MX2012010813A - Diagnostico y tratamiento de cancer basado en avl9. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a péptidos, ácidos nucleicos y células para su utilización en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer. La presente invención se refiere además a epítopos peptídicos de linfocitos T citotóxicos (CTL) asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que sirven de ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulan las respuestas inmunitarias antitumorales. La presente invención se refiere a 95 secuencias peptídicas novedosas y sus variantes derivadas de moléculas HLA de clase 1 de células de tumor humanas que pueden utilizarse en composiciones de vacunas para desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales.

Description

DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE CANCER BASADO EN AVL9 La presente invención se refiere a péptidos, ácidos nucleicos y células para su utilización en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer. La presente invención se refiere además a epítopos asociados a tumores reconocidos por linfocitos T CD8 + , solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que sirven de ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulan respuestas inmunitarias antitumorales. La presente invención se refiere a 33 secuencias peptídicas novedosas y a sus variantes derivadas de moléculas HLA de clase I de células tumorales humanas que pueden utilizarse en composiciones de vacunas para desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales, particularmente respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL).

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cáncer gástrico es una enfermedad en la que se forman células malignas en la pared del estómago. El cáncer gástrico o de estómago puede desarrollarse en cualquier parte del estómago y extenderse por el mismo y por otros órganos; particularmente el esófago, los pulmones y el hígado. El cáncer de estómago es el cuarto tipo de cáncer más frecuente del mundo con 930 000 casos diagnosticados en 2002. Es una enfermedad con un elevado índice de mortalidad (~ 800 000 al año), lo que la convierte en la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en todo el mundo después del cáncer de pulmón. Es más frecuente en varones y en países asiáticos y emergentes. (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en) Representa aproximadamente el 2% (25 500 casos) de todos los nuevos casos de cáncer que cada año se diagnostican en Estados Unidos, pero es más frecuente en otros países. Es el principal tipo de cáncer en Corea, con un 20,8% de las neoplasias malignas. En Japón, el cáncer gástrico sigue siendo el tipo de cáncer más frecuente entre los varones. En Estados Unidos, cada año se diagnostica cáncer de estómago a unos 13 000 varones y 8 000 mujeres. La mayoría tiene más de 70 años.

El cáncer de estómago es el cuarto tipo de cáncer más frecuente en el mundo, después de los de pulmón, mama y colon y recto. Además, el cáncer de estómago sigue siendo la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer. La American Cáncer Society calcula que, en el año 2007, se registraron cerca de un millón de nuevos casos, casi el 70% de los mismos en países en desarrollo, y unas 800,000 muertes. (http://www.cancer.org/downloads/STT/Global_Facts_and_Figures_ 2007_rev2.pdf) Existe una enorme variación geográfica en cuanto a la incidencia de esta enfermedad en el mundo. Los mayores índices de la misma se registran en Asia y en partes de Sudamérica, y los menores en Norteamérica. Los mayores índices de mortalidad se registran en Chile, Japón, Sudamérica y la antigua Unión Soviética.

El cáncer gástrico suele diagnosticarse en una etapa avanzada debido a que, en la mayor parte del mundo, no se lleva a cabo ninguna prueba preventiva, a excepción de Japón (y de forma limitada en Corea), donde suele lograrse la detección temprana. Por lo tanto, sigue suponiendo un reto de primer orden para los profesionales de la salud. Los factores de riesgo para sufrir cáncer gástrico son la infección por Helicobacter pylori {H. pylori), fumar, la ingesta elevada de sal y otros factores dietéticos. Unos pocos cánceres gástricos (entre el 1% y el 3%) están relacionados con síndromes hereditarios de predisposición al cáncer gástrico. Las mutaciones de E-cadherina se dan en cerca del 25% de las familias con una predisposición autosómica dominante a padecer cánceres gástricos de tipo difuso. Este subconjunto de cáncer gástrico se ha denominado cáncer gástrico hereditario difuso. Podría ser útil proporcionar asesoramiento genético y considerar la gastrectomía profiláctica en portadores jóvenes y asintomáticos de una línea germinal truncada.

La pared del estómago está hecha de 3 capas de tejido: la túnica mucosa (la más interna), la túnica muscular (intermedia) y la túnica serosa (la más externa). El cáncer gástrico se inicia en las células de la túnica mucosa y se extiende por las capas más externas a medida que va creciendo. Se utilizan cuatro tipos de tratamientos estándar. El tratamiento del cáncer gástrico puede implicar cirugía, quimioterapia, radioterapia o quimiorradioterapia. La cirugía es el tratamiento primario para el cáncer gástrico. El objetivo de la cirugía es efectuar una resección completa con márgenes negativos (resección RO). Sin embargo, cerca del 50% de los pacientes con cáncer gástrico locorregional no tolera una resección R0. R1 indica cáncer residual microscópico (márgenes positivos); y R2 indica cáncer residual (macroscópico) pero enfermedad no distante. El desarrollo del paciente depende de la etapa inicial del cáncer en el momento del diagnóstico (Pautas NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology™).

El índice de 5 años de supervivencia en los casos de resección quirúrgica curativa es del 30-50% en pacientes con enfermedad en la etapa II y del 10-25% en pacientes con enfermedad en la etapa III. Estos pacientes presentan una elevada probabilidad de recaída local y sistémica. En el 80-90% de los individuos con cáncer de estómago se da metástasis, con un índice de seis meses de supervivencia del 65% en los diagnosticados en etapas tempranas y de menos del 15% en los diagnosticados en etapas avanzadas.

Por lo tanto, continúa habiendo necesidad de nuevas opciones de tratamiento seguro y eficaz contra el cáncer gástrico, el carcinoma de próstata, los carcinomas de la cavidad bucal, el carcinoma escamoso oral (OSCC), la leucemia mieloide aguda (AML), el linfoma MALT inducido por H. pylori, el cáncer colorrectal / carcinoma de colon, el glioblastoma, el cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC), el carcinoma cervical, el cáncer humano de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de colon, los cánceres pancreáticos, el adenocarcinoma pancreático ductal, el cáncer de ovario, el carcinoma hepatocelular, el cáncer de hígado, los tumores cerebrales de fenotipos diversos, las leucemias como la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el cáncer de pulmón, el sarcoma de Ewing, el cáncer de endometrio, el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, el cáncer epitelial de la laringe, el carcinoma esofágico, el carcinoma bucal, el carcinoma de la vejiga urinaria, los carcinomas de ovarios, el carcinoma de células renales, el meningioma atípico, el carcinoma papilar de tiroides, los tumores cerebrales, el carcinoma del conducto salival, el cáncer cervical, los linfomas de linfocitos T/NK extranodales, los linfomas no hodgkinianos y los tumores sólidos malignos de pulmón y mama y otros tumores, para mejorar el bienestar de los pacientes sin utilizar agentes quimioterapéuticos u otros agentes que podrían producir efectos secundarios graves.

La presente invención incorpora péptidos que estimulan el sistema inmunitario y actúan como agentes antitumorales de forma no invasiva.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos reconocidos como extraños por el sistema inmunitario huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas tanto humorales como celulares del sistema inmunitario para la inmunoterapia del cáncer.

Determinados elementos de la respuesta celular inmunitaria son capaces de reconocer y destruir específicamente células tumorales. El aislamiento de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de poblaciones de linfocitos destructores de tumores o de sangre periférica sugiere que tales linfocitos desempeñan una función importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Los linfocitos T CD8+ (TCD8 + ) en particular, que reconocen péptidos que portan moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de unos 8 a 10 residuos de aminoácidos derivados de proteínas o productos ribosómicos defectuosos (DRIP) situados en el citosol, desempeñan una función importante en esta respuesta. Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos de leucocito humano (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de células con un núcleo. Las moléculas MHC están compuestas de una cadena pesada alfa y beta-2-microglobulina (receptores MHC de clase I) o una cadena alfa y una cadena beta (receptores MHC de clase II), respectivamente. Su forma tridimensional resulta en un surco de unión que se utiliza para la interacción no covalente con péptidos. El MHC de clase I presenta péptidos que resultan de la escisión proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, DRIP y péptidos mayores. Las moléculas MHC de clase II predominan en células profesionales presentadoras de antígenos (APC). Presentan principalmente péptidos de proteínas exógenas o de transmembrana que las APC absorben durante el curso de la endocitosis, y que se procesan posteriormente. Los complejos de péptido y moléculas MHC de clase I son reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD8+ que portan el adecuado receptor de linfocitos T (TCR), mientras que los complejos de péptido y moléculas MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4 + que portan el adecuado TCR. Es bien sabido que el TCR, el péptido y el MHC están presentes así en una cantidad estequiométrica de 1:1:1.

Para que un péptido desencadene una respuesta celular inmunitaria, debe unirse a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de aminoácidos del péptido. Los péptidos de unión a MHC de clase I suelen ser de 8-12 residuos de aminoácido de largo y suelen contener dos residuos conservados («anchors») en su secuencia que interaccionan con el correspondiente surco de unión de la molécula MHC. En este sentido, cada alelo de MHC tiene un «motivo de unión» que determina qué péptidos pueden unirse específicamente al surco de unión.

En la reacción inmunitaria dependiente del MHC de clase I, los péptidos no sólo tienen que ser capaces de unirse a determinadas moléculas del MHC de clase I expresadas por células tumorales, sino que también deben ser reconocidos por linfocitos T portadores de receptores específicos de linfocitos T (TCR).

Los antígenos que son reconocidos por los CTL específicos de tumor, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteína, como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc., que son expresadas y, en comparación con células no alteradas del mismo origen, reguladas ascendentemente en las células del tumor correspondiente.

La clasificación actual de los antígenos asociados a tumores (TAA) comprende los siguientes grupos principales: a) Antígenos de cáncer de testículo: los primeros TAA identificados que pueden ser reconocidos por linfocitos T pertenecen a esta clase, a la que se denominó antígenos de cáncer de testículo (CT) por la expresión de sus miembros en tumores humanos histológicamente distintos y, en los tejidos normales, sólo en espermatocitos/espermatogonias del testículo y, ocasionalmente, en la placenta. Debido a que las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por linfocitos T en tejidos normales y pueden considerarse, por lo tanto, ¡nmunológicamente específicos de tumor. Ejemplos bien conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE o el NY-ESO-1. b) Antígenos de diferenciación: estos TAA son compartidos por los tumores y el tejido normal del que surge el tumor; la mayoría se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de estas proteínas relacionadas con el número de líneas de los melanocitos están involucradas en la biosíntesis de la melanina y no son, por lo tanto, específicas de tumor pero, no obstante, se utilizan ampliamente para la inmunoterapia del cáncer. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la tirosinasa y la Melan-A/MART-1 para el melanoma, o el PSA para el cáncer de próstata. c) TAA sobreexpresados: los genes que codifican TAA ampliamente expresados han sido detectados en tipos de tumor histológicamente diferentes, así como en muchos tejidos normales, generalmente con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epítopos procesados y presentados potencialmente por tejidos normales se encuentren por debajo del umbral de reconocimiento de linfocitos T, mientras que su sobreexpresión en células tumorales puede desencadenar una respuesta anticancerígena mediante la ruptura de la tolerancia previamente establecida. Ejemplos prominentes de esta clase de TAA son Her-2/neu, Survivin, Telomerasa o WT1. d) Antígenos específicos de tumor: estos TAA únicos surgen a partir de mutaciones de genes normales (como á-catenina, CDK4, etc). Algunos de estos cambios moleculares están relacionados con la evolución y/o transformación neoplásica. Los antígenos específicos de tumor suelen ser capaces de inducir respuestas inmunitarías fuertes sin el riesgo de reacciones autoinmunes contra los tejidos normales. Por otro lado, en la mayoría de los casos, estos TAA sólo son relevantes para el tumor exacto en el que se identificaron y no suelen ser compartidos por muchos tumores individuales. e) TAA que surgen de modificaciones anormales postraduccionales: tales TAA pueden surgir de proteínas que no son ni específicas ni están sobreexpresadas en los tumores pero que, no obstante, se vuelven asociados a tumores mediante procesos postraduccionales principalmente activos en tumores. Ejemplos de este tipo surgen de pautas alteradas de glicosilación que conducen a nuevos epítopos en tumores como MUC1 o sucesos como el empalme de proteínas durante la degradación, que puede o no ser específico de tumor. f) Proteínas oncovíricas: estos TAA son proteínas víricas que pueden desempeñar una función crítica en el proceso oncogénico y, debido a que son foráneas (no de origen humano), pueden suscitar una respuesta de linfocitos T. Ejemplos de tales proteínas son las proteínas del virus del papiloma humano de tipo 16, E6 y E7, que se expresan en el carcinoma cervical.

Para que las proteínas sean reconocidas por linfocitos T citotóxicos como antígenos asociados o específicos de tumores, y para que se puedan utilizar en una terapia, deben cumplirse unos requisitos concretos. El antígeno debe estar expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos sanos normales o en cantidades comparablemente pequeñas. También es deseable que el antígeno correspondiente no sólo esté presente en un tipo de tumor, sino que además aparezca en concentraciones altas (es decir, en número de copias por célula del péptido correspondiente). Los antígenos asociados a tumores y específicos de tumores suelen derivar de proteínas involucradas directamente en la transformación de una célula normal en célula de tumor debida a una función, por ejemplo, en el control del ciclo celular o la inhibición de la apóptosis. Adicionalmente, las dianas en dirección 3' de las proteínas directamente causantes de una transformación pueden estar reguladas ascendentemente y así estar asociadas indirectamente a tumores. Tales antígenos indirectos asociados a tumores también pueden ser dianas de un enfoque de vacunación (Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cáncer Immunol. Immunother., marzo de 2004, 453 (3): 187-95). En ambos casos, es esencial que los epítopos estén presentes en la secuencia de aminoácidos del antígeno, ya que tal péptido («péptido inmunógeno») que deriva de un antígeno asociado a tumores debe conducir a una respuesta de los linfocitos T in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unir una molécula MHC puede actuar como epítopo de linfocito T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T con el TCR correspondiente y la ausencia de tolerancia ¡nmunitaria para este epítopo en particular.

Por lo tanto, los TAA son un punto de partida en el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos para la identificación y caracterización de TAA están basados en la utilización de CTL que pueden aislarse de pacientes o sujetos sanos, o están basados en la generación de perfiles de transcripción diferencial o en pautas diferenciales de expresión peptídica entre tumores y tejidos normales.

Sin embargo, la identificación de genes sobreexpresados en tejidos de tumor o en líneas celulares humanas de tumor, o expresados selectivamente en dichos tejidos o líneas celulares, no proporciona información precisa sobre la utilización de los antígenos que se están transcribiendo desde estos genes en una inmunoterapia. Esto se debe a que tan sólo una subpoblacion individual de epítopos de estos antígenos es adecuada para una utilización de estas características, ya que un linfocito T con el TCR correspondiente debe estar presente y la tolerancia ¡nmunitaria para este epítopo particular debe estar ausente o ser mínima. Por lo tanto, es importante seleccionar tan sólo aquellos péptidos de proteínas sobreexpresadas o expresadas selectivamente que estén presentes en conexión con moléculas MHC contra las que se halle un linfocito T funcional. Tal linfocito T funcional se define como un linfocito T que, al ser estimulado con un antígeno específico, puede expandirse clonalmente y es capaz de llevar a cabo funciones efectoras («linfocito T efector»).

Los linfocitos T colaboradores desempeñan una función importante en la organización de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos de linfocitos T colaboradores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T colaboradores del tipo THi apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T destructores CD8+, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra células tumorales que muestran complejos de MHC/péptidos asociados a tumores en sus superficies. En este sentido, los epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir de ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulen las respuestas inmunitarias antitumorales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figuras 1A-1D: Ejemplo de espectro de masas de CDC2-001 mostrando su presentación en la muestra de tumor principal GC2464. Se realizó nano-ESI-LCMS en una mezcla de péptidos eluida de la muestra 2464 de cáncer gástrico. El cromatograma de masas para m/z 597,3501 ± 0.001 Da, z = 2 muestra un pico peptídico en el momento de retención 151,63 min. B) El pico detectado en el cromatograma de masas a 151,63 min reveló una señal de m/z 597,3501 en el espectro de masas. C) Un espectro de masas de degradación de inducción por colisión del precursor seleccionado m/z 597,3501 registrado en el experimento nano-ESI-LCMS en el momento de retención dado confirmó la presencia de CDC2-001 en la muestra de tumor GC2464. D) El modelo de fragmentación del péptido de referencia CDC2-001 sintético fue registrado y comparado al modelo de fragmentación de TU AP natural generado mostrado en C para la verificación de secuencias.

Figuras 2A-2B: Perfiles de expresión de mRNA de proteínas seleccionadas en tejidos normales y en 25 muestras de cáncer gástrico a) CDC2 (ID del ensayo: 203213_at) b) ASPM (ID del ensayo: 219918_s_at) Figura 3: Ejemplos de resultados de inmunogenicidad in vitro especifica de péptidos de TUMAP de clase I. Se sensibilizaron linfocitos T CD8+ utilizando APC artificiales cargadas con péptido relevante (panel izquierdo) e irrelevante (panel derecho), respectivamente. Después de tres ciclos de estimulación, se efectuó la detección de células reactivas a los péptidos mediante la tinción doble con multimeros relevantes e irrelevantes A*2402. Las células mostradas se envían en linfocitos CD8+ vivos y los números de las tramas representan porcentajes de linfocitos de multimeros positivos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Tal y como se utilizan aquí, y a menos que se indique de otra manera, todos los términos se definen como se indica más abajo. El término «péptido» se utiliza en la presente invención para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados uno a otro típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos carbonilo y amino-alfa de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos son preferentemente de 9 aminoácidos de largo, pero pueden ser de un mínimo de 8 aminoácidos de largo, y de un máximo de 10, 11, 12, 13 o 14 aminoácidos de largo.

El término «oligopéptido» se utiliza en la presente invención para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados uno a otro típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos carbonilo y amino-alfa de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crítica para la invención, siempre que el epítopo o epítopos correctos se mantengan. Los oligopéptidos son típicamente menores de unos 30 residuos de aminoácidos de largo, y mayores de unos 14 aminoácidos de largo.

El término «polipéptido» designa una serie de residuos de aminoácidos, conectados uno a otro típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos carbonilo y amino-alfa de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crítica para la invención, siempre que se mantengan los epítopos correctos. En contraste con los términos «péptido» y «oligopéptido», el término «polipéptido» se usa para referirse a moléculas que contienen más de unos 30 residuos de aminoácidos.

Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica tal molécula es «inmunógeno» (y por lo tanto es un inmunogén en la presente invención) si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la habilidad para inducir una respuesta de linfocitos T. Por lo tanto, un inmunogén sería una molécula que es capaz de inducir una repuesta inmunitaria y, en el caso de la presente invención, una molécula capaz de inducir una respuesta de linfocitos T.

Un «epítopo» de linfocito T requiere un péptido corto que está unido a un receptor MHC de clase I, formando un complejo ternario (cadena alfa MHC de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por un linfocito T que porte el receptor de linfocito T correspondiente unido al complejo de péptido/MHC con afinidad adecuada. Los péptidos unidos a moléculas MHC de clase I tienen una longitud típica de entre 8 y 14 aminoácidos y, con la mayor frecuencia, de 9 aminoácidos.

En los seres humanos, existen tres locus genéticos diferentes que codifican moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC de los humanos también se designan antígenos de leucocito humanos (HLA)): HLA-A, HLA-B, y HLA-C. HLA-A*0l, HLA-A*02, y HLA-A*024 son ejemplos de alelos MHC de clase I diferentes que pueden expresarse desde estos locus.

Tabla 1: Frecuencias de expresión F de HLA*A024 y serotipos HLA*A02402 más frecuentes Las frecuencias se deducen de las frecuencias Gf de haplotipo de la población americana adaptadas de Mori et al. (Mori et al., 1017-27), empleando la fórmula de Hardy-Weinberg F=1-(1-Gf)2. Para más detalles, véase Chanock et al. (Chanock et al., 1211-23).

