JP5173406B2 - 生体高分子のクロマトグラフ分離のための複合吸収剤材料の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、芳香族モノマーおよび架橋化合物ならびに、好ましくは、ビニルクロロシランを介して支持体に結合した不飽和エステルまたはエーテルを含むコポリマーコーティングで実質的に変性された固体支持体を有する、生体高分子、特に、核酸の分離および精製のための吸収剤材料に関する。核酸の分離のためのこれらの材料の使用、特に、異なる生物源の溶解物からのＤＮＡの一ステップ単離が本発明の目的であり、加えて、本発明の吸収剤材料で少なくとも部分的に充填されたクロマトグラフカラムまたはカートリッジ、本発明の吸収剤材料を含む膜状装置、ならびにバルクにおいて、またはクロマトグラフ装置およびサンプル調製を行うために必要なその他の装置に充填された状態で本発明の吸収剤材料を含むキットが本発明の目的である。

固定相のための複合吸収剤材料の開発は、広範囲のクロマトグラフ性を伴う物質をもたらした。表面変性されたこれらの材料は、分離方法において広く使用されている。主に、シリカゲル等の親水性支持材料は、異なる長さのアルキル鎖の様な疎水性部分で変性される。

多くの努力が、化学的安定性、用途分野または選択性に関して、クロマトグラフ材料の性質改善のためになされてきた。表面材料の変性は、固定相の性質を穏やかにし、親水性、疎水性またはイオン−イオン相互作用をベースとする分離に影響を及ぼす。

米国特許第４０４５３５３号は、ミクロ細孔無機物質上に吸収された重合性モノマーの照射により調製されたクロマトグラフ材料を記載している。この様にして得られた吸収剤材料は、比較的に小さい分子の分離には適しているが、核酸の様な生体高分子の分離のための選択性は不十分である。

複合フッ素化材料、特に、固体多孔性シリカゲルのベース上に作製された吸収剤材料を得るための努力がなされている。これは、無機マトリックスの多孔性により決定される機械的強度およびフッ素化ポリマー変性化合物の特定の吸着性が同じ材料を組み合わせることである。ＥＰ１１４８９４５号は、多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）の固体支持体および架橋可能なオレフィン系オリゴマーのコーティングを有する材料を開示している。オリゴマー被覆支持体のフッ素化は、ガス状二フッ化キセノン（ＸｅＦ_２）で、場合によって、不活性ガス条件下で、またはフッ素および不活性キャリヤガスの混合物で行われる。この様にして得られた複合材料は、ＤＮＡは別としてＲＮＡ、タンパク質、低分子量物質および塩も存在する複雑な混合物からＤＮＡを単離する際の使用に適している。しかし、これらの材料は専ら疎水性であるために、生体高分子の水溶液と一緒に使用するにはある種の困難があり、そのため圧力を掛けたカラム中でのクロマトグラフィー分離（ＨＰＬＣ）および疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用する操作に対して使用することがはるかに多い。さらに、これらの材料の調製は、幾分複雑で、骨が折れ、環境的に有害である。

Ｎ−ビニルピロリドン、スチレン、エチレン、ビニルエチルエーテルの様なビニルモノマーで変性された、マクロ細孔シリカゲルのベース上に吸収剤材料を調製する別の提案がなされている（著者が認証する、ＵＳＳＲ、Ｎｏ．６８７０８１、１９７９年）。吸収剤材料は、前記モノマーのγ−アミノプロピレート化またはシラン化シリカゲルへの適用およびその後の重合において製造される。これらの吸収剤材料は、良好な機械的安定性を保持し、溶媒において膨潤せず、タンパク質およびその他の活性生体分子の分離のために使用することができる。これらの材料を核酸の分離において使用することに対するヒントは与えられていない。

ＰＣＲ法と関連した遺伝子工学における非常に大きな進歩は、迅速で経済的な方法、例えば、状態を変性することなしに生体高分子の単離能力を用意し、コーティングの表面を変性することにより選択性を改善する、副生成物および不純物の有効な除去を伴うＤＮＡの単離および精製において所望の生成物をもたらす用途に対する必要性の増大につながる。

したがって、本発明の目的は、分離および精製能力において改善された特性、および分離媒体における分離表面の改善された接近面積およびＨＰＬＣの様なクロマトグラフ用途およびＰＣＲ用途のための小型カートリッジにおける固体相抽出を介する迅速サンプル調製に適した材料の構成のためのコーティングの改善された安定性を伴う、主に水性媒体における生体高分子の単離および分離等の生物工学用途に対して進歩した表面を有する生体高分子に関する、吸収剤材料の特定作用における増加した選択性を伴う吸収剤材料を提供することである。

