RU2021136635A - Способы очистки матричной рнк - Google Patents

Claims (111)

1. Способ очистки матричной РНК (mRNA), включающий

a) осаждение mRNA в суспензии, содержащей высокомолярный раствор соли и амфифильный полимер, с получением осажденной mRNA;

b) захватывание осажденной mRNA;

c) промывание осажденной mRNA, захваченной на стадии b), раствором для промывания с очисткой осажденной mRNA и

d) солюбилизирование осажденной mRNA из стадии c) с получением композиции на основе очищенной mRNA.

2. Способ по п. 1, где композиция на основе очищенной mRNA по сути не содержит загрязняющих примесей, содержащих короткие молекулы абортивной РНК, длинные молекулы абортивной РНК, двухцепочечную РНК (dsRNA), остаточную плазмидную ДНК, остаточные ферменты транскрипции in vitro остаточный растворитель и/или остаточную соль.

3. Способ по п. 2, где уровень остаточной плазмидной ДНК составляет 10 пг/мг или меньше.

4. Способ по п. 1, где амфифильный полимер выбран из плюроников, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля (PEG) или их комбинаций.

5. Способ по п. 4, где амфифильный полимер представляет собой PEG.

6. Способ по п. 5, где суспензия содержит PEG в концентрации, составляющей от приблизительно 10% до приблизительно 100% вес/объем.

7. Способ по п. 6, где суспензия содержит PEG в концентрации, составляющей приблизительно 50% вес/объем.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где высокомолярный раствор соли содержит гуанидинтиоцианат (GSCN).

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где раствор для промывания, содержащий амфифильный полимер, применяют для промывания mRNA на стадии c).

10. Способ по п. 9, где амфифильный полимер предусматривает PEG.

11. Способ по п. 10, где концентрация PEG в растворе для промывания составляет от приблизительно 10% до приблизительно 100% вес/объем.

12. Способ по п. 10, где концентрация PEG в растворе для промывания составляет от приблизительно 50% до приблизительно 90% вес/объем.

13. Способ по п. 12, где концентрация PEG в растворе для промывания составляет приблизительно 90% вес/объем.

14. Способ по любому из пп. 5-13, где молекулярная масса PEG составляет от приблизительно 200 г/моль до приблизительно 40000 г/моль.

15. Способ по п. 14, где PEG имеет линейную, разветвленную, Y-образную или многолучевую конфигурацию.

16. Способ по п. 15, где PEG является линейным.

17. Способ по п. 16, где раствор PEG содержит PEG, выбранный из триэтиленгликоля, тетраэтиленгликоля, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1000, PEG 1500, PEG 2000, PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000, PEG 35000 и PEG 40000.

18. Способ по п. 17, где раствор PEG содержит PEG 6000.

19. Способ по любому из пп. 5-17, где раствор PEG не содержит PEG 6000.

20. Способ по п. 17, где PEG представляет собой PEG 400.

21. Способ по любому из пп. 5-20, где раствор PEG содержит смесь одного или более полимеров PEG.

22. Способ по п. 21, где смесь полимеров PEG содержит полимеры, имеющие различные молекулярные массы.

23. Способ по п. 22, где смесь полимеров PEG содержит полимеры, имеющие различные геометрические конфигурации.

24. Способ по любому из предыдущих пунктов, где раствор для промывания является водным.

25. Способ по п. 24, где раствор для промывания не содержит спирт.

26. Способ по п. 25, где раствор для промывания не содержит этанол, изопропиловый спирт или бензиловый спирт.

27. Способ по любому из пп. 5-23, где раствор PEG содержит неводный компонент.

28. Способ по п. 27, где неводный компонент представляет собой этанол, изопропиловый спирт или бензиловый спирт.

29. Способ по любому из предыдущих пунктов, где захватывание осажденной mRNA осуществляется с помощью фильтра.

30. Способ по п. 29, где фильтр выбран из фильтра для микрофильтрации или фильтра для ультрафильтрации.

31. Способ по п. 30, где фильтр для микрофильтрации имеет размер пор от 0,05 мкм до 1,0 мкм.

32. Способ по п. 31, где фильтр для микрофильтрации имеет номинальный предел молекулярной массы (NMWL), составляющий более чем 1000 килодальтон (кДа).

33. Способ по п. 30, где фильтр для ультрафильтрации имеет размер пор менее чем 0,05 мкм.

34. Способ по п. 33, где фильтр для ультрафильтрации имеет NMWL, составляющий от приблизительно 1 кДа до 1000 кДа.

35. Способ по любому из предыдущих пунктов, где фильтрацию в тангенциальном потоке (TFF) или диафильтрацию применяют для очистки осажденной mRNA на стадии c).

36. Способ по любому из предыдущих пунктов, где применяют вспомогательное фильтрующее средство.

37. Способ по п. 36, где вспомогательное фильтрующее средство представляет собой средство на основе целлюлозы.

38. Способ по п. 37, где вспомогательное фильтрующее средство содержит диатомовую землю и/или вулканический пепел.

39. Способ по любому из предыдущих пунктов, где способ не включает стадию хроматографирования.

40. Способ по любому из предыдущих пунктов, где осажденную mRNA центрифугируют с получением осадка mRNA.

41. Способ по п. 40, где осадок mRNA ресуспендируют в буферном растворе.

42. Способ по п. 41, где буферный раствор выбран из воды, трис-EDTA (ТЕ), цитрата натрия или их комбинаций.

43. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выход очищенной mRNA составляет от приблизительно 50% до приблизительно 100%.

44. Способ по п. 43, где выход очищенной mRNA составляет от приблизительно 70% до приблизительно 99%.

45. Способ по п. 44, где выход очищенной mRNA составляет от приблизительно 90% до приблизительно 99%.

46. Способ по любому из предыдущих пунктов, где чистота очищенной mRNA составляет от приблизительно 60% до приблизительно 100%.

47. Способ по п. 46, где чистота очищенной mRNA составляет от приблизительно 80% до 99%.

48. Способ по п. 47, где чистота очищенной mRNA составляет от приблизительно 90% до приблизительно 99%.

49. Способ очистки матричной РНК (mRNA), включающий

a) осаждение mRNA в суспензии, содержащей высокомолярный раствор соли и амфифильный полимер;

b) захватывание mRNA с помощью фильтра и

c) промывание mRNA из стадии b) раствором PEG с получением композиции на основе очищенной mRNA, по сути не содержащей загрязняющих примесей.

50. Способ по п. 49, где выход очищенной mRNA составляет от приблизительно 50% до приблизительно 100%.

51. Способ по п. 50, где выход очищенной mRNA составляет от приблизительно 70% до приблизительно 99%.

52. Способ по п. 51, где выход очищенной mRNA составляет от приблизительно 90% до приблизительно 99%.

53. Способ по любому из пп. 49-52, где чистота очищенной mRNA составляет от приблизительно 60% до приблизительно 100%.

54. Способ по п. 53, где чистота очищенной mRNA составляет от приблизительно 80% до 99%.

55. Способ по п. 54, где чистота очищенной mRNA составляет от приблизительно 90% до приблизительно 99%.

56. Способ по любому из пп. 49-55, где осажденная mRNA содержит по меньшей мере 100 мг, 1 г, 10 г, 100 г, 1 кг, 10 кг, 100 кг, одну метрическую тонну или десять метрических тонн mRNA или любое промежуточное количество.

57. Способ по п. 55, где осажденная mRNA содержит более чем 1 кг mRNA.

58. Способ по любому из пп. 49-57, где амфифильный полимер выбран из плюроников, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля (PEG) или их комбинаций.

59. Способ по п. 58, где амфифильный полимер представляет собой PEG.

60. Способ по любому из пп. 49-59, где высокомолярный раствор соли содержит гуанидинтиоцианат (GSCN).

61. Способ по любому из пп. 49-60, где способ не предусматривает применение этанола.

62. Способ по любому из пп. 49-61, где композиция на основе очищенной mRNA по сути не содержит загрязняющих примесей, содержащих короткие молекулы абортивной РНК, длинные молекулы абортивной РНК, двухцепочечную РНК (dsRNA), остаточную плазмидную ДНК, остаточные ферменты транскрипции in vitro остаточный растворитель и/или остаточную соль.

63. Способ очистки матричной РНК (mRNA), включающий

a) осаждение mRNA в растворе гуанидинтиоцианата (GSCN), содержащем PEG;

b) центрифугирование раствора из стадии a) с получением осадка mRNA;

c) ресуспендирование осадка mRNA в буфере;

d) захватывание mRNA с помощью фильтра;

e) промывание mRNA из стадии d) раствором PEG; и

f) солюбилизирование промытой mRNA из стадии e) с получением композиции на основе mRNA, по сути не содержащей загрязняющих примесей.

64. Способ по п. 63, где композиция на основе очищенной mRNA по сути не содержит загрязняющих примесей, содержащих короткие молекулы абортивной РНК, длинные молекулы абортивной РНК, двухцепочечную РНК (dsRNA), остаточную плазмидную ДНК, остаточные ферменты транскрипции in vitro остаточный растворитель и/или остаточную соль.

65. Способ изготовления mRNA, включающий стадии

a) осуществления транскрипции in vitro (IVT) посредством смешивания (i) ДНК-матрицы, содержащей промотор, и (ii) РНК-полимеразы с получением неочищенного препарата, содержащего полноразмерную mRNA

b) обеспечения высокомолярной соли и амфифильного полимера в суспензии с осаждением полноразмерной mRNA и получением осажденной полноразмерной mRNA в суспензии;

c) захватывания осажденной полноразмерной mRNA посредством нанесения суспензии на фильтр;

d) промывания осажденной полноразмерной mRNA из стадии (c) водным растворителем с получением очищенной полноразмерной mRNA в водном растворе; и

e) солюбилизирования осажденной mRNA из стадии (d) с получением композиции на основе очищенной mRNA, где очищенная полноразмерная mRNA в водном растворе, полученная на стадии (d), по сути не содержит (i) ДНК-матрицу, содержащую промотор, и (ii) РНК-полимеразу.

66. Способ по п. 65, где на стадии (a) РНК-полимераза представляет собой полимеразу SP6.

67. Способ по п. 65 или 66, где очищенная полноразмерная mRNA в водном растворе, полученная на стадии (e), также по сути не содержит (v) двухцепочечную РНК (dsRNA).

68. Способ по любому из пп. 1, 49 и 65, где амфифильный полимер предусматривает MTEG.

69. Способ по п. 68, где суспензия содержит осажденную mRNA, высокомолярный раствор соли и MTEG, при этом конечная концентрация MTEG составляет от приблизительно 15% до приблизительно 45% вес/объем.

70. Способ по п. 69, где суспензия содержит осажденную mRNA, высокомолярный раствор соли и MTEG, при этом конечная концентрация MTEG составляет от приблизительно 20% до приблизительно 40% вес/объем.

71. Способ по п. 70, где суспензия содержит осажденную mRNA, высокомолярный раствор соли и MTEG, при этом конечная концентрация MTEG составляет приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30% или приблизительно 35% вес/объем.

72. Способ по любому из пп. 1, 49 и 65, где суспензия содержит осажденную mRNA, высокомолярный раствор соли и PEG или MTEG.

73. Способ по пп. 5, 59 или 65, где конечная концентрация высокомолярной соли составляет приблизительно 2-4 M, и конечная концентрация PEG составляет от приблизительно 5% до приблизительно 20% вес/объем.

74. Способ по п. 73, где конечная концентрация высокомолярной соли составляет приблизительно 2,5-3 M, и конечная концентрация PEG составляет от приблизительно 10% до приблизительно 15% вес/объем.

75. Способ по п. 74, где конечная концентрация высокомолярной соли составляет приблизительно 2,7 M, и конечная концентрация PEG составляет приблизительно 12% вес/объем.

76. Способ по любому из пп. 69-75, где высокомолярный раствор соли содержит GCSN.

77. Способ по любому из пп. 72-76, где PEG имеет молекулярную массу, составляющую приблизительно 6000 г/моль (например, PEG-6000).

78. Способ по любому из пп. 69-77, где суспензия дополнительно содержит вспомогательное фильтрующее средство при массовом соотношении с осажденной mRNA, составляющем 2:1; 5:1; 10:1 или 15:1.

79. Способ по п. 78, где массовое соотношение вспомогательного фильтрующего средства и осажденной mRNA составляет 10:1.

80. Способ по п. 78 или 79, где вспомогательное фильтрующее средство представляет собой средство на основе целлюлозы.

81. Способ по п. 9, где амфифильный полимер предусматривает MTEG.

82. Способ по п. 81, где концентрация MTEG в растворе для промывания составляет приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90% или приблизительно 95% вес/объем.

83. Способ по п. 82, где концентрация MTEG в растворе для промывания составляет от приблизительно 90% до 100% вес/объем.

84. Способ по п. 83, где концентрация MTEG в растворе для промывания составляет приблизительно 95% вес/объем.

85. Способ по п. 63, относящийся к стадии a), где конечная концентрация GSCN составляет приблизительно 2-4 M, и конечная концентрация PEG составляет от приблизительно 5% до приблизительно 20% вес/объем.

86. Способ по п. 85, где конечная концентрация GSCN составляет приблизительно 2,7 M, и конечная концентрация PEG составляет приблизительно 12% вес/объем.

87. Способ по п. 85 или 86, где PEG имеет молекулярную массу, составляющую приблизительно 6000 г/моль (например, PEG-6000).

88. Способ по любому из пп. 85-87, где раствор дополнительно содержит вспомогательное фильтрующее средство при массовом соотношении с осажденной mRNA, составляющем 2:1; 5:1; 10:1 или 15:1.

89. Способ по п. 88, где массовое соотношение вспомогательного фильтрующего средства и осажденной mRNA составляет 10:1.

90. Способ по п. 88 или 89, где вспомогательное фильтрующее средство представляет собой средство на основе целлюлозы.

91. Способ по п. 63, относящийся к стадии e), где концентрация PEG в растворе PEG составляет от приблизительно 50% до приблизительно 95% вес/объем.

92. Способ по п. 63, относящийся к стадии e), где концентрация PEG в растворе PEG составляет от приблизительно 90% до приблизительно 100% вес/объем.

93. Способ по п. 90, где концентрация PEG в растворе PEG составляет приблизительно 90% вес/объем.