KR20110058848A - 중공 섬유 막을 이용한 전단 민감성 생체중합체 농축 방법 - Google Patents

중공 섬유 막을 이용한 전단 민감성 생체중합체 농축 방법 Download PDF

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Abstract

일반적으로, 본 발명은 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 폰 빌레브란트 인자를 포함하는 혼합물의 농축 방법에 관한 것이다. 통상의 생체중합체 농축 방법은 너무 많은 전단 응력을 부여하고, 이것은 전단 민감성 생체중합체의 분해를 야기한다. 본원에 게재된 방법은 높은 속도의 여과물 투과율을 유지하면서 전단 응력을 감소시킨다. 본원에는 전단 민감성 생체중합체를 가지는 혼합물을 중공 섬유 투석 모듈 안으로 흘려보내서 혼합물의 전단 민감성 생체중합체 농도보다 높은 전단 민감성 생체중합체 농도를 가지는 농축물을 생성하는 것을 포함하는 전단 민감성 생체중합체 농축 방법이 게재된다. 중공 섬유 투석 모듈은 낮은 유속에서 높은 여과물 투과율 및 낮은 전단 속도를 가진다. 이것은 높은 생성물 수율 및 전단 민감성 생체중합체의 최소의 손실을 보장한다.

Description

중공 섬유 막을 이용한 전단 민감성 생체중합체 농축 방법{METHOD OF CONCENTRATING SHEAR-SENSITIVE BIOPOLYMERS USING HOLLOW FIBRE MEMBRANES}
본 발명은 일반적으로 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 폰 빌레브란트 인자(vWF)를 농축하는 방법에 관한 것이다.
관련 기술에 대한 간단한 설명
공지된 생체중합체 농축(및 정용여과) 방법은 평판 및 중공 섬유 기기에서의 접선 흐름(교차 흐름) 한외여과(및 정용여과)를 포함한다. 이 기기는 비용효과적인 작업에 적당한 여과물 투과율을 보장하는 충분히 높은 유속 및 막간 차압으로 작업한다. 그러나, 이러한 작업 조건은 높은 전단 속도를 야기한다. 추가로, 이러한 기기는 여과물 투과율을 더 증가시키기 위해 스크린을 포함할 수 있다. 또, 이 스크린은 생체중합체에 부여되는 전단 응력을 감소시킨다. 이러한 전단 응력은 생체중합체를 파괴하거나, 변성하거나 또는 불활성화할 수 있기 때문에 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 단백질 또는 바이러스 입자를 농축하는 시도를 할 때 특히 바람직하지 않다.
평판 또는 접선 흐름(교차 흐름) 중공 섬유 기기에서 농축 및/또는 정용여과를 하는 동안에 전단 응력을 감소시키는 다양한 방법이 공지되어 있다. 이러한 방법은 유속을 감소시키는 것, 막 표면적을 증가시키는 것, 및 막의 분획 입자 크기(cut-off size)를 증가시키는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 각 방법은 다양한 문제를 가진다. 예를 들어, 유속을 감소시키는 것은 또한 여과물 투과율을 감소시키고, 이것은 바람직하지 않게 총 작업 시간을 증가시키고 막 오염 위험을 증가시키며 전단 민감성 생체중합체가 전단 응력에 노출되는 시간의 양을 증가시킨다. 낮은 유속에서 막 표면적을 증가시키는 것은 여과물 투과율을 높게 유지하고 총 작업 시간의 증가를 방지한다. 그러나, 감소된 유속에서는 막 오염 위험이 증가한다. 증가된 막 표면적은 증가된 표면 흡착 때문에 더 많은 생성물 손실을 야기하고, 증가된 막 면적 및 완충제 소비 때문에 더 많은 비용이 들고, 농축 후 생성물의 요망 부피보다 큰 무용부피를 가질 수 있다. 막의 분획 입자 크기를 증가시키는 것은 더 큰 세공 크기로 인해서 충분한 여과물 투과율을 초래한다. 그러나, 증가된 막 오염 또는 전단 민감성 생체중합체에의 부적합성(즉, 생체중합체가 막을 통과해서 여과물로 손실될 수 있음) 문제가 남아 있다.
많은 생체 물질 가공 작업에서 단백질의 표면 흡착 및 응집체 생성을 피하기 위해 세정제가 이용된다. 그러나, 이러한 작업은 전단 민감성 생체중합체를 안정화하기 위해 특수 완충제 첨가제를 필요로 할 수 있다.
