JP4637533B2 - 固相抽出用分離剤 - Google Patents
固相抽出用分離剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4637533B2 JP4637533B2 JP2004252612A JP2004252612A JP4637533B2 JP 4637533 B2 JP4637533 B2 JP 4637533B2 JP 2004252612 A JP2004252612 A JP 2004252612A JP 2004252612 A JP2004252612 A JP 2004252612A JP 4637533 B2 JP4637533 B2 JP 4637533B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solid phase
- phase extraction
- hydrophobic
- separation agent
- meth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3289—Coatings involving more than one layer of same or different nature
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
- B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/58—Use in a single column
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/62—In a cartridge
Description
本発明は、固相抽出用分離剤、それを用いた固相抽出用カラム又はカートリッジ、それを用いた分離目的物の濃縮方法、夾雑物の除去方法、環境、医薬又は生体関連試料の固相抽出方法、蛋白成分含有試料の前処理方法に関する。
固相抽出法とは、液体と固体とが関与する物理的な抽出過程のことである。固相抽出法においては、例えば分離したい物質に対する固相の親和力が、分離したい物質を溶かした溶媒に対する親和力よりも大きい場合、試料溶液が固相床を通過するとき、分離目的物質は固相表面に濃縮されるが、その他の溶液の成分は通過し、目的物質の分離を可能とする。また、これとは逆に分離目的物質を通過させ、その他の溶液の成分を固相床に抽出する方法もある。固相抽出に用いられる分離剤としては、無機系基材としては、シリカゲル又はシリカゲルの表面を化学修飾した化学結合型シリカゲル、有機系基材としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体に代表される合成高分子系及びこれらの表面を化学修飾したものが挙げられる。
一般にクロマトグラフィーに用いる合成高分子系基材は、表面に多数の浅い細孔を有し、規則的な形状、好ましくは球形の多数の不連続粒子から構成されている。
合成高分子系基材の製造法については、操作が簡単であり再現性も優れている懸濁重合法が多い。通常は得られた高分子粒子を分級作業によってクロマトグラフィー用充填剤として適当な粒子径をもつ部分のみを分けて使用している（特許文献１〜１０，非特許文献１）。
合成高分子系基材の製造法については、操作が簡単であり再現性も優れている懸濁重合法が多い。通常は得られた高分子粒子を分級作業によってクロマトグラフィー用充填剤として適当な粒子径をもつ部分のみを分けて使用している（特許文献１〜１０，非特許文献１）。
上記の合成高分子系基材として挙げられているスチレン−ジビニルベンゼン共重合体は疎水性が強いため水溶液を処理する際の作業性が悪くなるという問題点がある。また、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体は溶媒によって収縮したり膨潤したりするため、溶媒を多数替えなくてはならないような複雑な抽出が要求される。そのため親水性と疎水性を併せ持つ基材が求められている。
市販されている合成高分子系基材の多くは、基材そのものが高分子粒子である。再現性のあるクロマトグラフィーを得るには、規則的な表面を有する粒子であることが理想的である。
合成高分子系基材の分離剤は、懸濁重合法によって製造されることが一般的であるが、この方法で得られた粒子の粒子径分布は極めて広い。このためクロマトグラフィー用の分離剤として得られる粒子の収率は低く、高コストになりやすい。したがって高分子基材の性能を保持し低コストで製造することが望まれる。
従って本発明の目的は、親水性と疎水性を併せ持つとともに、粒子の粒子径分布が狭く、高収率、低コストで製造可能な固相抽出用分離剤を提供することである。
本発明の他の目的は、上記固相抽出用分離剤を充填してなるカラム又はカートリッジを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする分離目的物の濃縮方法、夾雑物の除去方法、環境、医薬又は生体関連試料の固相抽出方法、蛋白成分含有試料の前処理方法を提供することである。
市販されている合成高分子系基材の多くは、基材そのものが高分子粒子である。再現性のあるクロマトグラフィーを得るには、規則的な表面を有する粒子であることが理想的である。
合成高分子系基材の分離剤は、懸濁重合法によって製造されることが一般的であるが、この方法で得られた粒子の粒子径分布は極めて広い。このためクロマトグラフィー用の分離剤として得られる粒子の収率は低く、高コストになりやすい。したがって高分子基材の性能を保持し低コストで製造することが望まれる。
従って本発明の目的は、親水性と疎水性を併せ持つとともに、粒子の粒子径分布が狭く、高収率、低コストで製造可能な固相抽出用分離剤を提供することである。
本発明の他の目的は、上記固相抽出用分離剤を充填してなるカラム又はカートリッジを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする分離目的物の濃縮方法、夾雑物の除去方法、環境、医薬又は生体関連試料の固相抽出方法、蛋白成分含有試料の前処理方法を提供することである。
本発明は以下に示す固相抽出用分離剤、これを充填してなるカラム又はカートリッジ、これを使用した方法を提供するものである。
１．基材コア粒子、該粒子の表面に形成された親水性高分子層、及び該親水性高分子層の表面に形成された疎水性高分子層を有する固相抽出用分離剤。
２．親水性高分子が、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース及びエチルセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１種である上記１記載の固相抽出用分離剤。
３．疎水性高分子が、疎水性架橋性単量体（Ａ）の重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）の共重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体、又は疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体を含む上記１又は２記載の固相抽出用分離剤。
４．疎水性架橋性単量体（Ａ）が、ジ（メタ）アクリル酸エステル、多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステル及び２個以上のビニル基を有する芳香族系化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記３記載の固相抽出用分離剤。
５．疎水性非架橋性単量体（Ｂ）が、（メタ）アクリル酸エステル、カルボン酸ビニル及びスチレン系単量体からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記３又は４記載の固相抽出用分離剤。
６．親水性単量体（Ｃ）が、水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド、及びＮ−ビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも１種である上記３〜５のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
７．疎水性架橋性単量体（Ａ）が、ジビニルベンゼンである上記３〜６のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
１．基材コア粒子、該粒子の表面に形成された親水性高分子層、及び該親水性高分子層の表面に形成された疎水性高分子層を有する固相抽出用分離剤。
２．親水性高分子が、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース及びエチルセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１種である上記１記載の固相抽出用分離剤。
３．疎水性高分子が、疎水性架橋性単量体（Ａ）の重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）の共重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体、又は疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体を含む上記１又は２記載の固相抽出用分離剤。
４．疎水性架橋性単量体（Ａ）が、ジ（メタ）アクリル酸エステル、多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステル及び２個以上のビニル基を有する芳香族系化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記３記載の固相抽出用分離剤。
５．疎水性非架橋性単量体（Ｂ）が、（メタ）アクリル酸エステル、カルボン酸ビニル及びスチレン系単量体からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記３又は４記載の固相抽出用分離剤。
６．親水性単量体（Ｃ）が、水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド、及びＮ−ビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも１種である上記３〜５のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
７．疎水性架橋性単量体（Ａ）が、ジビニルベンゼンである上記３〜６のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
８．疎水性非架橋性単量体（Ｂ）が、スチレンである上記３〜６のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
９．基材コア粒子及び親水性高分子層の総量１００質量部に対する、疎水性高分子層の総量が、５〜５００質量部である上記１〜８のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
１０．基材コア粒子が、シリカゲル、セルロース、アガロース、セラミック、カーボン及び合成高分子粒子からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記１〜９のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
１１．平均粒子径が１〜２００μｍである上記１〜１０のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
