KR20060080067A - 새로운 국화품종의 개발방법 및 그에 의해 개발된 국화품종 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 국화(Dendranthema grandiflora (Ramat.) Kitamura cv. Fashion scarlet Shadow)의 종자에서 발아된 조직절편체를 이용하여 완전한 식물체로 재분화(regeneration) 하는 방법과 꽃의 색을 결정하는 유전자를 아그로박테리움을 통해 국화에 도입하므로써 꽃이 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변화되는 국화 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
국화, 형질전환, Flavonoid 3`,5`-hydroxylase (F3`5`H) 유전자, 화색변화
Description
도 1은 본 발명에서 사용한 식물 형질전환용 발현 벡터(pMBP)의 모식도.
도 2는 Flavonoid 3`, 5`-hydroxylase 유전자를 포함하는 아그로박테리아를 국화 절편체에 공동배양 시킨 후 국화의 상처 부위에서 얻은 형질전환된 국화의 제조 과정을 나타낸 사진. (A: 공동배양시킨 국화 절편체, B,C: 형질전환된 부정아, D,E: 뿌리가 유도된 부정아, F,G: 토양순화된 식물체)
도 3은 국화 식물체에서 유전자의 도입을 확인한 PCR 분석사진.
도 4는 형질전환 국화 식물체의 게놈내에 유전자가 안정되게 삽입되었음을 확인하는 게놈 서던 분석 사진.
도 5는 꽃의 개화 후 시간경과에 따른 Wild type과 형질전환된 식물체의 화색 변화 사진.
도 6은 개화 후 시간경과에 따른 국화 Wild type 과 형질전환개체의 꽃잎으로부터 안토시아닌을 추출하여 spectrophotometer로 그 함량을 비교 분석한 사진.
본 발명은 아그로박테리움을 매개로 한 식물형질전환 기술을 이용하여 형질전환된 국화 식물체를 생산하는 것으로서 특히, 화색을 조절하는 Flavonoid 3`, 5`-hydroxylase 유전자를 도입하여 개화시기에 따라 화색이 빨간색에서 노란색으로 변하는 식물체 생산에 관한 것이다.
국화 (Dendranthema X grandiflora)는 장미, 카네이션과 더불어 세계 3대 화훼작물 중의 하나이다. 국화의 품종 육성은 관행적 육종법 즉 선발 및 돌연변이 유도를 통하여 이루어져 왔으나(De Jong and Clusters 1986; Drewlow et al. 1973), 최근 들어 외래유전자의 도입을 통한 형질전환법(아그로박테리움, 파티클건 등)이 국화의 새로운 육종법으로 자리잡아 가고 있다(Bush and Pueppke, 1991; Ledger et al. 1991). 형질전환 법은 특정 유용형질의 육종에 이용될 수 있는 장점이 있으므로 국화에 있어서 화색, 내병성 등과 같은 상품성 및 재배 특성 등의 개량에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다(Courtney-Gutterson et al. 1994).
일반적으로 자연계에 존재하는 색소는 크게 플라보노이드, 카르토노이드, 베탈레인 등 세 종류로 나눌 수 있다. 플라보노이드의 일종인 안토시아닌은 식물의 꽃, 잎, 줄기 및 과실에 분포하고 있으며 식물의 화색에 직접적으로 영향을 주는 대표적인 색소이다. 안토시아닌의 생합성에 관여하는 중요한 색소유전자는 chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavanone 3-hydroxylase (F3H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), anthocyanidin synthase (ANS) 그리고 flavonoid glucosyl transferase (FGT) 등 여섯 개의 기본적인 구조유전자(CHS, CHI, F3`H, F3`,5`H, ANS 3GT, 5GT, AMT, GST)들이 상하로 연결되어 있다.
