DL 16 h) 동안 광 조건으로 옮겼다. 옮긴 후 정상의 자엽 녹화(greening)를 나타내는 야생형 및 OE5 유묘와 비교하여, CS1 유묘에서 녹화는 매우 지연되었다(도 8A). 지연된 녹화를 세포 수준에서 조사하기 위해, 얇은 자엽 섹터를 지정된 시간에서 야생형 및 CS1 유묘로부터 준비하였고, 투과 전자 현미경(TEM)으로 관찰하였다(도 8B~O).
암배양한 야생형 유묘의 자엽 엽록체는 unstacked prothylakoids가 스트로마로 돌출되는 넓은 원중엽체(extensive prolamellar bodies, PLBs)를 나타내었다(도 8B, C). 광 노출 시, 일차적으로 unstacked thylakoids는 옮긴 후 3시간째에 감소된 크기의 PLBs가 없거나 또는 PLBs가 있는 것으로 발달하였는데, 옮긴 후 16시간째에 수많은 그라나 (grana) 무더기를 형성하였다(도 8D-H). CS1 형질전환 식물체에서, 몇몇의 황색체는 광 노출 이전에 이미 퇴화하고 있었다(도 8K). 더욱이, CS1 형질전환 식물체는 전이 동안에 틸라코이드 발달의 정상적인 진행을 보이지 않았다(도 8I-O). 옮긴 후 3 및 16시간째에, 색소체는 빈약하게 발달한 틸라코이드 시스템을 포함하였고, 몇몇의 색소체는 퇴화하거나 소낭으로 가득 찼다. 게다가, 성숙한 종자에 축적된 단백질체가 야생형의 황색화된(etiolated) 유묘의 자엽에서 거의 사라진 반면, CS1 유묘의 자엽은 여전히 많은 수의 단백질체를 포함하였고, 심지어 광에 옮긴 후 16시간째에도 존재하였다(도 8I, M; 8B의 대조군 참고). 이러한 결과는 자엽에서 영양분의 가동화(mobilization)가 CS1 형질전환 식물체에서 상당히 지연되었고, 이는 파괴된 틸라코이드 생물발생(biogenesis)과 일치한 것을 제안한다.
실시예 9: STF 과발현 개체가 보이는 고염에 대한 저항성
STF 과발현 개체가 보이는 고염에 대한 저항성을 관찰하였다 (도 9). STF가 과발현된 형질전환체 (OE5, OE7, OE9)의 T2 종자를 멸균한 뒤 소독된 종자를 야생형 담배 식물의 종자와 함께 100 mM과 150 mM 의 염화나트륨(NaCl)이 포함되어 있는 MS 고체배지에 치상하여 식물의 생장을 관찰하였다 (도 9). 먼저 많은 종자를 고염 배지에 치상하여 전체적 생장을 관찰하였을 때 100 mM NaCl에서는 별 차이를 보이지 않았으나 150 mM NaCl에서는 야생형 담배 식물은 발아율과 식물생장이 극도로 저해된 반면 STF 과대발현체인 세 개의 형질전환 식물체 모두 고염에 대한 내성을 보였다 (도 9A). 특히 OE7 형질전환 식물체의 내성이 가장 강하게 나타났다. 고염배지 위에서의 뿌리 생장을 좀더 자세히 관찰하기 위하여 종자를 치상한 후 배지를 직립으로 배양하여 20일 후 현미경으로 관찰하였다(도 9B). 100 mM NaCl 배지에서 STF 과대발현체인 세 개의 형질전환 식물체 모두 야생형 담배 식물에 비해 뿌리발달이 더 왕성하였다. 150 mM NaCl 배지 위에서는 야생형 담배 종자는 거의 발아되지 않았으나 STF 과대발현체인 세 개의 형질전환 식물체는 효율은 떨어졌으나 발아하여 생장하였다. 역시 OE7 형질전환 식물체의 내성이 가장 강하여 대부분의 종자가 발아하여 뿌리생장을 이뤘다(도 9B).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 STF(S1 domain-containing Transcription Factor) 단백질.
  2. 제1항에 따른 STF 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제2항의 유전자를 VIGS(Virus-Induced Gene Silencing)를 이용하여 담배 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 담배 식물체 잎의 황색화를 유발시키는 방법.
  6. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 담배 식물체.
  7. 제2항의 유전자를 담배 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는 염 스트레스에 대한 내성이 증진된 담배 식물체의 제조방법.
  8. 제7항의 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 증진된 담배 식물체.
  9. 제8항의 담배 식물체의 종자.
  10. 삭제
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