１２．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を充填してなるカラム又はカートリッジ。
１３．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする分離目的物の濃縮方法。
１４．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする夾雑物の除去方法。
１５．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする環境、医薬又は生体関連試料の固相抽出方法。
１６．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする蛋白成分含有試料の前処理方法。
９．基材コア粒子及び親水性高分子層の総量１００質量部に対する、疎水性高分子層の総量が、５〜５００質量部である上記１〜８のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
１０．基材コア粒子が、シリカゲル、セルロース、アガロース、セラミック、カーボン及び合成高分子粒子からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記１〜９のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
１１．平均粒子径が１〜２００μｍである上記１〜１０のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
１２．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を充填してなるカラム又はカートリッジ。
１３．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする分離目的物の濃縮方法。
１４．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする夾雑物の除去方法。
１５．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする環境、医薬又は生体関連試料の固相抽出方法。
１６．上記１〜１１のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする蛋白成分含有試料の前処理方法。
本発明の基材コア粒子、該粒子の表面に形成された親水性高分子層、及び該親水性高分子層の表面に形成された疎水性高分子層を有する固相抽出用分離剤は、親水性と疎水性の性能を併せ持っている。このため、水溶液を処理する際の作業性が優れており、溶媒による収縮や膨潤も少ない。また、基材コア粒子の表面に親水性高分子層及び疎水性高分子層を形成しているため、粒子径分布を制御し易くなり、収率も向上し、低コストで製造することができる。
本発明の基材コア粒子としては、シリカゲル、セルロース、アガロース、セラミック、カーボン、合成高分子等の粒子が挙げられる。基材コア粒子の粒子径は、好ましくは１〜２００μｍ、さらに好ましくは３０〜８０μｍである。
本発明に使用する親水性高分子としては、ヒドロキシル基等の親水性基を有する分子量１０００〜２００００００の高分子が挙げられる。具体的にはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ヘキサジメチリンブロマイド（ポリブレン）等が挙げられる。
本発明に使用する親水性高分子としては、ヒドロキシル基等の親水性基を有する分子量１０００〜２００００００の高分子が挙げられる。具体的にはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ヘキサジメチリンブロマイド（ポリブレン）等が挙げられる。
本発明において、基材コア粒子の表面に対する親水性高分子の結合は、実質的に基材コア粒子の細孔中には親水性高分子が結合しておらず、基材コア粒子の外表面に親水性高分子が物理的又は化学的に結合していることを意味する。
本発明において、親水性高分子は、その官能基の一部又は全部が化学修飾されていてもよい。化学修飾とは例えば、ジオール化、還元化又はグルタール化である。ジオール化とは、メタクリロキシ環の環状部位を希硫酸等で酸処理することにより２つのヒドロキシル基を生成させる反応等を意味する。
本発明において、基材コア粒子１００質量部に対する親水性高分子の被覆量は、好ましくは０．０１〜１０００質量部、さらに好ましくは０．１〜１０質量部である。
本発明において、親水性高分子は、その官能基の一部又は全部が化学修飾されていてもよい。化学修飾とは例えば、ジオール化、還元化又はグルタール化である。ジオール化とは、メタクリロキシ環の環状部位を希硫酸等で酸処理することにより２つのヒドロキシル基を生成させる反応等を意味する。
本発明において、基材コア粒子１００質量部に対する親水性高分子の被覆量は、好ましくは０．０１〜１０００質量部、さらに好ましくは０．１〜１０質量部である。
疎水性高分子層を形成する材料としては、疎水性架橋性単量体（Ａ）の重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）の共重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体、又は疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体を含む材料が挙げられる。
疎水性架橋性単量体（Ａ）としては、例えばエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートのようなジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレートなどの多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレンなど２個以上のビニル基を有する芳香族系化合物などが用いられる。
疎水性架橋性単量体（Ａ）としては、ジビニルベンゼンが入手しやすく好ましい。疎水性架橋性単量体（Ａ）は、疎水性を考慮すると単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量に対し、仕込量で、好ましくは２０〜９５質量％、共重合体の膨潤と収縮を考慮するとさらに好ましくは４０質量％以上含有した方がよい。また、ジビニルベンゼンは、純度８０％以上のものを使用することが好ましい。
疎水性架橋性単量体（Ａ）としては、ジビニルベンゼンが入手しやすく好ましい。疎水性架橋性単量体（Ａ）は、疎水性を考慮すると単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量に対し、仕込量で、好ましくは２０〜９５質量％、共重合体の膨潤と収縮を考慮するとさらに好ましくは４０質量％以上含有した方がよい。また、ジビニルベンゼンは、純度８０％以上のものを使用することが好ましい。
疎水性非架橋性単量体（Ｂ）としては、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレートのような（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルのようなカルボン酸ビニル；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、ブトキシスチレンのようなスチレン系単量体などが用いられる。
疎水性非架橋性単量体（Ｂ）としては、スチレンが入手しやすく好ましい。疎水性非架橋性単量体（Ｂ）は、単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量に対し、仕込量で、好ましくは５〜８０質量％、共重合体の膨潤と収縮を考慮すると５〜６０質量％使用することがさらに好ましい。
疎水性非架橋性単量体（Ｂ）としては、スチレンが入手しやすく好ましい。疎水性非架橋性単量体（Ｂ）は、単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量に対し、仕込量で、好ましくは５〜８０質量％、共重合体の膨潤と収縮を考慮すると５〜６０質量％使用することがさらに好ましい。
親水性単量体（Ｃ）としては、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸類；（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール、（メタ）アクリル酸２，３−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸グリコシルエチル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル等のヒドロキシル基、アミノ基、エーテル基等を有する（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類；メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等のビニルエーテル類、アリルアルコール類、Ｎ−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルイミダゾール等のＮ−ビニルヘテロ環類、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカプロラクタム等のＮ−ビニルラクタム類が挙げられる。中でも（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸グリコシルエチル、アリルアルコール等の水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステル類および（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカプロラクタム類等の親水性の高いものが好ましく、水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステル類および（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン等がさらに好ましい。
親水性単量体（Ｃ）は、単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量に対し、仕込量で、好ましくは５〜８０質量％、共重合体の膨潤と収縮を考えると５〜６０質量％がさらに好ましい。
親水性単量体（Ｃ）は、単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量に対し、仕込量で、好ましくは５〜８０質量％、共重合体の膨潤と収縮を考えると５〜６０質量％がさらに好ましい。
本発明において、親水性高分子を被覆した基材コア粒子１００質量部に対する疎水性高分子層の量は、好ましくは５〜５００質量部、さらに好ましくは３０〜２００質量部である。
本発明の固相抽出用分離剤は多孔質であり、その多孔質を付与する目的で疎水性高分子層を形成する単量体混合物に希釈溶媒を添加して重合される。
用いる希釈溶媒としては、単量体混合物に溶解するが重合反応には不活性で、さらに生成した重合体を溶解しない性質の有機溶媒が使用される。具体的には、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、ジエチルベンゼンのような芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカンのような飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール、２−エチルヘキシルアルコールのようなアルコール類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタンのような脂肪族ハロゲン化水素類；酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチルのような脂肪族あるいは芳香族エステル類などが挙げられる。これらの溶媒は、単独又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。
