JP2001258564A - 穀類でんぷんの構造、糊化特性を制御するでんぷん合成酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 でんぷんの特性に関与する機能を有するＤＮ
Ａの提供。 【解決手段】 アミロペクチンの枝状構造を変化させる
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミロペクチンの
枝状構造を変化させる活性を有するＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】イネ（オリザ属サティバ種）には、亜種
としてインディカとジャポニカが存在する。両亜種は芒
の長さ、発芽速度、耐冷性、胚乳のアルカリ溶液中での
崩壊性（アルカリ崩壊性）の難易等、複数の形質につい
ての判定によって分類可能である（Morishima and Oka,
1981）。

【０００３】このうちアルカリ崩壊性に関しては、米の
食味（Jones,1938）、糊化性（Littleら、1958）、との
関連が示唆されている。アルカリ崩壊性の難易は、米か
らでんぷんを精製して調べても、米粒を用いた結果と同
様であることから、でんぷんの性状の差異に起因すると
考えられている。しかしながら、現在まで、いかなるで
んぷん性状の差異が崩壊性の原因であるかは明らかにさ
れていない。一方、遺伝解析から、上記両亜種間のアル
カリ崩壊性を制御する作用力の大きい遺伝子は一つで、
第６染色体に座乗することが示されている（Kudo,196
8）が、この遺伝子については現在まで特定されていな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、米の
アルカリ崩壊性がでんぷんのいかなる性状の差異に起因
するかを明らかにし、これらの性質の相関関係を遺伝子
レベルで解明することにより、でんぷんの特性に関与す
る機能を有するＤＮＡを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、でんぷんの性
状の差異に起因すると考えられるアルカリ崩壊性の難易
を制御する遺伝子(alk遺伝子)、でんぷんの主要成分で
あるアミロペクチンの構造を制御する遺伝子、でんぷん
合成酵素の活性を制御する遺伝子、でんぷん合成酵素遺
伝子であると推定される塩基配列が同一の遺伝子座に存
在することを見出し、またこの塩基配列の部分であるＤ
ＮＡを特定することにより、本発明を完成するに至っ
た。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡである： （ａ） 配列番号２記載のアミノ酸配列で表わされるタ
ンパク質、（ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において
１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列により表わされ、かつアミロペクチ
ンの枝状構造を変化させる活性を有するタンパク質。

【０００７】また本発明は、上記のＤＮＡのアンチセン
スＤＮＡである。さらに本発明は、上記アンチセンスＤ
ＮＡを植物内で発現させることを特徴とする、植物の作
出方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡである： （ａ） 配列番号２記載のアミノ酸配列で表わされるタ
ンパク質、（ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において
１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列により表わされ、かつアミロペクチ
ンの枝状構造を変化させる活性を有するタンパク質。

【０００９】上記ＤＮＡのうち、配列番号２記載のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡについては、本明細書の実
施例に記載された方法により得ることができる。また、
これらの塩基配列は、配列番号１に示すように、既に決
定されているので、例えば、これらの塩基配列をもとに
適当なプライマーを設計・合成してＰＣＲを行なうこと
によっても得ることができる。

【００１０】配列番号２記載のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、本願の出願時
において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発
法(Zollerら、Nucleic AcidsRes.10 6478-6500, 1982)
により、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを改変することにより得ることができる。本発明は
また、上記ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡである。

【００１１】ここで、本発明のアンチセンスＤＮＡと
は、その発現により上記ＤＮＡの発現を阻害する機能を
有するＤＮＡを意味し、例えば、上記ＤＮＡと相補的な
ＤＮＡまたはその断片等が例示できる。また、上記阻害
機能を有する限り、本発明のアンチセンスＤＮＡは上記
ＤＮＡと完全に相補的なもののみに限定されず、例えば
ミスマッチ配列を一部に含むものであってもよい。ま
た、上記ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡを植物に導入する
ことにより、その植物のアミロペクチンの構造を変化さ
せることができる。

【００１２】従って、本発明の植物の作出方法は、上記
アンチセンスＤＮＡを植物内で発現させることを特徴と
するものである。アンチセンスＤＮＡを発現させる植物
としては、特に限定されないが、イネ科に属する植物が
好ましく、イネが更に好ましく、イネの中でもとりわけ
イネインディカ品種の「カサラス(Kasalath)」が好まし
い。

【００１３】上記アンチセンスＤＮＡの植物内での発現
は、例えば、本発明のアンチセンスＤＮＡを含むベクタ
ーを構築し、該ベクターを植物のゲノムＤＮＡに組み込
むことにより実施することができる。前記ベクターは、
例えば以下のようにして構築することができる。まず、
本発明のアンチセンスＤＮＡを本来の向きと逆向きにし
てプロモーターと連結する。

【００１４】プロモーターとしては、例えば、植物につ
いて常用されているカリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーター(Terada, Mol.Gen.Gen., 220,389-392,
1990)を使用することができるが、好ましくは、配列番
号２記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが由来する
イネにおいて発現が確認されているイネでんぷん合成酵
素遺伝子プロモーター(Hirano,Plant Cell Physiol.acc
epted)，トウモロコシAdh1プロモーター(Kyozuka,Mol.G
en.Gen., 228, 40-48,1991)を使用する。

【００１５】更に効率よく目的とする遺伝子の転写を終
結させまたＲＮＡを安定させるために、ターミネーター
が用いられる。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子NO
Sのターミネーター(pBI221,Jefferson,EMBO J.,6,3901-
3907,1987)あるいはカリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓ（１９Ｓ）ＲＮＡターミネーター(pGL2, Shimamoto,N
ature,338,274-276,1989)等が挙げられる。組み換え操
作においては、pUC系列(Yanisch-Perron,Gene,33,103-1
19,1985)のプラスミド等が好適に用いられる。

【００１６】本発明の方法においては更に、ハイグロマ
イシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイ
シンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グ
ルキュロニダーゼ遺伝子等から選ばれる２つ以上の外来
遺伝子を使用し、かつその１つは目的とするコロニーを
選択する際に有効な、いわゆる選択マーカー遺伝子とす
るのが好ましい。かかる選択マーカー遺伝子としては、
ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子
が好ましい。