Frecuencias de expresión de serotipos HLA*24 y A*2402 en todo el mundo Alelo Población Fenotipo calculado de la frecuencia de alelo A*24 Filipinas 65% A*24 Nenets (Rusia) 61% A*2402 Japón 59% A*24 Malasia 58% A*2402 Filipinas 54% A*24 India 47% A*24 Corea del Sur 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 China 32% A*2402 India 29% A*24 Oeste de Australia 22% A*24 EUA 22% A*24 Samara (Rusia) 20% A*24 América del Sur 20% A*24 Europa 18% Tal y como se utiliza en la presente invención, la referencia a una secuencia de DNA incluye tanto DNA monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al DNA monocatenario de dicha secuencia, al dúplex de dicha secuencia con su complemento (DNA bicatenario) y al complemento de dicha secuencia. El término «región codificante» se refiere a esa porción de un gen que codifica, o bien natural o normalmente, el producto de expresión de ese gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión nativo del gen.

La región codificante puede ser de un gen alterado, mutado o no mutado («normal»), o incluso puede ser de una secuencia de DNA, o gen, sintetizado completamente en el laboratorio usando métodos bien conocidos para los expertos en síntesis de DNA.

El término «secuencia nucleotídica» se refiere a un heteropolímero de desoxirribonucleótidos.

La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser de formación natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de DNA que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención se ensamblan a partir de fragmentos de cDNA y conectores cortos de oligonucleótidos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operón microbiano o vírico.

El término «producto de expresión» se refiere al polipéptido o la proteína que es el producto de traducción natural del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifica equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y que, por lo tanto, codifica el/los mismo(s) aminoácido(s).

El término «fragmento», al estar referido a una secuencia de codificación, se refiere a una porción de DNA que comprende menos de la región codificante completa, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.

El término «segmento de DNA» se refiere a un polímero de DNA, en la forma de un fragmento separado o como un componente de un constructo de DNA mayor, que se ha derivado del DNA aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, manipulación y recuperación del segmento y sus secuencias nucleotídicas de componentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, la utilización de un vector de clonación. Tales segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones de secuencias internas no traducidas, o intrones, que están presentes típicamente en los genes eucarióticos. Las secuencias de DNA no traducido pueden estar presentes en dirección 3' desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.

El término «cebador» se refiere a una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede emparejarse con una cadena de DNA y que suministra un extremo 3?? libre en el que una polimerasa de DNA comienza la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.

El término «promotor» se refiere a una región de DNA involucrada en la unión de la polimerasa de RNA para iniciar la transcripción.

El término «aislado» se refiere a que el material se elimina de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido de formación natural presentes en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleotido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y seguir estando aislados en el sentido de que dicho vector o composición no sea parte de su entorno natural.

Los polinucleótidos y los polipéptidos inmunógenos o recombinantes, descritos de acuerdo con la presente invención, también pueden presentarse en forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la correspondiente técnica entienden tales términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de cDNA se han purificado de manera convencional hasta una homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o el material natural hasta al menos un orden de magnitud, preferentemente dos o tres órdenes, y más preferentemente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente un polipéptido reivindicado que tiene una pureza preferente del 99,999% o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, con mayor preferencia, del 99% por peso o mayor.

Los productos de expresión de polipéptidos y ácidos nucleicos descritos conforme a la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen tales ácidos nucleicos y/o tales polipéptidos, pueden estar en «forma enriquecida». Tal y como se utiliza en la presente invención, el término «enriquecido» se refiere a que la concentración del material es al menos unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0,01%, por peso, preferentemente al menos cerca del 0,1% por peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de cerca del 0,5%, 1%, 5%, 10%, y 20% por peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprende la presente invención pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada.

El término «fragmento activo» se refiere a un fragmento que genera una respuesta inmunitaria (es decir, que tiene una actividad inmunógena) cuando se administra, solo u opcionalmente con un adyuvante adecuado, a un animal, tal como un mamífero, por ejemplo, un conejo o un ratón, e incluyendo también a un humano, adoptando tal respuesta inmunitaria la forma de estimulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor, tal como un humano. Alternativamente, el «fragmento activo» también se puede utilizar para inducir una respuesta in vitro de linfocitos T.

Tal y como se utilizan en la presente invención, los términos «porción», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en referencia a polipéptidos, se refieren a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, formando dicha secuencia un subconjunto de una secuencia más larga. Por ejemplo, si un polipéptido se sometiera a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, tales como la tripsina o la quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarían porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido de inicio. Esto se refiere a que, cualquier fragmento de tales características, contendrá necesariamente como parte de su secuencia de aminoácidos un segmento, fragmento o porción sustancialmente idéntico, o exactamente idéntico, a una de las secuencias SEQ ID n.° 1 a 33, que corresponden a las proteínas «precursoras» o naturales de las secuencias SEQ ID n.° 1 a 33. Utilizados en relación con los polinucleótidos, estos términos se refieren a los productos producidos por el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.

Conforme a la presente invención, el término «identidad porcentual» o «porcentualmente idéntico», al estar referido a una secuencia, se refiere a que una secuencia se compara con una secuencia descrita o reivindicada tras la alineación de la secuencia que se va a comparar (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces conforme a la siguiente fórmula: Identidad porcentual = 100 [I -(C/R)] donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde: (i) cada base o aminoácido en la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineado correspondiente en la secuencia comparada y (¡i) cada gap en la secuencia de referencia y (iii) cada aminoácido o base en alineación en la secuencia de referencia que es distinto de un aminoácido o base en alineación en la secuencia comparada, constituye una diferencia; y R es el número de bases o aminoácidos en la secuencia de referencia a lo largo de la alineación con la secuencia comparada con cualquier gap creado en la secuencia de referencia también contado como base o aminoácido.

Si existe una alineación entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual calculada más arriba sea aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada tiene la identidad porcentual mínima especificada con respecto a la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada más arriba sea menor que la identidad porcentual especificada.

Los péptidos originales aquí descritos se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Tales sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora, por ejemplo, cuando un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como cuando un aminoácido hidrofóbico es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de igual o parecido tamaño y naturaleza química, como cuando la leucina es reemplazada por isoleucina. En estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homologas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos suelen tolerarse más que otras, y éstas suelen mostrar correlación con las similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, lo cual es la base de la definición de las «sustituciones conservadoras».

Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg, Lys); grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, lie, Val, Cys); y grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr, Trp).

Las sustituciones menos conservadoras podrían implicar el reemplazo de un aminoácido por otro que tenga características similares pero que sea algo distinto en tamaño, tal como el reemplazo de una alanina por un residuo de isoleucina. Los reemplazos altamente no conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido acídico por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inoperantes, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien podrían provocar efectos inesperados impredecibles a partir de principios químicos simples.

Naturalmente, tales sustituciones pueden implicar estructuras distintas a los aminoácidos L habituales. De esta forma, los aminoácidos D pueden ser sustituidos por los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aún así, englobarse en la descripción del presente documento. Además, los aminoácidos que procesan grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también se pueden usar para sustituciones con el fin de producir inmunogenes y polipéptidos inmunógenos conformes a la presente invención.

Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, no se sustituirán más de 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.

El término «respuesta de linfocitos T» se refiere a la activación y proliferación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vivo o in vitro. Para los CTL restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden ser la lisis de células diana presentadoras de péptido de forma natural, sensibilizadas reiteradamente con péptido-precursor o sensibilizadas reiteradamente con péptido, la secreción de citocinas, preferentemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducido por péptido, la secreción de moléculas efectoras, preferentemente granzimas o perforinas inducidas por péptido, o la desgranulación.

Preferentemente, cuando los CTL específicos de un péptido de las secuencias SEQ ID n.° I a 33 se prueban frente a los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la que los péptidos sustituidos logran la mitad del incremento máximo de lisis en relación al fondo no es mayor de aproximadamente 1 mM, preferentemente no es mayor de aproximadamente 1 µ?, más preferentemente no es mayor de aproximadamente 1 nM, y aún más preferentemente no es mayor de aproximadamente 100 pM y, con la máxima preferencia, no es mayor de aproximadamente 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por CTL de más de un individuo, al menos de dos y, más preferentemente, de tres individuos.

De esta forma, los epítopos de la presente invención pueden ser idénticos a epítopos específicos de tumores o asociados a tumores naturales o pueden incluir epítopos que difieran en no más de 4 residuos del péptido de referencia, siempre que tengan una actividad antigénica sustancialmente idéntica.

Enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que el sistema inmunitario huésped detecta como extraños. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia del cáncer.

Determinados elementos de la respuesta celular inmunitaria son capaces de reconocer y destruir específicamente células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotoxicos (CTL) de poblaciones de linfocitos destructores de tumores o de sangre periférica sugiere que tales linfocitos desempeñan una función importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Los linfocitos T CD8+ (TCD8+) en particular, que reconocen péptidos que portan moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de entre unos 8 a 12 residuos derivados de proteínas o productos ribosómicos defectuosos (DRIP) situados en el citosol, tienen una función importante en esta respuesta. Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos de leucocito humano (HLA).

Las moléculas MHC de clase I se encuentran en la mayoría de las células con núcleo que presentan péptidos que resultan de la escisión proteolítica de proteínas principalmente endógenas, citosólicas o nucleares, DRIPS, y péptidos más largos. Sin embargo, los péptidos derivados de compartimentos endosomicos o fuentes exógenas también suelen hallarse en moléculas MHC de clase I. Esta forma no clásica de presentación de clase I se designa presentación cruzada en la literatura de la materia.

Para que las proteínas sean reconocidas por linfocitos T citotoxicos como antígenos asociados o específicos de tumores, y para que se utilicen en una terapia, deben cumplirse unos requisitos concretos. El antígeno debe estar expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos normales sanos o en cantidades comparablemente pequeñas. También es deseable que el antígeno correspondiente no sólo esté presente en un tipo de tumor, sino que además aparezca en concentraciones altas (es decir, en número de copias del péptido correspondiente por célula). Los antígenos asociados a tumores y específicos de tumores suelen derivar de proteínas involucradas directamente en la transformación de una célula normal en célula de tumor por una función, por ejemplo, en el control del ciclo celular o la apóptosis. Adicionalmente, también las dianas en dirección 3' de las proteínas directamente causantes de una transformación pueden estar reguladas ascendentemente y asociadas así indirectamente a tumores. Tales antígenos asociados indirectamente a tumores también pueden ser dianas en un enfoque de vacunación. En ambos casos es esencial la presencia de epítopos en la secuencia de aminoácidos del antígeno, ya que tal péptido («péptido inmunógeno») que deriva de un antígeno asociado a tumores debe conducir a una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unir una molécula MHC puede funcionar como epítopo de linfocito T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T con el TCR correspondiente y la ausencia de tolerancia inmunitaria para este epítopo en particular.

Por lo tanto, los TAA son un punto de partida en el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos para la identificación y caracterización de TAA están basados en la utilización de CTL que pueden aislarse de pacientes o sujetos sanos, o están basados en la generación de perfiles de transcripción diferencial o en pautas de expresión de péptidos diferenciales entre tumores y tejidos normales (Lemmel et al., 450-54; Weinschenk et al., 5818-27).

Sin embargo, la identificación de genes sobreexpresados en tejidos de tumor o en líneas celulares de tumor humanas, o expresados de forma selectiva en dichos tejidos o líneas celulares, no proporciona información precisa sobre la utilización de los antígenos en transcripción desde estos genes en una inmunoterapia. Esto se debe a que tan sólo una subpoblación individual de epítopos de estos antígenos es adecuada para una aplicación de estas características, ya que un linfocito T con el TCR correspondiente debe estar presente y la tolerancia inmunitaria para este epítopo en particular debe estar ausente o ser mínima. Por lo tanto, es importante seleccionar sólo aquellos péptidos de proteínas sobreexpresadas o expresadas selectivamente que se presenten en conexión con moléculas MHC contra las que se halle un linfocito T funcional. Dicho linfocito T funcional se define como un linfocito T que, al ser estimulado con un antígeno específico, puede expandirse clonalmente y es capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).

Los linfocitos T colaboradores desempeñan una función importante en la organización de la función efectora de CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos de linfocitos T colaboradores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T colaboradores de tipo Tm apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T destructores CD8+, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra células de tumor que muestran complejos de MHC/péptidos asociados a tumores en sus superficies. En este sentido, los epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir de ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulen las respuestas inmunitarias antitumorales.

Puesto que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, participan de forma conjunta y sinérgica en el efecto antitumoral, la identificación y caracterización de antígenos asociados a tumores reconocidos o por CTL CD8+ (molécula MHC de clase I) o CTL CD4+ (molécula MHC de clase II), es importante en el desarrollo de vacunas antitumorales. Un objeto de la presente invención es, por tanto, proporcionar composiciones de péptidos que contengan péptidos que se unan a complejos MHC de cualquiera de las dos clases.

Considerando los graves efectos secundarios y los costes relacionados con el tratamiento del cáncer, se necesitan con urgencia métodos mejores de diagnóstico y pronóstico. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar otros factores que representen marcadores biológicos para el cáncer en general y el cáncer gástrico en particular. Además, existe la necesidad de identificar factores que puedan ser utilizados en el tratamiento del cáncer en general y del cáncer gástrico en particular.

Además, no existe un plan terapéutico establecido para pacientes de cáncer gástrico con recaída bioquímica tras una prostatectomía radical, causada normalmente por tumor residual dejado in situ en presencia de crecimiento tumoral avanzado localmente. Serían deseables nuevos enfoques terapéuticos que confieran menor morbilidad con eficacia terapéutica comparable en relación a los enfoques terapéuticos disponibles actualmente.

La presente invención proporciona péptidos que son útiles para el tratamiento del cáncer gástrico y otros tumores que sobreexpresan los péptidos de la invención. Mediante espectrometría de masas, se mostró que estos péptidos eran presentados de forma natural por moléculas HLA en muestras de cáncer gástrico humano primario (véase el ejemplo 1 y las figuras 1A-1 D).

Los genes fuente de los que derivan los péptidos mostraron estar muy sobreexpresados en el cáncer gástrico, el carcinoma de células renales, el cáncer de colon, el carcinoma no microcítico de pulmón, el adenocarcinoma, el cáncer de próstata, la neoplasia benigna y el melanoma maligno, en comparación con tejidos normales (véase el ejemplo 2 y las figuras 2A-2B), mostrando un alto grado de asociación a tumores del péptido, es decir, que estos péptidos son presentados intensamente en tejido de tumor pero no en tejidos normales.

Los péptidos unidos a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, específicamente por células/linfocitos T. Los linfocitos T pueden destruir las células que presenten el complejo péptido/HLA reconocido como, por ejemplo, células de cáncer gástrico que presenten los péptidos derivados.

Todos los péptidos de la presente invención que fueron compatibles con la plataforma de validación -véase el ejemplo3- se han mostrado capaces de estimular respuestas de linfocitos T (véase el ejemplo 3 y la figura 3). De esta forma, los péptidos son útiles para la generación de una respuesta inmunitaria en un paciente, mediante la que se pueden destruir las células tumorales. Una respuesta inmunitaria en un paciente se puede inducir mediante la administración directa al paciente de las sustancias precursoras adecuadas o los péptidos descritos (por ejemplo, péptidos alargados, proteínas o ácidos nucleicos que codifiquen estos péptidos), idealmente en combinación con un agente que potencie la ¡nmunogenia (es decir, un adyuvante). Se puede esperar que la respuesta inmunitaria que se origina de una vacunación terapéutica de estas características sea altamente específica contra las células tumorales, porque los péptidos diana de la presente invención no están presentados en tejidos normales en número comparable de copias, lo que previene el riesgo de reacciones autoinmunes no deseadas contra células normales del paciente.

Las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos, o bien en su forma libre, o en forma de sal farmacéuticamente aceptable. Tal y como se utiliza en la presente invención, una «sal farmacéuticamente aceptable» se refiere a un derivado de los péptidos descritos, donde el péptido es modificado mediante la elaboración de sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (en la que, típicamente, la forma neutral del fármaco tiene un grupo -NH2 neutral), lo que implica una reacción con un ácido adecuado. Los ácidos adecuados para la preparación de sales ácidas incluyen tanto ácidos orgánicos como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico, y similares, así como ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. A la inversa, la preparación de sales básicas de regiones ácidas que puedan estar presentes en un péptido se realiza utilizando una base farmacéuticamente aceptable como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido amónico, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.

En una preparación especialmente preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos como sales de ácido acético (acetatos) o ácido clorhídrico (cloruros).

Además de su utilidad para el tratamiento del cáncer, los péptidos de la presente invención también son útiles con fines diagnósticos. Debido a que los péptidos se generaron a partir de células de cáncer gástrico y a que se determinó que no estaban presentes en tejidos normales, estos péptidos pueden usarse para diagnosticar la presencia de un cáncer.

La presencia de los péptidos reivindicados en biopsias de tejido puede ayudar al patólogo a diagnosticar el cáncer. La detección de determinados péptidos mediante anticuerpos, espectrometría de masas u otros métodos usados por los expertos en la técnica, puede indicar al patólogo si el tejido es maligno, está inflamado o está enfermo en general. La presencia de grupos de péptidos permite la clasificación o subclasificación de tejidos enfermos.

La detección de péptidos en especímenes de tejido enfermo puede posibilitar la decisión acerca del beneficio de terapias que involucren al sistema inmunitario, especialmente si se sabe o se espera que los linfocitos T estén involucrados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo bien conocido mediante el cual las células malignas o infectadas escapan a la vigilancia inmunitaria. De esta forma, la presencia de péptidos muestra que este mecanismo no es aprovechado por las células analizadas.

Pueden utilizarse los péptidos para analizar las respuestas de linfocitos contra los péptidos, tales como las respuestas de linfocitos T o respuestas de anticuerpos contra el péptido o el péptido que forma un complejo con las molécula MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden usarse como marcadores de pronóstico para decidir las siguientes etapas de la terapia. Estas respuestas también pueden usarse como marcadores secundarios en enfoques inmunoterapéuticos dirigidos a inducir respuestas de linfocitos por medios distintos, como, por ejemplo, mediante vacunación de proteínas, ácidos nucleicos, material autólogo o traslado adoptivo de linfocitos. En la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos puede considerarse en la evaluación de los efectos secundarios. La monitorización de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta útil en los estudios de seguimiento de terapias de transplante, como, por ejemplo, para detectar enfermedades del injerto contra el huésped y del huésped contra el injerto.

Los péptidos pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/péptido. Éstos pueden utilizarse en terapia, direccionalizando toxinas o sustancias radioactivas al tejido afectado. Otro forma de utilización de estos anticuerpos puede consistir en la direccionalización de radionuclidos al tejido afectado destinada a la formación de imágenes, como la tomografía PET. Esto puede ayudar a detectar pequeñas metástasis o a determinar el tamaño y la localización precisa de los tejidos afectados.

Además, pueden utilizarse para verificar el diagnóstico de cáncer del patólogo, basado en una muestra de biopsia.

La tabla 2 muestra los péptidos conforme a la presente invención, su correspondiente n.° de SEQ ID, y las proteínas fuente de las que podrían derivar estos péptidos. Todos los péptidos se unen a los alelos HLA A*024.

Tabla 2: péptidos de la presente invención Otros péptidos HLAA*024 interesantes de la invención En otra forma de preparación de la invención se describen péptidos unidos a HLA A*02 contra el cáncer gástrico. Para las personas que son A*02 y/o A*24 positivo, se pueden usar mezclas de los péptidos descritos para el tratamiento del cáncer gástrico. Se prefieren mezclas de entre 2 y 20 péptidos y mezclas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 péptidos.