これらの希釈溶媒の添加量は疎水性高分子層を形成する単量体の総量１００質量部に対して好ましくは０．５〜５００質量部、さらに好ましくは１〜３００質量部である。
本発明の固相抽出用分離剤は多孔質であり、その多孔質を付与する目的で疎水性高分子層を形成する単量体混合物に希釈溶媒を添加して重合される。
用いる希釈溶媒としては、単量体混合物に溶解するが重合反応には不活性で、さらに生成した重合体を溶解しない性質の有機溶媒が使用される。具体的には、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、ジエチルベンゼンのような芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカンのような飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール、２−エチルヘキシルアルコールのようなアルコール類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタンのような脂肪族ハロゲン化水素類；酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチルのような脂肪族あるいは芳香族エステル類などが挙げられる。これらの溶媒は、単独又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。
これらの希釈溶媒の添加量は疎水性高分子層を形成する単量体の総量１００質量部に対して好ましくは０．５〜５００質量部、さらに好ましくは１〜３００質量部である。
本発明において、親水性高分子を被覆した基材コア粒子表面に疎水性高分子層を形成するには、親水性高分子を被覆した基材コア粒子の存在下、単量体（Ａ）、単量体（Ａ）と単量体（Ｂ）の混合物、単量体（Ａ）と単量体（Ｃ）の混合物、又は単量体（Ａ）と単量体（Ｂ）と単量体（Ｃ）の混合物を重合し、被覆すればよい。重合は、適当な分散剤を含んだ水性媒体中で懸濁重合により行うのが好ましい。この場合用いられる重合開始剤は、ラジカルを発生する公知のラジカル重合開始剤であれば特に限定されない。一例を挙げれば、過酸化ベンゾイル、過酸化ジクロロベンゾイル、過酸化ジクミル、過酸化ジ−第３ブチル及び過安息香酸第３ブチル、メチルエチルケトンペルオキシド、メチルシクロヘキサノンペルオキシド等の有機過酸化物系開始剤、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）のようなアゾ系開始剤をあげることができる。
重合開始剤は単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量１００質量部に対して０．００１〜５質量部使用することが好ましい。
重合開始剤は単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の総量１００質量部に対して０．００１〜５質量部使用することが好ましい。
重合反応は適当な分散剤を含んだ水相と単量体、希釈溶媒、開始剤等を含む有機相を撹拌することにより行われる。分散剤としては、公知のものを使用することことができる。例えば、ゼラチン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性高分子化合物が用いられる。用いる分散剤の濃度は、水性媒体に対して０．００１〜５質量％が好ましい。水性媒体は水を主体とする媒体であり、水のほかに塩類その他の水溶性成分が溶解していてもよい。
本発明における重合反応は適当な乳化剤を添加し行われるが、乳化剤としては、公知のものを使用することができる。例えば、ドデシルベンゼン硫酸塩、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルプロペニルフェニルエーテル硫酸塩、ナフタレンスルホン酸のホルマリン縮合物などのアニオン系界面活性剤を例示することができる。ここで、塩としてはナトリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。さらに、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンアルキルプロペニルフェニルエーテル、ソルビタンモノステアレートなどのノニオン系界面活性剤を使用することも可能である。
本発明において、親水性高分子を被覆した基材コア粒子表面に疎水性高分子層を形成するには、窒素雰囲気下、１５〜３５℃、例えば、室温において、疎水性高分子層形成用の単量体、有機溶媒、開始剤などを含む有機相と水性媒体分散相を含む液をホモジナイザーなどで３００〜１００００ｒｐｍで撹拌し、懸濁重合させればよい。エマルジョンが形成されていることを確認後、５〜２００ｒｐｍに撹拌を落とし、親水性高分子を被覆した基材コア粒子を添加し、窒素雰囲気下７０〜９０℃で２０時間以上重合反応を行う。以上のようにして得られた粒子は、必要により、粒子径１〜２００μｍ、好ましくは３０〜８０μｍに分級し、固相抽出用分離剤として使用される。
本発明の固相抽出用分離剤は、微量成分の濃縮・除去などに幅広く応用可能であるが、特に図１に示すようなカラム又はカートリッジ等に充填して用いることができる。
カラムとは円筒状で両端をカラムエンドで止めているものである。カラムエンドはゲル流出防止の為のフリット又はフィルターが使用され、直接コネクターとカラムエンドを接続し液を流すことができる。カートリッジを使用の際は、単独では液を流す為に必要なアダプターを持たない。そのため専用のカートリッジホルダー、ガードホルダーまたはアダプターと呼ばれるものを容器に装着して用いる。
カラムとは円筒状で両端をカラムエンドで止めているものである。カラムエンドはゲル流出防止の為のフリット又はフィルターが使用され、直接コネクターとカラムエンドを接続し液を流すことができる。カートリッジを使用の際は、単独では液を流す為に必要なアダプターを持たない。そのため専用のカートリッジホルダー、ガードホルダーまたはアダプターと呼ばれるものを容器に装着して用いる。
これらカラム及びカートリッジの材質としては、例えば、ステンレス、ガラスのような無機材質、ポリエチレン、ポリプロピレンのような合成樹脂材質等が挙げられる。容積１〜５００ｍＬ好ましくは１〜１００ｍＬの注射器型等が挙げられる。
固相抽出用カラム又はカートリッジは固相抽出操作中に充填した分離剤が流出しないようにカラム又はカートリッジの両端にフリット又はフィルターと呼ばれる多孔性の板状ものをセットして用いる。フリット又はフィルターの材質は特に限定されるものではなく、ステンレス、ガラス、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン製のものを挙げることができる。
固相抽出用分離剤のカラム又はカートリッジのリザーバーへの充填量は、粒子のかさ密度、試料の濃縮量によって異なるものの、通常、４ｍＬの容積に対して３０〜５００ｍｇである。
固相抽出用カラム又はカートリッジは固相抽出操作中に充填した分離剤が流出しないようにカラム又はカートリッジの両端にフリット又はフィルターと呼ばれる多孔性の板状ものをセットして用いる。フリット又はフィルターの材質は特に限定されるものではなく、ステンレス、ガラス、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン製のものを挙げることができる。
固相抽出用分離剤のカラム又はカートリッジのリザーバーへの充填量は、粒子のかさ密度、試料の濃縮量によって異なるものの、通常、４ｍＬの容積に対して３０〜５００ｍｇである。
本発明の固相抽出用分離剤が充填されているカラム又はカートリッジ等の使用用途に特に制限はないが、固相抽出用分離剤の性質上、環境関連試料、医薬関連試料等の分析処理の際に、微量含有する希薄な目的物質を濃縮する目的で、又は共存する夾雑物を容易に除去する目的等で用いることができる。さらに河川水中の農薬等有害物質の測定、農作物中の残留農薬の測定、血清中の薬物の測定等に好適に用いられ、例えば、タンパク質等の吸着除去に有効であるがこの限りではない。
本発明の環境又は医薬関連試料の処理方法は、上記固相抽出用分離剤を充填した固相抽出用カラム又は固相抽出用カートリッジを用いて目的成分を固相抽出する方法である。本発明の処理方法は、各種試料の分析の際に、微量含有する希薄な目的物質を濃縮、又は共存する夾雑物を除去するものであり、各種分析時の前処理又は後処理として、応用できるものである。
本発明の環境又は医薬関連試料の処理方法は、上記固相抽出用分離剤を充填した固相抽出用カラム又は固相抽出用カートリッジを用いて目的成分を固相抽出する方法である。本発明の処理方法は、各種試料の分析の際に、微量含有する希薄な目的物質を濃縮、又は共存する夾雑物を除去するものであり、各種分析時の前処理又は後処理として、応用できるものである。
以下、本発明によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
１Ｌの三頭フラスコに粒子径３５〜６５μｍ（平均粒子径５０μｍ）のシリカゲル５０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のヒドロキシプロピルセルロース水溶液（ヒドロキシプロピルセルロースはナカライテスク株式会社製）５００ｍＬを加え、室温にて１２０ｒｐｍで２０時間撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水９００ｍＬ、次いでアセトン１００ｍＬで洗浄し、８０℃で２０時間減圧乾燥させヒドロキシプロピルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＨＰＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）２．２５ｇ、スチレン（東京化成工業株式会社製）０．７５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）３ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液（メチルセルロースはナカライテスク株式会社製）６０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．７５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１．５ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＨＰＣシリカゲル４．０ｇを加え８０℃で２０時間反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水３５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで順次洗浄し、８０℃にて２０時間減圧乾燥した。得られた粒子は電磁式ふるい分け振とう機（セイシン企業 オクタゴンデジタル）で３８〜７５μｍに分級した。
実施例１