또한 이들 유전자의 발현을 조절하는 조절유전자인 Zea mays의 R, B, C1, 그리고 Anthrirrhium majus의 Delia, Eluta, Rosea 및 Petunia hybrida의 An 1, 2, 4, 10, 11, 12 등이 전사요소로 작용하여 안토시아닌 생합성에 관련된 여러 구조유전자의 발현을 조절하는 것으로 밝혀져 있다. (Holton and Cornish, 1995)
식물에서 생합성된 안토시아닌은 기질의 종류에 따라 청색의 delphinidin type과 적색의 cyanidin type 그리고 주황색의 pelargonidin type으로 구분되며 플라보노이드 생합성에 관련된 Cyt P450 효소 flavonoid 3`-hydroxylase (F3`H) 와 flavonoid 3`, 5`-hydroxylase (F3`,5`H)의 활성에 따라 적색, 주황색 및 청색 색소가 형성된다.
국화의 조직배양은 체세포배 형성(May and Trigiano 1991)을 통하여 식물체 재생이 가능하나, 주로 기관형성 (Kaul et al. 1990)을 통하여 식물체 재생이 이루어진다. 국화의 기관형성은 품종에 따라 요구되는 생장조절제의 종류 및 농도가 매우 상이하다. 이와 같이 국화의 식물체 재생 과정은 품종에 따라 재생빈도에 있어서 상당한 차이를 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에 상업적으로 유용한 품종을 대상으로 식물체 재생체계 확립 및 형질전환을 실시하여야 한다. 한편, 아그로 박테리움을 이용한 형질전환 국화에 대한 연구는 주로 report 유전자 삽입(Ledger et al. 1991; Wordragen et al. 1991; Renou et al. 1993; Urban et al. 1994; De Jong et al. 1995; Sherman et al. 1998; Yasumasa et at. 2000) 에 많은 보고가 있었으나, 화색 유전자의 도입을 통한 화색 변환 형질전환 국화식물체에 관한 보고는 아직 없다.
색소 유전자의 전이를 통한 최초의 식물의 화색전환 역사는 1987년 독일의 Max-Planck 식물육종학 연구소에서 옥수수로부터 dihydroflavonol 4-reductase (DFR) 유전자를 클로닝하고 페튜니아로 전이하여 지금까지 자연계에 존재하지 않던 주황색 색소를 합성하는 페튜니아를 성공적으로 창출하였다 (Mayer et al, 1987).
또한 오스트레일리아의 Calgene Pacific회사와 일본 Suntory회사의 공동연구진에 의해 페튜니아로부터 청색 색소발현에 필요한 flavonoid 3`, 5`-hydroxylase 유전자가 클로닝 되었다 (Holton et al, 1993).
타 작물로부터 분리한 색소유전자를 식물체에 도입하여 화색변화를 시도한 연구는 화색변화 연구의 모델 식물체인 페튜니아를 대상으로 성공적으로 수행되었다. 그러나 가지로부터 유래한 F3`,5`H 유전자를 국화에 삽입한 경우 형질전환된 국화의 화색을 변화시키는 것은 성공하지 못하였다 (Kim and Kim. 1998).
따라서, 세계 3대 화훼 중의 하나인 국화의 화색을 변화시킬 수 있게 된다면 화훼소비자의 취향을 다양한 측면에서 충족시킬 수 있을 뿐만 아니라 화훼농가에 새로운 소득품목으로 각광받을 수 있을 것이다.
본 발명은 형질전환방법을 이용하여 개화 후 시간경과에 따라 색깔변화가 나타나는 새로운 국화 품종의 개량방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 개화 후 시간경과에 따라 색깔변화가 나타나는 새로운 국화 품종을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (A) 안토시아닌 생합성 유전자를 아그로박테리움에 삽입하는 단계; (B) 국화의 자엽 또는 배축 절편체로부터 부정아를 유도하는 단계; (C) 상기 (A)단계를 거친 아그로박테리움과 (B)단계에서 유도된 부정아를 공동배양하여 상기 안토시아닌 생합성 유전자를 상기 부정아로 도입시키는 단계; (D) 상기 형질전환된 부정아를 선별하는 단계; (E) 선별된 부정아로부터 완전한 국화개체를 재분화하는 단계를 포함하는, 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변하는 국화품종의 개량방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 안토시아닌은 chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavanone 3-hydroxylase (F3H), flavonoid 3`, 5`-hydroxylase (F3`,5`H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), anthocyanidin synthase (ANS), flavonoid glucosyl transferase (FGT) 등의 유전자들이 순차적으로 반응하여 생성된다.