Proteína del ciclo 2 de división celular (CDC2) La serina/treonina quinasa CDC2, también conocida como Cdk1 (quinasa 1 dependiente de ciclina), desempeña una función fundamental en el control del ciclo celular. Se conoce como el principal regulador de la transición G2 a M. Al final de la interfase, se une a ciclinas de tipo A. Tras la ruptura de la envoltura nuclear, las ciclinas de tipo A son sustituidas por ciclina B, que forma el factor promotor de la mitosis (MPF) con Cdc2. El MPF es fundamental para dirigir las células a lo largo de la mitosis.

La función del Cdc2 en la mitosis es no redundante y no puede compensarse con la actividad de otras Cdks como Cdk2, 4 y 6. En contraste, también se ha informado del funcionamiento de Cdc2 en otras fases del ciclo celular como la transición G1-S, y es capaz de sustituir a las «Cdks de interfase». Por lo tanto, se propuso la Cdc2 como la única Cdk esencial del ciclo celular.

Se halló sobreexpresión de Cdc2 en varios cánceres, a menudo en correlación con un pronóstico desfavorable. Entre ellos se encuentran el carcinoma de próstata, los carcinomas de la cavidad bucal, el carcinoma escamoso bucal (OSCC), la leucemia mieloide aguda (AML) (Qian et al.), el linfoma MALT inducido por H. pylori (Banerjee et al., 217-25) y el carcinoma de colon (Yasui et al., 36-41). En el carcinoma gástrico se ha informado de sobreexpresion y/o actividad potenciada que podría desempeñar una función causante. Los inhibidores de Cdc2 y otras Cdks han sido considerados como candidatos para fármacos para la terapia del cáncer (Shapiro, 1770-83).

Proteína anormal de tipo fusiforme asociada a la microcefalia (ASPM) La proteína anormal de tipo fusiforme asociada a la microcefalia (ASPM) es el ortólogo humano de la anormal fusiforme de la Drosophila (ASP). Está involucrada en la regulación de la neurogénesis y su mutación causa microcefalia autosómica recesiva primaria. La ASPM se localiza en los polos del huso durante la mitosís. Se ha sugerido la sobreexpresion de la ASPM como marcador y diana terapéutica potencial en el glioblastoma. La disminución de la expresión mediada por siRNA inhibe la proliferación de las células tumorales y de las células nerviosas precursoras. La sobreexpresion de la ASPM también puede anunciar un potencial invasivo/metastático, recurrencia temprana del tumor y diagnóstico desfavorable en el carcinoma hepatocelular. La ASPM estaba regulada ascendentemente en células inmortalizadas y en tejidos de cáncer de pulmón no microcítico (Jung, Choi y Kim, 703-13).

Metaloproteasas 3 de la matriz (M P3) MMP3, también llamada progelatinasa o estromelisina 1, es una endopeptidasa que escinde los componentes de la matriz extracelular (ECM) como la fibronectina, la laminina, la elastina, el centro proteico del proteoglicano y las regiones no helicoidales de los colágenos. Las MMP son importantes en varios procesos fisiológicos que requieren el reordenamiento de la ECM, tales como la migración celular durante la embriogénesis, la remodelación de tejidos, la vascularización, la involución de las mamas después de la crianza y la curación de heridas. La MMP3 también desempeña una función en los conglomerados plaquetarios. Los estados patológicos que implican la secreción y la expresión potenciada de MMP3 incluyen estados inflamatorios autoinmunes y cáncer.

La MMP3 se encuentra sobreexpresada en algunos tumores y desempeña una función en la transición epitelio-mesenquimática (EMT). También podría participar en las fases tempranas de la cancerogénesis, desencadenando cambios epigenéticos que resulten en la generación de un fenotipo maligno (Lochter et al., 180-93). Se ha mostrado que los polimorfismos en el promotor MMP3 que están relacionados con los niveles de expresión inciden en el riesgo y el pronóstico de algunos cánceres como el adenocarcinoma esofágico (Bradbury et al., 793-98) y el carcinoma bucal de células escamosas (Vairaktaris et al., 4095-100) (Liu et al., 430-35). Los pacientes de cáncer gástrico por H. pylori con niveles potenciados de suero MMP3 y MMP7 mostraron una mayor invasión de los nodulos linfáticos y un menor índice de supervivencia.

En un estudio de cohortes con 74 pacientes de cáncer gástrico, la M P3 estaba expresada en el 27% de los casos (Murray et al., 791-97). c-Met El c-Met media en las actividades potencialmente oncogénicas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) / factor de difusión, incluyendo la potenciación del crecimiento celular, la motilidad, la supervivencia, la disolución de la matriz extracelular y la angiogénesis. La unión del HGF activa los eventos de señalización en dirección 3' incluyendo las vías relacionadas con la quinasa y activadas por mitógeno, fosfolipasa Cá, fosfatidilinositol 3'-quinasa y Ras (Dong et al., 5911-18; Furge et al., 10722-27; Furge, Zhang y Vande Woude, 5582-89; Montesano et al., 355-65; Naldini et al., 501-04; Ponzetto et al., 4600-08). El c-Met se expresa de forma predominante en células epiteliales. La activación oncogénica del c-Met (también en tejidos malignos no epiteliales) puede ser el resultado de procesos de amplificación o sobreexpresión, mutaciones de activación, adquisición de bucles autocrinos de c-Met/HGF o fosforilación constitutiva (Di Renzo et al., 147-54; Ferracini et al., 739-49; Fischer et al., 733-39; Koochekpour et al., 5391-98; Li et al., 8125-35; Maulik et al., 41-59; Qian et al., 589-96; Ramírez et al., 635-44; Tuck et al., 225-32) (Nakaigawa et al., 3699-705). La activación constitutiva de c-Met en ratones transgénicos que sobreexpresan HGF promueve una amplía tumorigenia (Takayama et al., 701-06; Wang et al., 1023-34). La desactivación del MET tiene como resultado la inhibición del crecimiento tumoral y la metástasis (Corso et al., 684-93). La amplificación de MET se ha relacionado con la evolución del cáncer gástrico humano (Lin et al., 5680-89) (Yokozaki, Yasui y Tahara, 49-95).

Hidrolasa carboxilo-terminal de ubiquitina L5 (UCHL5) La UCHL5, también conocida como hidrolasa carboxilo de ubiquitina (UCH37) o INO80R, es una deubiquitinasa asociada a proteasomas. Desensambla cadenas de poliubiquitina ligadas a proteínas del extremo distal mediante la escisión del enlace isopeptídico entre los extremos C Lys48 y Cys76 (Nishio et al., 855-60). En el núcleo, UCHL5 se asocia al complejo de remodelación de cromatina Ino80. Con la unión de un proteasoma, se activa y puede participar en la regulación de la transcripción o la reparación del DNA que se ha sugerido como mediada por Ino80 y el proteasoma.

Las proteasas específicas de ubiquitina como UCHL5 están involucradas en varios procesos tales como el control de la evolución del ciclo celular, la diferenciación, la reparación y replicación del DNA, la transcripción, el control de calidad de las proteínas, la respuesta inmunitaria y la apóptosis. UCHL5 podría participar en la transformación maligna. Se ha demostrado que su actividad aparece regulada ascendentemente en el tejido de carcinoma cervical humano, en comparación con el tejido normal. Es capaz de deubiquitinizar y así estabilizar el receptor TGF-beta y sus mediadores en dirección 3', las proteínas Smads, potenciando así la señalización TGF-beta. La señalización potenciada de TGF-beta puede actuar como promotora del tumor en etapas avanzadas de la evolución del cáncer, aunque tiene una función dual y también puede ser inhibidora del tumor en etapas tempranas y antes de su inicio (Bierie y Moses, 29-40; Horton et al., 138-43; Wicks et al., 8080-84; Wicks et al., 761-63).

Receptor de la proteína estimuladora de macrófagos (MST1R) El receptor ST1R (alias RON) es un miembro de la familia Met de receptores tirosina quinasa de la superficie celular y se expresa principalmente en macrófagos y células epiteliales. MST1R puede inducir la migración, invasión, proliferación y supervivencia de las células en respuesta a su ligando. Se han mostrado sus propiedades oncogénicas in vitro y en modelos animales in vivo, y suele estar regulada descendentemente en los cánceres humanos (Dussault y Bellon, 2009). Algunos estudios clínicos han mostrado que la sobreexpresión de MST1R está relacionada con la metástasis y el diagnóstico desfavorable. La expresión de MST1R es significativa en el tejido de carcinoma gástrico y el correspondiente tejido paraneoplásico, pero no se observa en la mucosa gástrica normal (Zhou et al., 236-40). La disminución de la expresión de MST1R en células de cáncer de próstata tiene como resultado la quimiotaxis reducida de células endoteliales in vitro, y el crecimiento tumoral reducido y la densidad reducida de los microvasos tras el transplante ortotopico in vivo en la próstata. La reducción de la expresión de MST1R mediada por siRNA en una línea celular de cáncer de colon muy tumorígena condujo a una proliferación reducida en comparación con las células de control.

Proteína de tipo quinesina (KIF2C) KIF2C es una depolimerasa microtubular que regula la unión microtubular del cinetocoro durante la formación del huso. Es importante en la segregación cromosómica de anafase y puede ser necesaria para coordinar el comienzo de la separación del centrómero hermana. La unión microtubular perturbada en los cinetocoros conduce a la segregación fallida de cromosomas y aneuploidía, que se observa en la mayoría de tumores sólidos (Maney et al., 67-131; oore y Wordeman, 537-46). KIF2C se encuentra sobreexpresada en células de cáncer de mama (Shimo et al., 62-70), cáncer de colon, cáncer colorrectal y cáncer gástrico (Nakamura et al., 543-49). Una linea celular de cáncer gástrico (AZ521) que expresaba KIF2C de forma estable mostró una mayor proliferación y migración en comparación con las células de control transfectadas. La expresión elevada de KIF2C en el cáncer gástrico puede estar relacionada con la invasión linfática, la metástasis de los nodulos linfáticos y el diagnóstico desfavorable. El tratamiento de las células de cáncer de mama con RNA pequeño de interferencia contra KIF2C inhibió su crecimiento.

Mantenimiento estructural de proteínas 4 de cromosomas (SMC4) Las proteínas SMC son ATPasas cromosómicas que desempeñan funciones en la dinámica y organización cromosómica de orden superior. SMC4 es un componente central del complejo de condensina que desempeña una función en la condensación de cromatina y que también se ha relacionado con la segregación nucleolar, la reparación del DNA y el mantenimiento del supercóntigo de cromatina. El gen SMC4 se halló muy expresado en las glándulas salivales y prostéticas normales, muy débilmente en el colon, páncreas e intestino, y sin expresión en otros tejidos. Se observaron niveles altos de expresión de RNA en muchas líneas celulares de cáncer y especímenes de cáncer, incluyendo cánceres de mama, próstata, colon y páncreas (Egland et al., 5929-34).

Receptor 2 de efrina tipo A (EPHA2) Los receptores Eph son una familia única de receptores tirosina quínasa (RTK) que desempeñan funciones críticas en la tipificación embrionaria, la direccionalización neuronal y el desarrollo vascular durante la embriogénesis normal. La estimulación de EphA2 mediante su ligando (efrina-A1) tiene como resultado la autofosforilación de EphA2; la estimulación invierte la transformación oncogénica. Los receptores Eph y sus ligandos, las efrinas, frecuentemente están sobreexpresados en una amplia variedad de cánceres. EphA2 suele estar sobreexpresado y alterado funcionalmente en células agresivas de tumor, y se cree que promueve el crecimiento tumoral mediante la potenciación de la adhesión de la matriz extracelular de la célula, el crecimiento independiente del anclaje y la angiogénesis. Se halló sobreexpresión de EphA2 y Efrina A-1 en el carcinoma gástrico, en correlación con la profundidad de la invasión tumoral, las fases de metástasis del nodulo tumoral (TNM), la metástasis del nodulo linfático y el diagnóstico desfavorable (Yuan et al., 2410-17).

ATAD 2 ATAD2 (también conocida como ANCCA) es un nuevo miembro de las proteínas de la familia ATPasa AAA+. Potencia la actividad transcripcional del receptor de andrógeno (AR) y el receptor de estrógeno (ER), conduciendo a la transcripción de genes incluyendo IGF1R, IRS-2, SGK1 y surviving (AR) y ciclina D1, c-myc y E2F1 (ER), respectivamente. También potencia la actividad transcripcional de c-Myc.

La expresión de ATAD2 es elevada en varios tumores humanos como el cáncer de mama, el cáncer de próstata y el osteosarcoma. Su expresión se ha relacionado con el diagnóstico desfavorable.

AVL9 Sorprendentemente, esta proteína se halló como proteína fuente, y sólo se dispone de datos escasos y muy limitados acerca de la proteína AVL9 y la función del gen correspondiente.

Cadena proteica de colágeno alfa-1 (XII) (Col12A1) La cadena de colágeno alfa-1 (XII) es una proteína que en humanos está codificada por el gen COL12A1. Este gen codifica la cadena alfa del colágeno de tipo XII, un miembro de la familia de colágenos FACIT (colágenos asociados a fibrilas con hélices triples interrumpidas). El colágeno de tipo XII es un homotrímero que se encuentra asociado al colágeno de tipo I, asociación que se cree que modifica las interacciones entre las fibrilas de colágeno I y la matriz circundante. Alternativamente, se han identificado variantes de transcrito de empalme que codifican distintas isoformas.

Cadena proteica de colágeno alfa-3(VI) (COL6A3) COL6A3 codifica la cadena alfa 3, una de las tres cadenas alfa de colágeno de tipo VI. Se ha mostrado que los dominios proteicos unen proteínas de la matriz extracelular, interacción que explica la importancia de este colágeno en la organización de los componentes de la matriz. La remodelación de la matriz extracelular mediante la sobreexpresión del colágeno VI participa en la resistencia al cisplatino en las células de cáncer de ovario. La presencia del colágeno VI guardaba correlación con el grado del tumor, un factor del pronóstico del cáncer de ovario (Sherman-Baust et al., 377-86). COL6A3 se sobreexpresa en el tumor colorrectal (Smith et al., 1452-64) y el carcinoma de glándulas salivales (Leivo et al., 104-13), y se expresa de forma diferencial en el cáncer gástrico (Yang et al., 1033-40). COL6A3 se identificó como uno de los siete genes con variantes de empalme específicas de tumor. Las alteraciones de empalme específicas de tumor validadas resultaron altamente consistentes, permitiendo una clara separación entre las muestras de cáncer y las normales y, en algunos casos, incluso entre las distintas fases del tumor (Thorsen et al., 1214-24).

Anemia de Fanconi, grupo complementario I (FANCI) La proteína FANCI se sitúa en la cromatina en respuesta a lesiones del DNA y está involucrada en la reparación del DNA (Smogorzewska et al., 289-301). Las mutaciones en el gen FANCI son causantes de la anemia de Fanconi, un desorden recesivo genéticamente heterogéneo caracterizado por la inestabilidad citogenética, la hipersensibilidad a agentes de entrecruzamiento de DNA, la rotura cromosómica aumentada y la reparación defectuosa del DNA. El empalme alternativo de FANCI resulta en dos variantes de transcrito que codifican distintas isoformas.

Proteína de choque térmico de 90 kDa, miembro 1 beta (HSP90B1) El miembro 1 de la HSP90 (también conocida como proteína 94 regulada por glucosa, Grp94) es una proteína chaperona humana. Participa en procesos asociados al retículo endoplasmático: traducción, control de calidad de las proteínas y degradación asociada al retículo endoplasmático (ERAD), detección de estrés en el retículo endoplasmático y unión/retención de calcio en el retículo endoplasmático (Christianson et al., 272-82; Fu y Lee, 741-44). HSP90 contiene la secuencia KDEL típica de las proteínas retenidas por el retículo endoplasmático, pero también aparece en la superficie de las células tumorales (Altmeyer et al., 340-49) y extracelularmente. Se sabe que las proteínas de choque térmico se liberan de células necróticas (pero no apoptósicas) y de células estresadas por diversos estímulos como el choque térmico y el estrés oxidativo, y pueden darse en la circulación (Basu et al., 1539-46; Tsan y Gao, 274-79).

Extracelularmente, HSP90 modula (y principalmente estimula) las respuestas inmunitarias y está involucrada en la presentación de antígenos. En la superficie celular, puede servir de receptor para la entrada de patógenos y/o la señalización (Cabanes et al., 2827-38). En caso de liberación o expresión específicas de tumor en la superficie celular, puede inducir inmunidad antitumoral (Zheng et al., 6731-35). Se ha mostrado que las vacunas basadas en HSP90 inmunizan contra el cáncer y enfermedades infecciosas en protocolos tanto profilácticos como terapéuticos (consultado en Bolhassani y Rafati, 1185-99; Castelli et al., 227-33; Murshid, Gong y Calderwood, 1019-30).

Sin embargo, HSP90 también puede considerarse diana para la terapia de tumores, ya que 1) guarda correlación con la evolución del tumor y conduce a la resistencia hacia la apóptosis, también en el tratamiento con quimioterapia o irradiación, y 2) se encuentra sobreexpresada en muchos tumores incluyendo el cáncer gástrico, el osteosarcoma (Guo et al., 62-67) y el carcinoma de mama (Hodorova et al., 31-35). La sobreexpresión de HSP90 está relacionada con el comportamiento agresivo y el pronostico desfavorable en el cáncer gástrico (Wang, Wang y Ying, 35-41; Zheng et al., 1042-49). La regulación descendente de HSP90 en el cáncer gástrico conduce a la apóptosis de las células de cáncer (Sheu, Liu y Lan, e1096).

Muc 6 MUC6 se expresa en células mucosas. Se cree que su función principal es la protección de superficies epiteliales vulnerables de los efectos dañinos de la exposición constante a un amplio rango de agentes endógenos proteolíticos o cáusticos (Toribara et al., 1997). Es posible que MUC6 también desempeñe una función en la organogénesis epitelial (Reid y Harris, 1999). Se encuentra expresión de MUC6 en la mucosa gástrica normal. Está sobreexpresado en algunos cánceres como el adenoma y el carcinoma intestinal, el carcinoma pulmonar (Hamamoto et al., 891-96), los pólipos colorrectales (Bartman et al., 210-18) y el carcinoma de mama (Pereira et al., 210-13), mientras que no está expresado en los correspondientes tejidos normales. Se ha sugerido que el alto nivel de expresión de MUC6 en el carcinoma mucinoso actúa como barrera en la expansión del cáncer, lo que resulta en un comportamiento biológico menos agresivo (Matsukita et al., 26-36). La expresión de MUC6 era menor en los carcinomas gástricos que en los adenomas o en la mucosa normal y guardaba correlación inversa con el tamaño del tumor, la profundidad de la invasión, la invasión linfática y venosa, la metástasis de los nodulos linfáticos y la clasificación de la UICC. La regulación descendente de MUC6 puede contribuir a la transformación maligna de células epiteliales gástricas y subyacer en las bases moleculares del crecimiento, la invasión, la metástasis y la diferenciación del carcinoma gástrico (Zheng et al., 817-23). También hay pruebas de que la infección por Helicobacter pylori, una de las principales causas de carcinoma gástrico, está relacionada con la expresión reducida de UC6 (Kang et al., 29-35; Wang y Fang, 425-31).

Proteína cinetocoro Nuf2 El gen NUF2 (CDCA-1) codifica una proteína que es muy similar al Nuf2 de la levadura, un componente de un complejo proteico conservado asociado al centrómero. El Nuf2 de la levadura desaparece del centrómero durante la profase meiótica, cuando los centrómeros pierden su conexión con el huso, y desempeña una función reguladora en la segregación de cromosomas. Se ha mostrado que los csiRNA de hNuf2 y survivin reducen temporalmente la expresión de sus mRNA, provocando multinucleación y muerte celular por detención mitótica, respectivamente (Nguyen et al., 394-403). Nuf2 y Hec1 son necesarios para la organización de sitios de unión estables del extremo positivo del microtúbulo en la placa externa, necesarios para las fuerzas mantenidas en dirección a los polos requeridas para la biorientación y los cinetocoros (DeLuca et al., 519-31).