１Ｌの三頭フラスコに粒子径３５〜６５μｍ（平均粒子径５０μｍ）のシリカゲル５０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のヒドロキシプロピルセルロース水溶液（ヒドロキシプロピルセルロースはナカライテスク株式会社製）５００ｍＬを加え、室温にて１２０ｒｐｍで２０時間撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水９００ｍＬ、次いでアセトン１００ｍＬで洗浄し、８０℃で２０時間減圧乾燥させヒドロキシプロピルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＨＰＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）２．２５ｇ、スチレン（東京化成工業株式会社製）０．７５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）３ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液（メチルセルロースはナカライテスク株式会社製）６０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．７５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１．５ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＨＰＣシリカゲル４．０ｇを加え８０℃で２０時間反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水３５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで順次洗浄し、８０℃にて２０時間減圧乾燥した。得られた粒子は電磁式ふるい分け振とう機（セイシン企業 オクタゴンデジタル）で３８〜７５μｍに分級した。
比較例１
ＨＰＣシリカゲルとドデシルベンゼン硫酸ナトリウムを加えず、実施例１と同様の配合比で単量体を加え懸濁重合し、洗浄した後スチレン−ジビニルベンゼン粒子を得た。乾燥後３８〜７５μｍに分級し、固相抽出用分離剤を得た。
ＨＰＣシリカゲルとドデシルベンゼン硫酸ナトリウムを加えず、実施例１と同様の配合比で単量体を加え懸濁重合し、洗浄した後スチレン−ジビニルベンゼン粒子を得た。乾燥後３８〜７５μｍに分級し、固相抽出用分離剤を得た。
評価条件１による評価
実施例１及び比較例１で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し、固相抽出用カートリッジとし、以下の手順で回収率測定を行った。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）１０ｍｇを含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬに、カフェイン１０μｇ、ケトプロフェン１０μｇ、及びｐ−トルイジン２０μｇを溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し、試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）メタノール５％を含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し溶出液を回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：ＳＴＲ ＯＤＳ−II４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（信和化工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／アセトニトリル＝８０／２０→ ５分後７５／２５
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２５４ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
結果を表１に示す。
実施例１及び比較例１で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し、固相抽出用カートリッジとし、以下の手順で回収率測定を行った。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）１０ｍｇを含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬに、カフェイン１０μｇ、ケトプロフェン１０μｇ、及びｐ−トルイジン２０μｇを溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し、試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）メタノール５％を含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し溶出液を回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：ＳＴＲ ＯＤＳ−II４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（信和化工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／アセトニトリル＝８０／２０→ ５分後７５／２５
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２５４ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
結果を表１に示す。
表１（評価条件１）
実施例１の分離剤では、回収率は８５％以上であり優れた固相抽出用分離剤であることが分かった。比較例１の分離剤では、ケトプロフェンと比べ水に溶けやすいカフェインとｐ−トルイジンの回収率が若干低いことが分かった。なおＢＳＡは実施例１、比較例１ともに９９％以上除去されている。
評価条件２による評価
実施例１及び比較例１で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し、固相抽出用カートリッジとし、以下の手順で回収率測定を行った。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）２０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）１０ｍｇを含む２０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに、プロカインアミド１０μｇ、及びテオフィリン２０μｇを溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）２０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）／メタノール＝５０／５０の溶出液１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｄ ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）／アセトニトリル＝９０／１０→ ５分後７０／３０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２７３ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
結果を表２に示す。
実施例１及び比較例１で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し、固相抽出用カートリッジとし、以下の手順で回収率測定を行った。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）２０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）１０ｍｇを含む２０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに、プロカインアミド１０μｇ、及びテオフィリン２０μｇを溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）２０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）／メタノール＝５０／５０の溶出液１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｄ ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）／アセトニトリル＝９０／１０→ ５分後７０／３０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２７３ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
結果を表２に示す。
表２（評価条件２）
実施例１の分離剤では、回収率は８５％以上であり優れた固相抽出用分離剤であることが分かった。比較例１の分離剤では、水溶性薬物のテオフィリン、プロカインアミドの回収率が実施例１よりも低いことが分かった。なおＢＳＡは実施例１、比較例１ともに９９％以上除去されている。
実施例２
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル５０ｇ、１．０ｗ／ｖ％のポリビニルアルコール水溶液（ＰＶＡはケン化度７８．０〜８０．５ｍｏｌ％ 日本酢ビ・ポバール株式会社製）６００ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水１３００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させポリビニルアルコールが被覆されたシリカゲル（以後ＰＶＡシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：４９．２５ｇ 収率：８７．９％
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル５０ｇ、１．０ｗ／ｖ％のポリビニルアルコール水溶液（ＰＶＡはケン化度７８．０〜８０．５ｍｏｌ％ 日本酢ビ・ポバール株式会社製）６００ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水１３００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させポリビニルアルコールが被覆されたシリカゲル（以後ＰＶＡシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：４９．２５ｇ 収率：８７．９％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬを加え溶解させた。さらに、１．０ｗ／ｖ％のポリビニルアルコール水溶液（ＰＶＡは日本酢ビ・ポバール株式会社製）４０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＰＶＡシリカゲル８．０ｇを加え８０℃で６時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
実施例３