접선 흐름 중공 섬유 기기의 경우, 권장 전단 속도는 2000 내지 8000 sec-1이고, 전단 민감성 공급 원료의 경우에는 2000 내지 4000 sec-1이다. 문헌[GE Healthcare, Operating Handbook: Hollow fiber cartridges for membrane separations 8 (2004)]을 참조한다. 그러나, 2000 sec-1 초과의 전단 속도에서 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 vWF 또는 바이러스 입자는 분해되기 시작하거나, 변성되기 시작하거나 또는 풀리기 시작한다. 따라서, 당 업계에서는 높은 수준의 전단 응력을 부여하지 않으면서 전단 민감성 생체중합체를 농축하는 방법이 필요하다.
일반적으로, 종래 기술은 단백질 침전, 막 오염 및 막 표면 흡착으로 인한 생체중합체의 실질적 손실이 일어나지 않으면서 전단 민감성 생체중합체를 농축하는 비용효과적인 방법을 당 업계 통상의 기술을 가진 자에게 충분히 교시하거나 또는 제안하지 못한다. 마찬가지로, 막 오염 및 침전물 흡착을 피하기 위해서는 일정 최소 유속이 필요하기 때문에, 생체중합체 함유 혼합물의 유속을 감소시켜서 기기에서의 전단 응력을 감소시키는 것은 효과적인 대안을 제공하지 못한다.
발명의 요약
본원에는 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 vWF를 함유하는 혼합물을 중공 섬유 투석 모듈 안으로 흘려보내서 혼합물의 전단 민감성 생체중합체 농도보다 높은 전단 민감성 생체중합체 농도를 가지는 농축물(retentate)을 생성하는 것을 포함하는 전단 민감성 생체중합체 농축 방법이 게재된다. 이 방법은 농축 동안에 또는 농축 후에 전단 민감성 생체중합체를 함유하는 혼합물과의 완충제 교환, 또는 투석을 더 포함할 수 있다.
중공 섬유 투석 모듈의 막은 바람직하게는 약 200 ㎛ 미만의 두께를 가지고, 예를 들어, 막은 두께가 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛일 수 있고, 바람직하게는 약 30 ㎛이다. 바람직한 실시태양에서, 중공 섬유 투석 모듈에서 벽 전단 속도는 약 2300 sec-1 미만, 바람직하게는 약 50 sec-1 내지 약 1800 sec-1이다. 중공 섬유 투석 모듈에서 막간 차압은 바람직하게는 약 1 ㎜Hg 내지 약 600 ㎜Hg(약 0.1 kPa 내지 약 80 kPa), 더 바람직하게는 약 10 ㎜Hg 내지 약 150 ㎜Hg(약 1 kPa 내지 약 20 kPa)이다.
전단 민감성 생체중합체를 함유하는 혼합물은 용해 완충제를 임의로 함유할 수 있다. 혼합물이 용해 완충제를 포함하는 경우, 이 방법은 용해 완충제의 일부를 투석 완충제로 대체하는 것을 더 포함할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 농축물은 혼합물의 전단 민감성 생체중합체의 약 70％ 이상을 포함하고, 바람직하게는 혼합물의 전단 민감성 생체중합체의 약 80％ 이상을 포함하고, 더 바람직하게는 혼합물의 전단 민감성 생체중합체의 약 90％ 이상을 포함한다. 농축물은 바람직하게는 혼합물의 전단 민감성 생체중합체의 활성의 약 70％ 이상을 보유하고, 더 바람직하게는 농축물은 혼합물의 전단 민감성 생체중합체의 활성의 약 80％ 이상을 보유한다.
게재된 방법은 단백질 침전, 막 오염 및 막 표면 부착으로 인한 생체중합체의 실질적 손실을 피하면서 전단 민감성 생체중합체를 농축하는 비용효과적인 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 특징은 도면, 실시예 및 첨부된 특허 청구 범위와 함께 하기 상세한 설명을 검토함으로써 당 업계 숙련자에게 명백할 수 있다.
본 발명의 더 완전한 이해를 위해서, 다음 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조해야 한다.
도 1은 중공 섬유 투석 모듈(일정 비율로 변형한 것이 아님)의 단면도.
도 2는 투석 완충제가 농축물에 직접 첨가되는 중공 섬유 투석 모듈의 공정 흐름도.
도 3은 투석 완충제가 공급물 흐름에 향류로 도입되는 중공 섬유 투석 모듈의 공정 흐름도.