この目的は、少なくとも３つの成分［Ａ］、［Ｂ］、および［Ｍ］（ここで、
［Ａ］は、少なくとも１つの重合可能な不飽和部分を有する、少なくとも１つの芳香族または脂肪族化合物であり、
［Ｂ］は、少なくとも１つの架橋可能な芳香族または脂肪族化合物であり、
「Ｍ」は、Ｃ−Ｃ鎖においてまたは側鎖においてヘテロ原子を有する、［Ａ］とは異なる有機不飽和重合可能な化合物である。）を重合する方法により得ることのできるポリマーであり、前記方法が、
成分［Ａ］、［Ｂ］、および［Ｍ］を順次にまたは非順次に混合するステップ、
得られた混合組成物を重合するステップ、
未反応材料を除去するステップ、ならびに
複合材料を回収および乾燥するステップ、
を含む、前記ポリマーにより解決される。

一実施形態においては、本発明のポリマーは、以下の構造
｛［Ａ］_ｘ−［Ｂ］_ｙ−［Ｍ］_ｚ｝_ｐ
（ここで、［Ａ］、［Ｂ］、および［Ｍ］は、請求項１におけるものと同じ意味を有し、ｘ、ｙおよびｚは、互いに独立に、１〜１００の整数であり、ｐは、２〜５０００の数である。）を含む。

本発明の対象は、また、［Ａ］_ｘ−［Ｂ］_ｙ−［Ｍ］_ｚ構造（ここで、［Ａ］、［Ｂ］、および［Ｍ］は、請求項１におけるものと同じ意味を有し、ｘ、ｙおよびｚは、互いに独立に、１〜１００の整数である。）を有するモノマーである。

本発明のポリマーを本質的に含むクロマトグラフ材料は、また、本発明の対象であり、加えて、本発明のポリマーコーティングにより少なくとも部分的に被覆された支持体を有する複合吸収剤材料も本発明の対象である。

本発明によれば、置換または非置換芳香族ビニルモノマー、置換または非置換芳香族架橋化合物、および場合によって不飽和カルボン酸もしくはエステルまたは不飽和アルコールもしくはエーテルをそれぞれに含むコポリマーコーティングを有する、予め脱水された固体支持体を有する吸収剤材料が提供される。コーティングは、ビニルクロロシランを介して支持体に結合できる。コポリマーコーティングの化合物の置換基は、コーティングの表面上の疎水性／親水性を変性し、選択した用途に対して本質的に改善された選択性を用意する。例えば、親水性を示す官能基は、吸収剤材料の細孔の内部および外部表面の本質的に良好な湿潤性を与える。

好ましくは、本発明の吸収剤材料の支持体は、アルミニウム、チタン、ジルコニウム、ケイ素および／または鉄の酸化物等の無機金属酸化物を含む群から選択される多孔性無機材料である。特に、１００〜２０００Å、好ましくは、３００〜１０００Åの平均細孔径、および２０〜３００ｍ^２／ｇ、さらに好ましくは、２０〜２００ｍ^２／ｇまたは２０〜１００ｍ^２／ｇの比表面積を有するシリカゲルが好ましい。

好ましくは、無機材料を含む支持体は、粒子状または一体膜形状であり、細孔径の二重分散またはオリゴ分散分布を示す多孔性構造を有する。その様な構造は、例えば、本発明による吸収剤材料のためのベースを構築し、本発明による吸着材料は、核酸等の生体高分子の分離、低分子量物質、例えば、５００Ｄａ未満の分子量を有する低分子量物質、塩およびタンパク質の改善された保持をさらに可能にする一方で、核酸を、保持することなしに通過させる。好ましい実施形態においては、核酸、例えば、ＤＮＡの分離は、一ステップにおいて行われる。その様な二重分散支持体は、単一分散コロイドシリカ粒子の２つのサイズタイプの混合物を伴う方法から出発して、シリカゾルのゲル化（ゲル構築）によって優先的に得られてもよい。これら２つのタイプのコロイド粒子の質量割合は、最終のシリカ支持体材料において、別々の寸法に作られる細孔の割合および分布を決定する。

一般に、２つのタイプのシリカゾルは、混合前に予備構造化される。予備構造化は、例えば、温度処理またはその他の方法および水の部分的蒸発により生起する。好ましくは、大細孔径分布および小細孔径分布の平均直径の比は、２〜１５または３〜１５ｎｍ、特に、４〜１０ｎｍの範囲である。好ましくは、大細孔径分布の平均直径は、２５〜５０ｎｍより小さいものであってはならず、２００ｎｍ（２０００Å）、好ましくは、１００ｎｍ（１０００Å）を超えてはならない。大細孔径分布の特に好ましい平均直径は、２０〜１００、さらに好ましくは、２５〜８０ｎｍの範囲である。小細孔対大細孔の質量比は、（９０〜６０、好ましくは、８５〜７０）：（１０〜４０、好ましくは、１５〜３０）（％において）である。