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル５０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液（メチルセルロースはナカライテスク株式会社製）６００ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水１３００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させメチルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＭＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：４６．０６ｇ 収率：８９．９％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液４０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＭＣシリカゲル８．０ｇを加え８０℃で６時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール５００ｍＬ、脱イオン水５００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル５０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液（メチルセルロースはナカライテスク株式会社製）６００ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水１３００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させメチルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＭＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：４６．０６ｇ 収率：８９．９％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液４０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＭＣシリカゲル８．０ｇを加え８０℃で６時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール５００ｍＬ、脱イオン水５００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
実施例４
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル３０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のエチルセルロースメタノール溶液（エチルセルロースはナカライテスク株式会社製）３６０ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水６００ｍＬ、メタノール２００ｍＬ，アセトン５０ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させエチルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＥＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：２６．８３ｇ 収率：８７．３％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液４０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＥＣシリカゲル８．０ｇを加え８０℃で６時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル３０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のエチルセルロースメタノール溶液（エチルセルロースはナカライテスク株式会社製）３６０ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水６００ｍＬ、メタノール２００ｍＬ，アセトン５０ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させエチルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＥＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：２６．８３ｇ 収率：８７．３％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液４０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＥＣシリカゲル８．０ｇを加え８０℃で６時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
実施例５
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル３０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のヒドロキシプロピルセルロース水溶液（ヒドロキシプロピルセルロースはナカライテスク株式会社製）３６０ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水８００ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させヒドロキシプロピルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＨＰＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：２７．５０ｇ 収率：８９．５％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液４０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１ｍＬ加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＨＰＣシリカゲル８．０ｇを加え８０℃で６時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル３０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のヒドロキシプロピルセルロース水溶液（ヒドロキシプロピルセルロースはナカライテスク株式会社製）３６０ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水８００ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させヒドロキシプロピルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＨＰＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：２７．５０ｇ 収率：８９．５％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液４０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１ｍＬ加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、上記のＨＰＣシリカゲル８．０ｇを加え８０℃で６時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
評価条件３による評価
実施例２〜５で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し、固相抽出用カートリッジとした。以下の手順でそれぞれ回収率測定を行った。結果を表３に示す。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）２０ｍｇを含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬに、プロカインアミド０．６μｇ、テオフィリン０．６μｇ溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）メタノール５％を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し溶出液を回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｄ ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）／アセトニトリル＝９０／１０→ ５分後７０／３０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２７３ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
実施例２〜５で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し、固相抽出用カートリッジとした。以下の手順でそれぞれ回収率測定を行った。結果を表３に示す。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）２０ｍｇを含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬに、プロカインアミド０．６μｇ、テオフィリン０．６μｇ溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）メタノール５％を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し溶出液を回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｄ ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）／アセトニトリル＝９０／１０→ ５分後７０／３０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２７３ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
表３（評価条件３）
ＰＶＡ被覆したコア粒子の実施例２はテオフィリンの回収率が極端に低く、セルロース誘導体を被覆したコア粒子のものは実施例２と比較し回収率が高い。セルロース誘導体の中でもヒドロキシプロピルセルロースを被覆したコア粒子をもつ実施例５は実施例３及び実施例４と比較し回収率が高く、固相抽出媒体であるポリマーがよく被覆されていることが予想される。
実施例６
