JPH01503039A - トランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスジェニック動物 本発明は畜産学、特に目的とする特性、たとえば＾められた体重増加、飼料効率 、乳汁産生、または疾１ｉ抵抗性を儂えた新品種の動物を育成する方法に関する 。

伝統的な１１棟法では、目的とする特定の′４１Ｆ性な備えた動物な得ること１ 可能であった。しかしこの種の方法では、目的とする特性のほかに多数の目的外 の特性が得られることがしばしばあった。

最近、外来遺伝子を動物の遺伝子系に導入することに関連して重要な発展が得ら れた。一般にこれはＲＮＡ／ＤＮＡ技術（遺伝子の分離および特性決定な含む） および単一細胞期胚移植法（卵子の採取および再着床な含む）の双方を用いて行 われる。

要約するとこの方法は全体とし℃下記の工程を伴う。

−純粋な遺伝子試料（ＤＮＡ断片）な分離し；−受精したばかりの卵子な採取し ； −少ｆｒ（たとえば１０３Ｊの遺伝子溶液な、雌性核と融合して一細飽期胚な形 成する前の雄性核（精子からのもの〕に注入し；そして −注入された卵子な適切に１ｉｉ１１！ｌ！された代用母体に移ｍ−ｆる。

子孫が生まれたのち、少量の組織（通常は尾Ｊを採取し、これからＤＮＡ１ｋ調 製し、これ七単−細胞期に注入された遺伝子がその動物の染色体に安定に取込ま れたか否かを確認するために評価することができる。そうであれば、これはトラ ンスジェニック動物である。

上記方法が、外来遺伝子、たとえばヒト成長ホルモンな敞込んだ遺伝子構造の導 入によってマウスにおい℃成長を促進し。

大きさな増重ために効果的に用いられてきた。しかしこの方法はＩＩｋ場動物に おいて目的の特性を高める試みでは成功し℃いないＯ 本発明の目的は先行技術方法に関連するｌまたは２以上の難点および／または欠 点を克服することである。

本発明の一観点によれば。

＋！Ｌｌ受精したばかりの卵子を採取し；ｌｂｌ卵子と相同の特性決定ホルそン の遺伝子試料な分離し；Ｉｃ＋この遺伝子試料を、雌性核と融合して単−細胞期 胚を形成する前の卵子の雄性核中へ導入し；そして＋ａ＋次いで卵子な適切に＆ ４殺された雌性動物中へ移植することよりなる。新品種の動物の育成法が提供さ れる。

受精したばかりの卵子はいかなる適切な動物のものであってもよい。適切な動物 には農場動物、たとえばウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シテメンチ１つ、お よび海洋動物、たとえばアワビが含まれる。受精した卵子は既知のいずれの方法 によっても得られる。

卵子と相同の特注決定ホルモンの遺伝子試料は必然的に、得られる動物卵子に依 存するであろう。たとえば得られる動物ｙ５子がブタのものである場合、遺伝子 試料は特性決定ブタホルモンからなるであろう。

分離および注入される特性決定ホルそンの種類は目的とするいかなる特性ホルモ ンでおってもよい。分離および注入されるホルモンの種類は目的とする子孫の特 性に依存するであろう。

たとえば子孫がブタであり、目的とする特性が成長促進である場合、遺伝子試料 はブタ成長ホルモンからなるであろう。遺伝子試料は既知のいかなる方法によっ ても単離できる。

本発明の他の観点によれば、非ブタプロ七−ター領域を；−ドする第１クローン 化ＤＮＡ配列、およびブタ成長ホルモン（ＰＧ）１ノ活性を有する第２クロー／ 化ＤＮＡ配列な含むプラスミド発現ベクターが提供される。

こうして調製されたプラスミド発現ベクターはコード領域中にブタ成長ホルモン の完全コピーを含んでい℃もよい。

いかなる適切なプラスミド発現ベクターまたはクローニングベクターも用いられ る。たとえばプラスミドクローニングベクターＰＵＣ１９（／うｙダー（Ｎｏｒ ｒａｎｄｅｒ　）ら、１９８３　Ｇｅｎθ２６：１０１−１０６　Ｊが適切であ ることが見出された。

第１クローン化ＤＮＡ配列はヒトプロモーター領域をコードし５る。ヒトプロモ ーター領域はヒトメタロチオネインプロミータ−（ｈＭＴ　ｌｌ　ＡＪでおろう 。好ましい形態においＣは、修飾されたメタロチオネインプロモータープラスミ ドが用いられるであろう。

第１クローン化ＤＮＡ配列はプラスミドクローニングベクター内でＥｃｏ　ＲＩ 　−Ｈｌｎｄ　ｌ挿入配列な形成しうる。この押入配列は長さ約８１０−８２３ 　ｂｐであろう。好ましい形態においてはこれは長さ８２３　ｂｐでらる。第１ クローン化ＤＮＡ配列はヒトメタロチオネインプロモーターの！！累も含みうる 。

ブタ成長ホルモン活性なコードするＤＮＡ配列は、メッセンジャーＲＮＡまたは ポリアデニル化ＲＮＡから形成されたＣＤＮＡライブラリーから分離することが できる。たとえばこれはブタ下垂捧組滅から分離できる。

第２クローン化ＤＮＡ配列はプラスミド発現ベクター内でＥｃｏ　ＲＩ　−Ｅｃ ｏ　ＲＩ挿入配列な形成し５る。この挿入配列は幾さ約５２２　ｂｐであろう。

プラスミドは小型の高コピー数発現ベクターである。プラスミド発現ベクターは プラスミドｐＵ０１ｇまたはｐＫＴ５２でありうる。

本発明によるプラスミドはさらに第３のクローン化ＤＮＡ配列を含みうる。第３ クローン化配列はブタ成長ホルモン遺伝子の３′末端な含みうる。第３クローン 化断片は第２クローン化ＤＮＡ断片中でＳｍａ　：　Ｂａｎ　／Ｓｍａ挿入配列 を形成しうる。この押入配列は長さ約１０００　ｋ）ｐであろう。