ポリマーコーティングは、約１０〜２５０Å、好ましくは、１０〜１００Åの厚さ、ならびに核酸に関して非吸着性であり、タンパク質に関して吸着性である、水、塩、および低分子量物質に接近可能な５０Å未満のミクロ細孔を有するのが好ましい。

一般式（変性剤として例示的に選択されるジメチルビニルクロロシランを伴う）

によるコポリマーコーティングにより少なくとも部分的に被覆された複合吸収剤材料の調製は、以下の方法により特徴付けられる。

予め乾燥された支持体材料は、それをビニルクロロシランの沸騰溶液で処理することにより変性される。支持体材料の表面の処理は、使用される溶媒の沸騰温度で行われる。この処理は、コポリマーのその後の化学吸着を可能にし、最終の吸収剤材料の高められた化学的安定性および耐久性の基礎をなす。未反応シランの除去のための、シラン化支持体、例えば、シリカゲルの洗浄は、有機溶媒（エタノール、アセトン、トルエン、ジオキサン）による複数抽出により行われる。

この後に、ａ）少なくとも１つの、非置換もしくは置換スチレンまたは一般式

のビニルナフタレン［Ａ］（少なくとも１つの、ヒドロキシル−、カルボキシ−、ニトロ−、クロロ−、ブロモ−、フルオロ−、アルコキシ−、アセトキシ−、アミノ−、モノ−またはジアルキルアミノ−、アセトアミノ−、アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_１５）−基により置換されてもよい）、
ｂ）一般式

の少なくとも１つの架橋可能な非置換または置換（１，４もしくは１，２）−ジビニルベンゼン［Ｂ］（少なくとも１つの、ヒドロキシル−、カルボキシ−、ニトロ−、クロロ−、ブロモ−、フルオロ−、アルコキシ−、アセトキシ−、アミノ−、モノ−またはジアルキルアミノ−、アセトアミノ−、アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_１５）−基により置換されてもよい）、
ｃ）場合によって、一般式

の不飽和カルボン酸またはそのアルキル、アリールもしくはヒドロキシアルキルエステル（Ｍ）、それぞれに、一般式

の不飽和アルコールまたはエーテル、
の添加が続く。

好ましい実施形態においては、［Ａ］、［Ｂ］、および［Ｍ］のコポリマー成分の質量比は、式［Ａ］：［Ｂ］：［Ｍ］＝１：０．０３〜０．３０：０〜０．２に従う。

コポリマー組成物の重合は、有機溶媒の溶液において、溶媒の沸騰温度で２〜８時間、または乳化剤を伴う水溶液（エマルション重合）において、ラジカル重合のための開始剤の存在における重合により行われる。適当な開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、水溶性開始剤としてのカリウムペルオキソジスルフェート、アンモニウムペルスルフェート等が挙げられる。好ましくは、コポリマーの５〜２０％溶液が使用される。シリカゲルマトリックスおよび溶液の１：３〜６の質量比も好ましい。最後に、未反応材料が除去され、複合材料が回収され、乾燥される。

本発明による吸収剤材料は分離方法において有用であり、取扱の容易さおよびこれらの方法の速度を高める。好ましくは、分離される物質は、核酸および／またはタンパク質である。通常使用されるクロマトグラフカラムまたはカートリッジは、少なくとも部分的に、本発明の吸収剤材料で充填することができる。本発明の吸収剤材料は、クロマトグラフカラムまたはカートリッジを充填する方法が、類似の方法において使用できるように、その他の固体クロマトグラフ支持体に似た挙動をする。クロマトグラフ分離を実施するための支持体は、吸収剤材料が、ナイロン膜等のポリマーマトリックスに埋め込まれる、本発明の吸収剤材料を含む膜状物品の形態において提供することもできる。また、生体分子の調製、単離または分離において使用されるその他の膜材料は、本発明の吸収剤材料を埋め込むためのマトリックスとして使用することができる。

本発明のクロマトグラフ材料の使用を容易にするためには、本発明による吸収剤材料を、バルクにおいて、または、充填材料、試薬および／または緩衝液、またはサンプル調製およびクロマトグラフ分離を速く行うためのその他の装置もしくは化学品と一緒の、クロマトグラフカラムもしくはカートリッジまたは膜状装置において用意することが有利である。この製品は、キットまたはチップもしくはマイクロ反応器の形態における小型化装置の形態において特に用意することができる。クロマトグラフ分離は、その規模において制限はない。調製または分析規模において、生体分子、特に核酸の分離、単離、同定、精製および／または検出のための任意のクロマトグラフ操作において使用することができる。

本発明は、進歩した吸着性を伴う製品であって、本発明の目的による生体高分子のクロマトグラフィーのためにこの製品を使用することが可能な製品を提供する。本発明方法は、タンパク質に関して高い結合能力および核酸の最小非特異的吸着を伴う吸収剤材料をもたらし、本発明方法は、補助的官能基を有するコポリマーを使用することにより遂行される。本発明方法は、高い機械的安定性および極めて良好な流体力学特性を有する、適合された親水性を伴う吸収剤材料の製造を可能にする。