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．５ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．７５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．７５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）３ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液６０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．７５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１．５ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、実施例５で得られたＨＰＣシリカゲル６．０ｇを加え８０℃で２０時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．５ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．７５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．７５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）３ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液６０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．７５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２’−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１．５ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、実施例５で得られたＨＰＣシリカゲル６．０ｇを加え８０℃で２０時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
実施例７
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル５０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のヒドロキシプロピルセルロース水溶液（ヒドロキシプロピルセルロースはナカライテスク株式会社製）５００ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水９００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させヒドロキシプロピルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＨＰＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：４５．２８ｇ 収率：８８．８％
１Ｌの三頭フラスコに平均粒子径５０μｍのシリカゲル５０ｇ、０．２ｗ／ｖ％のヒドロキシプロピルセルロース水溶液（ヒドロキシプロピルセルロースはナカライテスク株式会社製）５００ｍＬを加え、室温にて２０時間以上１２０ｒｐｍで撹拌した。撹拌終了後、脱イオン水９００ｍＬ、アセトン１００ｍＬで洗浄し８０℃で減圧乾燥させヒドロキシプロピルセルロースが被覆されたシリカゲル（以後ＨＰＣシリカゲルと呼ぶ）を得た。
収量：４５．２８ｇ 収率：８８．８％
１００ｍＬ四頭フラスコに窒素雰囲気下、室温にて、純度８０％のジビニルベンゼン（アルドリッチ株式会社製）１．５ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（和光純薬工業株式会社製）０．７５ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン（ナカライテスク株式会社製）０．７５ｇ、トルエン（和光純薬工業株式会社製）３ｍＬを加え溶解させた。さらに、０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液６０ｍＬ、１０ｗ／ｖ％ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム水溶液（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製）０．７５ｍＬを加え、５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。撹拌後１ｗ／ｖ％２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを含むトルエン溶液（２，２‘−アゾビスイソブチロニトリルは和光純薬工業株式会社製）１．５ｍＬを加え５００ｒｐｍにて１０分撹拌した。エマルジョンを確認後１００ｒｐｍにて撹拌し、得られた上記ＨＰＣシリカゲル４．０ｇを加え８０℃で２０時間以上反応を行った。
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
分級前の収量：６．２５ｇ（収率＝８９．３％）
分級後の収量：５．１４ｇ（収率＝７３．４％）
反応終了後、メタノール３００ｍＬ、脱イオン水２５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬで洗浄し、８０℃にて減圧乾燥した。得られた粒子を３８〜７５μｍに分級した。
分級前の収量：６．２５ｇ（収率＝８９．３％）
分級後の収量：５．１４ｇ（収率＝７３．４％）
比較例２
シリカゲルとドデシルベンゼン硫酸ナトリウムを加えず、実施例３と同様の配合比で単量体を加え懸濁重合し、洗浄した後、エチレングリコールジメタクリレート−Ｎ−ビニルピロリドン−ジビニルベンゼン共重合体粒子を得た。洗浄後３８〜７５μｍに分級した。
分級前の収量：１４．７１ｇ（収率＝７３．５％）
分級後の収量：３．０９ｇ（収率＝１５．４％）
シリカゲルとドデシルベンゼン硫酸ナトリウムを加えず、実施例３と同様の配合比で単量体を加え懸濁重合し、洗浄した後、エチレングリコールジメタクリレート−Ｎ−ビニルピロリドン−ジビニルベンゼン共重合体粒子を得た。洗浄後３８〜７５μｍに分級した。
分級前の収量：１４．７１ｇ（収率＝７３．５％）
分級後の収量：３．０９ｇ（収率＝１５．４％）
評価条件４による評価
実施例３、実施例６及び実施例７で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し固相抽出用カートリッジとした。また、比較例２で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子５０ｍｇ（シリカゲルと比較するとポリマー単独粒子は嵩比重が小さいため充填量を減らしている。）を３ｍＬのリザーバーに充填し固相抽出用カートリッジとした。以下の手順で回収率測定を行った。評価条件３と比較すると評価条件４は薬物濃度が高くなっている。結果を表４に示す。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）２０ｍｇを含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬに、プロカインアミド２０μｇ、テオフィリン４０μｇ溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）メタノール５％を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し溶出液を回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｄ ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）／アセトニトリル＝９０／１０→ ５分後７０／３０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２７３ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
実施例３、実施例６及び実施例７で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子７０ｍｇを４ｍＬのリザーバーに充填し固相抽出用カートリッジとした。また、比較例２で得られた３８〜７５μｍに分級された粒子５０ｍｇ（シリカゲルと比較するとポリマー単独粒子は嵩比重が小さいため充填量を減らしている。）を３ｍＬのリザーバーに充填し固相抽出用カートリッジとした。以下の手順で回収率測定を行った。評価条件３と比較すると評価条件４は薬物濃度が高くなっている。結果を表４に示す。
（１）固相抽出用カートリッジを、シリンジアダプターにセットする。
（２）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（３）５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。
（４）ＢＳＡ（牛血清アルブミン）２０ｍｇを含む５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬに、プロカインアミド２０μｇ、テオフィリン４０μｇ溶解したものを１ｍＬ／ｍｉｎで通液し試料を固相抽出用カートリッジ中に吸着させる。
（５）メタノール５％を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し洗浄する。
（６）メタノール１ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎで通液し溶出液を回収する。
（７）回収した溶出液から２０μLを採取し、高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所製 ＬＣ−２０１０Ｃ ＨＴ）により分析しその面積値を求める。
（８）測定条件
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｄ ４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）／アセトニトリル＝９０／１０→ ５分後７０／３０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：紫外吸収検出器
波長：ＵＶ２７３ｎｍ
試料注入量：２０μＬ
表４（評価条件４）
ＢＳＡは実施例３、実施例６、実施例７、比較例２ともに９９％以上除去されている。
実施例３はメチルセルロースを被覆したコア粒子をもつが、シリカゲルに対する単量体の質量比は０．２５である。実施例６は０．５、実施例７は０．７５である。実施例３は固相抽出媒体であるポリマーの量は少ないためか回収率が低い。比較例２のポリマー単独粒子も回収率が良いが、実施例７も十分に薬物を回収している。
実施例３はメチルセルロースを被覆したコア粒子をもつが、シリカゲルに対する単量体の質量比は０．２５である。実施例６は０．５、実施例７は０．７５である。実施例３は固相抽出媒体であるポリマーの量は少ないためか回収率が低い。比較例２のポリマー単独粒子も回収率が良いが、実施例７も十分に薬物を回収している。
Claims (12)
- 基材コア粒子、該粒子の表面に形成された親水性高分子層、及び該親水性高分子層の表面に形成された疎水性高分子層を有する固相抽出用分離剤であって、
親水性高分子が、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース及びエチルセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、
疎水性高分子が、疎水性架橋性単量体（Ａ）の重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）の共重合体、疎水性架橋性単量体（Ａ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体、又は疎水性架橋性単量体（Ａ）と疎水性非架橋性単量体（Ｂ）と親水性単量体（Ｃ）の共重合体を含み、
疎水性架橋性単量体（Ａ）が、ジ（メタ）アクリル酸エステル、多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステル及び２個以上のビニル基を有する芳香族系化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、
疎水性非架橋性単量体（Ｂ）が、（メタ）アクリル酸エステル、カルボン酸ビニル及びスチレン系単量体からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、