La proteína Nuf2 se halló sobreexpresada en NSCLC, relacionada con un diagnóstico desfavorable (Hayama et al., 10339-48), y en el cáncer cervical (Martin et al., 333-59). En tejidos de cáncer gástrico seccionados quirúrgicamente (de tipo difuso, 6; de tipo intestinal, 4), 2 variantes de NUF2 se encontraban reguladas ascendentemente. Las variantes de empalme alternativas detectadas en este estudio se sugirieron como potencialmente útiles como marcadores diagnósticos y/o dianas novedosas para la terapia contra el cáncer (Ohnuma et al., 57-68).

Se ha descubierto que la reducción de la expresión mediada por siRNA contra NUF2 inhibe la proliferación celular y la inducción de la apóptosis en NSCLC, el cáncer de ovario, el cáncer cervical, el cáncer gástrico, el cáncer colorrectal y el glioma (Kaneko et al., 1235-40).

Fosfato lipídico fosfohidrolasa 2 (PPAP2C) Las fosfatasas de ácido fosfatídico (PAP) convierten el ácido fosfatídico en diacilglicerol y actúan en la síntesis de novo de glicerolípidos, así como en la transducción de señales activada por receptores mediada por la fosfolipasa D. Se ha informado de tres variantes de transcrito empalmadas alternativamente que codifican isoformas distintas. PPAP2C se encuentra regulado ascendente en células precursoras mesenquimales primarias de humano adulto (MSC) transformadas y en numerosos cánceres humanos. Es posible que se necesite para la proliferación aumentada de células. La sobreexpresión de PPAP2C, y no un mutante catalíticamente inactivo, fue la causa de la entrada prematura en fase S, acompañada de acumulación prematura de ciclina A. La reducción de la expresión disminuye la proliferación celular mediante el retraso de la entrada en la fase S (Flanagan et al., 249-60).

La proteína ribosómica S11 de 40S es una proteína (RPS11) Los ribosomas consisten en una subunidad pequeña de 40S y una subunidad grande de 60S. Juntas, estas subunidades están compuestas de 4 especies de RNA y unas 80 proteínas estructuralmente diferenciadas. El gen RPS11 codifica una proteína ribosómica que es un componente de la subunidad 40S. RPS11 se encontró entre seis genes en un cribado de marcadores fecales basados en RNA para el diagnóstico del cáncer colorrectal. Se encontró específicamente en colonocitos fecales derivados de pacientes de cáncer (Yajima et al., 1029-37).

Ligasa Seven de la ubiquitina E3 en el homólogo 2 absentia (SIAH2) SIAH2 es una ligasa de la ubiquitina E3. Entre sus substratos se encuentran la beta-catenina, TRAF2 y DCC (borrado en el cáncer colorrectal) (Habelhah et al., 5756-65; Hu y Fearon, 724-32; Nakayama, Qi y Ronai, 443-51). SIAH2 también conduce a la degradación de la proteína nuclear repp86, lo que resulta en la abrogación de la detención mitótica inducida por la sobreexpresión de esta proteína (Szczepanowski et al., 485-90). SIAH2 tiene propiedades de promoción del tumor y de la metástasis mediante al menos dos vías de señalización, revisadas en Nakayama, Qi y Ronai, 443-51. En primer lugar, conduce a la ubiquitinización y degradación de las proteínas en la vía de respuesta a la hipoxia, lo que conduce a la actividad transcripcional potenciada de factores inducidos por hipoxia (HIF) (Nakayama, Qi y Ronai, 443-51) (Calzado et al., 85-91). En segundo lugar, inhibe Sprouty2, un inhibidor específico de la señalización Ras/ERK. La actividad de SIAH2 guarda correlación con el desarrollo del tumor pancreático, posiblemente por su efecto positivo en la señalización Ras (Nakayama, Qi y Ronai, 443-51). Aunque la función de SIAH2 en el cáncer es en parte controvertida, algunos documentos muestran una relación entre los niveles bajos de SIAH2 y una respuesta a la terapia o un diagnóstico más desfavorables (Confalonier! et al., 2959-68) (Jansen et al., 263-71), mientras que otros muestran una función tumorígena (Frasor et al., 13153-57). La inhibición de SIAH2 se ha considerado como tratamiento contra el cáncer, puesto que se ha mostrado que inhibe el crecimiento de los injertos heterologos en modelos de melanoma de ratón (Qi et al., 16713-18; Shah et al., 799-808) y de las líneas celulares de cáncer de pulmón humano injertadas en ratones desnudos (Ahmed et al., 1606-29).

Transportador de taurina dependiente de cloruro y sodio (SLC6A6) SLC6A6 es un transportador de taurina dependiente de cloruro y sodio (TauT) (Han et al., 2006). Los ratones con expresión anulada del transportador de taurina (taut-/-) sufren enfermedad crónica del hígado debida a la deficiencia de taurina, lo que podría implicar una disfunción mitocóndrica (Warskulat et al., 2006). La expresión de SLC6A6 está reprimida por el gen p53 de inhibición tumoral y es transactivada por protooncogenes tales como WT1, c-Jun y c-Myb. La sobreexpresión de SLC6A6 protege las células renales de la nefrotoxicidad inducida por cisplatina (Han et al., 2006; Han y Chesney, 2009). La expresión de mRNA de SLC6A6 se encontraba regulada ascendentemente por el factor alfa de necrosis de tumor (TNF-alfa) en las células epiteliales Caco-2 del intestino humano (Mochizuki et al., 2005).

Proteína de unión Ubiquinol-citocromo c reductasa (UQCRB) La proteína codificada por el gen UQCRB es parte del complejo ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa. Liga la ubiquinona y participa en la transferencia de electrones. Las mutaciones en este gen están relacionadas con la deficiencia mitocóndrica del complejo III. Se ha descrito un pseudogén en el cromosoma X.

El gen UQCRB puede ser un oncogén potencial o un gen de inhibición tumoral en el adenocarcinoma pancreático ductal (Harada et al., 13-24). Se halló sobreexpresado en el carcinoma hepatocelular (Jia et al., 1133-39) Receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico humano (ERBB3) ERBB3 codifica un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de receptores tirosina quinasa. Se activa mediante neuregulinas, mediante otros receptores ERBB y no ERBB, así como otras quinasas, y mediante mecanismos novedosos. En dirección 3', interacciona de forma prominente con la vía mitogénica / de supervivencia AKT/fosfoinositol 3-kinasa, pero también con GRB, SHC, SRC, ABL, rasGAP, SYK y el regulador de la transcripción EBP1 (Sithanandam y Anderson, 413-48). Se ha hallado sobreexpresión de ERBB3 en muchos cánceres incluyendo el cáncer gástrico, en el que puede desempeñar una función causante clave e incidir negativamente en el pronóstico (Kobayashi et al., 1294-301) (Slesak et al., 2727-32). En (Zhang et al., 2112-18) se halló que la sobreexpresión de ERBB3 era más frecuente en el cáncer gástrico de tipo difuso (26,2%) que en el de tipo intestinal (5,0%). En ambos tipos, la sobreexpresión estaba relacionada con un diagnóstico desfavorable. Los enfoques para la direccionalización de ERBB3 en la terapia del cáncer incluyen aptámeros de RNA al dominio extracelular (Chen et al., 9226-31), el bloqueo de su expresión génica mediante factores de transcripción sintética (Lund et al., 9082-91), los inhibidores de molécula pequeña como el isómero de vitamina E á-tocotrienol (Samant y Sylvester, 563-74), miRNA (Scott et al., 1479-86) y siRNA (Sithanandam et al., 1847-59).

Prominina 1 (Proml) Función: La Prominina-1, también denominada CD133, se identificó como molécula específica para las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ (Yin et al., 1997) y se mostró como marcador de células precursoras normales y células precursoras de cáncer (CSC) de diversos tejidos. Se sitúa principalmente en las protusiones de la membrana plasmática, y podría estar involucrada en la organización de la topología de la membrana o en el mantenimiento de la composición lipídica de la membrana plasmática. Se ha sugerido que una isoforma de empalme de la prominina-1 denominada AC133-2 y carente de un exón pequeño de 27 aminoácidos puede representar un marcador de células precursoras aún mejor (Mizrak et al., 2008; Bidlingmaier et al., 2008).

Sólo un pequeño porcentaje de células tumorales suele ser positivo para la prominina-1, tal y como se espera de un marcador CSC. Dependiendo del tipo de tumor, el número de células positivas por masa tumoral alcanza entre el 1 y el 15% y en su mayoría es del 2 %.

La prominina-1 se ha relacionado con la formación de tumores, la angiogénesis y la quimiorresistencia (Zhu et al., 2009a) (Bruno et al., 2006; Hilbe et al., 2004) (Bertolini et al., 2009). Sin embargo, las células positi vas de prominina-1 podrían ser accesibles por parte del sistema inmunitario, puesto que pueden ser destruidas por células NK (Castriconi et al., 2007; Pietra et al., 2009) y linfocitos T citotóxicos (Brown et al., 2009).

Mientras que para muchas entidades de cáncer se ha mostrado que las células positivas de prominina-1 son funcionalmente CSC, y su expresión se ha relacionado frecuentemente con un diagnóstico desfavorable, todavía existen controversias. Algunos documentos afirman que no es ni necesaria ni suficiente para la identificación de CSC (Cheng et al., 2009; Wu y Wu, 2009). Es posible que una combinación de prominina-1 con otras moléculas como CD44, o incluso combinaciones múltiples como prom1(+), CD34(+), CD44( + ), CD38(-), CD24(-) sean mejores marcadores de CSC (Zhu et al., 2009b; Fulda y Pervaiz, 2010).

En el cáncer gástrico difuso, se sugirió la expresión de PROM1 según un análisis in silicio (Katoh y Katoh, 2007) y en (Smith et al., 2008), se informó de la sobreexpresión en el cáncer gástrico a nivel proteico en comparación con el tejido normal de estómago. Sin embargo, en (BoegI y Prinz, 2009) se informaba de que la expresión de prominina-1 se encontraba reducida en el cáncer gástrico, especialmente en etapas avanzadas, y se reivindicaba que la expresión de la prominina-1 guarda más correlación con la angiogénesis -que también se encuentra reducida en las fases avanzadas- que con el crecimiento del tumor. Un estudio con líneas celulares de cáncer gástrico (Takaishi et al., 2009) reivindica que CD44, y no la prominina-1 , es el marcador CSC en el cáncer gástrico.

Metaloproteinasas 11 de la matriz (MMP11) Al igual que otras MMP, la MMP11 es una endopeptidasa que actúa en procesos que requieren de la remodelación de tejidos, tales como el desarrollo, la curación de heridas y la formación de cicatrices. También podría regular negativamente la homeostasis de grasas mediante la reducción de la diferenciación de los adipocitos. En contraste con otras MMP, no es capaz de escindir moléculas típicas de la matriz extracelular, excepto el colágeno VI. Sin embargo, se han identificado otros sustratos como la alfa 2-macroglobulina, ciertos inhibidores de serina proteasa (serpinas) incluyendo la alfa 1 antitripsina, la proteina-1 de unión al factor de crecimiento insulinoide y el receptor de laminina. En el cáncer, la MMP11 se expresa principalmente en las células de estroma que rodean el tejido tumoral. Esto se ha demostrado en numerosas entidades tumorales. Se ha afirmado que la MMP11 está sobreexpresada en el estroma de la mayoría de los carcinomas invasivos humanos, pero raras veces en sarcomas y otros tumores no epiteliales. En la mayoría de los casos, aunque no en todos, la MMP11 se expresa en células de estroma directamente adyacentes al tumor, mientras que las propias células tumorales, los tejidos normales y las células de estroma alejadas del tumor son negativas. Los niveles más altos de MMP11 guardan correlación con un fenotipo maligno / mayor invasividad y un pronóstico desfavorable. Sin embargo, en los carcinomas papilares tiroideos, la expresión de MMP11 estaba inversamente vinculada a características agresivas. Se encontró MMP11 en tejido de tumor así como en suero de pacientes de cáncer gástrico, y su expresión guardaba correlación con la metástasis (Yang et al.). Además, en (Deng et al., 274-81), se muestra que MMP11 está muy expresada en líneas celulares de tumor y en tumores primarios de cáncer gástrico -en contraste con otros tipos de cáncer, no exclusivamente en el estroma- y que parece potenciar la proliferación de células tumorales.

Subunidad beta del factor de transcripción nuclear Y (NFYB) El NFYB, también denominado CBF-B o CBF-A es, junto con NFYA y NFYC, una parte del factor de transcripción NF-Y heterotrimérico basal (también factor de unión de CCAAT o CBF) que se une a motivos CCAAT -o los motivos inversos, ATTGG, denominados Y-box- en los promotores y potenciadores de numerosos genes. Entre los genes diana de NF-Y se encuentran los genes MHC de clase II, el receptor beta PDGF, varias proteínas de choque térmico, el gen hMLH1 de reparación de la disparidad y la topoisomerasa II alfa.

NFYB no es un oncogén clásico, aunque su función podría participar en la tumorigenia. En primer lugar, muchos genes del ciclo celular como la ciclina A, la ciclina B 1 , Aurora A y cdkl son dianas de NF-Y. Las células son detenidas en la fase G2 / M sin NFYB funcional. En (Park et al.) se muestra que la regulación ascendente de la ciclina B2 y de otros genes relacionados con el ciclo celular en el adenocarcinoma colorrectal se debe a la actividad de NF-Y. En segundo lugar, la actividad de NF-Y contrarresta la apoptosis. Las células carentes de NF-Y sufren apoptosis por la activación de p53 y la transcripción reducida de genes antiapoptósicos que contienen secuencias de CCAAT en sus promotores, como Bcl-2 (Benatti et al., 1415-28). En tercer lugar, sus propiedades tumorígenas se potencian en combinación con otros factores de transcripción. Por ejemplo, el p53 mutado se une a NF-Y y a las proteínas p300, aumentando la expresión de genes del ciclo celular inducido por NF-Y.

ABL1 La proteína tirosína quinasa c-Abl se transporta entre los compartimentos nuclear y citoplasmático. La proteína nuclear c-Abl está involucrada en la inhibición del crecimiento celular y la apoptosis, mientras que la c-Abl citoplasmática puede desempeñar una función en la dinámica de la actina, la morfogénesis y la señalización inducida por estímulos extracelulares como los factores de crecimiento y los ligandos de integrina. Se ha informado que la c-Abl citoplasmática promueve la mitogénesis.

La actividad de la proteína c-Abl está regulada negativamente por su dominio SH3, y la eliminación del dominio SH3 convierte a ABL1 en un oncogén. En la leucemia mieloide crónica (CML), el gen es activado por translocación dentro del gen BCR (región del punto de ruptura) en el cromosoma 22. Esta proteína BCR-ABL de fusión resultante se encuentra en el citosol y permite que las células proliferen sin estar reguladas por las citocinas (Zhao et al.). La actividad de c-Abl también está regulada ascendentemente en los tumores sólidos, como se mostró para los carcinomas de mama y el NSCLC. La sobreexpresión no es suficiente y la actividad constitutiva de la quinasa requirió fosforilación de proteínas. En las células de cáncer de mama, la fosforilación de c-Abl está inducida por tirosina quinasas de membrana plasmática, incluyendo SFK, miembros de la familia EGFR y el receptor IGF-1. No se han detectado proteínas de fusión ABL en tumores sólidos (Lin y Arlinghaus, 2008). Se mostró que ABL se expresaba en el carcinoma gástrico y los microvasos asociados, lo que sugiere una posible función en la angiogénesis. Es de destacar que el gen A (CagA) asociado a la citotoxina H. pylori conduce a la activación de c-Abl, que, consecuentemente, fosforila el EGFR y, de esta forma, bloquea la endocitosis de EGFR (Bauer, Bartfeld y Meyer, 156-69). Varios inhibidores de la tirosina quinasa son más o menos específicos de Abl. Se utiliza Imatinib (Gleevec) como terapia de primera línea para la CML, y también ha sido autorizado para pacientes con tumores estromáticos gastrointestinales avanzados (GIST), puesto que también se direccionaliza a KIT (Pytel et al., 66-76) (Croom y Perry, 2003). Otros inhibidores utilizados para la terapia del cáncer son Dasatinib y Nilotinib (Pytel et al., 66-76) (Deremer, Ustun y Natarajan, 1956-75).

Quinasa 4 tipo polo (Plk4) Los miembros de la familia de las quinasas tipo polo (Plk 1 -4) son importantes durante la división celular, regulando varias etapas durante la mitosis. Plk4 es un organizador de la duplicación y formación de centriolos (Rodrigues-Martins et al., 1046-50). Mientras que P I k 1 es claramente un oncogén, la función de Plk4 en el cáncer es ambigua. La regulación descendente y la sobreexpresión de Plk4 se ha relacionado con el cáncer en humanos, ratones y moscas (Cunha-Ferreira et al., 43-49). Por ejemplo, en el cáncer colorrectal, Plk4 se halló sobreexpresada, pero un pequeño grupo de pacientes mostró una fuerte regulación descendente de Plk4 (Macmillan et al., 729-40). Esto puede explicarse por el hecho de que tanto la sobreexpresión como la deficiencia de Plk4 conducen a una formación aberrante de centriolos, lo que resulta en cantidades y estructuras anormales de centrosomas que frecuentemente se detectan en las células tumorales y participan en las aberraciones mitóticas que causan aneuploidía y segregación fallida de cromosomas (Peel et al., 834-43) (Kuriyama et al., 2014-23) (Korzeniewski et al., 6668-75).

Motivo IQ que contiene proteína 3 de activación de la GTPasa (IQGAP3) Las IQGAP participan en las vías celulares de señalización así como en la arquitectura citoesquelética y la adhesión celular. Poseen un dominio similar en secuencias a RasGAPs y, en consecuencia, se unen a GTPasas pequeñas. Sin embargo (y a pesar de su nombre), ninguna de ellas presenta actividad GTPasa. Se ha mostrado que IQGAP1 y IQGAP2 incluso estabilizan el estado ligado a GTP de Rac1 y Cdc42, y se ha sugerido que IQGAP3 estabiliza el Ras activado (Nojima et al., 971-78; White, Brown y Sacks, 1817-24). Por medio de su dominio IQ, se unen al calcio/calmodulina y, por medio de un dominio de homología de calponina, a filamentos de actina (White, Brown y Sacks, 1817-24). Wang et al., 567-77, informan que IQGAP3 se expresa en el cerebro, donde se asocia a filamentos de actina así como a Rac1 y Cdc42. Se acumula en la región distal de los axones y promueve la extensión de los axones dependientes de Rac1/Ccd42. Las IQGAP se han relacionado con el cáncer. Se considera que IQGAP1 es un oncogén. Potencia varias vías relacionadas con el cáncer como la señalización mediada por VEGF, la beta-catenina y la MAP kinasa, y está sobreexpresada en muchos tumores. IQGAP2 parece funcionar más bien como inhibidora de tumores y se encontró reducida en los cánceres gástricos con pronóstico desfavorable (White, Brown y Sacks, 1817-24). Se dispone de poca información acerca de IQGAP3. En (Skawran et al., 505-16), se halló entre los genes regulados ascendentemente de manera significativa en el carcinoma hepatocelular Dos estudios informan que IQGAP3 se encuentra expresado específicamente en células Ki67+ en proliferación en el hígado, el colon y el intestino delgado de ratón (Nojima et al., 971-78) (Kunimoto et al., 621-31).

Dominio de la hélice enrollada con 88a (CCDC88A) CCDC88A es un sustrato Akt de unión a la actina que desempeña una función en la organización de la actina y la motilidad celular dependiente de Akt en los fibroblastos. La vía CCDC88A/Akt también es esencial en la angiogénesis postneonatal mediada por VEGF.