本発明は、限定されるものではないことが理解される以下の実施例においてさらに説明される。

真空において、２００℃で３時間予め乾燥した、５００Åの平均細孔直径を有するマクロ細孔シリカゲル１０ｇを、乾燥ベンゼン中ジメチルビニルクロロシランの沸騰５％溶液（３ｘ２５ｍｌ）で、次いで、アセトン（３ｘ２５ｍｌ）で、そして最後に蒸留水（５ｘ２０ｍｌ）で処理し、２０℃で１時間空気乾燥し、さらに真空において１２０℃で２時間乾燥する。この様にして得た疎水性シリカゲルを、０．７ｇの乳化剤（ステアリン酸ナトリウム）を含む水５０ｍｌに懸濁する。その後、２．６ｍｌのスチレン、０．３２ｍｌのジビニルベンゼン、０．３０ｍｌの２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよび重合開始剤として０．０１７ｇのカリウムペルオキソジスルフェートを添加する。重合を、９５℃で４時間行う。液相を、デカントして分離し、吸収剤材料を、洗浄液の屈折率が溶媒（約６０ｍｌ）の屈折率と同じになるまで、ジメチルホルムアミドで洗浄する。さらに洗浄を、３ｘ２５ｍｌのエタノールおよび蒸留水でそれぞれ続ける。最後に、吸収剤材料を、真空において、８０℃で３時間乾燥する。

吸収剤材料を、実施例１と同様にして得たが、吸収剤材料は、成分［Ｍ］（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）なしのポリマー組成物を伴うものである。

１０００Åの平均細孔直径を有するマクロ細孔シリカゲル１０ｇを、実施例１に準じてジメチルビニルクロロシランの３％溶液で処理する。その後、この様にして得たシラン化シリカゲルを、攪拌機、温度計、および還流凝縮器を備えた３つ口バルブに移す。このバルブに、３０ｍｌのベンゼン、２．９ｍｌのビニルフェノール、０．５０ｍｌのジビニルベンゼン、０．１６ｍｌのメタクリル酸、および０．３３ｍｌの過酸化ベンゾイルを入れる。重合を、８０℃で４時間行う。さらなる処理を、実施例１に準じて行う。

吸収剤材料を、実施例３と同様にして得たが、吸収剤材料は、成分［Ｍ］（メタクリル酸）なしのポリマー組成物を伴うものである。

真空において、２００℃で３時間予め乾燥した、３００Åの平均細孔直径を有するマクロ細孔シリカゲル１０ｇを、実施例１に相当するジメチルビニルクロロシランの沸騰溶液で処理する。この様にして得たシラン化シリカを、攪拌機、温度計、および還流凝縮器を伴う３つ口フラスコに移す。このフラスコに、４０ｍｌのトルエン、３ｍｌのクロロビニルベンゼン、０．４ｍｌのジビニルベンゼン、０．４ｍｌのアリルアルコールおよび０．３０ｇの過酸化ベンゾイルを添加する。重合を、１０２℃で６時間行う。さらなる処理を、実施例１に準じて行う。

吸収剤材料を、実施例５と同様にして得たが、吸収剤材料は、成分［Ｍ］（アリルアルコール）なしのポリマー組成物を伴うものである。

タンパク質および低分子量化合物からのＤＮＡの分離のための、実施例１〜６により得られた吸収剤材料の使用の結果は、実施例９における、バクテリアからのゲノムＤＮＡの溶解および単離のための手順および同様に実施例９において与えられる、タンパク質保持率の推定、塩の保持率およびＤＮＡに対する収率の推定のための手順に相当する。

調節された二重分散細孔構造調製を伴う、シリカゲル支持体を有する吸収剤材料の合成は、次の様に行われる。

水における２つの開始タイプのシリカゾルは、次の特徴を有した。

Ａ：粒子直径：６ｎｍ；ＳｉＯ_２濃度：２２質量％；Ｎａ^＋−安定化ｐＨ：９．１
Ｂ：粒子直径：４０ｎｍ；ＳｉＯ_２濃度：４０質量％；Ｎａ^＋−安定化ｐＨ：９．２。

２つのシリカゾルから水を、水浴において、ｐＨ５．０で、８０℃で、定常攪拌により、それぞれ３０および６０質量％まで蒸発させた。蒸発により構造化されたゾルＡの１００ｍｌに、５０ｍｌの構造化されたゾルＢを添加し、均質ゲルの形成まで蒸発を続けた。４時間のシネレシス（ｓｉｎｅｒｅｔｈｉｓ）（部分的収縮）後に得られたシリカヒドロゲルを、初めに、水浴において８０℃で４時間、続いて、乾燥フードにおいて１３０℃で３時間乾燥した。その後、生成物をマッフル炉で、６００℃で５時間処理した。予め得られたシリカゲルを粉砕し、細分化し、水銀空隙率測定法（ＤＩＮ ６６ １３３（１９９３）による）およびＢＥＴ−法（ＩＳＯ ９２７７による）で両方の細孔径分布を分析した。これらの分析は、５ｎｍ（約８５％）および２８ｎｍ（約１５％）の２つのクラスにおける優先的細孔径および０．７ｃｍ^３／ｇの吸着容量を示した。