この３′末端断片もまた修飾されていてもよい。一形態においては１反復配列で あると同定された特定の領域が欠失している。

たとえば反復配列を欠失させて、原配列の約１０００ｂｐに対しｆＪ２００ｂｐ の３′断片な残すことができる。反復配列を除くためにブタ成長ホルモンＤＮＡ 試料の３′末端を修飾することは。

ブタゲノムにおける移植遺伝子（トランスジーンノの染色体再配列（リアレンジ メン）Ｊの安定化に寄与する付加的な因子である。この安定化はブタ遺伝子コー ド領域にイントロンを含有させることによりても達成される。

意外にも、コード領域に３′末端断片を含有させることによって、遺伝子からの 読取られた配列（メヴセ／ジャーＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）に安定性な付加しう ろことが見出された。

上記の型のを辿のプラスミドはｐＨＭＰＧ、４　と表示されるものであり、その 試料がオースト）リア、アゾレード大学のカルチャー・コレクシ謬ンに株存され ている。従って本発明の好ましい観点においては、プラスミドｐＨＭＰＧ、４が 提供される。

ｐＨＭＰＧ、４の構成図を第１図に示す。

本発明の他の観点においＣは。

一適切なプラスミドクローニングベクター、非ブタプロモーターケ含む第１ＤＮ Ａ断片、およびブタ成長ホルモンをコードする第２ＤＮＡ断片を用意しニ ー第１ＤＮＡｌｒ片なプラスミドクローニングベクターの適切な部位に挿入し： そして −第２ＤＮＡ断片をプラスミドクローニングベクターの適切な部位に押入する ことな含む、上記プラスミド発現ベクターの製法が提供される。

本発明のこの粂点による方法は、さらに。

−ブタ成長ホルモン遺伝子の染色体コピーからのブタ成長ホルモン遺伝子３′末 端な含む第３クローン化ＤＮＡ断片を用意する ことを含みうる。

この付加的工程は、ブタ成長ホルモンＤＮＡ部分に関する制限部位で制限処理し たプラスミド発現ベクターｔｔｉ４’！裂させ、そして第３ＤＮＡ断片を第２断 片の適切な部位にクローニングすることＫよって行うことができる。

これらの工程１に：第２図に要約する。

ここに記載したプラスミドの製法には、ブタ成長ホルモンのコード領域および関 与する場合には３′非コード領域の特性を決定する予備工程も含まれることは理 解されるであろう。このブタ成長ホルモン′＃性決定については後述する。。Ｐ ＧＨゲノム遺伝子のヌクレオチド配列な第３囚に示す。

プラスミドまたは遺伝子試料、たとえは第１図に示すプラスミドに由来するブタ 成長ホルモン試料Ｈｉｎｄ　ｌ　／　Ｐｖｕ　ｌセグメントな、適宜な方法でブ タの卵子の雄性前核に導入する。遺伝子試料）工卵子の雄性前核に江射で導入す ることができる。

本発明の好ましい観点においては。

１８．１雌性動物からの受精したばかりの卵子を用意し；＋１）ｌプロモーター の＠ｌおよび第２クローン化断片ならびに発現すべき遺伝子のクローニング領域 を含有するプラスミド発現ベクターをｐｍし、そして ＋０１このプラスミドを雌性核と融合して単−緬胞勘胚を形成する罰のＪ＆注前 核に注入する ことを含む、トランスジェニック動物の育成法が提供される。

遺伝子条造物な雄性前核に注入することに際して遭遇する主な問題は、卵子内に ある前核または核を視覚化することである。

ｇ兎などの動物の核構造物は容易に見ることができる。しかしヒツジおよびブタ などの動物の場合、前核および核の位置な確認することは困難である。

ヒツジ卵子の前核および核はＤＮＡ特異性フルオロクロモシームを用いる螢光顕 微鏡検査法、または位相差（干渉コントラスト（ＩＣツノ顕微鏡検量法により見 ることができる。染色および紫外線の組合わせは卵子に損傷を与える可能性があ る。従りて干渉コントラスト顕微鏡検査法がヒツジ卵子のマイクロインジェクシ 箇ン用として好ましい。′ｇＩｋ元分析によって、干渉コントラスト顕微鏡検査 法は約８０％のヒツジ受精卵において前核の位置決定に有効な方法であることが 示された。ヤギ卵子の前核および核を視覚化するためにも同様な方法が用いられ る。

ブタ卵子は不透明であり、干渉コントラストＩＩｊ倣鏡憔査法を用いても核の構 造を見ることはできない。しかし天然のブタ卵子９ｔ１５００１で３分関連心分 離すると、ブタ卵子の前核または核を見ることができる。ウシ卵子の前核および 核を見るためにも同様な方法が用いられる。しかし遠心分離法はヒツジ卵子の前 核な視覚化する助けにはならない。

＠核の注入は拡大下に標準的マイクロインジェクシ璽ン装置を用いて行うことが できる。卵子な先の平らな保持用ピペットにより保持し、透明帯、原形質膜およ び前核工／ベロープをインジェクタ１ンピペツトにより貫通させることができる 。この保持用ピペットの平らな先端は約５０μｍ直径なもつであろう。

インジェクシ嘗ンピペットは約１．５μｍの直径を有するであろう。

注入される遺伝子構造の量は、必然的に前核の大きさおよびインジェクシ曹ンピ ペットのサイズに依存するでろろう。たとえば目的とする特性ホルモンの遺伝子 な含む２．６キロベース（ｋｂＪ巌状断状断片百コピーを注入することができる 。