【００１７】本発明の方法においては、選択マーカー遺
伝子と他の外来遺伝子を同一のプラスミド中に有するも
のを使用してもよいし、選択マーカー遺伝子を有するプ
ラスミドと他の外来遺伝子を有するプラスミドとを併用
してもよい。上述の操作により構築された本発明のアン
チセンスＤＮＡを含むベクターを植物体に導入する手法
は、特に限定されるものではないが、例えばエレクトロ
ポレーション法が好ましい。

【００１８】この方法は、例えば以下のようにして行な
うことができる。まず、本発明のアンチセンスＤＮＡを
対象とする植物体のプロトプラストに導入する。再生す
ることによって、本発明のＤＮＡが導入され、発現され
た植物体を作出することができると考えられる。本発明
のＤＮＡを導入する植物体のプロトプラスト、例えばイ
ネ科植物由来のプロトプラストは、次の様にして調製す
ることができる。

【００１９】まず、イネ品種としてカサラス等、インデ
ィカ品種の完熟種子に由来するカルスを通常使用され得
る液体培地で培養した後、常法に従い、例えばセルラー
ゼやマセロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中２
５〜３０℃、３〜１６時間程度酵素処理する。酵素処理
終了後ろ過して未消化物を除き、ろ液に２〜５倍量のKM
C液（塩化カリウム0.118M、塩化マグネシウム0.0817M、
塩化カルシウム0.085M，pH6.0)(Theor.Appl.Genet.,53,
57-63,1978)等を加え遠心分離し、精製されたプロトプ
ラストを得ることができる。

【００２０】本発明の方法においては、プロトプラスト
(例えば(2〜10)×10⁶ 個／mL)に対しては、上記の様に
して調製したベクター(例えば1〜100μg／mL)を、さら
に、選抜遺伝子としてハイグロマイシンホスホトランス
フェラーゼをコードするベクター(pGL2：Shimamotoら、
Nature,338,274-276,1989)(例えば1〜100μg／mL)を、3
0〜200ｍＭ塩化カリウム、0〜50ｍＭ塩化マグネシウ
ム、0.2〜0.6Ｍマンニトールを含む緩衝液等の液体媒体
中に懸濁し、これに電気パルスを印加してプラスミドを
プロトプラスト中に導入する。

【００２１】電気パルス処理は、100〜1000μＦのコン
デンサーを用いて得られる200〜1000V／cmの初期電圧の
直流パルスで、パルス幅1〜30 msec程度の条件で印加す
るのが好適である（特開平第１−１８１７９１号公報を
参照されたい）。さらに、上述のようにして本発明のア
ンチセンスＤＮＡを導入した植物体(プロトプラスト)
を、常法により、例えば以下のようにして再生させるこ
とによって、本発明のアンチセンスＤＮＡが導入され、
発現された植物体を作出することができる。

【００２２】まず、上述のようにして電気パルス処理し
たプロトプラストを、Ｒ2 培地(Plant Cell Physiol.,1
4,1113,1973)の無機成分とＢ５培地(Gamborg et al.,5
0.151,1968)のビタミン混合液を含む液体培地（Ｒ2 ／
Ｂ５）好ましくは窒素源として硝酸カリウムを0.2〜0.5
％含有する培地に懸濁し、これを1.0〜3.0％程度のアガ
ロースを含むＲ2 ／Ｂ５培地と等量ずつ混ぜ、速やかに
シャーレ中に広げてうすく固める。この時のプロトプラ
ストの密度は約(5〜50)×10⁵ 個／mLとなるようにし、
またアガロースの厚さは平均0.7 mm程度となるようにす
るのがよい。

【００２３】固化したアガロースゲルを5〜20 mm程度の
大きさに切り、上記液体培地中で培養する。その際、イ
ネ科植物由来のプロトプラストを使用した場合には、好
ましくは培地中にイネ培養細胞を100〜300 mgFW／シャ
ーレ程度共存させ、20〜50 rpmの回転でゆっくり振とう
しながら、暗条件下27〜33℃で培養する。

【００２４】培養後３〜４週間で、0.5〜1 mmφ程度の
コロニーが形成される。その際、例えば選択標識遺伝子
であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子を導入しておいた場合、培養開始後7〜20日にハイグ
ロマイシンを10〜50μg／mL程度培養液中に添加し、更
に培養を続けることで形質転換細胞の一次選択を効率よ
く行うことができる。

【００２５】次いでこのコロニーを増殖培地、例えばＲ
２基本培地(Sci.Sin.,16,659-688,1975)に植物ホルモ
ン、例えば2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）を2
mg／リットル程度、アガロースを0.1〜1.0％加えた寒天
培地上で２〜４週間、照明下（1000〜4000 lux）、27〜
33℃で培養し、3〜6 mmφのカルスを得る。

【００２６】このカルスの一部からゲノムＤＮＡを、例
えば、Mol.Gen.Genet.,211,27-34,1988に準じて単離
し、このゲノムＤＮＡ約100 ngを、次のＰＣＲ法に供す
ることで、本発明のアンチセンスＤＮＡがとり込まれた
形質転換カルスを二次選択することができる。ＰＣＲ法
(Saiki,Science,239,487-491,1988)は、鋳型の熱変性、
プライマーと鋳型とのアニーリング及び耐熱性ポリメラ
ーゼによる伸長方法からなる工程を繰り返すことによ
り、標的ＤＮＡ領域を増幅する方法である。

【００２７】本発明の方法においては、上記で得られた
ゲノムＤＮＡを、例えば94℃、1分程度で熱変成して＋
鎖と−鎖の１本鎖に解離し、導入されたＤＮＡの＋鎖及
び−鎖の5'末端に相補的なプライマーをアニーリングし
た後、耐熱性ポリメラーゼにより相補鎖ＤＮＡを合成
（72℃，3分程度）するという工程を20〜30回繰り返し
て該相補鎖ＤＮＡを増幅する。

【００２８】ＤＮＡの導入が確認されたカルスを再生培
地、例えばＲ２基本培地(Sci.Sin,16,659-688,1975)に
植物ホルモン、例えばインドール酢酸(IAA)を0.5 mg／
リットル程度、ゼアチン1 mg／リットル程度、アガロー
ス0.6〜1.5％加えた寒天培地上で２〜８週間、照明下(1
000〜4000 lux)、27〜33℃で培養し再生幼植物を得る。