親水性単量体（Ｃ）が、水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド、及びＮ−ビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、
基材コア粒子が、シリカゲル、セルロース、アガロース、セラミック、及びカーボンからなる群から選ばれる少なくとも１種である
ことを特徴とする固相抽出用分離剤。 - 親水性高分子が、ヒドロキシプロピルセルロースである請求項１記載の固相抽出用分離剤。
- 疎水性架橋性単量体（Ａ）が、ジビニルベンゼンである、請求項１又は２記載の固相抽出用分離剤。
- 疎水性非架橋性単量体（Ｂ）が、スチレンである請求項１〜３のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
- 基材コア粒子及び親水性高分子層の総量１００質量部に対する、疎水性高分子層の総量が、５〜５００質量部である請求項１〜４のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
- 基材コア粒子が、シリカゲルである請求項１〜５のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
- 平均粒子径が１〜２００μｍである請求項１〜６のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を充填してなるカラム又はカートリッジ。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする分離目的物の濃縮方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする夾雑物の除去方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする環境、医薬又は生体関連試料の固相抽出方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載の固相抽出用分離剤を使用することを特徴とする蛋白成分含有試料の前処理方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004252612A JP4637533B2 (ja) | 2004-08-31 | 2004-08-31 | 固相抽出用分離剤 |
| US11/215,024 US8101073B2 (en) | 2004-08-31 | 2005-08-31 | Separating agent for solid-phase extraction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004252612A JP4637533B2 (ja) | 2004-08-31 | 2004-08-31 | 固相抽出用分離剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006068597A JP2006068597A (ja) | 2006-03-16 |
| JP4637533B2 true JP4637533B2 (ja) | 2011-02-23 |
Family
ID=35941544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004252612A Expired - Fee Related JP4637533B2 (ja) | 2004-08-31 | 2004-08-31 | 固相抽出用分離剤 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8101073B2 (ja) |
| JP (1) | JP4637533B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8158175B2 (en) | 2008-08-28 | 2012-04-17 | Frito-Lay North America, Inc. | Method for real time measurement of acrylamide in a food product |
| GB2472404B (en) * | 2009-08-04 | 2011-10-19 | Frito Lay Trading Co Gmbh | Solid phase extraction cartridge and method of use |
| US9132364B2 (en) * | 2010-02-26 | 2015-09-15 | Dionex Corporation | High capacity ion chromatography stationary phases and method of forming |
| US10258979B2 (en) | 2011-05-20 | 2019-04-16 | Waters Technologies Corporation | Porous materials for solid phase extraction and chromatography and processes for preparation and use thereof |
| US9976993B2 (en) | 2014-05-20 | 2018-05-22 | Tecan Sp, Inc. | Sample extraction apparatus with micro elution bed design |
| EP3146331B1 (en) * | 2014-05-20 | 2021-02-17 | Tecan SP, Inc. | Sample extraction apparatus with micro elution bed design |
| JP1541622S (ja) * | 2015-03-11 | 2019-01-07 | ||
| JP1541625S (ja) * | 2015-05-28 | 2019-01-07 | ||
| JP6623363B2 (ja) * | 2015-07-29 | 2019-12-25 | 名古屋市 | 金属イオン回収用吸水ゲル |
| CN113227753A (zh) * | 2018-11-19 | 2021-08-06 | 艾斯寇公司 | 液体环境监测方法和液体环境监测系统 |
| CN111495337B (zh) * | 2020-04-22 | 2023-08-11 | 宁波工程学院 | 基于亲水性萃取氟喹诺酮类药物的吸附剂及其制备方法和萃取方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6120561A (ja) * | 1984-07-09 | 1986-01-29 | 住友ベークライト株式会社 | 医療用吸着剤 |
| JPS6263856A (ja) * | 1985-09-13 | 1987-03-20 | Japan Synthetic Rubber Co Ltd | クロマトグラフイ−用充填剤の製造方法 |
| JP2001009274A (ja) * | 1999-06-30 | 2001-01-16 | Chisso Corp | 被覆イオン交換体とその製造方法、及び有用成分の分離精製方法 |
| JP2002361080A (ja) * | 2001-06-08 | 2002-12-17 | Sekisui Chem Co Ltd | 疎水性物質吸着剤 |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4140653A (en) | 1975-09-30 | 1979-02-20 | Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. | Solid support for liquid chromatography |
| US4544485A (en) * | 1984-08-31 | 1985-10-01 | Purdue Research Foundation | Chromatographic method and means |
| US4725359A (en) * | 1985-02-25 | 1988-02-16 | Bend Research, Inc. | Potable water from internal combustion engines |
| US4920152A (en) * | 1986-05-13 | 1990-04-24 | Purdue Research Foundation | Reversed-phase packing material and method |
| US5205929A (en) * | 1988-02-03 | 1993-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | High stability porous zirconium oxide spherules |
| US5277813A (en) * | 1988-06-17 | 1994-01-11 | S.A.C. Corporation | Shielded stationary phases |
| US5200069A (en) * | 1988-12-28 | 1993-04-06 | Lin Gwochung | Separations material |
| CA1331254C (en) | 1989-02-27 | 1994-08-02 | Victor Berber Barretto | Ion-exchange composition employing resin attachment to dispersant and method for forming the same |
| JP2513166B2 (ja) | 1989-07-24 | 1996-07-03 | 株式会社村田製作所 | 厚みすべり振動モ―ドを利用した圧電トラップおよびその製造方法 |
| US5030352A (en) * | 1990-01-25 | 1991-07-09 | Purdue Research Foundation | Coated media for chromatography |
| US5182016A (en) * | 1990-03-22 | 1993-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Polymer-coated carbon-clad inorganic oxide particles |
| US5230806A (en) * | 1991-02-04 | 1993-07-27 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Modified resins for solid-phase extraction |
| JP3164641B2 (ja) | 1992-04-27 | 2001-05-08 | 積水化学工業株式会社 | 液体クロマトグラフィー用充填剤およびその製造方法 |
| US5906734A (en) * | 1992-06-19 | 1999-05-25 | Biosepra Inc. | Passivated porous polymer supports and methods for the preparation and use of same |
| US6039876A (en) * | 1992-07-24 | 2000-03-21 | Yang; Yan-Bo | Hydrophilic polystrene divinylbenzene based matrixes for chromatography |