卵子を次いでいずれかの適宜ｉｓａされた代用母木に適宜な方法で移植する。こ れは既知のいかなる方法によっても達成できる。

本発明なより詳細に説明するために以下の実施例を提示するが、これは本発明を 限定するものではない。

実施例　ｌ プラスミドへ／　１−ｐＵｃ１９　（／　ラフター　（ＮｏｒｒａｎｄｅｒＪら 、Ｇｅｎｅ、２６．］０ｌ−１０６１９８３Ｊ　を用いて構成すレタ約４０００ １１Ｍの個々の組供え体のブタ下垂体ｃＤＮＡ　ライブラリーから１合成りＮＡ プローブを用い″（ｐＧＨのＣＤＮＡクローンな分１１［ｆることかできた。分 離したｃＤＮＡクローンのうち１種、ｐＰｏ、３−意図された全長の挿入配列な 含むことが誌められたーは完全に配列決定された。

ｐＰＧ、ａ　ｃＤＮＡ　％人配列のオープンリーディングフレームはアミノ酸２ １６＠のプレホルモンなコードすることが認められた。このアミノ酸配列はシー バーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ〕らＤＮＡ。

２．３７−４５（１９８３）の部分長ｐＧＨ０ＤＮＡクローンに相当する。この クローン＋ｚｐＧＨシグナル配列なコードする領域。

および４１＠基の５′側非翻訳領域の全配列を初めて提供した。

コード領域内のヌクレオチド配列はきわめて高度に保守されており、シーバーブ ら（１９８３７の配列と１ｍの塩基差があるにすぎない。

第３図 全２２３１ｂｐ配列を図示する。プレーｐＧＨ＆コードするオープンリーディン グフレームｔｔ、先に研兄されたｐＧＨＯＤＮＡ配列ｐＰＧ、３　と配列が異な る塩基とＬ℃示す。アミノ酸置換なもだうて塩基変化に星印を付ける。３′悌非 翻訳領域においてｐＰｏ、３と異なる単一塩基もその配列の下方に指示する。キ ャップ部位（＋ｌＪＯ位１ｌｊ１２ラットおよびヒトのＧＨ遺伝子のキャップ部 位から推定された（ページら、１９８１；プツト（ＤｅＮＯｔＯノら、１９８１ ノ。

推定プロモーターおよびポリアデニル化配列、たとえばＴＡＴＡ、ＡＡＴＡＡＡ 　およびＧＴ　リッチ配列にはアンダーラインな付し、ポリＡテイルが付加され る位置は矢印で示される。

菱異ＧＣ供与体スプライス部位は第１イントロン内、塩基＋７２付近に位に−ｆ る。

後記の章におい℃サブクローニングに用いたＳｍａ　ｌ制限部位も指示され℃い る。

３種の異なる制限ｕ累を用いて消化したブタゲノムＤＮＡのサザー７プロットを 探査するためにｐＰＧ、３のＣＤＮＡ挿入配列な用いると、各トラックに１個の 強＜／％イブリダイズする／＜ン弱いバンドを生じた。これは、遺伝子が実際に 単一コピーとＬ℃存在した場合、ゲノム遺伝子はこれら両＃累に対する内ｓｓ位 な、ｃＤＮＡ　Ｋ相同の領域の末端付近のいずれかに含むはずである（のちにこ れが正しいことが酩められたノ。用いた＠３の＃累Ｈｉｎｄ―は牟−のｆ３瞭な バンドを与えた。これらのデータを合わせると、ＧＨ遺伝子の単一コピーのみが ブタゲノム中に存在することが示される（半数体染色体相補体当たりノ。これは ウシおよびラットのゲノムに類似の状態である力ζヒトのものとは著しく異なる 。

ｐＰＧ、３のＰにＨｃＤＮＡクローンな用いてブタコスミドライブラリーをスク リーニングし、ＰＧ）１遺伝子配列を含むクローンな分離した（２．４Ｊ、コス ミドクローンのサザーン分析によが同定され、これらのサイズは同一のハイブリ ダイセージ、ンプロープな用いたゲノムサザーン法において恢出されたものと等 しかった。コスミドに含まれる遺伝子のヌクレオチド配タリ決定により、全コー ド領域（６４８ｔ）Ｉ）Ｊが、１７８ｂｐのプロモーター領域、５ｌｂｐの５′ 協非翻訳配列、それぞれ２４２゜２１０．１９７および２７８ｂｐの４か所のイ ントロン、ならびに４１４ｂ１）の３′餉非詠訳配列と共に存在することが明ら かになりた（ＩＩ３囚Ｊ、この遺伝子は先に配列決定されたＰＧＨｃＤＮＡクロ ーｙ、ｐＰＧ、３　に比べて、コード領域内に４個の塩基変更Ｓ位を含む。この 第３図に示した塩基置換によって。

シグナルペプチド内に２偽のアミノ酸残基の変更が生じる。残り２ｆＴＡの相違 は沈黙（５ｉｌｅｎｔＪＩｔ換である。３′側非翻訳領域にもｐＰＧ、５ｃＤＮ Ａ配列に比べ”Ｃ１個の塩基の変更がろる（第３図］。

第４図に示す配列の比較は、調べた配列それぞれのプロモーターが高度の相同性 を共有することを示す。第３図はＧＷおよびＨＰＬ遺伝子の５′側非翻訳領域も 意外なほど保守されていることを示す。

ＰＧＨ遺伝子の３′負配タリの分析によって、ポリアデニル化過程で１要である ことが示され℃いる配列の同定が可能となった。

ＰＧＨ遺伝子の３′貴配列な、入手出来たすべてのＧＨおよび）ＩＰＬ配列のも のと比軟することにより、これらもＧＨおよびＨＰＬ双方の遺伝子間で意外なほ ど保守され℃いることが明らかになった。