CCDC88A también está muy expresado en una variedad de tejidos humanos malignos, incluyendo los carcinomas de cuello uterino, pulmón, colon y mama. Desempeña una función importante en la evolución del tumor con activación aberrante de la vía de señalización Akt.

Ciclina B1 (CCNB1) La CCNB1 se induce durante la fase G2/M de la mitosis y forma el factor de promoción de la mitosis (MPF), junto con la kinasa 1 dependiente de la ciclina (Cdk1)/Cdc2. Se encuentra sobreexpresión en una variedad de cánceres y suele estar relacionada con un pronóstico desfavorable, por ejemplo, en el cáncer de mama (Aaltonen et al., 2009; Agarwal et al., 2009; Suzuki et al., 2007), el meduloblastoma (de et al., 2008), el NSCLC (Cooper et al., 2009), el cáncer cervical (Zhao et al., 2006) y otros. Fue uno de los genes incluidos en una signatura de 11 genes de la que se halló que predecía del intervalo corto a la recurrencia de la enfermedad en pacientes con 12 tipos distintos de cáncer (Glinsky, 2006). No se encontró información específica relativa al cáncer gástrico.

Ciclina D2 (CCND2) CCND2 une y activa, al igual que otras ciclinas de tipo D (D1 y D3), la quinasa 4 dependiente de ciclina (Cdk4) o la Cdk6. Esto se requiere para la transición G1/S. CCND2 se halló sobreexpresada en muchos tumores, incluyendo los de testículos y ovarios (Sicinski et al., 1996), las malignidades hematológicas (Hoglund et al., 1996; Gesk et al., 2006) y el cáncer gástrico, en el que puede estar causado por infección de H. pylori, y relacionado con un diagnóstico desfavorable (Yu et al., 2003). (Yu et al., 2001) (Oshimo et al., 2003) (Takano et al., 1999) (Takano et al., 2000).

Ciclina E2 (CCNE2) CCNE2 une y activa, como la otra ciclina CCNE1 de tipo E, la Cdk2. Esta actividad alcanza su máximo en la transición de fase G1/S. En estados saludables, la CCNE2 no se detecta en células inactivas y solo se encuentra en tejidos en división activa (Payton y Coats, 2002). Suele expresarse de forma aberrante en el cáncer, por ejemplo en el cáncer de mama, en correlación con un diagnóstico desfavorable (Desmedt et al., 2006; Ghayad et al., 2009; Payton et al., 2002; Sieuwerts et al., 2006), y en el cáncer de próstata metastásico (Wu et al., 2009).

Moléculas 1, 5 y 6 de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembriogénico (CEACAM 1, 5 y 6) Las CEACAM son glucoproteinas ancladas a la membrana que median en las interacciones célula-célula y activan las vías de señalización de la integrina (Chan y Stanners, 2007). También pueden servir de receptores para patógenos tales como E. coli (Berger et al., 2004) (Hauck et al., 2006) y estar involucradas en la regulación inmunitaria (Shao et al., 2006).

CEACAM5 y CEACAM6 presentan funciones pro-cancerígenas. Inhiben la anoikis (Ordonez et al., 2000), promueven la metástasis (Marshall, 2003; Ordonez et al., 2000), e interrumpen la polarización celular y la arquitectura del tejido (Chan y Stanners, 2007). La función de CEACAM1 en el cáncer es ambigua. Puede ser un inhibidor de tumores en etapas tempranas y participar en la formación de metástasis, la huida inmunitaria del tumor y la angiogénesis en etapas más avanzadas (Hokari et al., 2007; Liu et al., 2007; Moh y Shen, 2009). Su papel funcional depende de la isoforma, ya que CEACAM1 se da en 11 variantes de empalme, cuyo índice determina el resultado de la señalización (Gray-Owen y Blumberg, 2006; Leung et al., 2006; Neumaier et al., 1993; Nittka et al., 2008). El índice de las variantes de empalme podría verse alterado en el cáncer (Gaur et al., 2008).

CEACAM5 o CEACAM6 o ambos están sobreexpresados en hasta el 70% de todos los tumores humanos, relacionados a menudo con un diagnóstico desfavorable (Chan y Stanners, 2007; Chevinsky, 1991). El CEACAM5 de suero es un marcador clínico establecido para carcinomas de recto y colon, cuyos niveles elevados indican recurrencia o diagnóstico desfavorable (Chevinsky, 1991; Goldstein y Mitchell, 2005). También se ha sugerido como marcador de otras entidades incluyendo el cáncer gástrico, pero con poder limitado de pronóstico (Victorzon et al., 1995). El CEACAM1 puede estar regulado ascendente o descendentemente en el cáncer, dependiendo de la entidad (Kinugasa et al., 1998) (Dango et al., 2008) (Simeone et al., 2007). Han et al., 2008, hallaron niveles abundantes de CEACAM5 y CEACAM6 en nueve líneas celulares de cáncer gástrico, mientras que CEACAM1 no se detectó. Por contraste, un análisis de muestras de tumor primario de 222 pacientes mostró tinción o membranosa o citoplasmática para CEACAM1. La forma ligada a la membrana se relacionó con la angiogénesis potenciada (Zhou et al., 2009). El estudio de Kinugasa et al., 1998, también mostró regulación ascendente del adenocarcinoma gástrico.

En algunos tumores, CEACAM1 está regulada descendentemente en células tumorales, lo que conduce a la regulación ascendente de VEGF, y VEGF o las condiciones hipóxicas pueden inducir CEACAM1 en el endotelio adyacente. Consecuentemente, un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 bloqueó la formación del tubo endotelial inducida por VEGF (Oliveira-Ferrer et al., 2004; Tilki et al., 2006; Ergun et al., 2000). Especialmente CEACAM5 se ha probado como diana para medicamentos contra el cáncer, entre otros mediante enfoques de vacunación. Estos estudios mostraron que CEACAM5 puede ser una diana de reacciones celulares inmunitarias (Cloosen et al., 2007; Marshall, 2003). En Sarobe et al., 2004, se proporciona un resumen acerca de los epitopos de linfocitos T de CEACAM5.

Canal 3 de cloruro (CLCN3) CLCN3 es un canal de Cl que puede estar regulado por volumen y participar en el descenso regulador de volumen (RVD) que se da como reacción a un aumento en el volumen celular en el caso de situaciones como el ciclo celular o la hipoosmosis (Lemonnier et al., 2004; Sardini et al., 2003). Sin embargo, este punto se discute controvertidamente (Wang et al., 2004) y el canal de reducción de volumen activado durante la apóptosis es distinto del CLCN3 (Okada et al., 2006).

La expresión de CLCN3 cambia durante el ciclo celular, alcanzando un pico en la fase S (Wang et al., 2004). Las corrientes de CLCN3 pueden ser importantes en procesos relacionados con el cáncer, en entidades en las que CLCN3 está regulado ascendentemente, como el glioma: Las células tumorales necesitan tratar aumentos proliferativos de volumen, enfrentarse a condiciones hipoosmóticas, por ejemplo en el edema peritumoral (Ernest et al., 2005; Olsen et al., 2003; Sontheimer, 2008).

Además, se informó que CLCN3 potencia la resistencia de etoposida incrementando la acidificación del último compartimento endocítico (Weylandt et al., 2007).

La disminución de la regulación mediada por siRNA de CLCN3 redujo la migración de células de carcinoma nasofaríngeo in vitro (Mao et al., 2008).

DNAJC10 DNAJC10 es un miembro de un complejo supramolecular de degradación asociado al retículo endoplasmático (ERAD) que reconoce y despliega proteínas mal desplegadas para su eficiente retrotranslocación (Ushioda et al., 2008). La proteína se mostró elevada en el carcinoma hepatocelular (Cunnea et al., 2007). El descenso de la regulación de DNAJC10 por siRNA en células tumorales neuroectodermales incrementó la respuesta apoptósica al medicamento quimioterapéutico fenretinida (Corazzari et al., 2007). Se mostró que ERdj5 reduce la supervivencia de células de neuroblastoma mediante la regulación descendente de la respuesta de la proteína sin desplegar (UPR) (Thomas y Spyrou, 2009).

Factor 2 de iniciación de la traducción eucariótica, subunidad 3 gamma (EIF2S3) EIF2S3 es la subunidad más larga de un complejo proteico (EIF2) que recluta el tRNA-metionilo inicial a la subunidad ribosómica 40S (Clemens, 1997). La acción de las quinasas que regulan descendentemente la actividad de EIF, como la proteína quinasa dependiente de RNA (PKR), puede ser proapoptósica y e inhibidora de tumor (Mounir et al., 2009). En el cáncer gástrico, se informó de niveles más altos de EIF2 fosforilado y defosforilado, y se observó una redistribución al núcleo. Esta desregulación apunta a una implicación de elF2alfa en el cáncer gastrointestinal (Lobo et al., 2000).

Factor 3 de iniciación de la traducción eucariótica, subunidad L (EIF3L) EIF3L es una de las 10-13 subunidades de EIF3, asociada a la subunidad ribosómica pequeña. EIF3 desempeña una función en la prevención de la unión prematura de la subunidad ribosómica larga. EIF3L se encuentra entre las cinco subunidades de las que se ha informado que no son esenciales para la formación de EIF3 (Masutani et al., 2007). Un cribado con una genoteca antisentido ha sugerido que la regulación descendente de EIF3L potencia la actividad antitumorígena del 5-fluorouracilo en células de carcinoma hepatocelular (Doh, 2008).

Epiplaquina 1 (EPPK1) EPPK1 es un gen de la familia de las plaquinas con funciones en gran medida desconocidas. Los genes plaquín son conocidos por su función en la interconexión de filamentos citoesqueléticos y su anclaje a la unión adhesiva asociada a la membrana plasmática (Yoshida et al., 2008).

Receptor 39 acoplado a la proteína G (GPR39) GPR39 es un receptor acoplado a la proteína Gq del que se cree que está involucrado en las funciones gastrointestinal y metabólica (Yamamoto et al., 2009). Su señalización activa los elementos de respuesta de suero y cAMP (Holst et al., 2004). El ligando endógeno para GPR39 es probablemente el zinc (Chen y Zhao, 2007). GPR39 es un inhibidor novedoso de la muerte celular, que podría representar una diana terapéutica con implicaciones en procesos que impliquen apóptosis y estrés del retículo endoplasmático como el cáncer (Dittmer et al., 2008). GPR39 se encontró regulado ascendentemente en micromatrices tanto de HFK de riñon fetal humano e injertos heterólogos de tumor de Wilms de tipo precursor enriquecidos con blastema (Metsuyanim et al., 2009), y en una línea celular del hipocampo resistente a diversos estimuladores de la muerte celular (Dittmer et al., ) 2008).

ERBB2/HER2/NEU ERBB2 es un miembro de la familia EGFR de tírosína quinasas receptoras. No se conoce su ligando, pero es la pareja de heterodimerización preferida para otros miembros de la familia HER (Olayioye, 2001). En los carcinomas, HER2 actúa como un oncogén, principalmente porque la amplificación de alto nivel del gen induce la sobreexpresión proteica en la membrana celular y la adquisición subsecuente de propiedades ventajosas para una célula maligna (Slamon et al., 1989). Se observa sobreexpresión en un cierto porcentaje de muchos cánceres, incluyendo el cáncer gástrico. En general, está relacionada con un pronóstico desfavorable (Song et al., 2010) (Yonemura et al., 1991) (Uchino et al., 1993) (Mizutani et al., 1993).

ERBB2 es la diana del anticuerpo monoclonal trastuzumab (comercializado como Herceptina), que se ha sugerido como opción de tratamiento para pacientes con cáncer gástrico avanzado HER2-posit¡vo, en combinación con quimioterapia (Meza-Junco et al., 2009; Van Cutsem et al., 2009). Otro anticuerpo monoclonal, Pertuzumab, que inhibe la dimerización de los receptores HER2 y HER3, se encuentra en ensayos clínicos avanzados (Kristjansdottir y Dizon, 2010). La sobreexpresión selectiva de HER2 y HER3 en los dos tipos histológicos de cáncer gástrico (tipo intestinal y tipo difuso) está muy relacionada con un diagnóstico desfavorable (Zhang et al., 2009).

Integrina beta-4 (ITGB4) Las integrinas median en la adhesión celular así como en la transducción de señales de fuera a dentro y de dentro a fuera. La subunidad beta-4 de integrina heterodimeriza con la subunidad alfa-6.

La integrina resultante promueve la formación de hemidesmosomas entre el citoesqueleto intracelular de queratina y la membrana basal (Giancotti, 2007). La integrina beta-4 tiene una función dual en el cáncer, ya que puede mediar en la adhesión estable por un lado, y en la señalización proinvasiva (incluyendo las señalizaciones Ras/Erk y PI3K) y la angiogénesis por otro (Giancotti, 2007; Raymond et al., 2007). Está sobreexpresada en muchos tumores así como en células endoteliales angiogénicas, a menudo en correlación con la evolución y la metástasis. Se han detectado niveles elevados en el cáncer gástrico, particularmente en las células de invasión del estroma (Giancotti, 2007; Tani et al., 1996). Sin embargo, estaba regulada descendentemente en el carcinoma gástrico de tipo indiferenciado a medida que el tumor invadía con más profundidad, posiblemente por la transición mesénquimo-epitelial gradual, ya que la integrina beta-4 es una integrina epitelial (Yanchenko et al., 2009).

Lipocalina (LCN2) LCN2 o lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (NGAL) es una proteína reguladora del hierro que existe como monómero, homodímero, o como heterodímero ligado a disulfuros con MMP9 (Coles et al., 1999; Kjeldsen et al., 1993). La expresión está aumentada en varios cánceres, en algunos casos relacionada con la evolución. Desde el punto de vista mecánico, puede estabilizar la MMP9 y alterar la adhesión célula-célula mediada por E-cadherina, incrementando así la invasión. Los complejos de MMP-9 y LCN2 estaban relacionados con una peor tasa de supervivencia del cáncer gástrico (Kubben et al., 2007) (Hu et al., 2009). Aunque se ha observado un claro efecto protumoral en diversos tumores humanos, algunos estudios han demostrado que LCN2 puede inhibir el factor proneoplásico HIF-1 alfa, la fosforilación FA-Kinasa y también la síntesis VEGF, sugiriéndose así que, en condiciones alternativas, también LCN2, paradójicamente, tiene un efecto antitumoral y antimetastásico en las neoplasias de, por ejemplo, colon, ovario y páncreas. (Bolignano et al., 2009; Tong et al., 2008). LCN2 puede ser útil para inhibir la angiogénesis del tumor, además de inhibir la metástasis del tumor, en cánceres que muestran activación de ras (Venkatesha et al., 2006).

Complejo succinato deshidrogenasa, subunidad C (SDHC) SDHC es una de cuatro subunidades de succinato deshidrogenasa codificadas nuclearmente (complejo mitocondrial II), que transfiere electrones del succinato a la ubiquinona, produciendo fumarato y ubiquinol. La deficiencia de succinato deshidrogenasa puede ser causa de GIST (McWhinney et al., 2007). Los tumores gastrointestinales estromáticos familiares pueden estar causados por mutaciones en los genes de las subunidades SDHB, SDHC, y SDHD, y los paragangliomas abdominales relacionados con tumores gastrointestinales pueden estar causados únicamente por mutaciones de SDHC (Pasiní et al., 2008). La proteína mutante de SDHC en ratones transgénicos genera estrés oxidativo y puede participar en la lesión del DNA nuclear, la mutagénesis y, en último caso, en la tumorígenia (Ishii et al., 2005). El succinato dehidrogenasa se considera un inhibidor de tumores (Baysal, 2003; Gottlieb y Tomlinson, 2005). Los niveles reducidos de este complejo enzimático pueden resultar en tumorigenia (Eng et al., 2003).

Quinasa de unión a PDZ (PBK) PBK es una MAPKK ligada a MEK3/6 que activa la quinasa MAP p38, por ejemplo en dirección 3' de los receptores del factor de crecimiento (Abe et al., 2000; Ayllon y O'connor, 2007). JNK puede ser una diana secundaria (Oh et al., 2007). Puesto que, en los adultos, PBK se expresa en los testículos (véase más abajo), se ha propuesto una función en la espermatogénesis (Abe et al., 2000; Zhao et al., 2001). Además de eso, participa en la proliferación y la resistencia a la apóptosis de las células tumorales: Está fosforilada y activada durante la mitosis, lo que es necesario para la formación del huso y la citocinesis (Gaudet et al., 2000; Matsumoto et al., 2004; Park et al., 2009) (Abe et al., 2007). Otras funciones antiapoptósicas y potenciadoras del crecimiento incluyen la regulación descendente de p53 y la fosforilación de la histona (Park et al., 2006; Zykova et al., 2006) (Nandi et al., 2007). PBK se ha clasificado como antígeno del cáncer de testículo (Abe et al., 2000; Park et al., 2006) y se halló sobreexpresado en muchos cánceres.

Polimerasa (dirigida por DNA), delta 3, subunidad accesoria (POLD3) El complejo delta de polimerasa de DNA está involucrado en la replicación y reparación del DNA. Consiste en el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA), el factor C de replicación de subunidades múltiples, y el complejo de polimerasa de 4 subunidades: POLD1, POLD2, POLD3, y POLD4 (Liu y Warbrick, 2006). POLD3 desempeña una función crucial en el reciclaje eficiente de PCNA durante los ciclos de disociación-asociación de po1 delta durante la fase de elongación de la replicación del DNA (Masuda et al., 2007).

Subunidad 26S de proteasoma (Prosome, macropain), no ATPasa, 14 (PSMD14) PSMD14 es un componente del proteasoma 26S. Pertenece al complejo 19S (19S cap; PA700), que es responsable de la deubiquitinización del substrato durante la degradación proteasomal (Spataro et al., 1997). La sobreexpresión de PSMD14 en células de mamífero afecta a la proliferación celular y a la respuesta a medicamentos citotóxicos como vinblastine, cisplatin y doxorubicin (Spataro et al., 2002). La inhibición de siRNA de PSMD14 en células HeLa resultó en una reducción de la viabilidad celular y un aumento de los niveles de proteína poliubiquitinados (Gallery et al., 2007). La regulación descendente de PSMD14 por siRNA tuvo un impacto considerable en la viabilidad celular, provocando detención celular en la fase G0-G1 y, en último caso, senescencia (Byrne et al., 2010).

Subunidad 26S de proteasoma (Prosome, macropain), ATPasa, 2 (PSMC2) PSMC2 es parte del sistema proteasomal 26S. Es un miembro de la familia triple A de ATPasas, que tienen una actividad de tipo chaperona. Se ha mostrado que esta subunidad interacciona con varios de los factores de transcripción básales de forma que, además de participar en funciones proteasomales, esta subunidad podría participar en la regulación de la transcripción. Se ha mostrado que el sistema proteasomal 26S en el músculo esquelético puede activarse mediante TNF-alfa (Tan et al., 2006). En ratones transgénicos HBx, que portan el gen regulador de hepatitis B HBx en su línea germinal, y desarrollan HCC, PSMC2 y otras subunidades proteasomales están reguladas ascendentemente en tejidos tumorales (Cui et al., 2006). Los niveles de mRNA para la subunidad ATPasa PSMC2 del complejo 19S se incrementaron en la caquexia del cáncer (Combaret et al., 1999).

Proteína tirosina kinasa 2 (PTK2) PTK2 es una tirosina quinasa no receptora que modula la señalización de integrina y que puede promover el crecimiento, la evolución y la metástasis del tumor ((Giaginis et al., 2009); (Hauck et al., 2002); (Zhao y Guan, 2009)). PTK2 se ha sugerido como marcador para la carcinogénesis y la evolución del cáncer (Su et al., 2002; Theocharis et al., 2009; Jan et al., 2009). La sobreexpresión y/o la actividad aumentada se da en una amplia variedad de cánceres humanos incluyendo el cáncer gástrico. PTK2 también transduce señales en dirección 3' del receptor de gastrina, que participa en la proliferación de células de cáncer gástrico (Li et al., 2008b). El 8% de los carcinomas gástricos ha mostrado portar el virus de Epstein-Barr (EBV). Las sublíneas de línea celular de cáncer gástrico humano infectadas por EBV presentaron fosforilación de PTK2 incrementada (Kassis et al., 2002). El nivel de fosforilación de tirosina PTK2 en células epiteliales gástricas es reducido por el producto de Helicobacter pylori cagA-positivo.

Tetraspanina 1 (TSPAN1) y tetraspanina 8 (TSPAN8) TSPAN1 y TSPAN8 pertenecen a la familia de tetraspaninas que se caracterizan por cuatro dominios de transmembrana y un extremo amino y carboxilo intraceiular y que tienen funciones en una serie de procesos incluyendo la adhesión celular, la motilidad, la activación y la invasión tumoral. Suelen formar largos complejos moleculares con otras proteínas como las integrinas en la superficie celular (Tarrant et al., 2003; Serru et al., 2000). Las funciones de TSPAN1 todavía se desconocen y es posible que incluyan una función en la secreción (Scholz et al., 2009). TSPAN1 está sobreexpresada en varios cánceres, a menudo en correlación con la fase, la evolución y el peor resultado clínico. De forma notable, se informó que estaba sobreexpresada en el 56,98% de 86 casos de carcinoma gástrico, y su sobreexpresión guardaba correlación positiva con el estado de los nodulos linfáticos, la infiltración y la fase clínica, y negativa con los índices de supervivencia y el grado de diferenciación del tumor (Chen et al., 2008). Se ha informado que TSPAN8 es un gen asociado a la metástasis en muchos tipos de tumor (PMID: 16467180). En el cáncer gastrointestinal, la expresión de TSPAN8 está relacionada con un diagnóstico desfavorable (PMID: 16849554).

Proteína dedo de zinc 598 (ZNF598) ZNF598 es una proteína dedo de zinc con una función todavía desconocida.

Desintegrina A y metaloproteinasa 10 (ADAM10) ADAM10 desempeña una función en la angíogénesis, el desarrollo y la tumorigenia. Está sobreexpresada en el carcinoma gástrico. Los inhibidores selectivos de ADAM contra ADAM-10 se están sometiendo a ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer. (PMID: 19408347) Metaloproteinasa 12 de la matriz (MMP12) MMP12 es una endopeptidasa de zinc que degrada la elastina y muchas otras proteínas matriciales y no matricíales y que está involucrada en la migración de macrófagos y la inhibición de la angíogénesis (Chakraborti et al., 2003; Chandler et al., 1996; Sang, 1998). También desempeña una función en los procesos patológicos de destrucción de tejidos como el asma, el enfisema y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), la artritis reumatoide y el crecimiento tumoral (Cataldo et al., 2003; Wallace et al., 2008). Se debate la función de los inhibidores de MMP12 como agentes para el tratamiento de estas enfermedades (Churg et al., 2007; Norman, 2009). La MMP12 se sobreexpresa frecuentemente en el cáncer, en el que puede tener funciones ambiguas. Mientras que puede estar involucrada en la disolución de la matriz y, de esta forma, en la metástasis, también puede inhibir el crecimiento tumoral mediante la producción de angiostatina, que incide negativamente en la angiogénesis. Se ha informado de expresión potenciada de MMP12 para el cáncer gástrico, y se ha mostrado favorable: Guardaba correlación negativa con la densidad de los microvasos, el factor VEGF, el grado de diferenciación tumoral, la invasión vascular, la metástasis de los nodulos linfáticos y la recurrencia. Los pacientes con sobreexpresión de MMP12 mostraron un índice de supervivencia significativamente mejor (Cheng et al., 2010; Zhang et al., 2007b; Zhang et al., 2007a).

Ribonucleótido reductasa M2 (RRM2) RRM2 es una de las dos subunidades de ribonucleótido reductasa que genera desoxirribonucleótidos de ribonucleótidos. La sobreexpresión de RRM2 se ha observado en tumores incluido el cáncer gástrico e intensifica el potencial metastásico (PMID: 18941749) (PMID: 19250552). La disminución de la regulación siRNA de RRM2 ralentizó el crecimiento tumoral en varias especies (ratón, rata, mono) (PMID: 17929316; PMID: 17404105).

Proteasa de la transmembrana, serina 4 (TMPRSS4) TMPRSS4 es una serina proteasa de la transmembrana de tipo II situada en la superficie celular que se expresa intensamente en varios tejidos de cáncer, incluyendo el cáncer pancreático, de colon y gástrico.

Las funciones biológicas de TMPRSS4 en el cáncer no se conocen todavía. TMPRSS4 tiene cuatro variantes de empalme (Scott et al., 2001; Sawasaki et al., 2004). La expresión en el carcinoma ovárico guardaba correlación con la fase (Sawasaki et al., 2004). T PRSS4 se encuentra muy elevada en tejidos de cáncer de pulmón, y la disminución de la regulación siRNA de TMPRSS4 mediante el tratamiento con RNA antisentido pequeño en líneas celulares de cáncer de colon y de pulmón se relacionó con la reducción de la invasión celular y la adhesión a la matriz celular, así como con la modulación de la proliferación celular (Jung et al., 2008).

Deyodinasa, Yodotironina, tipo II (DI02) DI02 convierte la prohormona tiroxina (T4) en 3, 3', 5-triyodotironina (T3) bioactiva. Se expresa intensamente en el tiroides, y se halló falta de regulación de la expresión y/o la actividad en cánceres de tiroides (de Souza eyer et al., 2005) (Arnaldi et al., 2005). Sin embargo, también se encontró en otros tejidos, como el pulmón normal y el cáncer de pulmón (Wawrzynska et al., 2003), y en tumores cerebrales (Murakami et al., 2000).

Proteína de unión 3 de mRNA del factor de crecimiento insulinoide 2 (IGF2BP3) IGF2BP3 se encuentra presente principalmente en el nucléolo, donde liga el mRNA de IGF2 e inhibe su traducción. Desempeña una función en la embriogénesis y está regulada descendentemente en los tejidos adultos. En las células tumorales puede estar regulada ascendentemente y se considera, por lo tanto, una proteína oncofetal (Liao et al. 2005). En muchos cánceres, incluido el cáncer gástrico, se halló sobreexpresada, relacionada con un diagnóstico desfavorable (Jeng et al., 2009) (Jiang et al. 2006). En estudios de vacunación contra el cáncer, se han analizado péptidos derivados de IGF2BP3 (Kono et al. 2009).

Lamina B1 (LMNB1) La lamina B1 es una proteína de la matriz de la lamina nuclear y está involucrada en la estabilidad nuclear, la estructura de la cromatina y la expresión génica. En fases tempranas de la apóptosis, la lamina se degrada (Neamati et al. 1995) (Sato et al. 2008b; Sato et al. 2008a; Sato et al. 2009). LMNB1 se expresa hasta cierto punto en básicamente todas las células somáticas normales, y los estudios preliminares indican que puede estar reducida durante la patogénesis de algunos cánceres incluido el cáncer gástrico (Moss et al. 1999). En otros cánceres, tales como el carcinoma hepatocelular, LMNB1 se halló regulado ascendentemente y en correlación positiva con la fase del tumor, el tamaño y el número de nodulos (Lim et al., 2002).

Familia del sitio de integración MMTV de tipo Wingless, miembro 5A WNT5A es una proteína secretada de señalización que participa en la oncogénesis y en procesos de desarrollo. La señalización WNT5A canónica mediante receptores Frizzled y LRP5/LRP6 conduce al mantenimiento de las células precursoras/progenitoras, mientras que la señalización WNT5A no canónica mediante receptores Frizzled y ROR2/PTK/RYK controla la polaridad de los tejidos, el movimiento o la adhesión celular, como en la interfase estromática tumoral, conduciendo a la invasión (Katoh y Katoh, 2007). Puede ser inhibidora de tumores en algunos cánceres, pero se encuentra regulada ascendentemente en otros incluyendo el cáncer gástrico, en el que participa en la evolución y la metástasis y conduce a un diagnóstico desfavorable (Li et al., 2010) (Yamamoto et al., 2009) (Kurayoshi et al., 2006).

Proteína de activación de los fibroblastos, alfa (FAP) FAP es una gelatinasa integral de la membrana. Su supuesta actividad de serina proteasa podría desempeñar una función en el control del crecimiento de los fibroblastos o de las interacciones mesénquimo-epiteliales durante el desarrollo, la reparación de tejidos y la carcinogénesis epitelial (Scanlan et al., 1994). FAP tiene una función potencial en el crecimiento del cáncer, la metástasis y la angiogénesis mediante procesos de migración y adhesión celular, así como en la degradación rápida de componentes de la ECM. Está presente en las células de tumor que invaden la ECM, en fibroblastos reactivos asociados al cáncer y en células endoteliales involucradas en la angiogénesis, pero no en células inactivas del mismo tipo. (Dolznig et al., 2005; Kennedy et al., 2009; Rettig et al., 1993; Rettig et al., 1994; Scanlan et al., 1994; Zhang et al., 2010). Se ha hallado expresión de FAP en células de cáncer gástrico y fibroblastos estromáticos asociados (Zhi et al., 2010) (Chen et al., 2006) (Morí et al., 2004; Okada et al., 2003). En un modelo de ratón, las células que expresan FAP mostraron ser un componente inmunosupresor no redundante del microambiente tumoral (Krama et al., 2010). En modelos de ratón de vacunación tumoral, FAP se usó con éxito como diana de respuestas de linfocitos T CD8+ y CD4+ (Loeffler et al., 2006; Wen et al., 2010) (Lee et al., 2005) (Fassnacht et al., 2005).

Complejo de proteína de coatómero, subunidad gamma (COPG); Complejo de proteína de coatómero, subunidad gamma 2 (COPG2); Complejo de proteína de coatómero, subunidad beta 1 (COPB1); COPG, COPG2 y COPB1 son subunidades del complejo de coatómero, también denominado complejo 1 de la proteína de revestimiento (COPI), asociado a vesículas no cubiertas de clatrina. Las vesículas cubiertas de COPI median en el transporte retrógrado desde Golgi de vuelta al retículo endoplasmático y en el transporte intra-Golgi (Watson et al., 2004). También pueden estar implicadas en el transporte anterógrado (Nickel et al., 1998). El tráfico retrógrado regula, entre otros, el transporte nuclear de EGFR dependiente de EGF, que se une a COPG (Wang et al., 2010). COPG se halló sobreexpresado en células de cáncer de pulmón y en células endoteliales microvasculares asociadas al cáncer de pulmón (Park et al., 2008).

La secuencia del COPG2 ubicuamente expresado es idéntica en un 80% a COPG (Blagitko et al., 1999). COPG2 puede formar un complejo de tipo COP I en lugar de COPG, lo cual es probablemente redundante desde el punto de vista funcional (Futatsumori et al., 2000).

La reducción de la expresión de COPB1 en una linea celular de expresión del regulador de conductancia de transmembrana de fibrosis quística (CFTR) ha sugerido que el complejo de coatómero está implicado en el tráfico CRTR a la membrana plasmática (Denning et al., 1992) (Bannykh et al., 2000).

Enzima E2S de conjugación de la ubiquitina (UBE2S) UBE2S es un factor auxiliar del complejo de promoción de la anafase (APC), una ligasa E3 de la ubiquitina que regula G1 y la salida mitótica mediante la direccionalización de reguladores del ciclo celular. UBE2S elonga las cadenas de ubiquitina después de que los substratos han sido preubiquitinados por otros componentes (Wu et al., 2010). UBE2S también direccionaliza la proteína VHL para la degradación proteasomal, estabilizando así HIF-1 alfa (Lim et al., 2008), y potenciando posiblemente la proliferación, la transición mesénquimo-epitelial y la metástasis (Chen et al., 2009) (Jung et al., 2006). UBE2S está sobreexpresada en varias entidades de cáncer.

Miembro 11 de la familia de la quinesina (KIF11) KIF11 es necesario para el ensamblaje de un huso mitótico bipolar. Se ha hallado regulado ascendentemente en varios cánceres, a menudo en correlación con parámetros clinicopatológicos (Liu et al., 2010) (Peyre et al., 2010). Los inhibidores de molécula pequeña de KIF11 como S-Tritil-L-cisteína (STLC), desarrollados como medicamentos potenciales contra el cáncer, detienen las células en la mitosis y promueven la apóptosis de las células de cáncer (Tsui et al., 2009) (Wiltshire et al., 2010) (Ding et al., 2010). Clínicamente, los inhibidores KIF11 tan solo han mostrado una actividad modesta (Kaan et al., 2010; Tunquist et al., 2010; Wiltshire et al., 2010; Zhang and Xu, 2008).

Dominio 8 de metaloproteinasa y desintegrina A (ADAM8) ADAM8 se consideró inicialmente una ADAM inmunoespecífica, pero se halló también en otros tipos de células, a menudo en condiciones que implicaban inflamación y remodelación de la ECM, incluyendo cánceres y enfermedades respiratorias como el asma (Koller et al., 2009). Muchas especies de ADAM, incluyendo ADAM8, se expresan en tumores humanos malignos, donde están involucrados en la regulación de actividades del factor de crecimiento y funciones de integrina, conduciendo a la promoción del crecimiento y la invasión celulares, aunque los mecanismos exactos de las mismas no están claros en la actualidad (Mochizuki y Okada, 2007). En tumores gástricos de ratón, ADAM8 y otras especies de ADAM se vieron incrementadas en su proporción, probablemente por una señalización potenciada del EGFR (Oshima et al., 2011).

Homólogo del ciclo de división celular 6 (S. cerevisiae) (CDC6) CDC6 es esencial para iniciar la replicación de DNA. Se localiza en el núcleo durante la G1 pero se transloca al citoplasma al comienzo de la fase S. CDC6 también regula la activación de los puntos de control de la replicación mediante la interacción con ATR (Yoshida et al., 2010). La desregulación de CDC6 puede causar la inactivación del locus INK4/ARF que codifica tres genes importantes de inhibición tumoral: p16INK4a y p15INK4b, activadores ambos de la vía del retinoblastoma, y ARF, un activador de p53 (González et al., 2006). El descenso de la regulación siRNA de CDC6 podría prevenir la proliferación y promover la apóptosis (Lau et al., 2006). CDC6 se encuentra regulado ascendentemente en el cáncer incluyendo el cáncer gástrico (Nakamura et al., 2007) (Tsukamoto et al., 2008).

Receptor (de trombina) del factor II de coagulación de F2R (F2R) F2R, también denominado receptor activado por proteinasa (PAR1), es un receptor acoplado a la proteína G. Las señales de PAR1, PAR2 y PAR4 pueden regular la liberación de calcio o la activación de la proteína quinasa activada por mitógeno y conducir a la agregación plaquetaria, la relajación vascular, la proliferación celular, la liberación de citocinas y la inflamación (Oikonomopoulou et al., 2010). Se cree que F2R está involucrado en la proliferación celular tumoral y endotelial y en la angiogénesis, y que está sobreexpresado en tumores metastásicos e invasivos de muchos tipos. Los niveles de expresión guardan correlación directa con el grado de invasividad del cáncer (García-López et al., 2010) (Lurje et al., 2010). En las células de carcinoma gástrico, la activación de F2R puede desencadenar una variedad de respuestas que promueven el crecimiento y la invasión celular tumoral como, por ejemplo, la sobreexpresión de NF-kappaB, EGFR y Tenascina-C (TN-C) (Fujimoto et al., 2010). Consecuentemente, la expresión de F2R en el cáncer gástrico se halló relacionada con la profundidad de la invasión de la pared, la diseminación peritoneal y el pronóstico desfavorable (Fujimoto et al., 2008). Se ha descrito un anticuerpo de ratón PAR1 antihumano monoclonal (ATAP-2) que reconoce un epítopo (SFLLRNPN) en el extremo N del receptor de trombina, así como el péptido agonista PAR1 TFLLRNPNDK (Hollenberg y Compton 2002; Mari et al., 1996; Xu et al., 1995).

Olfactomedina 4 (OLFM4) OLFM4, cuya función se desconoce en gran medida, se encuentra sobreexpresada en el epitelio inflamado de colon y en una serie de tipos de tumor humano, especialmente los del sistema digestivo (Koshida et al., 2007). OLFM4 es un fuerte marcador de células precursoras del intestino humano y marca un subconjunto de células de cáncer colorrectal (Van der Flier et al., 2009). OLFM4 inhibe la proteína GRIM-19 promotora de la apóptosis (Zhang et al., 2004) (Huang et al., 2010), regula el ciclo celular y promueve la transición de la fase S en la proliferación de las células de cáncer. Además, OLFM4 está relacionada con la adhesión y la metástasis del cáncer (Yu et al., 2011b). La sobreexpresión forzada de OLFM4 en las células de tumor de próstata de roedor llevó a una formación más rápida del tumor en un huésped singénico (Zhang et al., 2004). OLFM4 se halló sobreexpresada en el cáncer gástrico (Aung et al., 2006). La inhibición de la expresión de OLFM4 podría inducir apóptosis en presencia de agentes citotoxicos en células de cáncer gástrico (Kim et al., 2010). La concentración de OLFM4 de suero en pacientes de cáncer gástrico antes de ser operados se encontraba potenciada en comparación con la de donantes sanos (Oue et al., 2009). OLFM4 se identificó como un gen diana novedoso de ácidos retinoicos (RA) y del agente de desmetilación 5-aza-2'-deoxicitidina. Estos dos agentes han demostrado su eficacia en el tratamiento de ciertos pacientes de leucemia mieloide (Liu et al., 2010).

Antígeno de la superficie celular Thy-1 (THY1) Thy-1 (CD90) es una glucoproteína anclada a GPI hallada en muchos tipos de células, incluyendo linfocitos T, neuronas, células endoteliales y fibroblastos. Thy-1 está involucrada en procesos que incluyen la adhesión, la regeneración nerviosa, el crecimiento tumoral, la inhibición de tumores, la migración, la muerte celular y la activación de linfocitos T. (Rege y Hagood, 2006b; Rege y Hagood, 2006a) (Jurisic et al., 2010). Thy-1 parece ser un marcador de la angiogénesis adulta pero no de la embrionaria (Lee et al., 1998). Además, se consideró un marcador para diversos tipos de células precursoras (células precursoras mesenquimales, células precursoras hepáticas ("células ovales") (Masson et al., 2006), células precursoras de queratinocitos (Nakamura et al., 2006) y células precursoras hematopoyéticas (Yamazaki et al., 2009)). Thy-1 se encuentra regulado ascendentemente en varios cánceres incluyendo el cáncer gástrico y el GIST, para el que se propuso ser un marcador (Yang y Chung, 2008; Zhang et al., 2010) (Oikonomou et al., 2007).

Proteína centrosómica de 250 kDa (CEP250) Cep250 desempeña una función en la cohesión de centros de organización de microtúbulos (Mayor et al., 2000). También se denomina proteína centrosómica asociada a Nek2 o C-Nap1, puesto que se localiza conjuntamente y es un substrato de la serina/treonina quinasa Nek2. La quinasa Nek2 y sus substratos regulan la unión entre los centrosomas (Bahmanyar et al., 2008). Al inicio de la mitosis, cuando los centrosomas se separan para la formación del huso bipolar, C-Nap1 es fosforilada y, posteriormente, se disocia de los centrosomas. Los experimentos in vitro mostraron que la sobreexpresión de Cep250 perjudicaba la organización de microtúbulos en el centrosoma (Mayor et al., 2002).

Factor 1 inducible por hipoxia, subunidad alfa (factor de transcripción básico hélice-lazo-hélice) (HIF1A) HIF1A es la subunidad sensible al oxígeno del factor inducible por hipoxia (HIF), un factor de transcripción activo en condiciones hipóxicas que se encuentran con frecuencia en los tumores. Media en la transcripción de más de 60 genes involucrados en la supervivencia, el metabolismo de la glucosa, la invasión, la metástasis y la angiogénesis (por ejemplo, VEGF). HIF1 está sobreexpresado en muchos cánceres, a menudo relacionado con un diagnóstico desfavorable, y se considera una diana interesante para la manipulación farmacológica (Griffiths et al., 2005; Quintero et al., 2004; Stoeltzing et al., 2004) (Zhong et al., 1999).