水における２つの開始タイプのシリカゾルは、次の特徴を有した。

Ａ：粒子直径：１０ｎｍ；ＳｉＯ_２濃度：３０質量％；Ｎａ^＋−安定化ｐＨ：９．２
Ｂ：粒子直径：８０ｎｍ；ＳｉＯ_２濃度：５０質量％；Ｎａ^＋−安定化ｐＨ：９．１。

シリカゲル吸収剤材料を、以下の変更を伴って、実施例７と同様に調製した。

２つのシリカゾルから水を、水浴において、ｐＨ４．５で、８０℃で、定常攪拌により、それぞれ５２および６０質量％まで蒸発させた。蒸発により構造化されたゾルＡの１００ｍｌに、１３０ｍｌの構造化されたゾルＢを添加した。分析は、７ｎｍ（約７５％）および６０ｎｍ（約２５％）の２つのクラスにおける優先的細孔径および０．７５ｃｍ^３／ｇの吸着容量を示した。

タンパク質および低分子量化合物からのＤＮＡの分離のための、実施例１〜６により得られた吸収剤材料の使用の結果は、実施例９における、バクテリアからのゲノムＤＮＡの溶解および単離のための手順および同様に実施例９において与えられる、タンパク質保持率の推定、塩の保持率およびＤＮＡに対する収率の推定のための手順に相当する。

吸収剤材料のテスト
水銀空隙率測定法
マクロ細孔シリカゲルをベースとした吸収剤材料をテストすることにより得られるポログラムは、微分および積分法における細孔分布を示し、吸収剤材料の平均細孔径に加えてポリマー層の有効厚さ（５〜７．５ｎｍ）を決定することを可能にする。

本発明の吸収剤材料を含むキットにおける、組織溶解および組織サンプルからゲノムＤＮＡの分離のための手順
キットは、細胞または組織の溶解およびゲノムＤＮＡ精製のために全て必要な試薬を含む。得られるＤＮＡは、殆どの酵素反応（制限消化、ＰＣＲ、解読等）に適している。

殆どのその他の手順と比較した場合、ＤＮＡは、カラム樹脂により保持されないが、タンパク質、洗剤および低分子量化合物は保持される。ＤＮＡは、短い、一ステップ精製手順の間にカラムを貫流する。

貯蔵条件：
全てのキット成分は、輸送の間、室温で安定である。到着後は、キットを、＋２℃〜＋８℃で貯蔵する。カラムは、室温で貯蔵されてもよい。

材料：
緩衝液Ｇ１ １０バイアル（青）、各５単離に対して
緩衝液Ｇ２ １０バイアル（青）、各５単離に対して
Ｎｅｘｔｔｅｃ透明カラム ５０カラム

用意しなかった材料：
エッペンドルフ管（１．５ｍｌ）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ、ｐＨ８

緩衝液の調製
１．使用直前に、１．６ｍｌの脱イオン水を、凍結乾燥された緩衝液Ｇ１を伴う管に添加する。管を渦巻き状に回転して構成成分を溶解する。
２．管の底部で成分を収集するために、緩衝液Ｇ２を含む管を短時間遠心分離に掛ける。
３．緩衝液Ｇ１の溶液を、緩衝液Ｇ２の１アリコート（管）に完全に移す。
４．緩衝液を混合して均質溶液を得る。
５．混合物は、組織または細胞溶解に必要な全ての成分を含み、直ぐ使える状態にある。混合物は、５単離に対して十分である。（混合物は、直ぐに使用されるべきである。したがって、分析されるサンプルの数に対して必要とされる量の緩衝液だけを調製する。）

細胞または組織溶解
１．細胞または組織サンプルを、エッペンドルフ管（＜１５ｍｇの初期重量）に移す。
２．３００μｌの溶解緩衝液混合物（緩衝液の調製を参照されたい）を、各細胞または組織サンプルに添加する。
３．サンプルを、エッペンドルフ熱混合機において、〜８００ｒｐｍで定常振盪しながら、６０℃で一晩中培養する。（新鮮な組織が使用される場合は、完全溶解のためには、短い培養期間で十分である。）
４．２０，０００×ｇで３分間の遠心分離により溶解物を透明にする。
５．ＤＮＡ精製のために、透明な上澄み液から１２０μｌを採取する。残りの溶解物は、−２０℃で貯蔵することができる。

