CN102137708B - 使用中空纤维膜浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明大体涉及浓缩包含有对剪切敏感的生物聚合物如冯威勒布兰特因子的混合物的方法。常规的浓缩生物聚合物的方法施加了太大的剪切应力，其会引起对剪切敏感的生物聚合物的降解。本申请公开的方法减少了剪切应力，同时维持高的滤液通量率。本申请公开的是一种浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法，该方法包括使含有对剪切敏感的生物聚合物的混合物流入中空纤维透析组件中以便形成滞留物，该滞留物中对剪切敏感的生物聚合物的浓度比混合物中对剪切敏感的生物聚合物的浓度高。中空纤维透析组件在低流速下具有高滤液通量和低剪切速率。这保证了高的产品产率和最小的对剪切敏感的生物聚合物损失。
Description
技术领域
本申请的公开大体涉及浓缩对剪切敏感的生物聚合物如冯威勒布兰特因子(vWF)的方法。
背景技术
浓缩(以及渗滤)生物聚合物的已知方法包括在平板式和中空纤维装置中的切向流超滤(以及渗滤)。这些装置在足够高的流速和跨膜压力下运行以便保证适合于成本有效的操作的滤液通量。然而，这些工作条件造成了高剪切速率。另外，这些装置可以包括筛子以便进一步增加滤液通量。这些筛子也增加了施加于生物聚合物的剪切应力。当试图浓缩对剪切敏感的生物聚合物如蛋白质或者病毒粒子时，这种剪切应力是特别不期望有的，因为剪切应力可以使得生物聚合物受到破坏、变性或者失活。
有各种已知的方法用于减少浓缩和/或渗滤期间在平板式或者切向流中空纤维装置中的剪切应力。那些方法包括降低流速、增加膜表面面积和增加膜截留尺寸。然而，这些方法中每一个都有各种问题。例如，降低流速也降低了滤液通量，从而不期望地增加了总操作时间、增加了膜堵塞的风险以及增加了对剪切敏感的生物聚合物暴露于剪切应力的时间值。在低流速下增加膜表面面积可保持高的滤液通量并且可以防止总操作时间的增加。然而，在降低的流速下，膜堵塞的风险会增加。由于增加的表面吸附，增加膜的表面面积会引起更多的产物损失，用于增加膜面积和缓冲剂消耗的成本会更多，并且可能死体积比浓缩后预期的产物体积还要大。由于更大的孔径，增加膜的截留尺寸可得到足够的滤液通量。然而，还存在着增加膜堵塞或者与对剪切敏感的生物聚合物不相容(即生物聚合物可以穿过膜并且在滤液中丢失)的问题。
洗涤剂被用于许多生物工艺操作中，以便避免蛋白质的表面吸附和形成聚集。然而，这些操作可能需要专门的缓冲剂添加剂来稳定对剪切敏感的生物聚合物。
用于切向流中空纤维装置的剪切速率建议是2000至8000秒-1，用于对剪切敏感的原料的剪切速率建议是2000至4000秒-1。参见通用电气医疗集团的《操作指南：用于膜分离的中空纤维滤柱8(2004)》。然而，在超出2000秒-1的剪切速率下，对剪切敏感的生物聚合物如冯威勒布兰特因子或者病毒粒子开始降解、变性或者解折叠。因此，本领域仍然需要用于浓缩对剪切敏感的生物聚合物且没有提供高剪切应力的方法。
大体上，现有技术没有教导或者为本领域的普通技术人员建议一种成本有效的浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法，且没有由于蛋白质沉淀、膜堵塞以及膜表面吸附而引起生物聚合物的大量损失。类似地，通过减少含有生物聚合物的混合物的流速，借此来降低装置中的剪切应力，这并没有提供一种有效的替换方法，因为这仍然需要一定的最小流速来避免膜堵塞和沉淀物吸附。
发明内容
本申请公开的是一种浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法，该方法包括使含有对剪切敏感的生物聚合物如冯威勒布兰特因子的混合物流入中空纤维透析组件中以便形成滞留物，该滞留物中对剪切敏感的生物聚合物的浓度比该混合物中的对剪切敏感的生物聚合物的浓度要高。该方法可以进一步包括在浓缩期间或者在浓缩后使缓冲液与含有对剪切敏感的生物聚合物的混合物交换或者透析。
中空纤维透析组件的膜优选厚度小于大约200微米，比如膜可以是大约10微米至大约100微米厚度，并且优选是大约30微米厚度。在优选的实施方式中，中空纤维透析组件的腔壁剪切速率是小于大约2300秒-1，并且优选大约50秒-1至大约1800秒-1。中空纤维透析组件中的跨膜压力优选是大约1mmHg至大约600mmHg(大约0.1kPa至大约80kPa)，并且更优选大约10mmHg至大约150mmHg(大约1kPa至大约20kPa)。
含有对剪切敏感的生物聚合物的混合物可以任选地包含溶液缓冲剂。如果该混合物包括溶液缓冲剂，则该方法可以进一步包括用透析缓冲剂取代一部分溶液缓冲剂。
在优选的实施方式中，滞留物包含混合物中至少大约70％的对剪切敏感的生物聚合物，优选混合物中至少大约80％的对剪切敏感的生物聚合物，并且更加优选混合物中至少大约90％的对剪切敏感的生物聚合物。所述滞留物优选保留混合物中对剪切敏感的生物聚合物的至少大约70％的活性，并且更加优选保留混合物中对剪切敏感的生物聚合物的至少大约80％的活性。
本申请公开的方法提供了一种成本有效的方法，以便浓缩对剪切敏感的生物聚合物，同时避免生物聚合物由于蛋白质沉淀、膜堵塞以及膜表面粘附而引起的大量损失。
从下面的详细说明综述，连同附图、实施例以及附后的权利要求中，对于本领域中的技术人员来说，本发明的其他特征可以很明显地呈现出来。
附图说明
为了对于本申请的公开有更加完整的理解，参照下面的详细说明以及附图，其中：
图1是中空纤维透析组件的横断面视图(不按照比例)；
图2是透析缓冲剂被直接添加至滞留物中的中空纤维透析组件的工艺流程图；
图3是透析缓冲剂被逆流引入至进料流中的中空纤维透析组件的工艺流程图；并且
图4是显示实验2-1的工艺数据的图表。
本申请此处公开的用于浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法允许各种形式的实施方式，应理解，在附图中举例说明的(以及下面将要描述的)本发明的特定实施方式是用来阐述发明，而不是将本发明限制于此处描述的和举例说明的这些特定的实施方式。
具体实施方式
本发明大体涉及从含有对剪切敏感的生物聚合物的混合物中浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法。浓缩生物聚合物的已知方法提供了不期望有的高剪切应力，使对剪切敏感的生物聚合物受到破坏、变性或者失活。本申请公开的是一种浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法，该方法包括使含有对剪切敏感的生物聚合物的混合物流入中空纤维透析组件中以便形成滞留物，该滞留物中对剪切敏感的生物聚合物的浓度比混合物中对剪切敏感的生物聚合物的浓度高。本申请公开的方法保证了足够低的剪切应力以便避免破坏对剪切敏感的生物聚合物，同时维持高滤液通量。
适用于本申请公开的浓缩方法的对剪切敏感的生物聚合物包括那些当暴露于显著的剪切力(即相对大的速度梯度)时易受损害、破坏和/或活性损失的那些聚合物。这种对剪切敏感的生物聚合物的一个例子是冯威勒布兰特因子(vWF)，其在血浆中循环，与凝血因子VIII复合并且促进生物凝血活性的调节。虽然vWF以一系列寡聚/多聚形式存在于血浆中，其基于520kDa的二聚物，的分子量范围是从大约1000kDa(千道尔顿)至大约20，000kDa，本申请公开的方法不必仅仅基于特定的分子量范围而受限于其浓缩对剪切敏感的生物聚合物的能力。
具体地说，vWF对于被运输流体的速度梯度产生的剪切力是敏感的，尤其是当vWF穿过或靠近滤膜(即在接近滤膜孔处液流集聚和迂曲的流路的地方导致尤其大的速度梯度)时。比如，超出2000秒-1(秒的倒数)的剪切速率可引起vWF从球状分子变形成伸长的链状分子。这个结构转变增加了与滤膜表面及其他蛋白质粘附的可能性。vWF的较大的多聚体是特别易遭受结构转变并且增加粘附的可能性。在浓缩期间，增加的粘附性降低了产品产率，并且较大的多聚体的损失降低了vWF瑞斯托菌素(Ristocetin)辅助因子的活性。
中空纤维透析组件具有高滤液通量和低剪切速率。这些组件可以保证高的产品产率和最小的对剪切敏感的生物聚合物损失。中空纤维透析组件是具有中空纤维或者管状膜的装置，如同在图1中所示的那样(不按照比例)横越该装置的长度。中空纤维透析组件已知是用于血液透析并且可购自如Edwards Lifesciences公司(Saint Prex，瑞士)和旭化成化学株式会社(东京，日本)。虽然不希望结合任何特定的原理，但人们认为该组件是根据透析原理操作的，其中压力梯度不是物质转移的主要驱动力。反而，浓度梯度驱动跨膜的物质转移或者缓冲液交换。
在图1中所示的是一种中空纤维透析组件100，其具有原料流入口102、滞留物液流出口104、滤液液流出口106和任选的透析缓冲剂液流入口108。中空纤维透析组件100具有横越组件100且平行于进料流的中空纤维110。中空纤维110被灌注材料(pottingmaterial)112包围。中空纤维透析组件100可以单独使用，或者取决于给料体积而被串联地或并行地使用。
中空纤维透析组件中的高的滤液通量是可达到的，因为中空纤维透析组件的膜比超滤和切向流中空纤维装置中的膜薄得多。后者的膜厚度大于200微米，因为这些膜必须承受高的跨膜压力、大体积(因为再循环)和多次使用。厚的膜会降低滤液通量。相反，中空纤维透析组件的膜厚度小于大约200微米，优选大约10微米至大约100微米厚度，以及更加优选大约30微米厚度。薄的膜允许有高的滤液通量，并且因此跨膜压力可以低于其它组件。
因为中空纤维透析组件具有高的滤液通量，需要通过中空纤维组件的次数比需要通过切向流中空纤维装置中的次数要少。此外，与透析缓冲剂被直接添加至原料流中的方法相比，当透析缓冲剂沿顺流或者逆流方向流动时，再循环的次数可以减少。中空纤维透析组件的效率远大于超滤和切向流中空纤维装置中可能的效率，超滤和切向流中空纤维装置需要更加多的再循环以便达到相同浓度。与在超滤或者切向流中空纤维装置中所发现的高剪切速率下的许多次数相比，在低剪切速率下通过中空纤维透析组件的较少次数使得更多的蛋白质可以保留其结构。
中空纤维透析组件的剪切速率优选低于大约2300秒-1。含有对剪切敏感的生物聚合物的混合物的流速可以被调整或者被控制，以便保证剪切速率低于特定水平比如低于2300秒-1，低于2000秒-1或者低于1800秒-1。通过下面的公式进行计算剪切速率：
其中Q是流速(mL/秒)，n是中空纤维透析组件中的纤维数目，并且r是纤维的内半径(cm)。
参见表1，其为具有0.2毫米纤维内径的组件在不同的流速和不同的纤维数目下的剪切速率。
表1：在不同的流速下对于具有不同纤维支数的组件的剪切速率
中空纤维透析组件的跨膜压力优选是大约1mmHg(毫米汞柱)至最大值大约600mmHg(大约0.1kPa(千帕斯卡)至大约80kPa)，并且更加优选大约10mmHg至大约150mmHg(大约1kPa至大约20kPa)。超滤和切向流中空纤维装置可以承受更高的压力，因为它们具有厚的膜。这些装置也需要高压力来保证效率和用于经济操作的最小滤液流量。比如，在10℃下用于切向流中空纤维装置的跨膜压力最大值大约是2600mmHg至3100mmHg(340kPa至415kPa)。在室温下，跨膜压力最大值是大约2300mmHg至2600mmHg(310kPa至345kPa)。参见通用电气医疗集团的《操作指南：用于膜分离的中空纤维滤柱19(2004)》。然而这些压力和流速有可能破坏对剪切敏感的生物聚合物，比如冯威勒布兰特因子。
中空纤维透析组件的膜可以由不同的易于防止生物聚合物粘附的材料制成。典型地，优选亲水性非常强的膜或者蛋白结合性较低的膜。优选的材料的蛋白质吸附性是低于1g/m2(每平方米克数)。一些合适的材料包括比如纤维素衍生物(如改性的或者再生的纤维素)和合成膜(如聚砜、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酰亚胺、陶瓷和脂族聚酰胺)。优选的膜材料包括聚砜、聚醚砜和改性纤维素。例如，对于聚醚砜，一般的蛋白质吸附是0.5g/m2；对于再生纤维素，一般的蛋白质吸附是0.1g/m2。
中空纤维透析组件可以在不同的模式包括浓缩、浓缩和渗滤、浓缩和透析下操作。在浓缩中，继续参考图1，原料流流进入口102，通过中空纤维110，形成滞留物，滞留物通过出口104流出组件100。来自于包含对剪切敏感的生物聚合物的混合物的小分子通过中空纤维110的膜进入灌注材料100，并且通过出口106作为滤液从组件100中移去。对剪切敏感的生物聚合物沿着中空纤维110输送形成滞留物。
含有对剪切敏感的生物聚合物的混合物可以包括溶液缓冲剂。例如用于对剪切敏感的生物聚合物如vWF的溶液缓冲剂可以是20mM(毫摩尔)HEPES和150mM NaCl缓冲剂，在室温下pH值是7.4。HEPES，或称4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，是一种两性离子的有机的化学缓冲剂。溶液缓冲剂可以通过中空纤维110的膜进入灌注材料，并且作为滤液流出中空纤维透析组件。
滞留物将包含对剪切敏感的生物聚合物。滞留物可以任选地包含透析缓冲剂。比如，用于对剪切敏感的生物聚合物如vWF的透析缓冲剂可以是20mM柠檬酸盐和15mM甘氨酸缓冲剂，在室温下pH值是7.3。在渗滤中，在浓缩期间或在浓缩后透析缓冲剂可以被直接添加至滞留物中，如图2所示。图2是透析缓冲剂被直接添加至滞留物中的中空纤维透析组件的工艺流程图。如果想要多次数通过中空纤维透析组件，滞留物可以任选地返回至进料中，如虚线所示。
在透析中，在浓缩期间或在浓缩后透析缓冲剂可以并流或者逆流地流过灌注材料112，如图1所示，从而取代溶液缓冲剂。图3是透析缓冲剂被逆流引入至进料流中的中空纤维透析组件的工艺流程图。并流(没有显示)可以通过转换滤液和透析缓冲剂液流来实现。如果想要多次通过中空纤维透析组件，滞留物可以任选地返回至进料中，如虚线所示。
如图1所示，透析缓冲剂通过入口108进入组件100，并且逆流地与中空纤维110的膜的外表面接触，并取代一部分溶液缓冲剂。具体地说，在图1中，包含溶液缓冲剂和对剪切敏感的生物聚合物的原料流通过入口102进入组件100。透析缓冲剂通过入口108进入组件，并且逆流地流过灌注材料100。在中空纤维110中，一部分溶液缓冲剂和一部分透析缓冲剂穿过膜。溶液缓冲剂作为滤液被除去，并且透析缓冲剂和对剪切敏感的生物聚合物形成滞留物，通过出口104流出组件100。可供选择地，透析缓冲剂和滤液液流可以被转换，使透析缓冲剂与原料流并流地进行(没有显示)。
在平板式和切向流空心纤维超滤装置中，透析不是通过膜的缓冲液交换进行的。反而，在浓缩后，透析缓冲剂被再次添加至滞留物中并被浓缩。该操作进行很多次直到完成足够的缓冲液交换。相反，中空纤维透析组件可以以浓缩和透析模式同时进行，减少了通过组件的次数。
缓冲剂优选与生物聚合物相容。缓冲剂一般根据特定生物聚合物的具体要求来变化。对于大多数治疗性蛋白质而言，比如，缓冲剂优选的pH值在室温下是大约4至大约9。在这个pH范围外的缓冲剂可能引起蛋白质的变性。然而，一些蛋白质(如胃蛋白酶)在酸性环境如pH大约1至大约2中功能最佳。此外，缓冲剂应当优选不含有会破坏生物聚合物的还原性或者离液序列高的化合物。还原性试剂仅仅是对于有二硫键的蛋白质或者肽有损害。大多数治疗性蛋白质包含二硫键，并且还原剂可以破坏这些键。还原性成分包括比如β-巯基乙醇、半胱胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)磷。离液序列高的成分包括比如尿素、盐酸胍、硫氰酸胍和硫氰酸钾。
在浓缩后，滞留物优选包含存在于混合物中的至少大约70％的对剪切敏感的生物聚合物，并且更加优选存在于混合物中的至少大约80％、更优选至少大约90％的对剪切敏感的生物聚合物。在浓缩后，存在于滞留物中的对剪切敏感的生物聚合物优选保留存在于混合物中的对剪切敏感的生物聚合物活性的至少大约70％，以及更加优选保留存在于混合物中的对剪切敏感的生物聚合物的活性的至少大约80％。
本申请公开的方法可避免通过利用洗涤剂来减少表面吸附和形成聚集、以及通过利用专门的缓冲添加剂的展开来稳定对剪切敏感的生物聚合物。洗涤剂的使用是成问题的，因为超出临界浓度，它们可能形成行为类似于蛋白质的高分子量胶束，并且可能随着对剪切敏感的生物聚合物一起被浓缩。因此，洗涤剂的最终浓度将很难被控制。
实施例
下面的实施例用来说明本发明，并不是想限制本发明的范围。实施例1描述了利用含有3000cm2的膜表面面积的中空纤维透析组件进行的四个试验。实施例2描述了利用含有7000cm2的膜表面面积的中空纤维透析组件进行的两个试验。膜表面面积是中空纤维的内膜表面面积乘以组件中的中空纤维数目。这些试验是利用透析缓冲剂延逆流方向的流动进行的，如图2所示。
实施例1
利用vWF作为对剪切敏感的生物聚合物和中空纤维透析组件进行四个试验。中空纤维透析组件有3000cm2的膜表面面积、30微米厚的膜、100毫米的纤维长度和200微米的纤维内径。膜材料是聚醚砜。原料流的浓度是每升0.7克vWF蛋白质(gvWF/L)、0.56gvWF/L、0.39g vWF/L、0.27g vWF/L。浓缩后滞留物的浓度分别是2.52g vWF/L、4.59gvWF/L、2.23g vWF/L和1.26g vWF/L。实验花了大约2至4小时完成。
在原料流中的溶液缓冲剂是20mM(毫摩尔)HEPES和150mM NaCl缓冲剂，在室温下pH值是7.4。透析缓冲剂是20mM柠檬酸盐和15mM甘氨酸缓冲剂，在室温下pH值是7.3。HEPES浓度由进料中的大于15mM缩小至滞留物中的小于1mM。
表2：试验1-1、1-2、1-3和1-4的数据
实施例2
利用vWF作为对剪切敏感的生物聚合物和中空纤维透析组件进行两个试验。中空纤维透析组件有7000cm2的膜表面面积、30微米厚的膜、100毫米的纤维长度和200微米的纤维内径。膜材料是聚醚砜。实验是在300ml/分钟的进料流速、2L/小时初始体积减少速率和5L/小时透析速度下进行的。进料流速施加的剪切速率是大约571秒-1。原料流浓度是大约0.18g vWF/L和大约0.22g vWF/L。滞留物浓度分别是大约0.88g vWF/L和大约0.95gvWF/L。
在原料流中的溶液缓冲剂是20mM(毫摩尔)HEPES和150mM NaCl缓冲剂，在室温下pH值是7.4。透析缓冲剂是无盐的、20mM柠檬酸盐和15mM甘氨酸缓冲剂，在室温下pH值是7.3。HEPES浓度由进料中的大于15mM缩小至滞留物中的小于1mM。
表3：试验2-1和2-2的数据
图4是试验2-1的图示，数据是跨膜压力、过滤前压力、体积减小速率和总滤液体积。
比较例
在含有300kDa膜的切向流中空纤维装置(购自通用电气医疗集团(白金汉郡，英国))上进行九个试验。切向流中空纤维装置的内径是0.5mm。在膜表面面积是140cm2的切向流中空纤维装置上进行六个实验，在膜表面面积是650cm2的切向流中空纤维装置上进行三个实验。浓缩过程包括超滤步骤和渗滤步骤。用于对剪切敏感的原料的剪切速率建议是2000至4000秒-1，然而这些剪切速率对于被试验的对剪切敏感的生物聚合物vWF而言还是过高了。因此，试验是在比建议流速低的流速下进行的，以便减少施加于生物聚合物的剪切应力。在超滤后，平均vWF蛋白质收率是50.7％，并且vWF瑞斯托菌素辅助因子收率是59.0％。在渗滤后，最终的工序中，平均vWF蛋白质收率是48.3％，并且vWF瑞斯托菌素辅助因子收率是53.8％。
这些收率显著低于在中空纤维透析组件中所达到的收率。此外，切向流中空纤维装置中必需的用以降低剪切速率的低流速增加了操作时间至过高的水平。在没有补偿与低流速相关的导致低滤液通量的情况下，操作时间在经济上是不可行的。增加滤液通量的方法比如增加TMP或者膜表面面积，导致由蛋白质沉淀或者表面吸附引起的对剪切敏感的生物聚合物的损失。
前面的实施例阐述了一种用于浓缩对剪切敏感的生物聚合物的有效方法，该方法通过减少剪切应力和保留足够高的滤液通量达到了高收率。这个方法保证了含对剪切敏感的生物聚合物的混合物被浓缩，并且没有由于结构转变、蛋白质沉淀、膜堵塞和/或膜表面吸附而引起生物聚合物显著大量的丢失。
上述给出的描述是为了清晰地理解本发明，应理解没有不必要的限制，本发明范围内的修改对于本领域的技术人员是显而易见的。
Claims (13)
1.一种浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法，该方法包括：使含有对剪切敏感的生物聚合物和溶液缓冲剂的混合物流入中空纤维透析组件中以便形成滞留物和滤液，该滞留物中对剪切敏感的生物聚合物的浓度比所述混合物中对剪切敏感的生物聚合物的浓度高，其中，所述混合物和所述滤液之间的跨膜压力是1mmHg至150mmHg，其中所述中空纤维透析组件的膜厚度小于200微米，其中所述中空纤维透析组件的腔壁剪切速率小于2300秒-1，其中存在于所述滞留物中对剪切敏感的生物聚合物保留的活性是存在于所述混合物中敏感的生物聚合物的活性的至少70%。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维透析组件的膜厚度是10微米至100微米。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维透析组件的膜厚度是30微米。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维透析组件的腔壁剪切速率是50秒-1至1800秒-1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维透析组件的膜包含蛋白质吸附性低于每平方米1克的材料。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维透析组件的膜包含选自下组的材料：聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚酰亚胺、陶瓷、改性纤维素、脂族聚酰胺和聚丙烯腈。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维透析组件的膜包含选自下组的材料：聚砜、聚醚砜和改性纤维素。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括用透析缓冲剂取代一部分所述溶液缓冲剂。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滞留物包含存在于混合物中的至少70%的对剪切敏感的生物聚合物。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滞留物包含存在于混合物中的至少80%的对剪切敏感的生物聚合物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滞留物包含存在于混合物中的至少90%的对剪切敏感的生物聚合物。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对剪切敏感的生物聚合物包含冯威勒布兰特因子。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，存在于所述滞留物中对剪切敏感的生物聚合物保留的活性是存在于所述混合物中对剪切敏感的生物聚合物的活性的至少80%。
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