국화의 부정아를 유도하는 것은 통상의 세포 및 조직배양방법을 활용할 수 있다. 예를 들면, 국화의 자엽 또는 배축 절편체를 옥신 NAA 와 사이토키닌류 BA가 조합 처리된 MS고체배지에서 배양하여 부정아를 유도하는 것이 가능하다.
외래 유전자를 아그로박테리움에 삽입하는 방법, 아그로박테리움을 식물세포 또는 식물조직과 공동배양하는 방법 등은 종래 알려진 통상의 방법을 활용하는 것이 가능하다.
본 발명에서, 상기 형질전환된 부정아는 Kanamycin에 의해 유도·선발되는 것이 가능하며, 기타 통상 알려진 선발(선별)방법에 의해 선발될 수 있다.
또한, 전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 개량방법에 의해 만들어지는, 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변하는 새로운 국화품종을 제공한다. 예컨대, 새로운 국화품종은 화색이 개화 초기에 빨간색에서 시간경과에 따라 노란색으로 변하는 새로운 국화품종일 수 있다.
이하, 본 발명의 방법을 단계별로 구체적으로 설명한다. 하기 설명에서는 예를 들면, 구체적인 유전자, 구체적인 호르몬 등을 열거하고 있으나, 이는 예시적인 것일 뿐 다른 유전자 또는 다른 호르몬 등을 사용하여 본 발명의 기본적 기술사상을 구현할 수 있음은 당업자에게 있어 당연할 것이다.
(A) 안토시아닌 생합성 유전자를 아그로박테리움에 삽입하는 단계
국화 형질전환용 재조합 유전자는 식물발현용 벡터 pMBP을 이용하였는데, 이 벡터는 항생제 선발 유전자인 NPTⅡ(neomycin phosphotransferase Ⅱ) 유전자 및 페튜니아에 유래한 F3`5`H(Flavonoid 3`, 5`-hydroxylase) 유전자로 재조합되어 있다. 이들 유전자는 모두 CaMV 35S 프로모터와 nopaline synthase 유전자 터미네이터로 구성되어 있다. 상기 벡터는 식물 발현벡터로 널리 알려져 있으며, 이들의 조작은 통상의 방법에 따라 이루어질 수 있기 때문에 벡터의 기탁은 생략하였다.
상기 식물발현용 벡터 pMBP를 A. tumefaciens LBA 4404에 도입하였다 (도 1).
아그로박테리움 균주는 YEP배지 (Batopeptone 10 g1-1, Bacto-yeast extract 10 g1-1, NaCl 5 g1-1; pH 7)에 접종하여 1-2일 동안 120 rpm으로 배양한 후 3,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 제거한 후 새로운 MS 액체배지에 재현탁하였다.
(B) 국화의 자엽 또는 배축 절편체로부터 부정아를 유도하는 단계
본 발명에서는, 국화의 종자에 발아된 자엽과 배축을 사용하였다.
국화의 종자를 70% 에탄올로 1분간, 1% 차아염소산나트룸 용액으로 15분 동안 표면살균 하였다. 이 후 멸균수로 3회 정도 세척하였으며, 살균된 종자를 Murahige and Skoog (MS) 기본배지에 치상하였다. 7일 후에 자엽과 배축을 종자로부터 예리한 면도날로 절단하여 식물재분화 및 형질전환 실험에 사용하였다.