ＤＮＡの精製
６．回転カラムを開け、３００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を、各カラム上に添加する。（緩衝液は、樹脂に入る。）
７．カラムを、３５０×ｇ（小型遠心機の２４−位置エッペンドルフローターにおける約２，０００ｒｐｍに相当する）で１分間の遠心分離に掛け、過剰の緩衝液を除去する。
８．緩衝液で収集管を廃棄し、カラムを、新しいエッペンドルフ管中に入れ、カラムを開く。
９．ステップ４からの１２０μｌの透明な上澄み液をカラム上に移し、蓋を閉める。（溶解物は、樹脂層に入る。）
１０．カラムを室温で３分間培養する。
１１．カラムを伴う管を、７００×ｇ（小型遠心機の２４−位置エッペンドルフローターにおける約３，０００ｒｐｍに相当する）で１分間回転する。
１２．貫流は、精製されたＤＮＡを含む。カラムを廃棄し、ＤＮＡを直ぐに使用するか、ＤＮＡを−２０℃で貯蔵する。

本発明のキットを使用する、バクテリアからのゲノムＤＮＡの溶解および単離のための手順
キットは、バクテリア細胞の溶解およびＤＮＡ精製に全て必要な試薬を含む。それは、多数のグラム（−）およびグラム（＋）バクテリアに対して承認される。得られるＤＮＡは、殆どの酵素反応（制限消化、ＰＣＲ、解読等）に適している。

殆どのその他の手順と比較した場合、ＤＮＡは、カラム樹脂により保持されないが、タンパク質、洗剤および低分子量化合物は保持される。ＤＮＡは、短い、一ステップ精製手順の間にカラムを貫流する。

貯蔵条件：
全てのキット成分は、輸送の間、室温で安定である。到着後は、ＲＮａｓｅ溶液を、−２０℃で貯蔵する。その他のキット成分は、＋２℃〜＋８℃で貯蔵されなければならない。Ｎｅｘｔｔｅｃ透明カラムは、室温で貯蔵されてもよい。

用意した材料：
緩衝液Ｂ１（基準緩衝液） ５バイアル（白）、各１０単離に対して
緩衝液Ｂ２ ５バイアル（白）、各１０単離に対して
緩衝液Ｂ３ ５バイアル（白）、各１０単離に対して
Ｎｅｘｔｔｅｃ透明カラム ５０カラム
ＲＮａｓｅ溶液 １バイアル（白）、５０単離に対して

用意しなかった材料：
リゾチーム
エッペンドルフ管（１．５ｍｌ）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ、ｐＨ８

緩衝液の調製
６．純水における２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製する（例えば、Ｓｉｇｍａ社のＫａｔ．−Ｎｒ．Ｌ−６８７６または類似物の凍結乾燥リゾチームを使用）。溶解したリゾチームは、−２０℃で凍結貯蔵しなければならない。
７．緩衝液Ｂ１（基準緩衝液）を伴う各バイアルは、１０個のＤＮＡ調製に対して十分である。使用直前に、１１０μｌのリゾチーム貯蔵溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）および２２０μｌのＲＮａｓｅ溶液を添加して緩衝液を完成する。管を渦巻き状に混合する。
８．管の底部で成分を収集するために、緩衝液Ｂ２を含むバイアルを短時間遠心分離に掛け、次いで、５５０μｌの脱イオン水を添加し、渦巻きに掛ける。調製した緩衝液Ｂ２は、＋４℃で２日間貯蔵することができる。
９．５５０μｌの脱イオン水を、緩衝液Ｂ３を伴う１つのバイアルに添加し、渦巻き状に構成成分を溶解する。再懸濁緩衝液は直ちに使用しなければならない。

バクテリア細胞の溶解：
１．適当な媒体（例えば、ＬＢ、ＣＳＢ）において、バクテリアの一夜培養液を培養する。
２．０．５ｍｌの培養液を、１．５ｍｌのエッペンドルフ管に移す（１．５ ＯＤ_６００）。
３．細胞を、６，０００×ｇで１分間遠心分離に掛けてペレットにし、除去して、上澄み液を廃棄する。
４．１２０μｌの緩衝液Ｂ１（リゾチームおよびＲＮａｓｅ溶液を含む）をバクテリア細胞ペレットに添加する。
５．管を徐々に渦巻き状に細胞を再懸濁する。
６．管を、定常振盪しながら（１，２００ｒｐｍ、エッペンドルフ熱混合機）、６０℃で１０分間培養する。
７．５０μｌの緩衝液Ｂ２を添加し、６０℃で５分間培養する（１，２００ｒｐｍ、エッペンドルフ熱混合機）。
８．次いで、５０μｌの緩衝液Ｂ３を添加し、熱混合機において、（ステップ７において記載した様に）６０℃で２５分間の培養を続ける。
９．殆どの場合、溶解物は、培養後は透明でなければならない。透明でなければ、細胞片をペレットにするために、管を、２０，０００×ｇで３分間遠心分離に掛ける。