【００２９】次いで幼植物を順化後、温室にて育成する
ことにより、４〜５ケ月後に本発明のＤＮＡが導入され
た植物を作出することができる。導入されたＤＮＡの存
在は、ゲノムＤＮＡのサザン解析(Southern, J.Mol.Bio
l.,98,503〜517,1975)によって確認できる。

【００３０】例えばゲノムＤＮＡは(Walbot et al,Mol.
Gen.Genet.,211,27-34,1988)に準じて調整し、その2μg
を50μLの反応系（組成はTOYOBO Co.による）においてB
gl IIで切断する。これを１回エタノール沈殿に供し、7
0％エタノールで洗って乾燥し、水10μLに溶解し、泳動
用色素(Molecular Cloning)2μLを加えて１％アガロー
スゲル電気泳動（FMC SEAKEM GTGAGAROSE,TBE緩衝液）
で分画する。次いでアマルシャム社のハイボンドＮメン
ブレン取扱い説明書の方法に準じて酸部分を分解した
後、アルカリ変性させてハイボンドＮ膜にブロットす
る。膜は４２℃で１時間以上プレハイブリダイゼーショ
ンする(50％ホルムアミド×4 SSCP(Molecular Cloning)
1% SDS、0.5％スキムミルク、0.25 mg／mL ウシ精子Ｄ
ＮＡ）。

【００３１】プローブは、植物に導入した本発明のアン
チセンスＤＮＡの一部または全部をアマシャム社マルチ
プライムラベリングキットと〔α−³²Ｐ〕dCTPにより調
整したものを用いる。熱変性したプローブをハイブリダ
イゼーション液（0.1g、デキストラン硫酸／mLプレハイ
ブリ液）に混合し、プレハイブリダイゼーション液をき
った膜にまぶし、42℃で１晩静置する。2×SSC＋0.1％
ＳＤＳ 100 mL中で15分×2回室温で振とうし、さらに0.
1×SSC＋0.1％ＳＤＳ 100 mL中で15分×2回洗ってプロ
ーブの特異的な結合をオートラジオグラフィで検出す
る。本発明のＤＮＡを導入した場合、4.8または4.1kb以
外のバンドとして検出される。

【００３２】本発明の方法によれば、でんぷんの１成分
であるアミロペクチンの枝状構造を変化させることで、
食品素材として異なった加工適性を持つでんぷんを提供
することができる。さらに、アミロペクチンの枝状構造
を変化させることで、米粒の希アルカリ溶液に対する崩
壊性を変化させることができる。希アルカリ溶液に対す
る崩壊性の難易は米粒の熱糊化性の難易と対応すること
が知られているため、アルカリ崩壊性を変化させること
で、米の炊飯特性、調理適性を変えることが期待でき
る。

【００３３】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもので
はない。 〔実施例１〕 アルカリ崩壊性の難易の判定方法 日本晴、カサラスおよび（日本晴×カサラス）×日本晴
の戻し交雑後代自殖系統群(Backcross Inbred Lines,BI
Ls)９８系統（BIL1〜98）の米粒を３粒ずつ半切し、24
穴のマイクロプレートに入れ、1.3%水酸化カリウム溶液
1mLを加え、蒸発を押さえるため蓋をした後、室温に１
昼夜置いた。全ての試験試料につて、２反復で試験を実
施した。

【００３４】その後、米粒の、特に半切面からのでんぷ
んの溶け出した程度や、溶液の懸濁状態から崩壊性の難
易を判定した。判定は品種「日本晴」のアルカリ崩壊性
程度を易、品種「カサラス」のそれを難の基準とし、目
視により行った。比較基準とした品種「日本晴」および
品種「カサラス」の処理結果を図１に示す。

【００３５】（結果）判定結果は、BIL1易、BIL2易、BI
L3易、BIL4易、BIL5易、BIL6難、BIL7易、BIL8易、BIL9
難、BIL10難、BIL11易、BIL12易、BIL13難、BIL14易、B
IL15易、BIL16易、BIL17易、BIL18易、BIL19易、BIL20
難、BIL21易、BIL22易、BIL23易、BIL24易、BIL25易、B
IL26易、BIL27易、BIL28易、BIL29易、BIL30難、BIL31
難、BIL32易、BIL33易、BIL34易、BIL35易、BIL36易、B
IL37難、BIL38易、BIL39易、BIL40易、BIL41易難、BIL4
2難、BIL43難、BIL44易、BIL45易、BIL46易難、BIL47
易、BIL48易、BIL49易、BIL50難、BIL51易、BIL52易、B
IL53易、BIL54易、BIL55難、BIL56易、BIL57易、BIL58
難、BIL59難、BIL60易、BIL61難、BIL62易、BIL63易、B
IL64難、BIL65易、BIL66易、BIL67易、BIL68易、BIL69
易、BIL70易、BIL71難、BIL72易、BIL73難、BIL74易、B
IL75易、BIL76難、BIL77難、BIL78難、BIL79易、BIL80
易、BIL81易、BIL82易、BIL82易、BIL84易、BIL85易、B
IL86難、BIL87易、BIL88易、BIL89易、BIL90易、BIL91
易、BIL92難、BIL93難、BIL94易、BIL95易、BIL96難、B
IL97易、BIL98易、であった。判定が「易難」とあるの
は、反復試験間あるいは反復試験内で粒ごと結果が異な
ったことを示す。

【００３６】〔実施例２〕 アミロペクチンの枝状構造
の分析 アミロペクチンの枝状構造分析用の米粉の調製は、日本
晴およびカサラス両品種ならびにおよび（日本晴×カサ
ラス）×日本晴の戻し交雑後代自殖系統群９８系統（BI
L1〜98）の胚を取り除いた玄米を、乳鉢と乳棒で摩砕す
ることにより行った。