식물체 재분화 배지는 100 mg1-1 myo-inositol, 0.4 mg1-1 thiamine·HCl, 3% (w/v) sucrose, 0.4% (w/v) Gelrite가 첨가된 MS배지를 사용하였으며, 배양실 조건은 30 μmol·m-2·sec-1, 백색 형광등으로 16시간 명처리, 8시간 암처리 하였으며 온도는 25℃로 유지하였다.
절편체를 옥신으로 NAA 0.1, 0.5 mg1-1와 사이토키닌으로 BA 0-4 mg1-1으로 조합 첨가된 MS 고체배지에서 배양하였다. 약 배양 4주 후부터 잎절편체의 절단면에서 부정아들이 형성되기 시작하였으며, 4 mg1-1 BA를 처리한 실험구가 다른 실험구 보다 부정아형성에 보다 효과적이었는데, NAA 0.1 mg1-1와 BA 4.0 mg1-1를 처리한 실험구에서 총 치상한 절편체 중 79.8%의 절편체에서 부정아를 형성하였으며 절편체 당 9.5 ± 1.9의 부정아가 생성되어 가장 효과적인 식물체 재생체계인 것으로 결정되었다 (표1).
(C) 아그로박테리움과 부정아를 공동배양하는 단계
상기 (A) 단계에서 준비된 아그로박테리움 재현탁액을 국화 절편에 접종하였다. 멸균된 필터페이퍼로 잎 절편체에서 박테리아 잔액을 제거하고 재분화 배지로 옮겨 암상태에서 3일간 공동배양 하였다.
공동배양 3일 후에 배축과 자엽 절편체를 선발배지로 옮겼다. 선발배지 조건은 4 mg1-1 BA, 0.1 mg1-1 NAA, 400 mg1-1 carbenicillin과 50 mg1-1
kanamycin를 첨가한 MS 배지를 이용하였다. 한달 후에 가나마이신에 저항성을 갖는 부정아를 절편으로부터 절단하여, 200 mg1-1 carbenicillin과 150 mg1-1 kanamycin이 첨가된 MS 배지에 계대배양 하였다. 3 차례 계대배양 후에 형질전환된 부정아를 얻을 수 있었다 (도 2;A-C).
(D) 형질전환된 부정아를 선별하는 단계
(D-1) PCR을 이용한 형질전환체 분석
PCR을 이용하여 형질전환체에 도입된 유전자를 확인하였다.
가나마이신에 저항성이 있는 식물체들을 이용하여 게놈 DNA을 분리하고 각각 F3`,5`H, NPTⅡ 유전자의 도입을 확인할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR로 DNA를 증폭시킨 후 그 산물을 전기영동하여 유전자의 삽입을 확인하였다. 유전자의 확인을 위해 사용된 프라이머는 각각 F3`,5`H; 5`-TTC GGT GGC GGA GAT GTT GA-3`(서열 1)과 5`-TTC GTC CAG CAC CAA ATG-3`(서열 2), NPTⅡ; 5`-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CT-3`(서열 3)과 5`-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GT-3`(서열 4)이다.
PCR 반응조건은 94℃에서 5분 반응 후 94℃에서 30초, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분 반응을 36회 반복하였으며, 최종 72℃에서 10분간 신장반응 하였다.
그 결과 PCR분석을 통하여 F3`5`H 유전자와 NPTⅡ 유전자의 도입을 확인할 수 있었다 (도 3).
(D-2) 서던 블롯을 이용한 형질전환체 분석
가나마이신 저항성을 가진 식물체들에서 게놈 DNA를 분리하여 제한효소 BamHⅠ으로 절단하였으며, 0.8% 아가로스겔 상에서 크기별로 분리한 후 Zeta-ProbeR GT Blotting membrane으로 옮겼다. [α-32P]dCTP으로 label된 F3`,5`H 유전자 특이 탐침을 제조하였고, 하이브리다이제이션 및 검출과정 등을 수행하였다.