도 4는 실험 2-1의 공정 데이터를 나타내는 그래프.
게재된 전단 민감성 생체중합체 농축 방법은 다양한 형태의 실시태양이 가능하지만, 도면에는 본 발명의 특정 실시태양이 도시되어 있으며(또한, 이하에서 설명될 것이고), 이때 본원의 게재 내용은 예시적인 것임을 의도하고 본 발명을 본원에 기술되고 도시된 특정 실시태양으로 제한하는 것을 의도하지 않음을 이해해야 한다.
발명의 상세한 설명
일반적으로, 본 발명은 전단 민감성 생체중합체를 함유하는 혼합물로부터 전단 민감성 생체중합체를 농축하는 방법에 관한 것이다. 공지된 생체중합체 농축 방법은 전단 민감성 생체중합체를 파괴하거나, 변성하거나 또는 불활성화하는 바람직하지 않게 높은 전단 응력을 부여할 것이다. 본원에는 전단 민감성 생체중합체를 함유하는 혼합물을 중공 섬유 투석 모듈에 흘려보내서 혼합물의 전단 민감성 생체중합체 농도보다 높은 전단 민감성 생체중합체 농도를 가지는 농축물을 생성하는 것을 포함하는 전단 민감성 생체중합체 농축 방법이 게재된다. 게재된 방법은 높은 여과물 투과율을 유지하면서 전단 민감성 생체중합체 파괴를 피하는 충분히 낮은 전단 응력을 보장한다.
게재된 방법에 따라서 농축하기에 적당한 전단 민감성 생체중합체는 상당한 전단력(즉, 상대적으로 큰 속도 구배)에 노출될 때 손상, 파괴, 및/또는 활성 손실을 당하기 쉬운 것들을 포함한다. 이러한 전단 민감성 생체중합체의 한 예는 혈장에서 제 8 인자와 복합체화되어 순환하고 생물학적 혈액 응고 활성 조절에 도움을 주는 폰 빌레브란트 인자(vWF)이다. vWF는 혈장에서 520-kDa 이량체에 기초한 약 1000 kDa(킬로달톤) 내지 약 20000 kDa의 범위의 분자량을 가지는 일련의 올리고머/중합체 형태로 존재하지만, 게재된 방법은 이 특정 분자량 범위를 갖는 전단 민감성 생체중합체를 농축하는 능력에 반드시 제한되지는 않는다.
구체적으로, vWF는 특히 vWF가 필터 막을 통과해서 지나거나 또는 필터 막 근처를 지날 때(즉, 필터 막 세공 근처의 흐름 압축 및 완곡한 흐름 경로 때문에 특히 큰 속도 구배가 발생하는 경우) 운반 유체 매질의 속도 구배에 의해 유발되는 전단력에 민감하다. 예를 들어, 2000 sec-1(초의 역수) 초과의 전단 속도는 vWF를 구형 분자로부터 연장된 사슬형 분자로 변형하게 한다. 이러한 구조 변형은 필터 표면 및 다른 단백질에의 부착 가능성을 증가시킨다. vWF의 큰 다량체가 특히 이러한 구조 변형을 받기 쉽고 부착 가능성이 증가하기 쉽다. 농축 동안, 부착 증가는 생성물 수율을 감소시키고, 큰 다량체의 손실은 vWF 리스토세틴 보조인자 활성을 감소시킨다.
중공 섬유 투석 모듈은 높은 여과물 투과율 및 낮은 전단 속도를 가진다. 이 모듈은 높은 생성물 수율 및 전단 민감성 생체중합체의 최소의 손실을 보장할 수 있다. 도 1(일정 비율로 변형한 것이 아님)에 도시된 바와 같이, 중공 섬유 투석 모듈은 기기의 길이에 걸치는 중공 섬유, 또는 관형 막을 갖는 기기이다. 중공 섬유 투석 모듈은 혈액 투석에 이용하는 것으로 알려져 있고, 예를 들어 에드워즈 라이프사이언시즈(Edwards Lifesciences)(세인트-프렉스(Saint-Prex), 스위스) 및 아사히 카세이 케미칼즈 코포레이션(Asahi Kasei Chemicals Corp.)(일본 동경)으로부터 상업적으로 입수가능하다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이고 싶지 않지만, 모듈은 압력 구배가 물질 전달의 주된 구동력이 아닌 투석 원리로 작동한다고 믿어진다. 대신, 농도 구배가 막을 가로지르는 물질 전달 또는 완충제 교환을 구동한다.