第４図 配列の相同性の程度を判定するために、ブタｔｈ、ウシ（Ｂ１．ヒト日およびラ ットｔａＧＨ遺伝子、ならびにヒト胎盤性ラクトジエン（ＨＰＬＪ遺伝子な列記 した（２．５．３Ｊ。星印は隣接配列間の相ＰＩａな示す。ＰＧ）１配列にはキ ャップ部位（＋ＩＪからの組版についての番号な付した。

このガではｐＰＧ、ａに含まれるブタＧＷ　ｃＤＮＡ挿入配列を大腸Ｓ細胞内で ＰＧＨ９を産生させるために選ばれた発現ベクターはｐＫＴｓ２であった。この プラスミドはＪ、シャイン（カリフォルニア・バイオテクノロジーノにより好意 的に提供されたものであるが、小型の高コピー数発現ベクターであり、＠力な論 節ｉ５Ｔ能なｔｒｃプロモーター（プロジウス（Ｂｒｏｓ　ｉ　ｕｓＪら。

１９８５ノ、および強力な大腸−５８転写ターミネータ−（ブロプロモーターの コンセンサス−３５領域な宮む融会プロモーターテ；ｈル（）”ヘール（ｄｏ　 Ｂｏｅｒ）ら、１９８３２Ｌノ。このプロモーターの１ａｃＵＶ５配列は工ａＣ オペレータ一部位な含み、そのされる。１ａｃＩＱ休甲におけるこのプロモータ ーからの転写は。

細胞ケＩ　ＰＴＧ　の存在下で増殖させることにより世道される（ドペールら、 １９８３ａＪ。ｐＫＴ５２１７）Ｔｈｔ限堆図およびＨＢＳ／クローニング−域 ン第５−に示す。

第５図 大臓島発現ベクターｐＫＴ５２の構成な図示する。ｐＰＧ、３０片を分離した。

この断片１完全ブレーＰＧＨコード領域（ｔＩＬ初の２１−のアミノ酸な除く） に加えて３３　ｂｐのｍｐ１９ポリリンに挿入すると、全ブレーＰＧＨ配列が再 生する（３．２．１．）。こ−１９中へクローニングし１．ｐＫＴ５２／ＰＧＨ ｃＤＮＡ　ｋ合点ロモ−１−および５ｓ　ｒＦＩＮＡ転写ターミネーｐ　−（ｒ ｒｎ’ＩＬおよびｒｒｎＴ２）、の位置な示す。

この例に記載した作条の発現水準を分析するために、２ｍの大腸１株ＭＣ１０６ １およびＪＭＩＯＸ’に用イｆ、−０ｔｒｃ　プロモーターからの発現はＭＣｌ ０６１細胞においては発現性であり。

１ａｃＩｑｉ１株ＪＭ１０１においてハ抑制ｇｒｔ、た。ＪＭ１０１Ｔｈｌｌ＆ におけるｔｒｃ　プロモーターからの転写抑制は細胞な１ｍＭＩ　ＰＴＧ　の存 在下で増殖させることにより解除された。

プレホルモンのアミン［２−２６３’コードするＤＮＡＱ欠失てるようなオリゴ ヌクレオチドの変典訪発により、メチオニル−ＰＧＨ（ｍ−ＰＯ２（Ｊｔ！：発 現すべく設計された栴造を構成した。

この欠失によりて成熟ＰＧＨ分子の最初のアミノ酸のＴＴｃ＝＋トンがＡＴＧ開 始コドンに直楓に結会した。

ｔｒｃ　プロモーター配列に融合した完全ＰＧ）ｉ　ｃＤＮＡを含にクローン化 した。次いでこのファージから分離した一重鎖ＤＮＡを変異あ発反応に用いた。

プレホルモンのアミノ酸２−２６なコードする７５塩基を除去するために、要求 される欠失の両伽各１５塩基に相補的な長さ３０塩基のオリゴヌクレオチド、　 Ｇ）ｉ、　３０．１に！異誘発反応に用いた。アニーリングおよび伸長ののち、 変異酩発反応体をＪＭＩ０１中へ形質転侠した・次いで得られたプラークを形質 転換プレートからｆ構成した二重リフト（１ｉｆｔ）　のプラークハイプリダイ セージ璽ンによりスクリーニングして、目的とする欠失な検出した。スクリーニ ングした１５０プラークのうち３５％は二龜試鋏におい″（ＧＨ，３０オリゴヌ クレオチドプローブにハイブリダイズすることが鮎められた。−を鎮ＤＮＡ１に 多数の陽性プラークから分離し、ＰＧＨ特異注オリゴヌクレオチド、ＧＨ，２５ をプライマーとして用いて配列決定し、欠失の精度を確認した。陽性のプラーク 丁べてが正確な欠失な有するＤＮＡを含んでいた。この欠失したファージ（ｍｐ ＧＨＸ、ｌ）ｂ’ら！ｌ製形ｔＲＦＪＤＮＡ９を分離し、Ｅｃ。

中へサブクローン化し、プラスミドｐＧＨＸ、　ｌｋ影形成た。このプラスミド および記載された他の発現プラスミドの５′宋端のヌクレオチド配列を第６図に 示す。

第６図 第３章において得た発現プラスミドそれぞれのｍＦＩＮＡ　リーダーの最終２４ 塩基、およびコード領域の５′末端のヌクレオチド配列％を図示する。各配列は ＰＧＨ特異注オリゴヌクレオチドＧＨ，２５を用いるブライミング配列決定反応 により決定された（第５図；６．２．５）。ｐＫＴＧＨ（プレーＰＧＨ）および ｐｃｔＨＸＦ（ＰＧＨ融合蛋白質）を除く各プラスミドはメチオニル−ｐＧＨ（ ｍ−ＰＧＨＪをコードする。ｐＧＨＸ、１配列と異なるｍ−ＰＧＨ発現プラスミ ドの塩基にアンダーラインを付した。

ＲＢＳ９！：ＡＧＧＡＡＡからＡＧＧＡＧＧに、かつスペーサーなＣＡＧＡＣＣ からＴＡＡＴＡＴまたｓｚ　Ｔ　ＡＡＡＡＴ　Ｋ　没更するタメニ。

リダンダンシー１か所な含む３８Ｗ基オリプヌクレオテド。

含む一重鎖ＤＮＡ１ｋ変異島発し、陽性のプラークを選択し、配列決定した。合 計３０％のプラークがＧ）１．３８グローブに／％イブリダイズしたが、これら のうち２０％がＧＧＴＡＡＴＡＴまたはＧＧＴＡＡＡＡＴ　ＲＢＳ／スペーサー 配列な含んでいたにすぎない。残りの陽性プラークは、変！！Ｌ＆！発反応に際 してＧＨ，３８オリゴヌクレオチドに不通正にハイブリダイズしたことにより生 じたと思われる１複挿入配列を含んでいた。目的とする両方の変更を適正に含む プラークからＲＦ　ＤＮＡを１１１ｃ１１＆Ｌｉ：、これｙｐＫＴＧＨにクロー ン化で戻した。得られたプラスミドｐＧＨＸｓ、　４お！びｐＧＨＸＳ、　９ｏ ＞ＲＢＳ／ｘぺ一？−’ｖｋ域のヌクレオチド配列を第４図に示す。これら２種 のプラスミドのいずれかｔ含むＭＣ１０６１および誘発されたＪＭＩＯＩ細麺の 双方からＦＡ製された抽出物は付加的な主壁バンドｌ（ｉ！な含み。

これは分子１１２２に、丁なわち期待したｍ　ＰＧＨの大きさなもっことが誌め らｎた。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルのレーザーテンシトメトリーにより１両プラスミ ドとも等しい普のｍ−ＰＧＨ％：産生し、これｉ；両宿主において総細胞蛋臼質 の１５〜２０％に及ぶことが示された。

第７図は非誘発およびａ発ＪＭＩＯＩ　細胞中においｃｐＧＨＸ８゜４から産生 されたｍ−ＰＧＨの量な示す。この図は大腸緯生蛋白と下垂体出来ＰＧＨの分子 量の類似性ヶも示す。ｍ−ＰＧＨは予想されたもの（約２００ダルトンノよりわ ずかに高い分子量に泳動しており、これはゲルに施された蛋白質抽出物がきわめ て粗製のものであることによると思われる。この現象は先にヒ）ＧＨを含む粗製 細命抽出物において観察されている（シ為ｙ（Ｈｓｉｕｎｇ）ら、１９８６ノ。

＠７図 発現プラスミドｐＧＨＸ８．４を含む非誘発（−ＩＰＴ（、Ｊおよび６発（＋Ｉ ＰＴＧＪＪＭ１０１　！１ｔ１Ｍからの蛋白質抽出物な分子蓋マーカーおよび精 製した下垂体由来ＰＣ）（（Ｒ，ジ−マークによって好意的に提供された〕と共 にＳＤＳ／ＰＡＧＥ［施した。

予期した分子蓋のＰＧＨ（２２，０００ダルトンノの主侵バンドはＩＰＴＧ綽専 細「ざ中におい℃のみ産生された（　３．２．２．　ｉ＋ｉ　Ｊ。

ヒトＭＴ−ＩＩＡプロモーター／ＰＧＨ融合遺伝子の４％成これらの試験のため に選はれたプロモーターはヒトメタロチオネインｌＩＡプロモーター（カリン（ Ｋａｒｉｎノおよびリチャーゾ（ＲｉｃｈａｒｄｓＪ、１９８２Ｊであり、これ ｔｓＲ，リチャーゾによって好意的に提供された。

ｈＭＴ−１Ａプロモーターはプロモーター配列がＭ１３ベクターｍｐｇ中にクロ ーン化されて−７６３，から＋６０にわたる。

８２３　ｂｐの断片とし”（得られた（Ａ、ロビンス、パーソナル・コミ２ニケ ーシ曹ンノ。このプロモーターな含むＲＦファーｂｐのベクターポリリンカー配 列にｉ合し℃プロモーター配列が遊離する。この８２３ｂｐの断片を精製し、Ｉ （ｉｎｄｌ／ドｐＵｃＭＴな形成した。

ＰＣ，Ｈなコードする配列なＰＧＨｃＤＮＡクローンｐＰＧ、３−トすることに よりｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターの下ｆｉＫクローン化した。得られた形質転換 体から調製したプラスミドＤＮＡの制限分析（ａ３−ｔｉ　Ｊによりて、適正な 向きで挿入されたＰＧＨｃＤＮＡ　９ｒ：含むプラスミドが確認され、これはｐ ＵＣＭＴＧ８．４と命名された（第６図ノ。これら２断片間の結合点のヌクレオ チド配列は、この領域な含む制限断片をＭ１３ｍｐｌｓ中へ同方向にサブクロー ニングすることにより決定された。このクローンから得られた配列データは予期 した配列が形成され℃おり、かつ七の配列ｊＸｈＭＴ−ＩＩＡプロ七−ター配夕 ＩＬおよび９ｂｐ　のポリリンカー／合成リンカ−ＤＮＡによってＰ（１，Ｈの ５′側非勧訳憧域（＋２１から上方ノに結合した転写開始部位（＋６０の位置ま でノを含むことな示した（第８図ノ。

訳配列（ｐｇｈ遺伝子からのものノを含むプラスミドｐＧＨＢ、３（ｃＰＧＨ， １の２ｋｂ　ＢａｍＨＩ　サブクローン化からのｌｋｂ部位にサブクローン化す ることを決定した。

化した。得られた多数の形質転換座から分離したプラスミドＤＮＡの検査により 、大部分は大きさがｐＵｃＭＴＧ８．４に等しいことか明らかになりた。従りて 形質転換体をｃＰＧＨ，１配列の存在につき、ｐＧＨ８，３の遠３′末端からの ５ｏｏｂｐブとして用いるフィルターハイプリダイセージ冒／によりスクリーニ ングした。得られた陽性体から隔設したプラスミドＤＮＡの制限分析により、１ つの形質転換体が適正な向きの挿入配列を営むことが示された。このプラスミド ）ｉ）ｉＭＰＧ、４（ＨＭ。

ヒトメタロチオネイン；ＰＧ、ブタ成長ホルモンノと命名された。このプラスミ ドの構成な第１図に示す。

ｐＨＭＰＧ、４の構成ｔｔ表わ丁７０−チャートな示す。ｈＭＴ−ヘクローン化 してプラスミドｐＵＣＭＴを形成した。　次いでこのプラスミドｙＥｃｏＲＩ　 で制限処理し、脱リン酸化し、ＰＧＨドをＳｍａＩで制限処理し、脱リン酸化し 、そしＣＰ（１，Ｈゲノム遺伝子の鯉終エクソンの大部分および約７００ｂｐ１ ７）ＰＧ８３′餞非コード配列を含むコスミドサブクローンｐＧＨ８，３のｐ） ｉＭＰＧ、４を形医した。すべての桝成座なりＮＡ配列分析により検査した。

第８図 配列 ＰｓｔＩ断片−ＱｐＵＧＭＴＧＨ，４から分離し、配列分析のためにＳｍａＩ／ ＰｓｔＩ消化ｍｐ１８中へクローン化した。このクローンの配列データから、適 正な融合が得られており、ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーター、キャップ部位（キャッ プ部位２か所があり。

両方とも＋１とし℃示した）、および５′側非勧訳配列（＋６０にまで及ふ）が ９ｂｐの合成リンカ−配列によりｃｈｉ１１．）（ｃＤＮＡ配列−ｊａ基＋２１ から下流へ伸びるーに結合していることが示された（４．２〕。

第１図 発机ベクターｐＨＭＰＧ、４の制限地図および構成な示す。

ｈＭＴ−ＩＡプｏモーター配列が、＋２１１’うを異的ＳｍａＩ　８位にまで沖 ひ、この地点から下流のＰＧＨゲノム逼伝子配列に結合した　ＰＧＨＣＤＮＡ配 列な含むハイブリッド遺伝子に融合している０プロモーターおよびＰ（１，Ｈ配 夕むのてぺ℃、さらに３′末％Ｋｇ８したｌ　２０　ｂｐＯ）　ｐＵｃ　１６　 Ｉａｃｚ遺伝子な含む２．７ｋｂＨｉｎｄ震／ｐＶｕＩ　断片な低融点アカロー スから精製し、トランスジェニック動物の育成に用いた。

二ニックブタな構成した。単一細胞期インビボ受精ブタ卵子を過剰排９ト注の大 型８嬢ブタから採取した。これらな−製し、約６００コピーのｐＨＭＰｏ、４挿 入配列を注入した。約３０個の注入洒み卵子を多数の同期化された被検４［雌ブ タそれぞれの卵管内に外科的に移罹した。これらの雌ブタのうち４頭が少数を分 娩しくｌ腹当たり４〜５頭）１合計１７１１１の子ブタな産んだ。

これらの子ブタを外来遺伝子の存在につき１尾組織から分離したＤＮＡのドット ープロットハイプリダイゼーシ嘗ンによって試験した。正常ブタＤＮＡおよびヒ トゲノムＤＮＡの双方なこれらドツト−プロット上に含めてそれぞれ陰性および 陽性の対熱とした。これらのドツト−プロットをｈＭＴ−［ＩＡプロモーターの Ｈ１ｎｄｌ／ＡｖａＩ断片にハイブリダイズさせると、多数の陽性の色号が給め られた。４頭のブタが細胞光たりｌコピー以上ＶＣ′＋Ｂ当てるシいハイブリダ イゼーシ謬ンを示し、さらに２頭がパックグラウンドよりわずかに高い、細胞光 たりｌコピー未満に相当する拘いハイブリダイゼーシ１７な示した（第９図〕。

各トランスジェニック夕に存在するｐＨＭＰＧ、４挿入配列のコピー数／紬胞な スロット−プロット分析法により測定した。各トランスジェニック動物から得た 尾部ＤＮＡの試料５μｍな、ヒトおよびブタの陽性および陰性対照と共にスロッ ト−プロット上へ濾過した。細胞光たり１〜４０コピーに相当するゲノムコピー 数に対応する範囲の鍵のｐＨＭＰＧ、４プラスミドＤＮＡ　（対照ブタゲノムＤ ＮＡ５μ？をも含有）も含めた。このスロット−プロット−４ｔｈＭＴ−１ｌＡ プロモーターリユツクトランスレーシ高ストリンジエンシー下に洗浄した。トラ ンスジェニック動物のハイプリダイゼーシ嘗ンの強度なレーザーテンシトメトリ ーによりプラスミド標準品と比較し、動物＃３７５および＃７３９コピー／ｍｋ Ｋ）Ｘふことが鯰められた（第１表：銅９因）。

ｍノサザーン分析法 トランスジェニックブタにおける外米性配列のｂａをサザー７プロヴテインク伝 により切穴した。ｐＨＭＰＧ、４神入配列内にはＢａｍ）ｉＩ　９位はない。従 ってトランスジェニック動物のゲノムＤＮＡ４この酵素で消化するとゲノムサザ ーン上にパン位までの距離、統合部位の数、およびｐＨＭＰＧ、４神入配列の統 合コピー数により℃支配されるであろう。

第９　図 ｐＨＭＰＧ、４％人配列をマイクロインジエクシ嘗ンされた卵子から発育したブ タの尾より分離したＤＮＡの試料１Ｏ１５およびｌｐｔな変性さゼ、膜に施した 。ｐＨＭＰＧ、４およびヒト（Ｈ（ＪＭツノゲノムＤＮＡ１ｉｉ対照、およびブ タ（ＰＩＧノゲノムＤＮＡ陰性対照な各ドツト−プロット系列に含めた。プラス ミド陽性対照は第１列、ブロッ）Ａである。この列において。

かっこ内の数値は各プラスミドドツトが相当するコピー数／細胞ｔｔ意味する。

Ａ４−Ａｌ１列およびＢ１−８９列の試料を工被験ブタ試料を含む。ニックトラ ンスレージ璽ン処理ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターＨ１ｎｄ膓／ＡｖａＩ挿入配列 ｔハイプリダイゼーシ嘗ンプローブとＬ℃用いた。各ドツトにおける試料の同− 注Ａ、ｌＯμ？　（２）　ＨＬＩＭ　ＰＩＧ　１７７　１７８　１７９　１８０ 　２９５　２９６　２９７　２９８Ｂ−５μ？　（１）ＩＴ　＃　＃　＃　ＪＦ 　＃　Ｊｌ　＃　ＩＩ　ＪＰＣ＋　１μ）（０，５）　＃＃＃＃＃＃＃＃ＪＦ＃ Ｂ。

Ａ、ｌＯμ）　３７３３７４３７５３７６７３５７３６７３７７３８７３９　Ｐ ＩＧ　Ｈｔ）Ｍ８、　５μ）　（１）　ｚｅｉｚｐｐｐｔｚｚｐＣ−１／ＪＰ（ ０，５）　ｌ１ｔｌｌｌｌｌｌｌｌｌｊｌｊｌｌｌ第１Ｏ図 トランスジェニックブタＤＮＡ、ならびにブタ（ＰＩＧ）およびヒ）（ＨＵＭＪ の陰性および陽性対照の試料（５μｍ〕な変性させ、ブタ対照ＤＮＡ５μ？と結 合した種々の普のｐＨＭＰＱ。

４プラスミドＤＮＡＩ含有する多数の試料と共に膜上ＫｆｆｉＬだ。

施されたｐＨＭＰＧ、４　ＤＮＡのｔは細紀当たり１〜４０コピーの遺伝子に相 当する（下記においてかつこ内に示す）。用いたプローブは二ヴクトランスレー シ首ン処［ｈＭＴ−１１Ａ　プロ試料に対する手がかりが下記に示される。この 膜上の各試料のハイプリダイゼーシ嘗ンの強度の定１１ハレーザーデンシトメー ターにより行われた。この分析の結果をｒＫ表に示す。

Ａ　Ｂ　ｃ ｌ、　１７７　１８０　２９５ ２、　３７５　７３６　７３９ ３、　ＰＩＧ　８０Ｍ ４゜ ５、　５００（４０〕　１２５（１０）　５０（４）６、　３７５（３０）　Ｚ ｏｏ（８Ｊ　２５（２〕７、　２５０（２０Ｊ　７５（６〕　１２．５　（１） 第　１　表 スロット−プロット分析により拙走された。各トランスジェニックブタに存在す る外来遺伝子のコピーｉｆｆ　（ｍＢ当たり）。

各トランスジェニックブタおよびそれらの非トランスジェニック同級子の１日当 たり体重増加（５０〜１２０日目）および血清ＰＣｚＨｔｊｋ度を示す。雌対照 値は３頭の動物の平均であり、雄対照値は２頭の動物の平均である。

１日当たり　血清ＰＧＨ ブタ　性　コピ←数　体ｉ！増加　護　度１７７　Ｆ　３　７６５　１０．４ ２９５　Ｆ　１５　９５３　２７．８ ７３９　Ｆ　Ｏ，５６８６６，９ 対照　Ｆ　−８０６１０，６ １８０Ｍ　６　８５１　１５．３ ３７５　Ｍ　Ｏ，５４８７６，３ ７３６Ｍ　６　８５７　１１．１ 対照　Ｍ　−、６７０１５，３ トラ／スジエニツクプタの成長速度 各トランスジェニックブタの成長挙動を非トランスジェニック同腹子の成長速度 に対してプロツトした。点線はＰＪ注の非トランスジェニック同腹子の平均成長 速度を表わし、破融は異性の非トランスジェニック同腹子の平均な表わし、冥際 はトランスジェニック動物を表わす。

実施例　２ Ｓｐｌ結合部位を欠如するｈＭＴ−ＩＡ／ＰＧＨプラスミドｐｈＭＧＰＧ、３ 基礎水準配列に＠接した位置にあるコンセンサスミルｌ結合部位配列ＧＧＧＧＧ Ｇ（＊Ｆｔガ（Ｋａｄｏｎａｇａ　）ら、　ＴｒｅｊｎｄＳＢｊｏｃｈｅｍ、Ｓ ｃｉ、１１．２０−２３．１９８６ハエ目的とするパラメーターを備えたプロモ ーターを与えるであろうということが報告されている。Ｓｐｌ！１ｉｉｉ合部位 がＰＳｔＩ　！Ｊンカーでｌｌｉ換され、目的とする転写特ａな備えたＨ％ｈＭ Ｔ−ＩＩＡプロモーターのヌクレオチド配列が１Ｍ、カリン（Ｋ＆ｒｉｎ　）の 好意によって提供された。この変異はｈＭＴ−ＩＩＡ／ｍｐ８クローンにおいて 、オリゴヌクレオチドへのに異誘発により再形成された。

５ｐｌＷ；合部位な囲み、これを含むｔｓｂｐ＠域な長さ１７塩基のｐｓｔｘり ンカー配列で＃Ｌ洪イるために、長さ４６塩基のオリゴヌクレオチドＭＴ　、４ ６に設計した。ｈＭＴ−ＩＩＡ／ｍｐ６−重鎮ＤＮＡ？：ＭＴ、４６で変異誘発 し、ＪＭＩＯＩ中へ形質転換したのち、適正な配列置換を含むプラークをプラー クハイプリダイゼーシ雪ンおよびヌクレオチド配列決定により選択した。適正な Ｒ異を含むプラークの１つからＲＦＤＮＡを１９　ＤＮＡ　との三直リゲーシ璽 ンに用いた。このリゲーシ冒ンにより得られたプラスミドのうち１種が適正な制 限パターンケ含み、ｐＨＭＧＰＧ、３　（ＧＯ配列欠如）と命名された。

この１ラスミドの挿入配列は現在、トランスジェニック−マクスに導入され℃い る。

本発明方法は、マウス、艦ツジまたＳ！ヒトメタロテオネづンプロモーター中に 見出される配列に対応する種々の組合わせの金属反応性１１累を含む合成プロモ ーター構成−ｍ個のプロモーター要素な含むもの、または含まないもの−をＰＪ Ｉ４製するためにも採用できると考えられる。たとえばこれはＦ６＋＋ｌＩの調 節に採用できる。

最後に、ここに説明した本発明の精神から逸脱することなく他の樵々の修正およ び／または変夷ななしうると解すべきである。

２５．７−　−一鵠一二］ Ａ １　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　ＩＩ１　２　３　４　５　６　７ 　８　９　＋０　ＩＩＡＢ　Ｃ ＦＩＣｉ　１０ 体中　（ｋｇ） 国際調査報告 １−−−ｍ　＾−ｂｊ＝　”・　ＰＣＴ／Ａυ８８１０ＯＩＣ９にＮ■πフΣ： ζ＝αにゴα；シ、圧λ工ΣだフコＣＣ；：＊スＷａＸ話−Ｃ−（１）曳匹υ醒 朋か固型ＡＤ　２０９２９／８３　ＤＫ　５０９１／８３　ＥＰ　１１１３８９ 　ＥＳ　５２７０７７ＥＳ８５０４２５５ＪＰ５９１４４７４３ＫＡ８３０８２ ７フシロｆｆに重低ズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（ａ）　受精したばかりの卵子を採取し；（ｂ）　上記卵子と相同の特性決定 ホルモンの遺伝子試料を分離し； （ｃ）　この遺伝子試料を、雌性核と融合して単一細胞期胚を形成する前の上記 卵子の雄性核中へ導入し；そして（ｄ）　上記卵子を適切に調製された雌性動物 中へ移植することよりなる、新品種の動物の育成法。 ２．動物がウマ、ウシ、プタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウおよび海洋動物か ら選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．特性決定ホルモンがブタ成長ホルモンである、請求の範囲第２項に記載の方 法。 ４．動物がブタである、請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．非ブタプロモータ−領域をコードする第１クローン化ＤＮＡ配列およびブタ 成長ホルモン活性をコードする第２クローン化配列を含むプラスミドクローニン グベクターからなるブラスミド発現ベクター。 ６．プラスミドクローニングベクターがｐＵＣ１９またはｐＫＴ５２から選ばれ る、請求の範囲第５項に記載のプラスミド発現ベクター。 ７．第１クローン化ＤＮＡ配列がヒトメタロチオネインブロモータ−（ｈＭＴ− ＩＩＡ）をコードする、請求の範囲第５項または第６項に記載のプラスミド発現 ベクター。 ８．第１クローン化ＤＮＡ配列がプラスミドクローニングベクター内でＥｃｏＲ Ｉ−Ｈｉｎｄ■挿入配列を形成し、約８１０〜８２３ｂＰの長さである、請求の 範囲第５項ないし第７項のいずれが１項に記載のプラスミド発現ベクター。 ９．第２クローン化配列がプラスミドクローニングベクター内でＥｃｏＲＩ−Ｅ ｃｏＲＩ挿入配列を形成し、約５２２ｂｐの長さである、請求の範囲第５項ない し第８項のいずれか１項に記載のプラスミド発現ベクター。 １０．第２クローン化配列中に挿入された第３クローン化ＤＮＡ配列を含む、請 求の範囲第５項ないし第９項のいずれか１項に記載のプラスミド発現ベクター。 １１．第３クローン化配列がブタ成長ホルモン遺伝子の３′末端からなる、請求 の範囲第１０項に記載のプラスミド発現ベクター。 １２．第３クローン化配列が第２クローン化配列内で長さ約１０００ｂｐのｓｍ ａ：Ｂａｍ／Ｓｍａ挿入配列を形成する、請求の範囲第１０項に記載のプラスミ ド発現ベクター。 １３．３′末端が反復配列であると同定された領域を欠失させることにより修飾 された、請求の範囲第１０項または第１１項に記載のプラスミド発現ベクター。 １４．ｐＨＭＰＧ・４からなる、請求の範囲第５項に記載のブラスミド発現ベク ター。 １５．−適切なプラスミドクローニングベクター、非ブタプロモーターを含む第 １ＤＮＡ断片、およびブタ成長ホルモンをコードする第２ＤＮＡ断片を用意し； −第１ＤＮＡ断片をプラスミドクローニングベクターの適切な部位に挿入し；そ して −第２ＤＮＡ断片をプラスミドクローニングベクターの適切な部位に挿入する ことよりなる、請求の範囲第５項ないし第１４項のいずれか１項に記載のプラス ミド発現ベクターの製法。 １６．（ａ）雌性動物からの受精したばかりの卵子を用意し；（ｂ）請求の範囲 第５項ないし第１４項のいずれかに記載のプラスミド発現ベクターを調製し； （ｃ）このプラスミドを雌性核と融合して単一細胞期胚を形成する前の雄性前核 に注入し、そして （ｄ）次いで卵子を適切に調製された雌性動物に移植することを含む、トランス ジェニック動物の育成法。 １７．動物がブタである、請求の範囲第１６項に記載の方法。