【００３７】アミロペクチンの枝状構造の分析は、Naka
muraら（1997）の方法に従って、５mgの米粉を100%メタ
ノール５mLにけん濁し、10分間煮沸した。その後2,000g
で10分間遠心し、90%メタノール５mLで沈殿物を２度洗
浄した。洗浄した試料に５mLの蒸留水を加え、１時間煮
沸することにより試料中のでんぷんを糊化した。糊化で
んぷん１mLに50μLの600mM酢酸緩衝液（pH4.4）、２%ア
ジ化ナトリウム10μLを加え、さらに約1,400unitのイソ
アミラーゼ（枝切り酵素）を加え24時間40℃で反応させ
ることにより、アミロペクチンの枝状構造を枝の付け根
の部分で加水分解した。分解産物は弱アルカリ条件（pH
約８）で25mgの水素化ホウ素ナトリウムと室温で20時間
反応させることにより還元し、引き続き真空乾燥した。

【００３８】乾燥試料を１N水酸化ナトリウム100μLで
溶解した後、900μLの蒸留水で希釈した。希釈試料の一
部（25μL）をDionex BioLC（Model DX-500、ダイオネ
ックス社、カリフォルニア、アメリカ合衆国）にパルス
ドアンペロメトリック検出器（ダイオネックス社）を装
着し、CarboPac PA-1カラム（ダイオネックス社）を用
いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって、アミロ
ペクチンの各枝の長さの分布の分析を行った。なお、溶
出は0.1M NaOH中の酢酸ナトリウム濃度を25mMから250mM
に変化させ、１mL/分の流速とした。結果の一部を図２
Ａに示す。

【００３９】（結果）図２Ａに示すように、日本晴、カ
サラス両品種間では、アミロペクチンの鎖長（グルコー
スが重合した分枝の長さ）分布が異なり、日本晴ではカ
サラスより短鎖（重合度７〜9）が相対的に多く、逆に
中鎖（重合度１２〜２１）の割合が少ないことが明らか
となった。両品種におけるこの違いは、各鎖のピーク面
積相対値の差分（日本晴のピーク面積相対値−カサラス
のピーク面積相対値）で表した場合、より明確であった
（図２Ｂ）。

【００４０】同様の解析を（日本晴×カサラス）×日本
晴の戻し交雑後代自殖系統群９８系統（BILs）について
行い、各々のアミロペクチン鎖長（枝の長さ）分布が品
種「日本晴」のそれに類似しているか、品種「カサラ
ス」のそれに類似しているかを判定した。その結果は、
以下の通りである。

【００４１】（結果） 〔品種「日本晴」に類似しているBIL〕BIL1、BIL2、BIL
3、BIL4、BIL5、BIL7、BIL8、BIL11、BIL12、BIL14、BI
L15、BIL16、BIL17、BIL18、BIL19、BIL21、BIL22、BIL
23、BIL24、BIL25、BIL26、BIL27、BIL28、BIL29、BIL3
2、BIL33、BIL34、BIL35、BIL36、BIL38、BIL39、BIL4
0、BIL41、BIL44、BIL45、BIL47、BIL48、BIL49、BIL5
1、BIL52、BIL53、BIL54、BIL56、BIL57、BIL60、BIL6
3、BIL65、BIL66、BIL67、BIL68、BIL69、BIL70、BIL7
2、BIL74、BIL75、BIL79、BIL80、BIL81、BIL82、BIL8
4、BIL85、BIL87、BIL88、BIL89、BIL90、BIL91、BIL9
4、BIL95、BIL97、BIL98

【００４２】〔品種「カサラス」に類似しているBIL〕B
IL6、BIL9、BIL10、BIL13、BIL20、BIL30、BIL31、BIL3
7、BIL42、BIL43、BIL46、BIL50、BIL55、BIL58、BIL5
9、BIL61、BIL62、BIL64、BIL71、BIL73、BIL76、BIL7
7、BIL78、BIL83、BIL86、BIL92、BIL93、BIL96

【００４３】〔実施例３〕 でんぷん合成酵素活性の検
出 でんぷん合成酵素活性の検出は、発育途中のイネ胚乳の
ポリアクリルアミド電気泳動し、その後、活性染色を行
うことにより実施した。電気泳動終了までの操作は４℃
もしくは氷冷下で行った。

【００４４】詳しくは、日本晴、カサラス、BIL11、BIL
13、BIL14、BIL19、BIL20、BIL37、BIL49、BIL50、BIL6
3、BIL69、BIL73、BIL92の発育途中の胚乳（３〜８粒）
をガラスホモジナイザーを用いてサンプルの５倍量の抽
出用緩衝液（50mM Tris(pH7.0)、10mM EDTA、5mM ジチ
オスレイトール、10％グリセロール）とともに摩砕し
た。摩砕物を４℃条件下において10,000gで５分間、遠
心分離し上清を粗酵素液とした。

【００４５】ポリアクリルアミド電気泳動は、分離ゲル
の組成を7.5%(w/v)アクリルアミド（30:0.8, アクリル
アミド:ビスアクリルアミド）、375mM Tris(pH8.8)、0.
8%(w/v)ウサギ肝臓グリコーゲン（シグマ社）とし、分
離ゲルと泳動用緩衝液は一般的に用いられるSDS-PAGE法
（Laemmli, 1970）のそれらからSDSを省いて調製した。

【００４６】なお、分離ゲルの大きさは幅8.5cm、長さ6
cmとした。泳動は15mAの定電流で約３時間行った。泳動
後のゲルは35mLの培養液（100mMビシン、0.5Mクエン酸
ナトリウム（pH8.5）1mM EDTA、2mMジチオスレイトー
ル、10%グリセロール）に浸し15分間穏やかに振とうす
ることにより、ゲルの平衡化を行った。この操作はもう
一度繰り返した。

【００４７】その後、上記培養液にでんぷん合成酵素の
基質であるADPグルコースを1mMとなるように加え、この
溶液30mL中にゲルを浸して25℃で一晩穏やかに振とうを
続けた。でんぷん合成酵素活性に基づくバンドの検出
は、ヨウ素を含むルゴール液（シグマ社）約10mLでゲル
を染めることによった。この染色により、でんぷん合成
酵素の活性は赤褐色、茶褐色もしくは黒褐色のバンドと
して検出される。なお、培養液にADPグルコースを加え
ない対照のゲルでは活性に基づくバンドは検出されな
い。結果を図３に示す。