도 1에 공급물 스트림 유입구 (102), 농축물 스트림 유출구 (104), 여과물 스트림 유출구 (106), 및 임의의 투석 완충제 스트림 유입구 (108)을 가지는 중공 섬유 투석 모듈 (100)이 나타나 있다. 중공 섬유 투석 모듈 (100)은 공급물 흐름에 평행하게 모듈 (100)에 걸친 중공 섬유 (110)을 가진다. 중공 섬유 (110)은 포팅(potting) 물질 (112)에 의해 둘러싸인다. 중공 섬유 투석 모듈은 공급물 부피에 따라 단독으로 또는 직렬 또는 병렬로 이용될 수 있다.
중공 섬유 투석 모듈의 막이 한외여과 및 접선 흐름 중공 섬유 기기의 막보다 훨씬 얇기 때문에 중공 섬유 투석 모듈에서 높은 여과물 투과율이 달성될 수 있다. 한외여과 및 접선 흐름 중공 섬유 기기의 막은 높은 막간 차압, 큰 부피(재순환 때문) 및 다회 사용을 견뎌내야 하기 때문에 두께가 200 ㎛ 초과이다. 이 두께의 막은 여과물 투과율을 감소시킨다. 대조적으로, 중공 섬유 투석 모듈의 막은 두께가 약 200 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 더 바람직하게는 약 30 ㎛이다. 얇은 막은 높은 여과물 투과율을 허용하고, 따라서 막간 차압이 다른 모듈보다 낮을 수 있다.
중공 섬유 투석 모듈은 높은 여과물 투과율을 가지기 때문에, 중공 섬유 투석 모듈을 통한 통과 횟수가 접선 흐름 중공 섬유 기기에서 요구되는 것보다 더 적게 요구된다. 게다가, 투석 완충제가 병류 또는 향류로 흐를 때, 투석 완충제가 공급물 스트림에 직접 첨가되는 방법에 비해 재순환 횟수가 감소될 수 있다. 중공 섬유 투석 모듈의 효율은 동일한 농축을 달성하기 위해서는 더 많은 재순환을 요구하는 한외여과 및 접선 흐름 중공 섬유 기기에서 가능한 효율보다 훨씬 더 크다. 중공 섬유 투석 모듈을 통해 낮은 전단 속도로 더 적게 통과하는 것은 한외여과 또는 접선 흐름 중공 섬유 기기에서 발견되는 높은 전단 속도로 많이 통과하는 것에 비해 더 많은 단백질이 구조를 유지하는 것을 가능하게 한다.
중공 섬유 투석 모듈의 전단 속도는 바람직하게는 약 2300 sec-1 미만이다. 전단 속도를 일정 수준 미만, 예를 들어 2300 sec-1 미만, 2000 sec-1 미만 또는 1800 sec-1 미만으로 보장하기 위해 전단 민감성 생체중합체를 함유하는 혼합물의 유속을 조정 또는 조절할 수 있다. 전단 속도는 다음 방정식으로 계산한다.
Figure pct00001
여기서, Q는 유속(mL/sec)이고, n은 중공 섬유 투석 모듈의 섬유의 수이고, r은 섬유의 내측 반경(㎝)이다.
표 1은 0.2 ㎜ 섬유 내경을 가지는 모듈의 다양한 유속 및 섬유 수에서의 전단 속도를 나타낸다.
다양한 섬유 수를 가지는 모듈의 다양한 유속에서의 전단 속도
4775 개의 섬유를 가지는 모듈 7925 개의 섬유를 가지는 모듈 11141 개의 섬유를 가지는 모듈 12547 개의 섬유를 가지는 모듈
유속(mL/분) 벽 전단 속도(sec-1)
50 222 134 95 85
100 444 268 190 169
200 889 536 381 338
300 1333 803 571 507
400 1778 1071 762 676
500 2222 1339 952 846
바람직하게는, 중공 섬유 투석 모듈에서 막간 차압은 약 1 ㎜Hg(밀리미터 수은) 내지 최대 약 600 ㎜Hg(약 0.1 kPa(킬로파스칼) 내지 약 80 kPa)이고, 더 바람직하게는 약 10 ㎜Hg 내지 약 150 ㎜Hg(약 1 kPa 내지 약 20 kPa)이다. 한외여과 및 접선 흐름 중공 섬유 기기는 두꺼운 막을 가지기 때문에 훨씬 더 높은 압력을 견뎌낼 수 있다. 또, 이들 기기는 경제적 작업을 위한 효율 및 최소의 여과물 흐름을 보장하기 위해 더 높은 압력을 요구한다. 예를 들어, 접선 흐름 중공 섬유 기기의 최대 막간 차압은 10 ℃에서 약 2600 ㎜Hg 내지 3100 ㎜Hg(340 kPa 내지 415 kPa)이다. 실온에서, 최대 막간 차압은 약 2300 ㎜Hg 내지 2600 ㎜Hg(310 kPa 내지 345 kPa)이다. 문헌[GE Healthcare, Operating Handbook: Hollow fiber cartridges for membrane separations 19 (2004)]을 참조한다. 그러나, 이러한 압력 및 유속은 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 vWF를 파괴할 것이다.