| JP3274898B2 (ja) | 1993-03-10 | 2002-04-15 | 横河アナリティカルシステムズ株式会社 | 固相抽出用カートリッジカラム |
| JP2871435B2 (ja) * | 1993-04-22 | 1999-03-17 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックスの製造方法 |
| US5503933A (en) * | 1994-02-25 | 1996-04-02 | Purdue Research Foundation | Covalently bonded coatings |
| US5519064A (en) * | 1994-10-28 | 1996-05-21 | The Dow Chemical Company | Surface-modified post-crosslinked adsorbents and a process for making the surface modified post-crosslinked adsorbents |
| JP3508304B2 (ja) | 1995-06-02 | 2004-03-22 | Ｊｓｒ株式会社 | 架橋ポリマー粒子のグリコール分散体およびその製造方法 |
| US5906747A (en) * | 1995-11-13 | 1999-05-25 | Biosepra Inc. | Separation of molecules from dilute solutions using composite chromatography media having high dynamic sorptive capacity at high flow rates |
| JP3664328B2 (ja) * | 1996-01-19 | 2005-06-22 | 富士写真フイルム株式会社 | 血漿または血清試料の調製方法 |
| US5882521A (en) | 1996-04-18 | 1999-03-16 | Waters Investment Ltd. | Water-wettable chromatographic media for solid phase extraction |
| JP4406713B2 (ja) * | 1996-08-26 | 2010-02-03 | マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー | 親水性表面を有するポリマー膜及びポリマー物品とその作製方法 |
| DE19820302A1 (de) | 1998-05-04 | 2000-02-24 | Basf Ag | Kern/Schale-Partikel, ihre Herstellung und Verwendung |
| WO1999064480A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Waters Investments Limited | Novel ion exchange porous resins for solid phase extraction and chromatography |
| US7232520B1 (en) * | 1998-06-12 | 2007-06-19 | Waters Investments Limited | Ion exchange porous resins for solid phase extraction and chromatography |
| WO2001059444A1 (fr) | 2000-02-10 | 2001-08-16 | Eisai Co., Ltd. | Substance de remplissage de colonne pour la chromatographie |
| JP2001343378A (ja) | 2000-06-02 | 2001-12-14 | Showa Denko Kk | 固相抽出用充填剤及び固相抽出方法 |
| JP2002139482A (ja) | 2000-08-21 | 2002-05-17 | Showa Denko Kk | 固相抽出用充填剤及び固相抽出用カートリッジ |
| US20050029196A1 (en) * | 2002-11-19 | 2005-02-10 | Resq Lab B.V. | Packing materials for separation of biomolecules |
| US20070084788A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Millipore Corporation | Ultrafiltration membranes and methods of making and use of ultrafiltration membranes |
-
2004
- 2004-08-31 JP JP2004252612A patent/JP4637533B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-08-31 US US11/215,024 patent/US8101073B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6120561A (ja) * | 1984-07-09 | 1986-01-29 | 住友ベークライト株式会社 | 医療用吸着剤 |
| JPS6263856A (ja) * | 1985-09-13 | 1987-03-20 | Japan Synthetic Rubber Co Ltd | クロマトグラフイ−用充填剤の製造方法 |
| JP2001009274A (ja) * | 1999-06-30 | 2001-01-16 | Chisso Corp | 被覆イオン交換体とその製造方法、及び有用成分の分離精製方法 |
| JP2002361080A (ja) * | 2001-06-08 | 2002-12-17 | Sekisui Chem Co Ltd | 疎水性物質吸着剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20060043022A1 (en) | 2006-03-02 |
| US8101073B2 (en) | 2012-01-24 |
| JP2006068597A (ja) | 2006-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8101073B2 (en) | Separating agent for solid-phase extraction | |
| Włoch et al. | Synthesis and polymerisation techniques of molecularly imprinted polymers | |
| CN102711978B (zh) | 多孔聚合物整料、其制备方法及其用途 | |
| US20060102556A1 (en) | Porous molecularly imprinted polymer membranes | |
| AU778045B2 (en) | Process for making fluorinated polymer adsorbent particles | |
| CN103709274A (zh) | 一种聚苯乙烯类材料的亲水改性方法及其产品 | |
| Camli et al. | Functional, uniform, and macroporous latex particles: Preparation, electron microscopic characterization, and nonspecific protein adsorption properties | |
| CN103959057A (zh) | 用于蛋白质纯化的基于烯丙胺及其衍生物的新型色谱介质 | |
| JP6790834B2 (ja) | 分離材 | |
| JP2001343378A (ja) | 固相抽出用充填剤及び固相抽出方法 | |
| JP6834129B2 (ja) | 分離材及びカラム | |
| US6759442B2 (en) | Packing material for solid phase extraction and solid phase extraction method | |
| JP2010529210A (ja) | 架橋された球形粒子を含む新しいポリマー材料、該材料を製造する方法およびそれらの使用 | |
| Choi et al. | Modeling of the permeate flux during microfiltration of BSA-adsorbed microspheres in a stirred cell | |
| JP6476887B2 (ja) | 分離材 | |
| JP3087332B2 (ja) | 液体クロマトグラフィー用充填剤 | |
| JPH11189601A (ja) | 高分子微粒子の製造方法及び液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 | |
| US20020041938A1 (en) | Packing material and cartridge for solid phase extraction | |
| JP2000275231A (ja) | 液体クロマトグラフィー用充填剤及びそれを用いた測定方法 | |
| JP2002139482A (ja) | 固相抽出用充填剤及び固相抽出用カートリッジ | |
| JP2017122644A (ja) | 分離材、カラム、及び分離材の製造方法 | |
| JP2002055093A (ja) | 生体試料中の薬物の分離方法及びそれに用いる分離剤 | |
| WO2001096556A1 (en) | The use of polymer adsorbent particles in dna separation | |
| EP4265327A2 (en) | Stationary phase medium for adsorption chromatography and manufacturing method thereof | |
| JP3176423B2 (ja) | クロマトグラフィー用担体およびその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070831 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20100216 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100806 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101005 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101108 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101124 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131203 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4637533 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |