JP6212249B2 - カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法、並びに、メラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法、並びに、メラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法に関する。

細胞小器官の１つである小胞体（ＥＲ）は、タンパク質合成、脂質合成、物質の代謝、カルシウム（Ｃａ²⁺）貯蔵、等の様々な機能を有している。

タンパク質合成に関して、小胞体は、正しく折り畳まれた（正しい立体構造を有する）タンパク質のみを選択的に分泌し、正しく折り畳まれなかったタンパク質（ミスフォールドタンパク質）を分解除去する品質管理機構を備えている。これは、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）と呼ばれる機構であり、ミスフォールドタンパク質は小胞体からサイトゾルに逆輸送され、ユビキチン・プロテアソーム系にて分解される。小胞体関連分解において、ＥＤＭ１と呼ばれるタンパク質がミスフォールドタンパク質を認識することが知られている。

ＥＲｄｊ５は小胞体で初めて見つかった還元酵素である（非特許文献１）。ＥＲｄｊ５はＥＤＥＭ１に結合するタンパク質として同定された。ＥＲｄｊ５は、ミスフォールドタンパク質における誤ったジスルフィド結合を切断し、ミスフォールドタンパク質の小胞体関連分解を促進する。結晶構造解析により、ＥＲｄｊ５のドメイン構造が明らかとなっている（非特許文献２）。また、ＥＲｄｊ５を利用した種々の技術開発が行われている（特許文献１）。

一方、小胞体のカルシウム貯蔵機能の関連では、細胞内のカルシウム濃度は、細胞外からのカルシウムの流入に加えて、小胞体からのカルシウムの放出によっても制御されている。小胞体には、細胞内シグナル伝達に関わるタンパク質が局在しており、カルシウム結合タンパク質等とともにシグナルに応じたカルシウムの放出が行われている。

小胞体におけるカルシウム制御には、ＩＰ３レセプター、リアノジンレセプター、及びＳＥＲＣＡ２の各カルシウムポンプが関与している。小胞体内からサイトゾルへのカルシウムの放出は、ＩＰ３レセプター、リアノジンレセプターを介して行われる。一方、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムの取り込みは、ＳＥＲＣＡ２を介して行われる。

ＳＥＲＣＡ２はＣａ²⁺−ＡＴＰアーゼの一種である。ＳＥＲＣＡ２は分子内ジスルフィド結合を有しており、この分子内ジスルフィド結合がＳＥＲＣＡ２のポンプ機能に影響を与えるといわれている。すなわち、ジスルフィド結合がある状態では、ＳＥＲＣＡ２は負に制御されており、小胞体内へのカルシウムの取り込みは行われない。一方、ジスルフィド結合が切断されると、ＳＥＲＣＡ２を介して小胞体内にカルシウムが取り込まれる。ＳＥＲＣＡ２には、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＥＲＣＡ２ｂ、及びＳＥＲＣＡ２ｃの３つのスプライシングバリアントが存在する。ＳＥＲＣＡ２ａとＳＥＲＣＡ２ｃは心筋や骨格筋に局在し、ＳＥＲＣＡ２ｂはユビキタスに発現が確認されている。

特開２００８−１６１１８５号公報

Ushioda et al., Science 321: 569-572 (2008) Hagiwara et al., Molecular Cell, 41, 432-444 (2011)

ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を制御している因子については、まだ不明な点が多い。そこで本発明は、ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を制御している因子を新たに特定し、ＳＥＲＣＡ２を介したカルシウム輸送に関係する一連の技術を提供することを目的とする。

本発明者らは、ＥＲｄｊ５に関する研究をさらに進めた結果、小胞体関連分解に深く関与しているＥＲｄｊ５が、ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能にも関与していることを見出した。詳細には、小胞体内において、ＥＲｄｊ５の還元作用によってＳＥＲＣＡ２の分子内ジスルフィド結合が切断されるとともに、ＥＲｄｊ５がジスルフィド結合を介してＳＥＲＣＡ２に結合すること、そして、このＥＲｄｊ５のＳＥＲＣＡ２への結合により、ＳＥＲＣＡ２を介したサイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの輸送が促進されることを見出した（図１）。そして本発明者らは、この仕組みを利用した、ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を制御する物質をスクリーニングする技術、さらに、メラニン色素の合成を阻害する物質をスクリーニングする技術を開発し、本発明を完成するに至った。上記した課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。

請求項１に記載の発明は、被験物質が有する、ＥＲｄｊ５の発現量を増加又は減少させる機能を指標として、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を制御する物質をスクリーニングすることを特徴とするカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法である。

本発明はカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法に係るものであり、被験物質が有する「ＥＲｄｊ５の発現量を増加又は減少させる機能」を指標として、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を制御する物質をスクリーニングするものである。本発明は、ＥＲｄｊ５がＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を制御可能である、という新しい知見に基づいている。本発明によれば、サイトゾルから小胞体へのカルシウム取り込みを促進又は抑制する物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。

ここで「カルシウムポンプ機能の制御」には、カルシウムポンプ機能の促進と抑制の両方が含まれる。また「ＥＲｄｊ５の発現量」には、ＲＮＡへの転写レベルとタンパク質への翻訳レベルの両方の発現量が含まれる。

請求項２に記載の発明は、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現量をもって、前記ＥＲｄｊ５の発現量を把握することを特徴とする請求項１に記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法である。

本発明では、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現量をもって、ＥＲｄｊ５の発現量を把握する。本発明によれば、レポーター遺伝子の発現量によってスクリーニングできるので、より簡便、迅速、かつ高感度なスクリーニングが可能である。

ここで「ＥＲｄｊ５のプロモーター」とは、細胞内においてＥＲｄｊ５遺伝子の発現を調節しているＤＮＡ上の領域であって、転写因子が結合することにより、ＥＲｄｊ５遺伝子の発現が誘導される領域をいう。
ここで「機能的に連結」とは、プロモーターの下流に連結された遺伝子が当該プロモーターの制御下で発現可能である連結様式をいう。

請求項２に記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法において、下記工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞又は当該細胞の抽出液に、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた細胞又は細胞の抽出液における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を包含する構成が好ましい（請求項３）。

請求項２又は３に記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法において、前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子であることが好ましい（請求項４）。

請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法によって、メラニン色素の合成を阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とするメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法である。

本発明はメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法に係るものであり、上記したカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法を用いるものである。本発明は、ＥＲｄｊ５がＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を制御可能である、という新しい知見、並びに、メラノサイトにおいて、ＥＲｄｊ５の還元作用によってＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能が促進されると、サイトゾルのカルシウムイオンが小胞体に取り込まれ、これがサイトゾル内のＬ−フェニルアラニンの減少につながり、メラニン色素の合成が阻害される、という新しい知見に基づいている。本発明によれば、メラニン色素の合成を阻害する物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。

関連の発明は、被験物質が有する、ＥＲｄｊ５の還元活性を増加又は減少させる機能を指標として、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を制御する物質をスクリーニングすることを特徴とするカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法である。
関連の発明は、単離されたＥＲｄｊ５に被験物質を接触させた際の、当該ＥＲｄｊ５の還元活性を測定する工程を包含することを特徴とする上記のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法である。

この発明は、ＥＲｄｊ５の還元活性に着目したものである。この発明は、単離されたＥＲｄｊ５に被験物質を接触させた際の、当該ＥＲｄｊ５の還元活性を測定する工程を包含する。この発明によれば、試験管内で酵素活性を測定するだけスクリーニングを行えるので、より簡便かつ迅速なスクリーニングが可能である。

また関連の発明は、上記のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法によって、メラニン色素の合成を阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とするメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法である。

関連の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法又は請求項５に記載のメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法に用いるためのベクターであって、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターと、レポーター遺伝子とを有し、前記プロモーターの下流に前記レポーター遺伝子が機能的に連結されていることを特徴とするベクターである。

この発明は、カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法又はメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法に用いるためのベクターに係るものである。このベクターは、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターと、レポーター遺伝子とを有し、前記プロモーターの下流に前記レポーター遺伝子が機能的に連結されている。このベクターは、ＥＲｄｊ５の発現量に着目した上記カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法、又はメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法を実施する際に有用である。

上記のベクターにおいて、前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子である構成が好ましい。

関連の発明は、上記のベクターを有することを特徴とする細胞である。

この発明は細胞に係るものであり、上記したベクターを有することを特徴とするものである。この細胞は、ＥＲｄｊ５の発現量に着目した上記カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法、又はメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法を実施する際に有用である。

本発明のカルシウムポンプ機能制御物質のスクリーニング方法によれば、サイトゾルから小胞体へのカルシウム取り込みを促進又は抑制する物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。

本発明のメラニン色素合成阻害物質スクリーニング方法によれば、メラニン色素の合成を阻害する物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。

上記のベクターによれば、ＥＲｄｊ５の発現量に着目した上記カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法、又はメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法を簡便に行うことができる。

上記の細胞によれば、ＥＲｄｊ５の発現量に着目した上記カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法、又はメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法を簡便に行うことができる。

ＥＲｄｊ５の結合によってＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能が促進される機構を説明する説明図であり、（ａ）はＥＲｄｊ５がＳＥＲＣＡ２に結合していない状態、（ｂ）はＥＲｄｊ５がＳＥＲＣＡ２に結合している状態を示す。 塩化カルシウムを用いたサイトゾルのカルシウム濃度の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はＥＲｄｊ５を発現している細胞の場合、（ｂ）はＥＲｄｊ５をノックアウトした細胞の場合を示す。 チロシナーゼを強制発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いたメラニン色素合成阻害実験の結果を示す写真である。 メラノーマＢ１６細胞を用いたメラニン色素合成阻害実験の結果を示すグラフである。

前述のように、本発明は、小胞体内において、ＥＲｄｊ５の還元作用によってＳＥＲＣＡ２の分子内ジスルフィド結合が切断されるとともに、ＥＲｄｊ５がジスルフィド結合を介してＳＥＲＣＡ２に結合すること、並びに、このＥＲｄｊ５のＳＥＲＣＡ２への結合により、ＳＥＲＣＡ２を介したサイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの輸送が促進される、という新しい知見に基づいている。また、ＥＲｄｊ５とＳＥＲＣＡ２の結合には分子シャペロンの一種であるＢｉＰが必須である。ＢｉＰは両者の間を橋渡しするように結合する。図１に上記の機構を模式的に示す。

本発明の１つの様相は、カルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法に係るものである。本発明のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法は、被験物質が有する、ＥＲｄｊ５の発現量又は還元活性を増加又は減少させる機能を指標として、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を制御する物質をスクリーニングするものである。

本発明のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法では、被験物質が有する「ＥＲｄｊ５の発現量又は還元活性を増加又は減少させる機能」を指標とする。「指標とする」の代表例は、基準値と比較することである。例えば、被験物質ごとに得られた測定値を、予め設定した基準値と比較し、その比較結果に基づいて所望の物質を選抜することができる。当該基準値としては、例えば、被験物質を用いない陰性対照を設定し、当該陰性対照におけるＥＲｄｊ５の発現量又は還元活性の値を採用することができる。

本発明では、「ＥＲｄｊ５の発現量」と「ＥＲｄｊ５の還元活性」のいずれもが指標となり得る。まず、ＥＲｄｊ５の発現量を指標とする実施形態について説明する。

前述のとおり、「ＥＲｄｊ５の発現量」には、転写レベルの発現量（ｍＲＮＡ量）と翻訳レベルの発現量（タンパク量）の両方が含まれる。すなわち、ＥＲｄｊ５遺伝子又はその代替遺伝子（レポーター遺伝子等）の転写産物の量と翻訳産物の量の両方が、ＥＲｄｊ５の発現量となり得る。

ｍＲＮＡ量の測定方法としては、対応する遺伝子のｍＲＮＡ量を測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、等を用いて行うことができる。

タンパク量の測定方法としては、対応する遺伝子がコードするタンパク質を特異的に測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＥＬＩＳＡ等の免疫測定法、ウエスタンブロット法、等を用いて行うことができる。当該タンパク質が酵素の場合は、酵素活性をもってタンパク量に代えることができる。

ＥＲｄｊ５の発現量を指標とする場合は、レポーター遺伝子を使用することが好ましい。すなわち、１つの好ましい実施形態では、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現量をもって、ＥＲｄｊ５の発現量を把握する。

前述のとおり、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターとは、細胞内においてＥＲｄｊ５遺伝子の発現を調節しているＤＮＡ上の領域であって、転写因子が結合することにより、ＥＲｄｊ５遺伝子の発現が誘導される領域をいう。ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡとしては、特許文献１に記載されている、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜３５１を含む領域、及び塩基番号１１〜１９を含む領域が挙げられる。

前述のとおり、「機能的に連結」とは、プロモーターの下流に連結された遺伝子が当該プロモーターの制御下で発現可能である連結様式をいう。すなわち、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子は、当該プロモーターの制御下で転写され、その後、翻訳される。

前記レポーター遺伝子としては、生命工学の分野で一般的に用いられているものを採用することができる。例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、をコードする遺伝子を採用することができる。

好ましい実施形態では、下記工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞又は当該細胞の抽出液に、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた細胞又は当該細胞の抽出液における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を包含する。以下、本実施形態の具体的手順の例について説明する。

工程（ａ）の具体例としては、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を機能的に連結し、これを適宜のベクターに組み込み、さらに適宜の細胞に導入する。そして、この細胞（組換え細胞）に被験物質を接触させる。細胞に被験物質を接触させる方法としては、被験物質を含有する培地で細胞を培養することが挙げられる。その他の例としては、細胞懸濁液や細胞抽出液に被験物質を添加することが挙げられる。

工程（ｂ）では、レポーター遺伝子の発現量を測定する。例えばレポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であれば、発現産物であるルシフェラーゼの活性を、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子であれば、発現産物であるＧＦＰを、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＵＳ遺伝子であれば、発現産物であるＧＵＳの活性を、グルクロン等の発色をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子であれば、発現産物であるＣＡＴの活性を、クロラムフェニコールのアセチル化をもって検出することができる。

別途、工程（ａ）で細胞等に被験物質を接触させない陰性対照を設定し、その場合の発現量を基準値として設定する。そして、被験物質を細胞等に接触させた場合の測定値と、当該基準値とを比較する。

ここで、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を促進する物質をスクリーニングしたい場合は、ＥＲｄｊ５の発現量を増加させる物質をスクリーニングすればよいので、基準値よりも高い測定値を示した被験物質を選抜すればよい。一方、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を抑制する物質をスクリーニングしたい場合は、ＥＲｄｊ５の発現量を減少させる物質をスクリーニングすればよいので、基準値よりも低い測定値を示した被験物質を選抜すればよい。

ＥＲｄｊ５のプロモーターの下流に連結する遺伝子は、ＥＲｄｊ５遺伝子の一部又は全長とレポーター遺伝子との融合遺伝子であってもよい。

レポーター遺伝子を使わずに、ＥＲｄｊ５遺伝子をそのまま使うことも可能である。すなわち、前記プロモーターの下流に連結されたＥＲｄｊ５遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ量）又は翻訳産物（ＥＲｄｊ５タンパク）の量を測定することにより、ＥＲｄｊ５の発現量を把握することができる。ＥＲｄｊ５タンパクの量は、ＥＲｄｊ５の還元活性をもって測定することもできる。還元活性の測定方法としては、インスリン還元活性法が挙げられる。インスリン還元活性法については後述する。
また、この場合のＥＲｄｊ５遺伝子は、ＥＲｄｊ５の全長をコードする遺伝子に加えて、ＥＲｄｊ５の機能的断片をコードする遺伝子であってもよい。ＥＲｄｊ５の機能的断片については後述する。

上記した実施形態は、ＥＲｄｊ５の発現量を指標としてスクリーニングを行うものであったが、本発明はＥＲｄｊ５の還元活性を指標とすることもできる。すなわち、本発明のカルシウムポンプ機能制御物質のスクリーニング方法における他の実施形態は、単離されたＥＲｄｊ５に被験物質を接触させた際の、当該ＥＲｄｊ５の還元活性を測定する工程を包含する。

本実施形態に係るカルシウムポンプ機能制御物質のスクリーニング方法では、「単離されたＥＲｄｊ５」を使用する。なお、ＥＲｄｊ５の遺伝子（ｃＤＮＡ）は単離されており、組換え型のＥＲｄｊ５が入手可能である。例えば、この組換え型のＥｒｄｊ５を「単離されたＥＲｄｊ５」として用いることができる。ここで、ヒトＥＲｄｊ５遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。マウスＥＲｄｊ５遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。

単離されたＥＲｄｊ５に被験物質を接触させる方法としては、ＥＲｄｊ５を含む溶液に被験物質を添加することが挙げられる。

ＥＲｄｊ５の還元活性を測定する方法としては、例えば、非特許文献１に記載のインスリン還元活性法を採用することができる。この方法は、酸化したインスリンを基質として、インスリンの還元をＮＡＤＰＨの消費をもってモニターし、還元活性を測定するものである。

本実施形態で用いる単離されたＥＲｄｊ５には、ＥＲｄｊ５の全長に加えて、ＥＲｄｊ５の機能的断片が含まれる。ここで「ＥＲｄｊ５の機能的断片」とは、ＥＲｄｊ５の部分配列を有するポリペプチドであって、ＥＲｄｊ５としての活性（例えば、ＳＥＲＣＡ２に対する結合および還元活性）を保持しているものを指す。
例えば、特許文献１と非特許文献１に記載されているように、ＥＲｄｊ５は、酸化還元に関与すると考えられる４個のチオレドキシン様ドメインと、分子シャペロンＢｉＰとの結合部位と考えられる１個のＪドメインを有する。そして、各チオレドキシン様ドメインは、ＣＸＸＣモチーフを有する。これらのドメイン又はモチーフの一部又は全部を有し、かつＥＲｄｊ５としての活性を保持するポリペプチドが、ＥＲｄｊ５の機能的断片の例として挙げられる。

また、本実施形態で用いる単離されたＥＲｄｊ５には、天然のＥＲｄｊ５と実質的に同等とみなせるＥＲｄｊ５の変異体、改変体が含まれる。
例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（ヒトＥＲｄｊ５のｃＤＮＡ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつＥＲｄｊ５としての活性を有するタンパク質が、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ５に含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、「０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ、６５℃、２４時間」の条件をいう。
別の例として、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ヒトＥＲｄｊ５）において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＲｄｊ５としての活性を有するタンパク質も、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ５に含まれる。

本実施形態によるカルシウムポンプ機能制御物質のスクリーニングの具体的手順を、以下に例示する。この例では、インスリン還元活性法を用いる。まず、単離精製されたＥＲｄｊ５（例えば、組換え型のＥＲｄｊ５）を準備する。反応用緩衝液に、被験物質、ＥＲｄｊ５、インスリン、グルタチオンレダクターゼ、及びＮＡＤＰＨを溶解し、混和する。この溶液に、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加し、反応を開始させる。ＮＡＤＰＨ量を反映する３４０ｎｍの吸光度をモニターし、その減少量又は減少速度を測定する。
対照として、被験物質を添加しない系で同様の操作を行い、基準値を設定する。
そして、被験物質を添加した場合の測定値を、基準値と比較する。

ここで、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を促進する物質をスクリーニングしたい場合は、ＥＲｄｊ５の還元活性を増加させる物質をスクリーニングすればよいので、基準値よりも高い測定値を示した被験物質を選抜すればよい。一方、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を抑制する物質をスクリーニングしたい場合は、ＥＲｄｊ５の還元活性を減少させる物質をスクリーニングすればよいので、基準値よりも低い測定値を示した被験物質を選抜すればよい。

上記したように、本発明の１つの様相は、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を制御する物質をスクリーニングするカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法に係るものであるが、本スクリーニング方法でスクリーニングされるカルシウムポンプ制御物質には、様々な用途に適した物質が含まれる。例えば、本スクリーニング方法によって、メラニン色素の合成を阻害する物質をスクリーニングすることができる。すなわち本発明の特に好ましい様相は、上記したカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法によって、メラニン色素の合成を阻害する物質をスクリーニングするメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法である。

ここで、メラニン色素の生合成について説明する。メラニン色素はメラノサイト（melanocyte）で合成される。詳細には、メラノサイトのサイトゾルにおいて、Ｌ−チロシンがチロシナーゼによって酸化されてＬ−ドーパとなり、さらにＬ−ドーパが酸化されてドーパキノンとなる。そして、ドーパキノンが数段階の反応を経て、メラニン色素となる。すなわち、メラニン色素合成の出発物質はＬ−チロシンである。

また、細胞内のＬ−チロシンは、細胞外から取り込まれたＬ−フェニルアラニンから合成される。ここで、Ｌ−フェニルアラニンの細胞内への取り込みは、ＬＡＴ１をアンチポーターとする機構で行われ、カルシウムイオンの細胞外への放出と交換的に行われる。

このメラノサイトにおけるメラニン色素合成の機構を、ＥＲｄｊ５のＳＥＲＣＡ２に対する作用と組み合わせると、以下のことが期待される。すなわち、メラノサイトにおいて、ＥＲｄｊ５の還元作用によってＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能が促進されると、サイトゾルのカルシウムイオンが小胞体に取り込まれ、サイトゾルのカルシウムイオンが減少する。それに伴い、Ｌ−フェニルアラニンの細胞外からサイトゾルへの取り込みが抑制され、サイトゾル内のＬ−フェニルアラニンが減少する。これがメラニン色素合成の出発物質であるＬ−チロシンの減少につながり、結果的にメラニン色素の合成が阻害される。

本発明者らは、実施例で詳述するように、メラニン色素合成能を有する細胞において、ＥＲｄｊ５をＳＥＲＣＡ２に作用させることによって、メラニン色素の合成を阻害できることを初めて示した。このことから、ＥＲｄｊ５の発現量又は還元活性を増加させる物質は、メラニン色素の合成を阻害することができると考えられる。

メラニン色素合成阻害物質のスクリーニングにおいても、上記した全ての実施形態がそのまま適用可能である。例えば、上記した工程（ａ）及び（ｂ）を包含する実施形態において、メラニン色素の合成を阻害する物質をスクリーニングしたい場合は、ＥＲｄｊ５の還元活性を増加させる物質をスクリーニングすればよいので、陰性対照にて設定した基準値よりも高い測定値を示した被験物質を選抜すればよい。

本発明のベクターは、上記したカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法又はメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法（単離されたＥＲｄｊ５を用いる実施形態を除く）に用いるためのベクターであって、ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターと、レポーター遺伝子とを有し、前記プロモーターの下流に前記レポーター遺伝子が機能的に連結されていることを特徴とするものである。本発明のベクターを適宜の宿主細胞に導入し、当該細胞（組換え細胞）に被験物質を接触させることで、本発明のスクリーニング方法を簡便に行うことができる。市販のプロモーターレス蛍光タンパク質ベクターのレポーター遺伝子上流に、ＥＲｄｊ５のプロモーターを含むＤＮＡ断片を挿入することにより、本発明のベクターを構築することもできる。

本発明の細胞は、上記した本発明のベクターを有するものである。本発明の細胞の元となる宿主細胞は、ベクター上のＥＲｄｊ５のプロモーターが機能し、レポーター遺伝子が前記プロモーターの制御下で発現可能なものであれば、特に限定はない。宿主細胞の例としては、Ｂ１６メラノーマ細胞、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。本発明の細胞に被験物質を接触させることにより、本発明のスクリーニング方法を簡便に行うことができる。

本発明のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法によれば、様々な用途に有用な物質をスクリーニングすることができる。例えば、上記したように、ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を促進する物質は、メラニン色素合成阻害物質として有用である。メラニン色素合成阻害物質は、化粧品、医薬等への応用が可能である。その他、サイトゾルのカルシウムが外分泌の刺激になっているという事実から、ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を促進する物質は、外分泌を抑制する目的（例えば花粉症対策）に使用することができる。
一方、ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能を抑制する物質は、外分泌を促進する目的（例えばドライアイ対策）に使用することができる。

以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．塩化カルシウムを用いたサイトゾルのカルシウム濃度の測定
ＥＲｄｊ５ノックアウトマウス（−／−）およびＥＲｄｊ５ヘテロマウス（＋／−）から単離した線維芽細胞（ＭＥＦ−／−およびＭＥＦ＋／−）に、Yellow CameleonをLipofectamineLTX（Invitrogen）でトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、Yellow Cameleonがカルシウムとの結合によって引き起こす蛍光エネルギーの共鳴移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET）によって、サイトゾルのカルシウム濃度を測定した。図２（ａ），（ｂ）の矢印で示した時点で２０ｍＭ塩化カルシウムを添加し、サイトゾルにおけるカルシウムの一時的濃度上昇を観察した。

結果を図２（ａ），（ｂ）に示す。図２（ａ）はＭＥＦ＋／−（ＥＲｄｊ５を発現している細胞）の場合、図２（ｂ）はＭＥＦ−／−（ＥＲｄｊ５をノックアウトした細胞）の場合を示す。各グラフの縦軸は細胞内カルシウム濃度（相対値）、横軸は経過時間（分）である。
図２（ａ）に示すように、ＥＲｄｊ５を発現しているＭＥＦ＋／−では、塩化カルシウム添加後、サイトゾルのカルシウム濃度は２分程度で速やかに元のレベルに戻った。一方、図２（ｂ）に示すように、ＥＲｄｊ５が存在しないＭＥＦ−／−では、サイトゾルのカルシウム濃度が元のレベルに戻るまで６分以上かかった。これは、ＥＲｄｊ５が存在しないＭＥＦ−／−ではＳＥＲＣＡ２による小胞体へのカルシウムの取り込みが悪く、塩化カルシウム添加後におけるサイトゾルのカルシウムイオン濃度の戻りが悪くなっているためと考えられた。
以上より、ＥＲｄｊ５がＳＥＲＣＡ２に作用することにより、ＳＥＲＣＡ２のカルシウムポンプ機能が促進されることが示された。

２．メラニン色素合成阻害実験
本実施例では、ＨＥＫ２９３細胞にチロシナーゼを強制発現させてメラニン色素合成能を付与し、この細胞を用いてＥＲｄｊ５がメラニン色素の合成を阻害できることを示した。

ＨＥＫ２９３細胞に、チロシナーゼと、野生型ＥＲｄｊ５（ＷＴ）、ＥＲｄｊ５／ＡＡ変異体（ＳＳ）、又はＥＲｄｊ５／Ｈ６３Ｑ変異体（Ｈ６３Ｑ）とを共発現させた。なお、ＥＲｄｊ５／ＡＡ変異体は、還元活性をもたない変異型ＥＲｄｊ５である。ＥＲｄｊ５／Ｈ６３Ｑ変異体は、ＢｉＰに結合しない変異型ＥＲｄｊ５である。これらの変異型ＥＲｄｊ５は、いずれもＳＥＲＣＡ２への結合性が減弱している。
トランスフェクションから２４時間後に、各細胞の黒色化の有無を観察した。細胞へのトランスフェクションにはLipofectamine2000（Invitrogen）を使用した。
コントロールとして、チロシナーゼを発現させてＥＲｄｊ５を発現させないＨＥＫ２９３細胞（Ｍｏｃｋ）と、チロシナーゼを発現させない通常のＨＥＫ２９３細胞を用いた。

結果を図３に示す。図中、「Ｍｏｃｋ」はＥＲｄｊ５を発現させなかった細胞、「ＳＳ」はＥＲｄｊ５／ＡＡ変異体を発現させた細胞、「Ｈ６３Ｑ」はＥＲｄｊ５／Ｈ６３Ｑ変異体を発現させた細胞、「ＷＴ」は野生型ＥＲｄｊ５を発現させた細胞の場合を示す。左から１番目のマイクロチューブは、チロシナーゼを発現させなかった細胞の場合、左から２〜５番目のマイクロチューブは、チロシナーゼを発現させた細胞の場合である。
ＥＲｄｊ５を強制発現させた細胞（ＷＴ）では、メラニン色素の合成が阻害されて黒色化が抑えられた。これは、ＥＲｄｊ５によるＳＥＲＣＡ２の活性化によってサイトゾルのカルシウムイオンが小胞体に積極的に取り込まれ、サイトゾルでのカルシウムシグナルに依存するチロシンの供給が損なわれた結果であると考えられた。
一方、Ｍｏｃｋ、ＳＳ、Ｈ６３Ｑの場合は、いずれもメラニン色素の合成が阻害されず、細胞は黒色化した。ＥＲｄｊ５／ＡＡ変異体とＥＲｄｊ５／Ｈ６３Ｑ変異体は、いずれもＳＥＲＣＡ２への結合性が減弱しており、これらの結果から、メラニン色素の合成阻害は、ＥＲｄｊ５によるＳＥＲＣＡ２の活性化に起因すると考えられた。なお陽性対照では、メラニン色素の合成は起こらず、黒色化しなかった。
以上のように、ＥＲｄｊ５がＢｉＰを介してＳＥＲＣＡ２に結合し、かつＳＥＲＣＡ２を還元することにより、メラニン色素の合成が阻害されることが示された。

３．メラノーマＢ１６細胞を用いたメラニン合成量の測定
チロシナーゼを定常的に発現しているＢ１６細胞に、Lipofectamine2000を用いてＥＲｄｊ５またはＳＥＲＣＡ２ｂを強制発現させた。トランスフェクションから２４時間後、細胞を１Ｎ水酸化ナトリウムによって溶解し、溶解液を吸収波長４７０ｎｍで測定し、相対的なメラニン合成量を測定した。

図４に結果を示す。図４中、「Ｍｏｃｋ」はＥＲｄｊ５またはＳＥＲＣＡ２ｂを強制発現させない通常のメラノーマＢ１６細胞、「ＥＲｄｊ５」はＥＲｄｊ５を強制発現させたメラノーマＢ１６細胞、「ＳＥＲＣＡ２ｂ」はＳＥＲＣＡ２ｂを強制発現させたメラノーマＢ１６細胞の場合をそれぞれ示す。各メラニン合成量は、Ｍｏｃｋの場合を１とした相対値で示している。図４に示すように、ＥＲｄｊ５を過剰発現したメラノーマＢ１６細胞において、メラニン色素の合成量が有意に減少した。
以上より、ＥＲｄｊ５の過剰発現よるＳＥＲＣＡ２のカルシウムイオン取り込みの促進効果により、メラノーマＢ１６細胞のメラニン色素合成が抑制されることが示された。

Claims (5)

1. 被験物質が有する、ＥＲｄｊ５の発現量を増加又は減少させる機能を指標として、サイトゾルから小胞体内へのカルシウムイオンの取り込みに関わるカルシウムポンプ機能を制御する物質をスクリーニングすることを特徴とするカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法。
2. ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現量をもって、前記ＥＲｄｊ５の発現量を把握することを特徴とする請求項１に記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法。
3. 下記工程（ａ）及び（ｂ）：
   （ａ）ＥＲｄｊ５遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞又は当該細胞の抽出液に、被験物質を接触させる工程、
   （ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた細胞又は細胞の抽出液における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
   を包含することを特徴とする請求項２に記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法。
4. 前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項２又は３に記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載のカルシウムポンプ制御物質のスクリーニング方法によって、メラニン色素の合成を阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とするメラニン色素合成阻害物質のスクリーニング方法。