중공 섬유 투석 모듈의 막은 생체중합체의 부착에 저항하는 경향이 있는 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 대표적으로, 매우 친수성인 막, 또는 낮은 단백질 결합을 갖는 막이 바람직하다. 바람직한 물질은 1 g/㎡(그램/제곱미터) 미만의 단백질 흡착을 가진다. 적당한 물질은 예를 들어 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 개질 또는 재생 셀룰로오스) 및 합성 막(예를 들어, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리이미드, 세라믹 및 지방족 폴리아미드)를 포함한다. 바람직한 막 물질은 폴리술폰, 폴리에테르술폰 및 개질 셀룰로오스를 포함한다. 예를 들어, 대표적인 단백질 흡착은 폴리에테르술폰의 경우 0.5 g/㎡이고, 재생 셀룰로오스의 경우 0.1 g/㎡이다.
중공 섬유 투석 모듈은 농축, 농축 및 정용여과, 및 농축 및 투석을 포함해서 다양한 방식으로 작업할 수 있다. 농축에서는, 계속해서 도 1을 참조하면, 공급물 스트림이 유입구 (102)에 흘러들어가서 중공 섬유 (110)을 통과해서 농축물을 생성하고, 이 농축물이 유출구 (104)를 통해서 모듈 (100)을 나간다. 전단 민감성 생체중합체를 함유하는 혼합물로부터의 작은 분자들은 중공 섬유 (110)의 막을 통과해서 포팅 물질 (100)에 들어가서 유출구 (106)을 통해서 여과물로서 모듈 (100)으로부터 제거된다. 전단 민감성 생체중합체는 중공 섬유 (110)을 따라서 이동해서 농축물을 생성한다.
전단 민감성 생체중합체를 함유하는 혼합물은 용해 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 vWF를 위한 용해 완충제는 20 mM(밀리몰) HEPES 및 150 mM NaCl 완충제일 수 있고, 실온에서 pH 7.4이다. HEPES 또는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산은 쯔비터이온성 유기 화학 완충제이다. 용해 완충제는 중공 섬유 (110)의 막을 통과해서 포팅 물질에 들어가서 여과물로서 중공 섬유 투석 모듈을 나갈 수 있다.
농축물은 전단 민감성 생체중합체를 포함할 것이다. 농축물은 투석 완충제를 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, 전단 민감성 생체중합체, 예를 들어 vWF의 투석 완충제는 20 mM 시트레이트 및 15 mM 글리신 완충제일 수 있고, 실온에서 pH 7.3을 가진다. 정용여과에서는, 도 2에 도시된 바와 같이, 농축 동안 또는 농축 후에 투석 완충제가 농축물에 직접 첨가될 수 있다. 도 2는 투석 완충제가 농축물에 직접 첨가되는 중공 섬유 투석 모듈의 공정 흐름도이다. 점선으로 나타낸 바와 같이, 중공 섬유 투석 모듈을 다회 통과하는 것이 요망되면, 농축물을 임의로 공급물에 되돌려보낼 수 있다.