PCR반응에 의해 유전자의 도입이 확인된 식물체를 게놈 서던 분석 결과 5개 개체로부터 F3`,5`H 유전자가 국화 식물체의 게놈에 완전하게 도입되었다는 것을 확인 하였다 (도 4).
(E) 선별된 부정아로부터 완전한 국화개체를 재분화
(E-1) 개체의 재분화 및 육안관찰
가나마이신 저항성을 가진 부정아를 0.1 mg1-1 NAA가 첨가된 1/2 MS 배지에 계대배양하여 뿌리를 유도, 증식한 후 정상적으로 뿌리와 잎이 전개된 식물체로 크 기가 약 5-7 cm 정도 되게 생장시켰다 (도 2;D-E). 이후 토양순화를 위해 식물체는 상토와 버뮤큘라이트를 2:1의 비율로 혼합시킨 토양에 이식하였으며, 수분의 급속한 손실을 막기 위해 비닐랩으로 용기를 감싸준 후 growth chamber에서 생장시켰다 (도 2;F-G).
재생된 형질전환 국화 식물체로부터 개화유도를 위해 식물체를 growth chamber에서 단일 조건(광주기: 8/16 시간, 25℃)을 처리한 후 약 2달 경과 후에 화아의 형성을 관찰할 수 있었다. Wild type 개체는 개화 후 시간경과에 따라 꽃잎의 색이 1 - 3단계까지는 빨간색을 계속 유지하다가 4단계에서는 약간 탈색된 빨간색을 보였다. 그러나, 형질전환체는 개화 후 시간경과에 따라 화색의 변화가 크게 이루어졌다. 형질전환체는 1단계에서는 빨간색의 꽃봉오리가 발달하였으나, 2단계와 3 단계에서는 오렌지색 꽃잎이 관찰되었으며, 그리고 마지막 4단계에서는 노란색 꽃잎이 관찰되었다. 육안 관찰 결과를 보면 wild type보다 형질전환 개체가 개화 시기에 따라 화색변화가 매우 빠르다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 잎의 모양, 꽃의 크기, 꽃잎의 수와 꽃의 모양 및 개화 시기등 육안식별이 가능한 형태적 특징은 wild type 개체와 비교해 볼 때 큰 차이가 없었다 (도 5).
(E-2) 시간경과에 따른 화색변화의 분석
국화 형질전환개체 및 wild type 개체의 꽃잎을 각 단계별로 수집하였다.
각 꽃의 단계는 꽃의 발달 정도 및 시기에 따라 크게 4단계로 구분하였다.
1단계는 꽃봉오리 형성 후 꽃잎이 벌어지기 직전 단계이고, 2단계는 꽃잎이 벌어지는 단계이고, 3단계는 꽃잎이 벌어지기 시작하여 5-7 일이 경과된 단계이고, 4단계는 꽃잎이 완전히 벌어지는 단계이다.
각 단계별로 꽃잎 약 10 mg을 Eppendorf tube (1.5 ㎖)에 넣고 150 ㎕의 안토시아닌 색소추출용액(1% HCl + 70% 메탄올)을 첨가한 다음 실온에서 3시간 배양하였다. 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 추출된 색소를 회수한 후 spectrophotometer로 비교분석 하였다.
Wild type체는 개화 후 시간경과에 따라 꽃잎의 색이 1-3단계 까지는 525 nm에서 흡광도가 0.5 에서 0.6 사이에 분포되어 있었지만, 4단계에서는 흡광도가 그의 절반인 0.25로 적색 색소의 함량이 감소함을 알 수 있었다. 그러나, 형질전환체는 개화 후 시간경과에 따라 많은 변화가 나타났다. 1단계의 525 nm에서 흡광도가 0.3 이였고, 2단계에서는 1단계 보다 1/3 정도 감소 된 0.117이였으며, 3단계의 흡광도는 2단계의 흡광도 보다 더 감소하여 0.081이였다. 그리고, 마지막 4단계에서는 525 nm에서 흡광도를 전혀 관찰할 수 없었다. 이는 형질전환 국화개체가 개화시기에 따라 안토시아닌의 함량이 급속히 변화하며 4단계에서는 안토시아닌이 완전히 사라지는 것을 의미하는 것으로 육안 관찰에 의한 화색변화 결과와 정확히 일치하였다.
본 발명자들은 원래 페튜니아에서 유래한 F3`,5`H 유전자를 국화 식물체에 삽입을 통하여 청색의 국화를 생산하려고 의도하였다. 그러나, F3`,5`H 유전자가 삽입된 국화는 개화 후 청색을 띠는 것이 아니라 wild type 같은 빨간색을 나타내 었으며, 개화가 더욱 진행되면서 꽃이 빨간색에서 노란색으로 변화하였다. 이것은 형질전환개체의 국화에 빨간색을 조절하는 유전자인 F3`H와 청색을 조절하는 F3`,5`H가 서로 존재하고 있으며 동일한 기질에 대해 서로 경쟁함으로써 개화시기에 따라 빨간색 안토시아닌을 합성하는 능력을 잃어버림으로써 국화의 원래 바탕색인 노란색으로 변화되는 것으로 추측된다. 즉, 형질전환 국화는 초기 개화 시는 안토시아닌을 생산하다가 개화가 진행될수록 안토시아닌이 생성되지 않아 국화의 원래 바탕색소인 카로티노이드가 축적됨으로써 노란색으로 변화되었을 것으로 추측할 수 있다.
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본 발명에 의하여 개화 후 시간이 경과하면서 꽃잎의 색이 변화하는 새로운 형태의 국화품종을 얻을 수 있게 된다.
<110> LIU, Jang Ryol
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Chrysanthemum Cultivar by the Method}
<130> P0105-001
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ttcggtggcg gagatgttga 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ttcgtccagc accaaatg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
gaggctattc ggctatgact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
atcgggagcg gcgataccgt 20
Claims (5)
- (A) 안토시아닌 생합성 유전자를 아그로박테리움에 삽입하는 단계;(B) 국화의 자엽 또는 배축 절편체로부터 부정아를 유도하는 단계;(C) 상기 (A)단계를 거친 아그로박테리움과 (B)단계에서 유도된 부정아를 공동배양하여 안토시아닌 생합성 유전자를 부정아로 도입시키는 단계;(D) 상기 형질전환된 부정아를 선별하는 단계;(E) 선별된 부정아로부터 완전한 국화개체를 재분화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하고, 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변하는 국화품종의 개량방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 안토시아닌 생합성 유전자는 chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavanone 3-hydroxylase (F3H), flavonoid 3`, -hydroxylase (F3`H), flavonoid 3`, 5`-hydroxylase (F3`,5`H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), anthocyanidin synthase (ANS) 및 flavonoid glucosyl transferase (FGT)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하고, 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변하는 국화품종의 개량방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 안토시아닌 생합성 유전자는 flavonoid 3`, 5`-hydroxylase (F3`,5`H) 인 것을 특징으로 하고, 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변하는 국화품종의 개량방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 의한 방법에 의하여 제조된, 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변하는 국화품종.
- 제 4 항에 있어서,화색은 초기에 빨간색에서 시간경과에 따라 노란색으로 변하는 것을 특징으로 하고, 개화 후 시간경과에 따라 화색이 변하는 국화품종.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2013077526A1 (ko) * | 2011-11-23 | 2013-05-30 | 상명대학교 산학협력단 | 화형 또는 화색이 조절된 형질전환 국화과 화훼 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 |
| KR101340958B1 (ko) * | 2012-07-04 | 2013-12-13 | 한국원자력연구원 | 국화에서 분리된 신규 ｆ３＇ｈ 유전자 및 이를 이용한 화색 돌연변이체 선별 방법 |
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2005
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