ＤＮＡの精製
１０．回転カラムを開け、３００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を、カラム上に添加する。（緩衝液は、樹脂に入る。）
１１．カラムを、３５０×ｇ（小型遠心機の２４−位置エッペンドルフローターにおける約２，０００ｒｐｍに相当する）で１分間の遠心分離に掛け、過剰の緩衝液を除去する。
１２．緩衝液を伴う収集管を廃棄し、カラムを、新しいエッペンドルフ管中に入れ、カラムを開く。
１３．ステップ９からの１２０μｌの透明な溶解物をカラム上に移し、蓋を閉める。（溶解物は、吸収剤層に入る。）
１４．カラムを室温で３分間培養する。
１５．カラムを伴う管を、７００×ｇ（小型遠心機の２４−位置エッペンドルフローターにおける約３，０００ｒｐｍに相当する）で１分間遠心分離に掛ける。
１６．貫流は、精製されたＤＮＡを含む。カラムを廃棄し、ＤＮＡを直ぐに使用するか、ＤＮＡを−２０℃で貯蔵する。

タンパク質保持率は、モデルタンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して測定した。ＢＳＡを緩衝液に溶解し、２８０ｎｍの波長で、得られた溶液の光学密度を、異なる吸収剤材料を含むカラムを通す前および後で測定した。次いで、両方の溶液におけるＢＳＡの濃度を、緩衝液における異なるＢＳＡ濃度の標準曲線から得られる直線回帰を使用して計算した。ＢＳＡの適用量を１００％に設定し、ＢＳＡの溶出量を、適用量の％において再計算した。両方の値の差が、％におけるタンパク質保持率を与える。

塩保持率は、モデル塩として硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）を使用して測定した。水におけるこの塩の溶液は、青色液体をもたらす。溶液の光学密度は、ＣｕＳＯ_４の濃度に直線的に依存する。ＣｕＳＯ_４を水に溶解し（ｃ＝１Ｍ）、６５０ｎｍの波長で、得られた溶液の光学密度を、異なる吸収剤材料を含むカラムに通す前および後で測定した。次いで、両方の溶液におけるＣｕＳＯ_４の濃度を、水における異なるＣｕＳＯ_４濃度の標準曲線から得られる直線回帰を使用して計算した。ＣｕＳＯ_４の適用量を１００％に設定し、ＣｕＳＯ_４の溶出量を、適用量の％において再計算した。両方の値の差が、％における塩保持率を与える。

相当するクロマトグラフ材料で充填されたカラムの、通過中の吸収剤材料に対するＤＮＡ回収率を決定するために、大腸菌細胞から粗溶解物を得た。溶解物は、低分子量化合物、タンパク質（ペプチド）、核酸およびその他の化合物を含む。

吸収剤材料を含むカラムを通過する前（粗溶解物）および後（溶出物）におけるＤＮＡの濃度を、製造業者の指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｃ／ｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ピコグリーン、即ち、二重鎖ＤＮＡにのみ結合する蛍光染料を使用して測定した。標準曲線の調製のために、知られている濃度を伴うバクテリオファージλからのＤＮＡの連続希釈法を使用した。溶解物内におけるＤＮＡの適用量を１００％に設定し、ＤＮＡの溶出量を、適用量の％において再計算した。得られた値が、％におけるＤＮＡ回収率を与える。

Claims (23)

1. 一般式
   

   

   を有する、ポリマーコーティングにより少なくとも部分的に被覆された支持体を有する、クロマトグラフ材料であって、
   ａ） Ａは、下記一般式の非置換もしくは置換スチレンまたはビニルナフタレンであり、
   

   

   ｂ） Ｂは、下記一般式の架橋可能な非置換または置換（１，４もしくは１，２）−ジビニルベンゼンであり、
   

   

   ｃ） Ｍは、下記一般式の不飽和カルボン酸またはそのアルキル、アリールもしくはヒドロキシアルキルエステル、
   

   

   あるいは、下記一般式の不飽和アルコールまたはエーテルであり、
   

   

   ｘ、ｙおよびｚは、互いに独立に、１から１００の整数である、クロマトグラフ材料。
2. 一般式
   

   

   （ｘ、ｙおよびｚは、互いに独立に、１から１００の整数である）
   を有する、ポリマーコーティングにより少なくとも部分的に被覆された支持体を有する、クロマトグラフ材料であって、
   前記支持体をビニルクロロシランで変性するステップ、
   続いて、
   ａ）少なくとも１つの、下記一般式の非置換もしくは置換スチレンまたはビニルナフタレン［Ａ］と、
   

   

   ｂ）少なくとも１つの、下記一般式の架橋可能な非置換または置換（１，４もしくは１，２）−ジビニルベンゼン［Ｂ］と、
   

   