투석에서는, 도 1에 도시된 바와 같이, 농축 동안 또는 농축 후에 투석 완충제가 포팅 물질 (112)를 통해서 병류 또는 향류로 흘러서 용해 완충제를 대체할 수 있다. 도 3은 투석 완충제가 공급물 흐름에 대해 향류로 도입되는 중공 섬유 투석 모듈의 공정 흐름도이다. 병류(나타내지 않음)는 여과물 스트림 및 투석 완충제 스트림을 바꿈으로써 달성할 수 있다. 점선으로 나타낸 바와 같이, 중공 섬유 투석 모듈을 다회 통과하는 것이 요망되면, 농축물을 임의로 공급물에 되돌려보낼 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 투석 완충제는 유입구 (108)을 통해 모듈 (100)에 들어가서 향류로 흐르면서 중공 섬유 (110) 막의 외표면과 접촉하고, 용해 완충제의 일부를 대체한다. 구체적으로, 도 1에서, 용해 완충제 및 전단 민감성 생체중합체를 함유하는 공급물 스트림이 유입구 (102)를 통해 모듈 (100)에 들어간다. 투석 완충제는 유입구 (108)을 통해 모듈에 들어가서 향류로 흐르면서 포팅 물질 (100)을 통해 흐른다. 중공 섬유 (110)에서, 용해 완충제의 일부 및 투석 완충제의 일부가 막을 통과한다. 용해 완충제는 여과물로서 제거되고, 투석 완충제 및 전단 민감성 생체중합체는 농축물을 생성하고, 이 농축물은 유출구 (104)를 통해 모듈 (100)을 나간다. 별법으로, 투석 완충제가 공급물 스트림과 병류로 흐르도록 투석 완충제 스트림 및 여과물 스트림을 바꿀 수 있다(나타내지 않음).
평판 및 접선 흐름 중공 섬유 한외여과 기기에서는, 투석이 막을 통한 완충제 교환에 의해 수행되지 않는다. 대신, 농축 후, 농축물에 투석 완충제를 첨가해서 다시 농축한다. 이것을 충분한 완충제 교환을 달성하기 위해 여러 번 수행한다. 대조적으로, 중공 섬유 투석 모듈은 동시에 농축 및 투석 모드로 작업할 수 있어서, 모듈 통과 횟수를 감소시킨다.
완충제는 바람직하게는 생체중합체와 상용성이다. 완충제는 일반적으로 특정 생체중합체에 대한 특정 요건에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 대부분의 치료 단백질의 경우, 완충제는 바람직하게는 실온에서 약 4 내지 약 9의 pH를 가진다. 이 pH 범위 밖의 완충제는 단백질의 변성을 야기할 수 있다. 그러나, 일부 단백질(예: 펩신)은 산성 환경, 예를 들어 약 1 내지 약 2의 pH에서 가장 잘 기능을 한다. 게다가, 완충제는 바람직하게는 생체중합체를 파괴하는 환원 또는 무질서 유발 화합물을 함유하지 않아야 한다. 환원제는 디술피드 결합을 포함하는 단백질 또는 펩티드에 유해할 뿐이다. 대부분의 치료 단백질은 디술피드 결합을 포함하고, 환원제는 이러한 결합을 파괴할 수 있다. 환원 성분은 예를 들어 베타-메르캅토에탄올, 메르캅토에틸아민, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀을 포함한다. 무질서 유발 화합물은 예를 들어 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 구아니딘 티오시아네이트 및 칼륨 티오시아네이트를 포함한다.
농축 후, 농축물은 바람직하게는 혼합물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체의 약 70％ 이상, 더 바람직하게는 약 80％ 이상, 훨씬 더 바람직하게는 혼합물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체의 약 90％ 이상을 포함한다. 농축 후, 농축물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체는 바람직하게는 혼합물에 존재하는 활성의 약 70％ 이상, 더 바람직하게는 혼합물에 존재하는 활성의 약 80％ 이상을 보유한다.
게재된 방법은 표면 흡착 및 응집체 생성을 감소시키기 위한 세정제의 사용 및 전단 민감성 생체중합체를 안정화시키는 특수 완충제 첨가제의 개발을 피한다. 세정제는 임계 농도 초과에서 단백질과 유사하게 거동하는 높은 분자량 미셀을 생성할 수 있고 전단 민감성 생체중합체와 함께 농축될 수 있기 때문에, 세정제 사용은 문제가 된다. 따라서, 세정제의 최종 농도를 조절하기 어려울 것이다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 실시예 1은 3000 ㎠의 막 표면적을 가지는 중공 섬유 투석 모듈로 수행되는 4 개의 실험을 기술한다. 실시예 2는 7000 ㎠의 막 표면적을 가지는 중공 섬유 투석 모듈로 수행되는 2 개의 실험을 기술한다. 막 표면적은 중공 섬유 하나의 내측 막 표면적에 모듈의 중공 섬유의 수를 곱한 것이다. 이 실험은 도 2에 도시된 바와 같이 투석 완충제를 향류로 흐르게 하여 수행하였다.
실시예 1
전단 민감성 생체중합체로서 vWF를 이용해서 중공 섬유 투석 모듈로 4 개의 실험을 수행하였다. 중공 섬유 투석 모듈은 3000 ㎠의 막 표면적, 30 ㎛의 막 두께, 100 ㎜의 섬유 길이 및 200 ㎛의 섬유 내경을 가졌다. 막 물질은 폴리에테르술폰이었다. 공급물 스트림의 농도는 0.7 g vWF 단백질/L(g vWF/L), 0.56 g vWF/L, 0.39 g vWF/L 및 0.27 g vWF/L였다. 농축 후, 농축물의 농도는 각각 2.52 g vWF/L, 4.59 g vWF/L, 2.23 g vWF/L 및 1.26 g vWF/L였다. 실험 완결에 약 2 내지 4 시간이 걸렸다.
공급물 스트림에서 용해 완충제는 20 mM(밀리몰) HEPES 및 150 mM NaCl 완충제이고, 실온에서 pH 7.4이었다. 투석 완충제는 20 mM 시트레이트 및 15 mM 글리신 완충제이고, 실온에서 pH 7.3이었다. HEPES의 농도는 공급물에서의 15 mM 초과로부터 농축물에서의 1 mM 미만으로 감소하였다.
실험 1-1, 1-2, 1-3 및 1-4의 데이터
실험 1-1 실험 1-2 실험 1-3 실험 1-4
공급물 부피 (L) 1.4 1.94 2.36 4.85
농축물 부피 (mL) 330 235 410 1057
총 여과물 부피(L) 15.3 10 12.86 12
투석 완충제 부피 (L) 14.2 8.3 10.9 8.2
공급물 유속(mL/분) 50 내지 100 50 내지 200 200 200
TMP(㎜Hg) -6 내지 28 0 내지 60 -1 내지 75 n/a
공정 시간(분) 152 123 143 207
vWF 단백질 수율(％) 84.8 69 80.7 74.1
활성 수율 - vWF 리스토세틴 보조인자 (％) 80 74.9 105.8 73.4
실시예 2
전단 민감성 생체중합체로서 vWF를 이용해서 중공 섬유 투석 모듈로 2 개의 실험을 수행하였다. 중공 섬유 투석 모듈은 7000 ㎠의 막 표면적, 30 ㎛의 막 두께, 100 ㎜의 섬유 길이 및 200 ㎛의 섬유 내경을 가졌다. 막 물질은 폴리에테르술폰이었다. 실험은 300 ㎖/분의 공급물 유속으로 2 L/h의 초기 부피 감소 속도 및 5 L/h의 투석 속도로 수행하였다. 공급물 유속에 의해 부여되는 전단 속도는 약 571 sec-1이었다. 공급물 스트림의 농도는 약 0.18 g vWF/L 및 약 0.22 g vWF/L였다. 농축물의 농도는 각각 약 0.88 g vWF/L 및 약 0.95 g vWF/L였다.
공급물 스트림에서 용해 완충제는 20 mM HEPES 및 150 mM NaCl 완충제이고, 실온에서 pH 7.4이었다. 투석 완충제는 염이 없는 20 mM 시트레이트 및 15 mM 글리신 완충제이고, 실온에서 pH 7.3이었다. HEPES의 농도는 공급물에서의 15 mM 초과로부터 농축물에서의 1 mM 미만으로 감소하였다.
실험 2-1 및 2-2의 데이터
실험 2-1 실험 2-2
공급물 부피 (L) 10.5 12.7
공급물 중의 vWF 총 단백질 (g) 1.9 2.8
공급물 유속(mL/분) 300 300
TMP(㎜Hg) 8 내지 131 -4 내지 116
부피 감소 속도 (mL/h) 2000 2000
투석 속도 (mL/h) 5000 4000
총 시간(h) 8.9 6.3
vWF 단백질 수율(％) 108.5 79.6
활성 - vWF 리스토세틴 보조인자 수율 (％) 97.6 77.7
도 4는 막간 차압, 필터 이전의 압력, 부피 감소 속도 및 총 여과물 부피의 데이터를 이용해서 실험 2-1을 그래프로 나타낸 것이다.
비교예
GE 헬스케어(GE Healthcare)(영국 버킹햄셔)로부터 상업적으로 입수가능한 300 kDa 막을 가지는 접선 흐름 중공 섬유 기기로 9 개의 실험을 실시하였다. 접선 흐름 중공 섬유 기기의 내경은 0.5 ㎜였다. 실험 중 6 개는 140 ㎠의 막 표면적을 가지는 접선 흐름 중공 섬유 기기로 수행하였고, 3 개는 650 ㎠의 막 표면적을 이용해서 수행하였다. 농축 공정은 한외여과 단계 및 정용여과 단계를 포함하였다. 전단 민감성 공급 원료의 권장 전단 속도는 2000 내지 4000 sec-1이었지만, 이러한 전단 속도는 시험된 전단 민감성 생체중합체 vWF에게는 너무 높았다. 따라서, 실험은 생체중합체에 부여되는 전단 응력을 감소시키기 위해 권장된 것보다 낮은 유속으로 실시하였다. 한외여과 후, 평균 vWF 단백질 수율은 50.7％였고, vWF 리스토세틴 보조인자 수율은 59.0％이었다. 최종 공정인 정용여과 후, 평균 vWF 단백질 수율은 48.3％이었고, vWF 리스토세틴 보조인자 수율은 53.8％이었다.
이들 수율은 중공 섬유 투석 모듈로 달성된 수율보다 많이 낮았다. 추가로, 접선 흐름 중공 섬유 기기에서 전단 속도를 감소시키는 데 필요한 낮은 유속은 공정 시간을 금지 수준까지 증가시켰다. 낮은 유속과 관련된 낮은 여과물 투과율에 대한 보상 없이는, 이러한 공정 시간은 경제적으로 알맞지 않다. 여과물 투과율을 증가시키는, 예를 들어 TMP 또는 막 표면적을 증가시키는 방법은 단백질 침전 또는 표면 흡착으로 인한 전단 민감성 생체중합체 손실을 초래한다.
상기 실시예는 전단 응력을 감소시키고 충분히 높은 여과물 투과율을 보유함으로써 높은 수율을 달성하는 전단 민감성 생체중합체를 농축하는 효과적인 방법을 증명한다. 이 방법은 구조 전환, 단백질 침전, 막 오염 및/또는 막 표면 흡착으로 인한 유의한 양의 생체중합체의 손실 없이 전단 민감성 생체중합체 함유 혼합물이 농축되는 것을 보장한다.
상기 설명은 오직 이해를 명확하게 하기 위해서 제공된 것이고, 본 발명의 범위 내의 변형이 당업계 통상의 기술을 가진 자에게 명백할 수 있기 때문에, 그로부터 불필요한 제한이 없음을 이해해야 한다.

Claims (19)

  1. 전단 민감성 생체중합체를 포함하는 혼합물을 중공 섬유 투석 모듈 안으로 흘려보내서 혼합물에서의 전단 민감성 생체중합체 농도보다 더 높은 전단 민감성 생체중합체 농도를 가지는 농축물을 생성하는 것을 포함하는 전단 민감성 생체중합체 농축 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈의 막 두께가 약 200 ㎛ 미만인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈의 막 두께가 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈의 막 두께가 약 30 ㎛인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈에서 벽 전단 속도가 약 2300 sec-1 미만인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈에서 벽 전단 속도가 약 50 sec-1 내지 약 1800 sec-1인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈에서 막간 차압이 약 1 ㎜Hg 내지 약 600 ㎜Hg인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈에서 막간 차압이 약 10 ㎜Hg 내지 약 150 ㎜Hg인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈의 막이 1 g/㎡ 미만의 단백질 흡착을 가지는 물질을 포함하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈의 막이 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리이미드, 세라믹, 개질 셀룰로오스, 지방족 폴리아미드 및 폴리아크릴로니트릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 중공 섬유 투석 모듈의 막이 폴리술폰, 폴리에테르술폰 및 개질 셀룰로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 혼합물이 용해 완충제를 더 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 용해 완충제의 일부를 투석 완충제로 대체하는 것을 더 포함하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 농축물이 혼합물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체의 약 70％ 이상을 포함하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 농축물이 혼합물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체의 약 80％ 이상을 포함하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 농축물이 혼합물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체의 약 90％ 이상을 포함하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 전단 민감성 생체중합체가 폰 빌레브란트 인자를 포함하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 농축물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체가 혼합물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체의 활성의 약 70％ 이상의 활성을 보유하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 농축물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체가 혼합물에 존재하는 전단 민감성 생체중합체의 활성의 약 80％ 이상의 활성을 보유하는 방법.
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