【００４８】（結果）図３に示すように、日本晴、カサ
ラスならびにBIL11、BIL14、BIL19、BIL49、BIL63、BIL
69では、でんぷん合成酵素活性に基づくバンドが２本検
出された。一方、BIL13、BIL20、BIL37、BIL50、BIL7
3、BIL92では、さらに泳動度の大きいもう１本のバンド
が検出された。

【００４９】〔実施例４〕 アルカリ崩壊性遺伝子の染
色体上の座乗位置の決定方法 ９８系統の（日本晴×カサラス）×日本晴の戻し交雑後
代自殖系統群を使用して、アルカリ崩壊性遺伝子の染色
体上の座乗位置を決定した。BILsは、まず、ジャポニカ
品種「日本晴」にインディカ品種「カサラス」を交配
し、得られたF1個体に「日本晴」を戻し交雑（backcros
s, BC)しBC1F1種子を得る。98系統からなるBC1F5系統群
（戻し交雑後代自殖系統群）は、BC1F1種子98粒から植
物体を育て、各々の個体から１粒のみ採種して次世代を
得る方法（single seed decentmethod）を４度繰り返す
ことにより育成することができる(Linら（1998）)。

【００５０】98系統あるBILsを用いて作成された245個
のDNAマーカーよりなる遺伝連鎖地図と、BIL各々の系統
の12本ある染色体のどの領域が「日本晴」あるいは「カ
サラス」由来であるかは明らかにされている（イネゲノ
ムプログラム公開データ、http://www.staff.or.jp）。
各マーカーの位置における遺伝子型、「日本晴」型か
「カサラス」型かと、各BILのアルカリ崩壊性の難易が
「日本晴」型（易）か「カサラス」型（難）かを対応さ
せることにより、アルカリ崩壊性を制御する遺伝子は第
６染色体短腕上のマーカーG200、R2147（このふたつの
マーカーは現時点の解析精度では同座とされている）と
C1478の間に存在することが明らかである。また、BIL1
1、BIL63、BIL69はマーカー G200、R2147との間で、BIL
37はマーカーC1478との間で組換えが確認された。この
結果、組換え価の計算によりアルカリ崩壊性を制御する
遺伝子は、上記マーカー間のG200、R2147側から３対１
にあたる位置、Harushima ら（1998）が「日本晴」「カ
サラス」のF2集団を用いて作成した高密度連鎖地図を基
準とすると、第６染色体短腕上36.7cMに座乗すると判断
された。

【００５１】〔実施例５〕 アミロペクチンの枝状構造
を制御する遺伝子の染色体上の座乗位置の決定方法 上記（日本晴×カサラス）×日本晴のBILs各々のアミロ
ペクチン枝状構造を実施例２と同様にして分析し、それ
らの鎖長分布が日本晴とカサラスのいずれのものに類似
しているかを判定した。その判定結果、すなわちアミロ
ペクチンの鎖長構造が「日本晴」あるいは「カサラス」
に類似しているかと、BILsの各マーカーの遺伝子型が
「日本晴」型あるいは「カサラス」型であるかを比較す
ることにより、アミロペクチンの枝状構造を制御する主
働遺伝子は一つ存在し、その染色体上の位置はアルカリ
崩壊性を制御する遺伝子と同じく第６染色体短腕上のマ
ーカー G200、R214とC1478の間であった。また、BIL1
1、BIL63、BIL69はマーカー G200、R2147との間で、BIL
37はマーカーC1478との間で組換えが確認された。組換
え価の計算によりアミロペクチンの枝状構造を制御する
遺伝子は、アルカリ崩壊性を制御する遺伝子と同じく第
６染色体短腕上36.7cMに座乗すると判断された。

【００５２】〔実施例６〕 でんぷん合成酵素の活性を
制御する遺伝子の染色体上の座乗位置の決定方法 ポリアクリルアミド電気泳動−活性染色法によりBIL1
3、BIL20、BIL37、BIL50、BIL73、BIL92に検出されBIL1
1、BIL14、BIL19、BIL49、BIL63、BIL69には検出されな
かったでんぷん合成酵素の活性の有無を制御する遺伝子
の染色体上の位置を、用いたBILsの各マーカーの遺伝子
型と対応させることにより決定した。

【００５３】BILsの育成に用いた日本晴、カサラス両品
種から当該でんぷん合成酵素活性を検出できなかったた
め、当該でんぷん合成酵素活性をもつBILを仮に「日本
晴」型とし解析した結果、その活性の有無を制御し得る
遺伝子座は存在しなかった。逆に当該でんぷん合成酵素
活性をもつBILを「カサラス」型とした場合、それを制
御し得る遺伝子座は、アルカリ崩壊性を制御する遺伝子
ならびにアミロペクチンの枝状構造を制御する遺伝子と
同じく第６染色体短腕上のマーカー G200、R214とC1478
の間となった。さらに、BIL11、BIL63、BIL69はマーカ
ー G200、R2147との間で、BIL37はマーカーC1478との間
で組換えが確認され、組換え価の計算より当該でんぷん
合成酵素の活性を制御する遺伝子は、アルカリ崩壊性を
制御する遺伝子、アミロペクチンの枝状構造を制御する
遺伝子と同じく第６染色体短腕上36.7cMに座乗すると判
断された。

【００５４】〔実施例７〕胚乳のESTクローン(E11205)
の塩基配列およびアミノ酸配列の解読イネ胚乳のESTク
ローン(E11205)について、その塩基配列およびアミノ酸
配列を決定した。 上記ESTクローン（E11025）は、農林水産省農業生物資
源研究所イネゲノム研究チームより分譲された。該クロ
ーンは、ジャポニカ型イネ品種である日本晴の未熟種子
のmRNAを鋳型にし、ポリTをプライマーとして、リバー
ストランスクリプターゼの作用によって作成したcDNA
を、５’末端と３’末端にSalIとNotI認識塩基配列をそ
れぞれ付加して、プラスミドベクターpBluescript IISK
+（Stratagene）にサブクローニングしたものである。
このプラスミドを更に大腸菌JM109株に感染させ、形質
転換された大腸菌をグリセロールストックして保存して
ある。

【００５５】上記の形質転換された大腸菌JM109株を、5
0 mg/mLのアンピシリンを含むLB培地（１Ｌ当たり1％バ
クトトリプトン、0.5％イーストエキストラクト、1％塩
化ナトリウムを含む）上にまき、３５℃で終夜培養し
た。得られたコロニー群からシングルコロニーを選び、
このコロニーからQiagenキット（アミコン、USA）によ
ってシングルコロニーにLB溶液３mLを加え、37℃条件下
で約６時間激しく撹拌しながら培養を行った。培養液に
LB溶液を添加し50mLとし、約12時間さらに培養を行っ
た。その後４℃条件下で6,000g、15分間遠心分離し、上
清を捨て沈殿にP1緩衝液４mLを加えてけん濁し、続けて
P2緩衝液を４mL加え容器を穏やかに４回反転させること
により混和し、室温に５分間静置して大腸菌を溶菌させ
た。その後、氷冷したP3緩衝液４mLを加え５回ゆっくり
と反転混和し、15分間、氷冷下で培養した。培養液を４
℃条件下で20,000g、10分間遠心分離して上清を取り、
再度20分間遠心分離してその上清をプラスミドDNA抽出
液とした。

【００５６】QEAGEN-tip 100カラムをQTB緩衝液4mLで平
衡化した後、プラスミドDNA抽出液をカラムに添加しプ
ラスミドDNAをカラムに吸着させ、10mLのQC緩衝液で２
度カラムを洗浄後、5mLのQF緩衝液を流すことによりプ
ラスミドDNAを溶出させた。溶出したプラスミドDNAは3.
5mLのイソプロパノールを加えることにより沈殿させ、5
mLの70%エタノールで洗浄後、５分程度風乾させた。風
乾後50μLのTE緩衝液に溶解させることによりプラスミ
ドＤＮＡを調製した。

【００５７】このプラスミドＤＮＡを制限酵素 Hind II
I, Kpn I, EcoR I, XhoI, SacIによって加水分解した
後、１％アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離
し、それぞれの長さを１kbＤＮＡラダー(ライフテック
オリエンタル社)をマーカーとして測定し、E11205クロ
ーンの制限酵素地図を作成したところ、E11205クローン
は全長約1.7-1.8kbであった。

【００５８】さらに、上記制限酵素によって得られた数
種類のＤＮＡ断片を１％アガロース電気泳動で分離した
後、GelNebulizer（アミコン、USA）によって精製し、
それぞれプラスミドpBluescript IISK+（Staratagene）
のそれぞれの制限酵素に対応する部位にサブクローニン
グした。サブクローニングされたクローンを含むプラス
ミドは大腸菌JM109株に感染させ、形質転換された大腸
菌はグリセロールストックして保存した。

【００５９】次に、E11025クローン全体及びクローンの
断片を含むプラスミドの塩基配列を、ジデオキシ法に基
づいて、DyePrimer Cycle Sequencing FS ReadyReactio
nキット（PEバイオシステムズジャパン、千葉県浦安
市）および蛍光DNAシーケンサー（PEバイオシステムズ
ジャパン, Model373S-36型）を用いて、決定した。各ク
ローンの両側からの塩基配列を求めるため、M13フォワ
ードプライマー：TGTAAAACGACGGCCAGT(配列番号３)、お
よびリバースプライマー：CAGGAAACAGCTATGACC (配列番
号４)を用いた。

【００６０】得られた塩基配列を、核酸およびアミノ酸
配列の解析ソフト（Genetyx、ソフトウェア開発、東
京）を用いて解析した。その結果、ESTクローン(E1120
5)は1,724塩基から成ることが明らかとなり、466アミノ
酸をコードすると考えられた。そこでさらに、ESTクロ
ーン（E11025）のアミノ酸配列を解析ソフト（Genety
x、ソフトウェア開発、東京）を用いて解析した。ESTク
ローン(E11205)の塩基配列を配列番号１に、またこの塩
基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に
示す。

【００６１】〔実施例８〕 アミノ酸配列の相同性解析 次に、実施例７で決定されたアミノ酸配列(配列番号２)
とデータベース(DDBJ,Genbank,EMBL)で得られる既知の
タンパク質との相同性を比較した。その結果、配列番号
２のアミノ酸配列は、トウモロコシのでんぷん合成酵素
IIａ型アイソザイム(SSIIa)の対応するアミノ酸配列と
の間に87.6％と最も高い相同性を示した。また、トウモ
ロコシのでんぷん合成酵素ｂ型アイソザイム(SSIIb)の
対応配列とも77.9％の相同性を示した(図４)。また、配
列番号２のアミノ酸配列中には、コムギ、トウモロコ
シ、エンドウ、ジャガイモのでんぷん合成酵素II型アイ
ソザイムの遺伝子(既知)に共通する８つの保存領域(こ
の遺伝子の機能の発現に重要であると考えられている)
のうち７つの保存領域(図４中領域2,3,4,5,5a,6,7)が含
まれていた。

【００６２】これらの結果から、配列番号２のアミノ酸
配列で表わされるタンパク質をコードするＤＮＡは、イ
ネSSIIa遺伝子の一部であると推定した。尚、配列番号
２のアミノ酸配列は、エンドウおよびジャガイモのでん
ぷん合成酵素II型(SSII)タンパク質の対応配列との間に
も、それぞれ70.6％、70.0％の相同性を示した。

【００６３】〔実施例９〕 イネSSIIa遺伝子と推定され
る塩基配列領域のマッピング イネSSIIa遺伝子と推定される塩基配列の所在を明らか
にするため、イネゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を
行った。まずイネジャポニカ品種の日本晴とインディカ
品種のカサラスのゲノムＤＮＡを幼葉から単離し、その
一部をエッペンドルフチューブ内でそれぞれ各BamH I,B
gl II, EcoR V, Hind III, Apa I, Dra I, EcoR I, Kpn
Iの制限酵素で加水分解した後、生成したＤＮＡ断片を
アガロース電気泳動によって分離した。分離ＤＮＡをフ
ィルターに転写し、全長ESTクローン（E11025）(配列番
号１)をプローブとして、サザンブロットを行った。結
果を図５に示す。

【００６４】（結果）その結果、BamH I断片においてプ
ローブとの反応が認められ、さらにこの断片にはイネの
日本晴・カサラス両品種においてRFLP性が認められた。
これを利用して、(日本晴×カサラス)×日本晴のBIL各
系統を、日本晴型（20kbのBamH I断片を含む）、カサラ
ス型（23kbのBamH I断片を含む）、ヘテロ型（20 kbお
よび23kbのBamH I断片両方を含む）の３つのタイプに分
類し、イネSSIIa遺伝子と推定される塩基配列のマッピ
ングを行った。

【００６５】その結果、BIL系統間におけるRFLPパター
ンの挙動は、アルカリ崩壊性と全て一致した。従って、
イネSSIIa遺伝子と推定される塩基配列は、alk遺伝子と
同一の遺伝子座かあるいは極めてその近傍に座上すると
結論した。

【００６６】

【発明の効果】本発明のアンチセンスＤＮＡを植物内で
発現させることにより、その植物のでんぷんの１成分で
あるアミロペクチンの枝状構造を変化させることがで
き、食品素材として異なった加工適性を持つでんぷんが
提供される。

【００６７】さらに、アミロペクチンの枝状構造を変化
させることで、米粒の希アルカリ溶液に対する崩壊性を
変化させることができる。希アルカリ溶液に対する崩壊
性の難易は米粒の熱糊化性の難易と対応することが知ら
れているため、アルカリ崩壊性を変化させることで、米
の炊飯特性、調理適性を変えることが期待できる。

【００６８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takahiro Inoue, Director-General of Tohoku National Agricultural E xperiment Station, Ministry of Agriculture,Forestry and Fisheries. <120> A starch synthase gene which controls the structure and the gelati nization properties of creal starch. <130> P00-0048 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1724 <212> DNA <213> Oryza sativa/Nipponbare <220> <221> CDS <222> (1)..(1398) <400> 1 ccg aaa gct ttg gcg agg aga gga cat cgt gtt atg gtt gtg gta cca 48 Pro Lys Ala Leu Ala Arg Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro 1 5 10 15 agg tac ggt gat tac gcg gaa gcc cag gat gta gga atc agg aaa tac 96 Arg Tyr Gly Asp Tyr Ala Glu Ala Gln Asp Val Gly Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 tac aag gct gct gga cag gat ctg gaa gtg aaa tat ttc cat gca ttt 144 Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp Leu Glu Val Lys Tyr Phe His Ala Phe 35 40 45 atc gat gga gtt gat ttt gtg ttc att gac gct cct ctc ttc cgt cac 192 Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His 50 55 60 cgt cag gat gac atc tat ggg ggg aac aga cag gaa atc atg aag cgc 240 Arg Gln Asp Asp Ile Tyr Gly Gly Asn Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg 65 70 75 80 atg att ctg ttt tgt aag gct gct gtt gag gtt cct tgg cac gtt cca 288 Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro 85 90 95 tgc ggt ggt gtg ccc tat ggg gat ggc aac ttg gtg ttc ctt gca aac 336 Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Leu Ala Asn 100 105 110 gat tgg cac act gca ctc ctg cct gtt tat ctg aag gca tat tac aga 384 Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg 115 120 125 gac aat ggc atg atg cag tac act cgc tct gtc ctt gtg ata cat aat 432 Asp Asn Gly Met Met Gln Tyr Thr Arg Ser Val Leu Val Ile His Asn 130 135 140 atc gct tac cag ggc cgt ggc cca gta gat gaa ttc ccc tac atg gaa 480 Ile Ala Tyr Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Tyr Met Glu 145 150 155 160 ttg ccg gag cac tac ctg gat cac ttc aag ctg tac gac ccc gtc ggc 528 Leu Pro Glu His Tyr Leu Asp His Phe Lys Leu Tyr Asp Pro Val Gly 165 170 175 ggc gag cac gcc aac atc ttc ggc gcg ggc ctg aag atg gcg gac cgg 576 Gly Glu His Ala Asn Ile Phe Gly Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Arg 180 185 190 gtg gtg acc gtg agc ccc ggc tac ctc tgg gag ctg aag acg acg gag 624 Val Val Thr Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Thr Glu 195 200 205 ggc ggc tgg ggc ctc cac gac atc ata cgg gag aac gac tgg aag atg 672 Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Glu Asn Asp Trp Lys Met 210 215 220 aac ggc atc gtg aac ggc atc gac tac cgg gag tgg aac ccg gag gtg 720 Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp Tyr Arg Glu Trp Asn Pro Glu Val 225 230 235 240 gac gtg cac ctg cag tcc gac ggc tac gcc aac tac acc gtg gcc tcg 768 Asp Val His Leu Gln Ser Asp Gly Tyr Ala Asn Tyr Thr Val Ala Ser 245 250 255 ctg gac tcc agc aag ccg cgg tgc aag gcg gcg ctg cag cgc gag ctg 816 Leu Asp Ser Ser Lys Pro Arg Cys Lys Ala Ala Leu Gln Arg Glu Leu 260 265 270 ggg ctg gag gtg cgc gac gac gtg ccg ctg atc ggg ttc atc ggg cgg 864 Gly Leu Glu Val Arg Asp Asp Val Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg 275 280 285 ctc gac ggg cag aaa ggt gtg gac atc atc ggc gac gcg atg ccg tgg 912 Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Asp Ile Ile Gly Asp Ala Met Pro Trp 290 295 300 atc gcc ggg cag gac gtg cag ctg gtg ctg ctg ggc tcc ggc cgc cgc 960 Ile Ala Gly Gln Asp Val Gln Leu Val Leu Leu Gly Ser Gly Arg Arg 305 310 315 320 gac ctg gag gtg atg ctg cag cgg ttc gag gcg cag cac aac agc aag 1008 Asp Leu Glu Val Met Leu Gln Arg Phe Glu Ala Gln His Asn Ser Lys 325 330 335 gtg cgc ggg tgg gtg ggg ttc tcg gtg aag atg gcg cac cgg atc acg 1056 Val Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Lys Met Ala His Arg Ile Thr 340 345 350 gcg ggc gcc gac gtg ctg gtc atg ccg tcg cgg ttc gag ccg tgc ggc 1104 Ala Gly Ala Asp Val Leu Val Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly 355 360 365 ctc aac cag ctc tac gcc atg gcg tac ggc acc gtc ccc gtc gtg cac 1152 Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His 370 375 380 gcc gtc ggc ggg ctg agg gac acc atg tcg gcg ttc gac ccg ttc gag 1200 Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr Met Ser Ala Phe Asp Pro Phe Glu 385 390 395 400 gac acc ggc ctc ggg tgg acg ttc gac cgc gcc gag ccg cac aag ctc 1248 Asp Thr Gly Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Pro His Lys Leu 405 410 415 atc gag gcg ctc ggc cac tgc ctc gag acg tac cgc aag tac aag gag 1296 Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu Glu Thr Tyr Arg Lys Tyr Lys Glu 420 425 430 agc tgg agg ggg ctc cag gtg cgc ggc atg tcg cag gac ctc agc tgg 1344 Ser Trp Arg Gly Leu Gln Val Arg Gly Met Ser Gln Asp Leu Ser Trp 435 440 445 gac cac gcc gcc gag ctc tac gag gag gtc ctt gtc aag gcc aag tac 1392 Asp His Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Glu Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr 450 455 460 caa tgg tgaagagacc atgtccgccc gcggtctccg cctgcgcgtt cggcagctat 1448 Gln Trp 465 agctatagcc tccctgaaga agcttggcgc tgctgtggag gtgcgactcg gtggcggtgt 1508 ggcgccggcg ccggcgcttg caggggaggt gtttgtgctg accgagctgt gcgttgaggt 1568 gcgcaaatta gcttccggtt tgtgtgttca tggcgaggca tggtggagtt gagggagtat 1628 taagctttgt ttcagatgca tcatgcatgc gtaataggat gttgtattta ataatgtgtt 1688 tgttatgtcc attgatgcga tgttacttct caaaaa 1724 <210> 2 <211> 466 <212> PRT <213> Oryza sativa/Nipponbare <400> 2 Pro Lys Ala Leu Ala Arg Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro 1 5 10 15 Arg Tyr Gly Asp Tyr Ala Glu Ala Gln Asp Val Gly Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp Leu Glu Val Lys Tyr Phe His Ala Phe 35 40 45 Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His 50 55 60 Arg Gln Asp Asp Ile Tyr Gly Gly Asn Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg 65 70 75 80 Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro 85 90 95 Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Leu Ala Asn 100 105 110 Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg 115 120 125 Asp Asn Gly Met Met Gln Tyr Thr Arg Ser Val Leu Val Ile His Asn 130 135 140 Ile Ala Tyr Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Tyr Met Glu 145 150 155 160 Leu Pro Glu His Tyr Leu Asp His Phe Lys Leu Tyr Asp Pro Val Gly 165 170 175 Gly Glu His Ala Asn Ile Phe Gly Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Arg 180 185 190 Val Val Thr Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Thr Glu 195 200 205 Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Glu Asn Asp Trp Lys Met 210 215 220 Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp Tyr Arg Glu Trp Asn Pro Glu Val 225 230 235 240 Asp Val His Leu Gln Ser Asp Gly Tyr Ala Asn Tyr Thr Val Ala Ser 245 250 255 Leu Asp Ser Ser Lys Pro Arg Cys Lys Ala Ala Leu Gln Arg Glu Leu 260 265 270 Gly Leu Glu Val Arg Asp Asp Val Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg 275 280 285 Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Asp Ile Ile Gly Asp Ala Met Pro Trp 290 295 300 Ile Ala Gly Gln Asp Val Gln Leu Val Leu Leu Gly Ser Gly Arg Arg 305 310 315 320 Asp Leu Glu Val Met Leu Gln Arg Phe Glu Ala Gln His Asn Ser Lys 325 330 335 Val Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Lys Met Ala His Arg Ile Thr 340 345 350 Ala Gly Ala Asp Val Leu Val Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly 355 360 365 Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His 370 375 380 Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr Met Ser Ala Phe Asp Pro Phe Glu 385 390 395 400 Asp Thr Gly Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Pro His Lys Leu 405 410 415 Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu Glu Thr Tyr Arg Lys Tyr Lys Glu 420 425 430 Ser Trp Arg Gly Leu Gln Val Arg Gly Met Ser Gln Asp Leu Ser Trp 435 440 445 Asp His Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Glu Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr 450 455 460 Gln Trp 465 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: M13 forward primer. <400> 3 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: M13 reverse primer. <400> 4 caggaaacag ctatgacc 18

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリ崩壊性の比較基準とした「日本晴」お
よび「カサラス」の２品種を処理した結果を示す。

【図２】Ａ：「日本晴」「カサラス」両品種におけるア
ミロペクチンの鎖長（グルコースが重合した分枝の長
さ）分布を示す。Ｂ：Ａにおける両品種間の違いを、各
鎖のピーク面積相対値の差分で表したグラフである。

【図３】ポリアクリルアミド電気泳動−活性染色法によ
るでんぷん合成酵素活性の検出結果を示す。

【図４】配列番号２のアミノ酸配列(上段)、およびこの
配列と高い相同性を有するトウモロコシのでんぷん合成
酵素IIａ型アイソザイム(SSIIa)の対応するアミノ酸配
列(中段)、トウモロコシのでんぷん合成酵素IIｂ型アイ
ソザイム(SSIIb)の対応配列(下段)、を示す。アミノ酸
略号の下のアスタリスクは、比較した３つの配列間でア
ミノ酸が相同であることを示す。

【図５】イネゲノムＤＮＡのサザンブロット解析の結果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ ４Ｈ０４５ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA01 CA06 CD02 CD07 CD09 4B024 AA08 BA07 CA04 DA01 EA04 GA14 4B050 CC03 DD13 LL10 4B064 AG01 CA11 CA19 CC24 DA11 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 BA03 CA27 CA53 4H045 AA10 BA10 CA31 DA89 EA05 FA72 FA74

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
   をコードするＤＮＡ： （ａ） 配列番号２記載のアミノ酸配列で表わされるタ
   ンパク質、（ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において
   １若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
   されたアミノ酸配列により表わされ、かつアミロペクチ
   ンの枝状構造を変化させる活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡのアンチセンスＤ
   ＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２記載のアンチセンスＤＮＡを植
   物内で発現させることを特徴とする、植物の作出方法。