   ｃ）下記一般式の不飽和カルボン酸またはそのアルキル、アリールもしくはヒドロキシアルキルエステル［Ｍ］、
   

   

   あるいは下記一般式の不飽和アルコールまたはエーテル［Ｍ］
   

   

   を添加するステップ、
   コポリマー組成物を重合するステップ、
   未反応材料を除去するステップ、および
   クロマトグラフ材料を回収および乾燥するステップ
   を含む方法により得られる、クロマトグラフ材料。
3. 支持体が、無機金属酸化物、多孔質ガラス（ＣＰＧ）、珪藻土およびこれらの組合せを含む群から選択される多孔性無機材料である、請求項１または２に記載のクロマトグラフ材料。
4. 無機金属酸化物が、アルミニウム酸化物、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、ケイ素酸化物および鉄酸化物から成る群から選択される、請求項３に記載のクロマトグラフ材料。
5. 無機金属酸化物が多孔性であり、小細孔径２〜１５ｎｍおよび大細孔径２０〜１００ｎｍの範囲の平均細孔径を伴う、細孔径の二重分散分布を示す、請求項３または４に記載のクロマトグラフ材料。
6. 支持体が、１００〜２０００Åの平均細孔径および２０〜３００ｍ^２／ｇの比表面積を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料。
7. 支持体が、３００〜１０００Åの平均細孔径および２０〜１００ｍ ^２ ／ｇの比表面積を有する、請求項６に記載のクロマトグラフ材料。
8. ポリマーコーティングが、１０から２５０オングストロームの厚さならびに水、塩、および低分子量物質に接近可能な５０オングストローム未満のミクロ細孔を有し、前記ポリマーコーティングが、核酸に関して非吸着性であり、タンパク質に関して吸着性である、請求項１から７のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料。
9. ポリマーコーティングが、１０から１００オングストロームの厚さを有する、請求項８に記載のクロマトグラフ材料。
10. コポリマー成分［Ａ］、［Ｂ］、および［Ｍ］の質量比が、式［Ａ］：［Ｂ］：［Ｍ］＝１：０．０３〜０．３０：０．０１〜０．２である、請求項１から９のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料が少なくとも部分的に充填された、クロマトグラフカラム。
12. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料が少なくとも部分的に充填された、クロマトグラフキャピラリー。
13. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料が少なくとも部分的に充填された、クロマトグラフカートリッジ。
14. クロマトグラフ材料が、多孔性有機または無機マトリックスに埋め込まれている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料を含む膜状物品。
15. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料を、バルクであるか、または請求項１１に記載のクロマトグラフカラムもしくは請求項１３に記載のカートリッジまたは請求項１４に記載の膜状物品に充填して含み、所望により、充填材料、試薬および／または緩衝液、またはその他の装置もしくは化学品を組み合わせて含む、サンプル調製もしくは生体高分子のクロマトグラフ分離を行うためのキット。
16. 核酸の精製および／または単離のための方法における、請求項１から１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフ材料の使用。
17. サンプル調製または核酸のクロマトグラフ分離を迅速に行うための、請求項１６に記載の使用。
18. 核酸は、保持されることなく材料を通過するが、タンパク質、塩およびその他の低分子量物質は保持される、核酸および／またはタンパク質の分離のための、請求項１６または１７に記載の使用。
19. ＤＮＡを１ステップで分離するための、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の使用。
20. 一般式
    

    

    （ｘ、ｙおよびｚは、互いに独立に、１から１００の整数である）
    の、生体高分子の分離のためのクロマトグラフ材料の製造方法であって、
    支持体を、ビニルクロロシランで変性するステップ、
    続いて、
    ａ）少なくとも１つの、下記一般式の非置換もしくは置換スチレンまたはビニルナフタレン［Ａ］、
    

    

    ｂ）少なくとも１つの、下記一般式の架橋可能な非置換または置換（１，４もしくは１，２）−ジビニルベンゼン［Ｂ］、
    

    

    ｃ）下記一般式の不飽和カルボン酸またはそのアルキル、アリールもしくはヒドロキシアルキルエステル［Ｍ］、
    

    

    あるいは下記一般式の不飽和アルコールまたはエーテル［Ｍ］
    

    

    を添加するステップ、
    コポリマー組成物を重合するステップ、
    未反応材料を除去するステップ、および
    クロマトグラフ材料を回収および乾燥するステップ
    を含む、方法。
21. コポリマー成分［Ａ］、［Ｂ］、および［Ｍ］の質量比が、［Ａ］：［Ｂ］：［Ｍ］＝１：０．０３〜０．３０：０．０１〜０．２に従う、請求項２０に記載の方法。
22. コポリマー組成物を重合するステップが、乳化剤および重合開始剤を用いて、有機溶媒における重合または水におけるエマルジョン重合により行われることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
23. 水または有機溶媒とコポリマーとの質量比が、５／１〜２０／１である、請求項２２に記載の方法。