En el cáncer gástrico, HIF1A participa en la angiogénesis (Nam et al., 2011), guarda correlación con el tamaño del tumor, la menor diferenciación, la fase del tumor, la menor supervivencia (Qiu et al., 2011) y la metástasis (Wang et al., 2010) (Han et al., 2006; Kim et al., 2009; Oh et al., 2008; Ru et al., 2007). También se cree que conduce a la resistencia a medicamentos quimioterapéuticos como 5-FU mediante la inhibición de la apóptosis inducida por medicamentos y el descenso de la acumulación intracelular de medicamentos (Nakamura et al., 2009) (Liu et al., 2008). El inhibidor HIF-1 alfa 2-metoxi-estradiol redujo de forma significativa las propiedades metastásicas de las células de cáncer gástrico (Rohwer et al., 2009).

Homólogo del oncogén vírico del sarcoma de rata de Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS) KRAS es un miembro de la superfamilia de GTPasas pequeñas y un protooncogén involucrado en las etapas iniciales de muchas vías de transduccion de señales, tales como las vías mediadas por MAPK y AKT, que son potencialmente oncógenas. Las substituciones aisladas de aminoácidos conducen a mutaciones de activación, que resultan en una proteína de transformación que desempeña una función clave en diversas malignidades como el cáncer gástrico (Capella et al., 1991). Las mutaciones oncógenas de KRAS son infrecuentes en el cáncer gástrico. En un subconjunto de cánceres gástricos, el locus de KRAS estaba amplificado, lo que resultó en la sobreexpresión de la proteína KRAS. De esta forma, es muy probable que la amplificación génica constituya el fundamento molecular de la sobreactivacion de KRAS en el cáncer gástrico (Mita et al., 2009). Los alelos de KRAS mutantes participan en la inducción de VEGF regulada por hipoxia (Kikuchi et al., 2009; Zeng et al., 2010). El gen KRAS mutado también se detecta en suero o plasma de pacientes de cáncer y, por ello, se ha sugerido como marcador de tumor fácilmente accesible (Sorenson, 2000). El péptido KRAS-001 deriva tan sólo de una de dos variantes de empalme -NP_004976 (188 aminoácidos) y no de la variante de empalme -NP_203524 (189 aminoácidos). Las variantes de empalme difieren en su último exón, en el que se encuentra KRAS-001.

Complejo de condensina I no SMC, subunidad G (NCAPG) NCAPG es parte del complejo de condensina I, compuesto de proteínas SMC (mantenimiento estructural de cromosomas) y no SMC, y regula la condensación y segregación de cromosomas durante la mitosis (Seipold et al., 2009). Se halló sobreexpresión de NCAPG en numerosos tumores como el carcinoma nasofaríngeo (Li et al., 2010), el carcinoma hepatocelular (Satow et al., 2010) y el melanoma (Ryu et al., 2007). En tejidos normales, NCAPG mostró su máxima expresión en los testículos. Se sugirió como posible marcador de la proliferación e indicador potencial de pronóstico en el cáncer (Jager et al., 2000).

Topoisomerasa (DNA) II alfa (TOP2A) y topoisomerasa (DNA) II beta (TOP2B) TOP2A y TOP2B codifican isoformas altamente homologas de una topoisomerasa de DNA, que controla y altera los estados topológicos del DNA durante la transcripción y que está involucrada en la condensación de cromosomas, la separación de cromátidas, la replicación y la transcripción. La topoisomerasa es una diana para varios medicamentos contra el cáncer, tales como las antraciclinas, y una variedad de mutaciones se han relacionado con la resistencia a los medicamentos (Kellner et al., 2002) (Jarvinen y Liu, 2006). TOP2A (pero no TOP2B) es esencial para la proliferación celular. Es adyacente al oncogén HER2 y está amplificado en una gran mayoría de tumores de mama de HER2 amplificado, pero también en los que no se da tal amplificación (Jarvinen y Liu, 2003), y en muchas otras entidades tumorales. En un subconjunto de cánceres gástricos, TOP2A también se halló amplificado y sobreexpresado, a menudo junto con HER2 (Varis et al., 2002) (Liang et al., 2008).

Laminina, gamma 2 (LAMC2) Las lamininas son los principales componentes no colagenosos de las membranas básales. Están involucradas en la adhesión, diferenciación, migración, señalización y metástasis celulares. La cadena gamma 2 junto con las cadenas alfa 3 y beta 3 constituye la laminina 5. LAMC2 promueve el crecimiento invasivo in vivo de células humanas de cáncer. Está muy expresado en el frente de invasión de los cánceres humanos, y su expresión guarda correlación con un diagnóstico desfavorable (Tsubota et al., 2010). Un producto de escisión de la laminina 5 generado por MMP-2 es capaz de activar la señalización de EGFR y promover la motilidad celular (Schenk et al., 2003). En el carcinoma gástrico, LAMC2 podría estar inducido por miembros de la familia de EGFR o por Wnt5a, y la actividad invasora se mostró dependiente de LAMC2 (Tsubota et al., 2010) (Yamamoto et al., 2009).

Receptor de hidrocarburo de Aril (AHR) AHR une hidrocarburos aromáticos planares como TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina) y media en la transcripción de genes, incluyendo las enzimas de metabolización xenobiotica como las enzimas citocromo P450. También desempeña una función en la evolución del ciclo celular (Barhoover et al., 2010). Se cree que AHR está relacionado en parte con la actividad de promoción de tumor de la dioxina, ya que tiene funciones antiapoptósicas y en favor de la proliferación, y puede conducir a la falta de regulación del contacto célula-célula, la desdiferenciación y la motilidad potenciada (Watabe et al., 2010) (Dietrich y Kaina, 2010) (Marlowe et al., 2008). La expresión de AHR puede estar regulada descendentemente por TGF-beta (Dohr y Abel, 1997; Wolff et al., 2001) e inducida por señalización Wnt o beta-catenina (Chesire et al., 2004). Se ha hallado sobreexpresión de AHR en muchos cánceres incluyendo el cáncer gástrico, en el que guardaba correlación con la expresión frecuente de CYP1A1 (Ma et al., 2006). La translocación nuclear y la expresión de AHR fueron mayores en el cáncer gástrico que en tejidos normales, y la expresión aumentó gradualmente durante la cancerogénesis (Peng et al., 2009a). La activación de la vía de AHR potencia la invasividad de las células de cáncer gástrico posiblemente mediante la inducción de MMP-9 dependiente de c-Jun (Peng et al., 2009b). En un modelo de ratón, la expresión de un mutante constitutivamente activo del receptor de hidrocarburo de aril (CA-AHR) resulta en el desarrollo de tumores de estómago, guardando correlación con un índice de mortalidad aumentado (Andersson et al., 2002; Kuznetsov et al., 2005). La función de AHR en el cáncer parece ambigua, ya que algunos estudios también apuntan hacia una actividad inhibidora de tumores (Gluschnaider et al., 2010) (Fan et al., 2010).

Receptor de motilidad mediado por hialurano (RHA M) (HMMR) HMMR puede darse en la superficie celular, en donde une al ácido hialurónico (HA) e interactúa con el receptor de HA CD44. Esta interacción desempeña una función en procesos como la motilidad celular, la curación de heridas y la invasión (Gares y Pilarski, 2000). Desde el punto de vista intracelular, HMMR se asocia al citoesqueleto, los microtúbulos, los centrosomas y el huso mitótico y desempeña una función en el control de la integridad del huso mitótico. HMMR se encuentra sobreexpresado en varios tejidos de cáncer (Sohr y Engeland, 2008). Se ha sugerido que HA protege a las células de cáncer contra el ataque inmunitario. El HA de suero suele estar aumentado en los pacientes con metástasis (Delpech et al., 1997). HMMR se ha identificado como prometedor antígeno asociado a tumores y posible factor de pronóstico de AML y CLL. En vacunas contra la leucemia, se han utilizado péptidos derivados de HMMR. También se ha probado la inmunogenia in vitro de HMMR-001, pero no se ha utilizado en vacunas (Tzankov et al., 2011) (Greiner et al., 2010; Schmitt et al., 2008; Tabarkiewicz y Giannopoulos, 2010) (Greiner et al., 2005). También se ha hallado sobreexpresión de HMMR en otros cánceres, relacionada a menudo con un pronóstico desfavorable. HMMR también estaba sobreexpresada en el cáncer gástrico, a menudo junto a CD44, y se ha sugerido que facilita la invasión y la metástasis (Li et al., 1999) (Li et al., 2000a) (Li et al., 2000b).

TPX2, asociada a los microtúbulos, homologa (Xenopus laevis) (TPX2) TPRX2 es una proteína asociada a la proliferación expresada en las fases S, G(2) y M del ciclo celular y considerada un marcador de la proliferación (Cordes et al., 2010).

Es necesaria para la nucleación normal de microtúbulos como, por ejemplo, el ensamblaje de husos mitóticos. TPX2 recluta y activa a Aurora A (Bird y Hyman, 2008; Moss et al., 2009). La fosforilación de TPX2 con la quinasa 1 de tipo polo aumenta su habilidad para activar a Aurora A (Eckerdt et al., 2009). TPX2 está sobreexpresada en muchos tipos de tumor y, con frecuencia, junto con Aurora A (Asteriti et al., 2010). Algunos ejemplos donde se halló sobreexpresión de TPX2 (relacionada frecuentemente con un diagnóstico desfavorable o una fase avanzada) son el meningioma (Stuart et al., 2010), el cáncer de pulmón (Kadara et al., 2009) (Lin et al., 2006; Ma et al., 2006) (Manda et al., 1999) y el carcinoma hepatocelular (Shigeishi et al., 2009b) (Satow et al., 2010) (Wang et al., 2003).

La presente invención se refiere por tanto a un péptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo de secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la misma que es homologa al menos al 80% a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la misma que induce la reacción cruzada de linfocitos T con el mencionado péptido, donde el mencionado péptido no es un polipéptido completo.

La presente invención se refiere además a un péptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo de secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la misma que es homologa al menos al 80% a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95, donde el mencionado péptido o variante tiene una longitud total de entre 8 y 100 aminoácidos, preferentemente entre 8 y 30 aminoácidos y, con la máxima preferencia, entre 8 y 14 aminoácidos.

La presente invención se refiere además a los péptidos previamente descritos, que tienen la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II.

La presente invención se refiere además a los péptidos previamente descritos, donde el péptido consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95.

La presente invención se refiere además a los péptidos previamente descritos, donde el péptido es modificado y/o incluye enlaces no peptídicos.

La presente invención se refiere además a los péptidos previamente descritos, donde el péptido es una proteína de fusión, que comprende en particular aminoácidos amino de la cadena invariante (li) asociada al antígeno HLA-DR.

La presente invención se refiere además a un ácido nucleico que codifica los péptidos previamente descritos, siempre que el péptido no sea la proteína humana completa.

La presente invención se refiere además al ácido nucleico previamente descrito que es DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA o combinaciones de los mismos.

La presente invención se refiere además a un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico previamente descrito.

La presente invención se refiere además a un péptido tal y como se describió anteriormente, a un ácido nucleico tal y como se describió anteriormente o a un vector de expresión tal y como se describió anteriormente para su utilización en medicina.

La presente invención se refiere además a una célula huésped que comprende un ácido nucleico tal y como se describió anteriormente o un vector de expresión tal y como se describió anteriormente.

La presente invención se refiere además a la célula huésped descrita que es una célula presentadora de antígenos.

La presente invención se refiere además a la célula huésped descrita, donde la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.

La presente invención se refiere además a un método de producción de un péptido descrito, comprendiendo dicho método el cultivo de la célula huésped descrita y el aislamiento del péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo.

La presente invención se refiere además a un método in vitro para la producción de linfocitos T citotóxicos activados (CTL), comprendiendo dicho método el contacto in vitro de CTL con moléculas de MHC humano de clase I o II cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula adecuada presentadora de antígenos durante un periodo de tiempo suficiente para activar dichos CTL de una forma específica de antígeno, donde dicho antígeno es cualquier péptido descrito.

La presente invención se refiere además al método tal y como se describe, donde el antígeno es cargado en moléculas MHC de clase I o II expresadas en la superficie de una célula adecuada presentadora de antígeno mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente de antígeno con una célula presentadora de antígeno.

La presente invención se refiere además al método tal y como se describe, donde la célula presentadora de antígenos comprende un vector de expresión capaz de expresar el mencionado péptido que contiene SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 33 o dicha secuencia variante de aminoácidos.

La presente invención se refiere además a linfocitos T citotóxicos activados (CTL), producidos por el método descrito, que reconocen selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos descrita.

La presente invención se refiere además a un método de destrucción de células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquier secuencia de aminoácidos descrita, comprendiendo dicho método la administración al paciente de un número efectivo de linfocitos T citotóxicos (CTL) tal y como se han definido.

La presente invención se refiere además a la utilización de cualquier péptido descrito, un ácido nucleico tal y como se ha descrito, un vector de expresión tal y como se ha descrito, una célula tal y como se ha descrito, o un linfocito T citotóxico activado tal y como se ha descrito como medicamento o en la fabricación de un medicamento.

La presente invención se refiere además a una utilización tal y como se ha descrito, donde el medicamento es una vacuna.

La presente invención se refiere además a una utilización tal y como se ha descrito, donde el medicamento es activo contra el cáncer.

La presente invención se refiere además a una utilización tal y como se ha descrito, donde las mencionadas células de cáncer son células de cáncer gástrico, gastrointestinal, colorrectal, pancreático, de pulmón o renal.

La presente invención se refiere además a proteínas marcadoras particulares que pueden usarse en el pronóstico del cáncer gástrico.

Además, la presente invención se refiere a la utilización de estas dianas novedosas para el tratamiento del cáncer.

Tal y como se da a conocer en la presente invención, las proteínas codificadas por ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, EIF2S3, LOC255308, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HM R, HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP12, MMP3, MST1R, NUF2, OLFM4, PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A, TSPAN1, WNT5A, HIF1A y PTK2 se describieron como sobreexpresadas en el cáncer gástrico en comparación con el tejido gástrico normal y otros tejidos vitales (como el hígado, el riñon, el corazón) de la literatura de la materia.

Las proteínas codificadas por ABL1, ADAM10, ADAM8, AHR, ASPM, ATAD2, CCDC88A, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, CLCN3, COL6A3, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HIF1A, HMMR, HSP90B1, IGF2BP3, IQGAP3, ITGB4, KIF11, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NFYB, NUF2, OLFM4, PBK, PLK4, PPAP2C, PROM1, PTK2, RRM2, SIAH2, THY1, TOP2A, TPX2, TSPAN1 , TSPAN8, UBE2S, UCHL5 y WNT5A mostraron tener una función importante en la tumorigenia por estar involucradas en la transformación maligna, el crecimiento celular, la proliferación, la angiogénesis o la invasión del tejido normal. También para las proteínas codificadas por DNAJC10, EIF2S3, EIF3L, POLD3, PSMC2, PSMD14 y TMPRSS4 existen algunas pruebas de funciones relacionadas con el cáncer.

Las proteínas codificadas por PROM1, WNT5A, SMC4, PPAP2C, GPR38, OLFM4 y THY1 se han mostrado muy expresadas y/o funcionalmente importantes en células precursoras y/o células precursoras de cáncer. Se ha debatido la utilización de PROM1 como marcador para células precursoras de cáncer gástrico, aunque los datos son controvertidos. Las células precursoras de cáncer son una subpoblacíón de células tumorales con potencial autorrenovable necesario para un desarrollo sostenido del tumor. Estas células se encuentran en estructuras especializadas y muy organizadas, los llamados nichos de células precursoras de cáncer, que son necesarios para el mantenimiento del potencial autorrenovable de las células precursoras de cáncer.

Se ha mostrado que la sobreexpresion de las proteínas AHR, ASPM, ATAD2, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDK1 (CDC2), CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HIF1A, HM R, HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF11, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, LMNB1, MET, MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NUF2, OLFM4, PBK, PPAP2C, PROM1, PTK2, TMPRSS4, TPX2, TSPAN1 y WNT5A en los tumores está relacionada con etapas avanzadas de la enfermedad y con un diagnóstico desfavorable para los pacientes.

Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para la identificación de un animal, preferentemente un humano, que tiene probabilidades de padecer cáncer gástrico. En una realización, la probabilidad establecida se encuentra entre el 80% y el 100%. Uno de tales métodos comprende la determinación del nivel de al menos una de las proteínas MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 en una muestra de tumor del animal. En una realización, la muestra se obtiene mediante cirugía radical. En otra realización, la muestra se obtiene mediante biopsia por punción.

Cuando el nivel establecido de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 en las células se encuentra regulado ascendentemente al 20% o más en comparación con el establecido en las células epiteliales benignas del mismo espécimen, el animal se identifica como enfermo potencial de cáncer gástrico.

Cuantas más proteínas distintas del grupo que comprende las proteínas MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 se encuentren reguladas ascendentemente, mayor será la posibilidad de que el animal se identifique como enfermo potencial de cáncer gástrico.

En una realización, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa in situ. En otra realización, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa in vitro. En otra realización más, la determinación del nivel de ST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o UC6 se efectúa in vivo. En una realización preferida, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa mediante microscopía por captura láser (LCM) junto con transferencia Western.

En una realización particular, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa con un anticuerpo específico para MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6. En otra realización tal, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa mediante PCR con un cebador específico para un mRNA que codifica MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6. En otra realización más, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa con una sonda de nucleótidos específica para un mRNA que codifica MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6. En una realización tal, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa mediante transferencia Northern. En otra realización, la determinación del nivel de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 se efectúa mediante análisis de protección de ribonucleasa. En otras realizaciones, se pueden utilizar análisis inmunológicos tales como análisis de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA) y transferencias Western para detectar polipéptidos de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y UC6 en una muestra de líquido biológico (tales como sangre, suero, esputo, orina o fluido peritoneal). Las biopsias, las muestras de tejido y las muestras de células (tales como ovarios, nodulos linfáticos, raspados de células epiteliales de la superficie ovárica, biopsias de pulmón, biopsias de hígado y cualquier célula que contenga muestras de fluidos (tales como fluido peritoneal, esputo y derrames pleurales) pueden analizarse desagregando y/o disolviendo la muestra de célula o tejido y sometiéndola a un inmunoanálisis para la detección de polipéptidos, tales como ELISA, RIA o transferencia Western. Tales muestras de célula o tejido también pueden analizarse con métodos basados en ácidos nucleicos como, por ejemplo, la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR), la hibridación Northern o la transferencia por hoyos o ranuras. Para visualizar la distribución de las células tumorales en una muestra de tejido, pueden emplearse análisis de diagnóstico que mantienen la estructura del tejido de una muestra como, por ejemplo, la tinción inmunohístológica, la hibridación in situ de RNA o la RT-PCR in situ para detectar polipéptidos o mRNA marcadores de cáncer gástrico, respectivamente. Para la localización in vivo de masas tumorales, pueden emplearse pruebas de imagen como el análisis de imágenes por resonancia magnética (MRI), mediante la introducción en el sujeto de un anticuerpo que une específicamente un polipéptido MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o UC6 (particularmente un polipéptido situado en la superficie de la célula), donde el anticuerpo está conjugado o acoplado de alguna otra forma a un trazador paramagnético (u otra región adecuadamente detectable, dependiendo del método de imaginería utilizado); alternativamente, se puede detectar la localización de un anticuerpo no marcado específico de marcador tumoral utilizando un anticuerpo secundario acoplado a una región detectable.

Además, la presente invención proporciona proteinas/péptidos quiméricos/de fusión que comprenden los polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 y fragmentos de los mismos, incluyendo fragmentos funcionales, proteolíticos y antigénicos. El par o las secciones de fusión de una molécula híbrida proporcionan de forma acorde epítopos que estimulan los linfocitos T CD4+. Los epítopos de estimulación de CD4+ son bien conocidos en la técnica e incluyen a aquellos identificados en el toxoide tetánico. En otra realización preferida, el péptido es una proteína de fusión que comprende en particular aminoácidos amino de la cadena invariante (li) asociada al antígeno HLA-DR. En una realización, el péptido de la invención es una proteína humana truncada o una proteína de fusión de un fragmento de proteína y otra porción de polipéptido, siempre que la porción humana incluya una o más secuencias inventadas de aminoácidos.

Los anticuerpos de los polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o UC6, de las proteínas quiméricas/de fusión que comprenden los polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6, así como de los fragmentos de los polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6, incluyendo los fragmentos proteolíticos y antigénicos, y de las proteínas/péptidos quiméricos/de fusión que comprenden estos fragmentos también son parte de la presente invención. Además, los métodos de utilización de tales anticuerpos para el pronóstico del cáncer, y del cáncer gástrico en particular, también son parte de la presente invención.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos quiméricos. Las lineas celulares inmortales que producen un anticuerpo monoclonal de la presente invención también son parte de la presente invención.

Un experto en la técnica entenderá que, en algunos casos, la mayor expresión de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 como gen marcador de tumor indica un diagnóstico peor para un sujeto con cáncer gástrico. Por ejemplo, los niveles de expresión relativamente mayores de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 pueden indicar un tumor primario relativamente grande, una mayor carga tumoral (más metástasis, por ejemplo) o un fenotipo de tumor relativamente más maligno.

Cuantas más proteínas distintas del grupo que comprende MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 se encuentren sobreexpresadas, peor será el diagnóstico.

Los métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención implican la utilización de métodos conocidos como, por ejemplo, métodos basados en anticuerpos para detectar polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 y métodos basados en la amplificación y/o la hibridación de ácidos nucleicos para detectar el mRNA de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6.

Además, puesto que la destrucción rápida de células tumorales suele resultar en la generación de autoanticuerpos, los marcadores tumorales de cáncer gástrico de la invención pueden utilizarse en análisis serológicos (por ejemplo, en un análisis ELISA del suero de un sujeto) para detectar autoanticuerpos contra MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 en un sujeto. Los niveles de autoanticuerpo específicos de los polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 que son al menos unas 3 veces mayores (y preferentemente al menos 5 veces o 7 veces mayores, y con la máxima preferencia al menos 10 veces o 20 veces mayores) que en una muestra de control, son indicativos de cáncer gástrico.

Todos los polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 secretados, ¡ntracelulares y localizados en la superficie celular, pueden emplearse para el análisis de biopsias, como por ejemplo muestras de células o tejidos (incluyendo células obtenidas de muestras líquidas como fluido de la cavidad peritoneal), para identificar biopsias de células o tejidos que contengan células de cáncer gástrico. Una biopsia puede analizarse como tejido intacto o como muestra de célula completa, o se puede desagregar y/o disolver la muestra de célula o tejido según se necesite para el tipo particular de análisis diagnóstico que se vaya a utilizar. Por ejemplo, las biopsias o las muestras pueden someterse a un análisis completo in situ de los niveles de mRNA o polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 en tejidos o células, utilizando, por ejemplo, inmunohistoquímica, hibridación in situ de mRNA o RT-PCR in situ. El experto en la técnica sabrá cómo procesar tejidos o células para el análisis de niveles de polipéptidos o de mRNA utilizando métodos inmunológicos tales como ELISA, inmunotransferecias o métodos equivalentes, o análisis de niveles de mRNA por métodos analíticos basados en ácidos nucleicos tales como RT-PCR, hibridación Northern o transferencias por hoyos o ranuras.

Equipos de reactivos para medir los niveles de expresión de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 La presente invención proporciona equipos de reactivos para detectar un nivel de expresión aumentado de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 como gen marcador de cáncer gástrico en un sujeto. Un equipo de reactivos para detectar polipéptidos marcadores de cáncer gástrico contiene preferentemente un anticuerpo que une específicamente un polipéptido seleccionado marcador de cáncer gástrico. Un equipo de reactivos para detectar mRNA marcador de cáncer gástrico contiene preferentemente uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, uno o más cebadores o sondas de oligonucleótidos, sondas de DNA, sondas de RNA o moldes para generar sondas de RNA) que hibrídan específicamente con mRNA de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6.

Particularmente, el equipo de reactivos basado en anticuerpos puede utilizarse para detectar la presencia y lo medir el nivel de un polipéptido MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 unido específicamente por el anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo del mismo. El equipo de reactivos puede incluir un anticuerpo reactivo con el antígeno y un reactivo para detectar una reacción del anticuerpo con el antígeno. Dicho equipo de reactivos puede ser un equipo de reactivos ELISA y puede contener un control (por ejemplo, una cantidad determinada de un polipéptido particular marcador de cáncer gástrico), anticuerpos primarios y secundarios en caso necesario, y cualquier otro reactivo necesario como reactivos coloreados, substratos de enzima y regiones detectables, tal y como se ha descrito más arriba. Alternativamente, el equipo diagnóstico de reactivos puede ser un equipo de inmunotransferencia que comprenda de forma general los componentes y reactivos descritos en la presente invención.

Puede utilizarse un equipo de reactivos basados en ácidos nucleicos para detectar y/o medir el nivel de expresión de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 mediante la detección y/o medición de la cantidad de mRNA de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 en una muestra tal como una biopsia de célula o tejido. Por ejemplo, un equipo RT-PCR para la detección de una expresión elevada de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 contiene preferentemente suficientes cebadores de oligonucleótidos para efectuar la transcripción inversa del mRNA marcador de cáncer gástrico a cDNA y la amplificación PCR del cDNA marcador de cáncer gástrico, y preferentemente también contendrá cebadores y moléculas molde de PCR de control para efectuar los controles positivo y negativo adecuados, y controles internos para la cuantificación. El experto en la técnica sabrá cómo seleccionar los cebadores adecuados para llevar a cabo las reacciones PCR y de transcripción inversa, y las reacciones de control adecuadas que deban efectuarse. Dichas pautas se encuentran, por ejemplo, en F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1997. Se conocen numerosas variaciones de RT-PCR en la técnica. El envío direccionaiizado de inmunotoxinas a MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 puede emplearse como diana terapéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer gástrico. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo que une específicamente un polipéptido MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 localizado en la superficie celular puede estar conjugado con un radioisótopo u otro compuesto tóxico. Los conjugados de anticuerpo se administran al sujeto de tal forma que la unión del anticuerpo a su polipéptido cognado de cáncer gástrico tiene como resultado el envío direccionaiizado del compuesto terapéutico a células de cáncer gástrico, tratándose así el cáncer de ovario.

La región terapéutica puede ser una toxina, un radioisótopo, un medicamento, un agente químico o una proteína (véase, por ejemplo, Bera et al., «Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent disulfide-stabilized Fv immunotoxin with improved antigen binding to erbB2», Cáncer Res., 59: 4018-4022, (1999)). Por ejemplo, el anticuerpo puede estar ligado o conjugado a una toxina bacteriana (por ejemplo, la toxina de difteria, la exotoxina A de pseudomonas o la toxina de cólera) o a la toxina de una planta (por ejemplo, la toxina de ricina) para el envío direccionalizado de la toxina a una célula que exprese MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6. Esta inmunotoxina puede enviarse a una célula y, en el momento de unión del polipéptido marcador de cáncer gástrico localizado en la superficie celular, la toxina conjugada al anticuerpo específico de marcador de cáncer gástrico será enviada a la célula.

Además, para cualquier polipéptido MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 para el que existe un ligando específico (por ejemplo, un ligando que une una proteína localizada en la superficie), el ligando puede utilizarse en lugar de un anticuerpo para dirigir un compuesto tóxico a una célula de cáncer gástrico, tal y como se describe más arriba.

El término «anticuerpos» se utiliza aquí en un sentido amplio e incluye anticuerpos tanto monoclonales como policlonales. Además de las moléculas intactas de inmunoglobulina, en el término «anticuerpos» también se incluyen fragmentos o polímeros de dichas moléculas de inmunoglobulina y de versiones humanizadas de moléculas de inmunoglobulina, siempre que exhiban cualquiera de las propiedades deseadas (por ejemplo, la unión específica de un polipéptido marcador de cáncer gástrico, el envío de una toxina a una célula de cáncer gástrico que expresa un gen marcador de cáncer gástrico a un mayor nivel y/o la inhibición de la actividad de un polipéptido marcador de cáncer gástrico) descritas en la presente invención.

Siempre que sea posible, los anticuerpos de la invención pueden adquirirse en el mercado. Los anticuerpos de la invención también pueden generarse utilizando métodos bien conocidos. El experto en la técnica sabe que pueden utilizarse o polipéptidos completos marcadores de cáncer gástrico o fragmentos de los mismos para generar los anticuerpos de la invención. Un polipéptido que se vaya a utilizar para generar un anticuerpo de la invención puede estar parcial o totalmente purificado a partir de una fuente natural o bien puede producirse utilizando técnicas de recombinación de DNA. Por ejemplo, un cDNA que codifique un polipéptido MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6, o un fragmento del mismo, puede expresarse en células procarióticas (bacterias, por ejemplo) o eucarióticas (células de mamíferos, insectos o levadura, por ejemplo), después de lo cual la proteína recombinante puede purificarse y usarse para generar una preparación de anticuerpo policlonal o monoclonal que una específicamente el polipéptido marcador de cáncer gástrico utilizado para generar el anticuerpo.

El experto en la técnica sabrá que la generación de dos o más conjuntos diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo con la especificidad y afinidad requeridas para la utilización pretendido (por ejemplo, la terapia de inmunotoxinas, las pruebas de imágenes in vivo, la inmunohistoquímica o ELISA). La actividad deseada de los anticuerpos se analiza mediante métodos conocidos, según el propósito para el que se vayan a utilizar los anticuerpos (por ejemplo, ELISA, inmunohistoquímica, ¡nmunoterapia, etc.; para más información sobre la generación y análisis de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Por ejemplo, los anticuerpos pueden analizarse con ensayos ELISA, transferencias Western, tinción inmunohistoquímica de cánceres gástricos fijados por formalina o secciones de tejido congelado. Tras su caracterización inicial in vitro, los anticuerpos destinados a la utilización terapéutica o diagnóstica in vivo se analizan según métodos conocidos de análisis clínico.

El término «anticuerpo monoclonal» tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, que los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos «quiméricos» en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad antagonista deseada (patente de EUA n.° 4816567).

Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden prepararse utilizando métodos de hibridoma. En un método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado se inmuniza típicamente con un agente de inmunización para desencadenar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse con métodos de DNA recombinante tales como los descritos en la patente de EUA n.° 4816567. El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de roedor).

Los métodos in vitro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, puede efectuarse utilizando técnicas rutinarias conocidas en la técnica. Por ejemplo, la digestión puede realizarse utilizando papaína. Algunos ejemplos de digestión de papaína se describen en el documento WO 94/29348 publicado el 22 de diciembre de 1994 y en la patente de EUA n.° 4 342 566. La digestión de los anticuerpos con papaína produce típicamente dos fragmentos idénticos de unión al antigeno denominados «fragmentos Fab», cada uno de ellos con un centro único de unión al antígeno, y un fragmento residual Fe. El tratamiento con pepsina produce un fragmento que tiene dos centros de combinación del antígeno y que aún es capaz de entrecruzamiento con el antígeno.

Los fragmentos de anticuerpo, tanto si están unidos o no a otras secuencias, también pueden incluir inserciones, deleciones, substituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o residuos específicos de aminoácidos, siempre que la actividad del fragmento no se encuentre significativamente alterada o debilitada en comparación con el fragmento de anticuerpo o el anticuerpo no modificados. Estas modificaciones pueden proporcionar alguna propiedad adicional tal como la eliminación/adición de aminoácidos capaces de un enlace disulfuro, el aumento de su biolongevidad, la alteración de sus características secretoras, etc. En cualquier caso, el fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva tal como actividad de enlace, regulación del enlace en el dominio de enlace, etc. Las regiones funcionales o activas del anticuerpo pueden identificarse mediante mutagénesis de una región específica de la proteína, seguida de la expresión y el análisis del polipéptido expresado. Tales métodos son fácilmente comprensibles para el experto en la técnica y pueden incluir mutagénesis específicas de sitio del ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (de roedores, por ejemplo) son ¡nmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab' u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen ¡nmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata o un conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias marco o CDR importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables de al menos uno, y típicamente dos, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consensuada de inmunoglobulina humana. De forma óptima, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

Los métodos para la humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido que se le han introducido de una fuente no humana. Estos residuos no humanos de aminoácido suelen denominarse residuos «de importación», que típicamente se obtienen de un dominio variable «de importación». La humanización puede efectuarse esencialmente mediante la sustitución de secuencias de CDR de roedor para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De tal forma, dichos anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quiméricos (patente de EUA n.° 4 816 567), en los que se ha sustituido sustancialmente menos que un dominio variable intacto humano por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

Se pueden emplear animales transgénicos (ratones, por ejemplo) que, al inmunizarse, son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión a la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos tiene como resultado la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz géníca de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal tendrá como resultado la producción de anticuerpos humanos en la reinmunización antigénica. Los anticuerpos humanos también pueden producirse en genotecas de expresión en fago.

Los anticuerpos de la invención se administran preferentemente a un sujeto en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Típicamente, en la fórmula se utiliza una cantidad adecuada de sal farmacéuticamente aceptable para volverla isotónica. Algunos ejemplos de vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferentemente de entre cerca de 5 y cerca de 8, y más preferentemente de entre cerca de 7 y cerca de 7,5. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que se presentan en artículos de distintas formas como, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Los expertos en la técnica sabrán que ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración del anticuerpo que se esté administrando.

Los anticuerpos pueden administrarse al sujeto, paciente o célula mediante inyección (intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, por ejemplo) u otros métodos tales como la infusión, que aseguren su envío al torrente sanguíneo de forma efectiva. Los anticuerpos también pueden administrarse por vías intra- o peritumorales para generar efectos terapéuticos sistémicos y locales. Se prefiere la inyección intravenosa o local.

La dosificación y periodicidad en la administración de los anticuerpos puede determinarse de forma empírica, y el establecimiento de tales determinaciones forma parte de la técnica. Los expertos en la técnica sabrán que la dosificación de los anticuerpos que deben administrarse variará dependiendo de, por ejemplo, el sujeto que vaya a recibir el anticuerpo, la vía de administración, el tipo de anticuerpo utilizado en particular y otros medicamentos que se estén administrando. Una dosis diaria típica del anticuerpo usado aisladamente podría oscilar entre aproximadamente 1 pg/kg y hasta 100 mg/kg o más de masa corporal al día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Después de la administración de un anticuerpo para el tratamiento del cáncer gástrico, la eficacia del anticuerpo terapéutico puede evaluarse de diversas formas bien conocidas para el experto en la técnica. Por ejemplo, el tamaño, el número y/o la distribución del cáncer gástrico en un sujeto que esté recibiendo tratamiento puede monitorizarse utilizando las técnicas de imagen estándar para detectar tumores. Un anticuerpo administrado terapéuticamente que detiene el crecimiento del tumor, lo reduce y/o previene el desarrollo de nuevos tumores, en comparación con el curso que seguiría la enfermedad si no se hubiera administrado el anticuerpo, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del cáncer gástrico.

Puesto que las proteínas ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, EIF2S3, LOC255308, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HMMR, HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MP12, MMP3, MST1R, NUF2, OLFM4, PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A, TSPAN1, WNT5A, HIF1A y PTK2 se han mostrado muy expresadas en al menos un subconjunto de tejidos de cáncer gástrico en comparación con tejidos normales, la inhibición de su expresión o actividad puede integrarse en cualquier estrategia terapéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer gástrico.

El principio de la terapia antisentido se basa en la hipótesis de que la inhibición de la expresión génica específica de secuencia (mediante transcripción o traducción) puede lograrse mediante hibridación intracelular entre el DNA o el mRNA genómico y una especie antisentido complementaria. La formación de tal dúplex híbrido de ácidos nucleicos interfiere con la transcripción del DNA genómico de codificación del antígeno del tumor diana o el procesamiento/transporte/traducción y/o estabilidad del mRNA del antígeno del tumor diana.

Los ácidos nucleicos antisentido pueden administrarse mediante una variedad de enfoques. Por ejemplo, pueden administrarse directamente (por inyección intravenosa, por ejemplo) oligonucleótidos antisentido o RNA antisentido a un sujeto en una forma que permita su absorción por las células tumorales. Alternativamente, en las células pueden introducirse in vivo vectores víricos o plásmidos que codifiquen RNA antisentido (o fragmentos de RNA). Los efectos antisentido también pueden estar inducidos por secuencias mensajeras; sin embargo, el grado de cambios fenotípicos es muy variable. Los cambios fenotípicos inducidos por una terapia antisentido efectiva se evalúan conforme a los cambios en, por ejemplo, los niveles de mRNA diana, los niveles de proteína diana y/o los niveles de actividad de la proteína diana.

En un ejemplo concreto, la inhibición de la función marcadora del tumor gástrico mediante terapia génica antisentido puede efectuarse mediante la administración directa de RNA antisentido marcador de tumor gástrico a un sujeto. El RNA antisentido marcador de tumor puede producirse y aislarse mediante cualquier técnica habitual, pero la forma más fácil de producirlo es la transcripción in vitro utilizando un cDNA antisentido marcador de tumor bajo el control de un promotor de elevada eficacia (por ejemplo, el promotor T7). La administración de RNA antisentido marcador de tumor a las células puede efectuarse mediante cualquiera de los métodos de administración directa de ácidos nucleicos descritos más abajo.

Una estrategia alternativa para inhibir la función de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 utilizando la terapia génica implica la expresión intracelular de un anticuerpo anti-MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 o una porción de un anticuerpo anti- MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6. Por ejemplo, el gen (o fragmento de gen) que codifica un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido ST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 e inhibe su actividad biológica se sitúa bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora génica específica (por ejemplo, específica de tumor o de tejido), dentro de un vector de expresión de ácidos nucleicos. El vector se administra a continuación al sujeto de tal forma que es absorbido por las células de cáncer gástrico u otras células, que después segregan el anticuerpo anti- MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6 y de esa forma bloquean la actividad biológica del polipéptido MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6. Preferentemente, los polipéptidos MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 están presentes en la superficie extracelular de las células de cáncer gástrico.

En los métodos descritos más arriba, que incluyen la administración y absorción de DNA exógeno en las células de un sujeto (es decir, la transfección o transducción génica), los ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar en forma de DNA desnudo o pueden estar en un vector para el envío de los ácidos nucleicos a las células para la inhibición de la expresión de la proteina marcadora de tumor gástrico. El vector puede ser una preparación disponible comercialmente tal como un vector de adenovirus (Quantum Biotechnologies, Inc., Laval, Quebec, Canadá). El envío del ácido nucleico o el vector a las células puede realizarse mediante una serie de mecanismos. Por ejemplo, el envío puede realizarse mediante un liposoma, utilizando preparaciones de liposoma disponibles comercialmente tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO- 25 BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.), así como otros liposomas desarrollados según procedimientos habituales en la técnica. Además, el ácido nucleico o vector de la presente invención puede suministrarse in vivo mediante electroporación, la tecnología para la cual se puede adquirir en Genetronics, Inc. (San Diego, California) así como mediante una máquina de SONOPORACIÓN (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona).

Por ejemplo, el suministro del vector puede realizarse mediante un sistema vírico, tal como un sistema de vector retrovírico que puede contener un genoma retrovírico recombinante. El retrovirus recombinante puede utilizarse entonces para infectar y así suministrar a las células infectadas ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB o MUC6. El método exacto de introducción del ácido nucleico alterado en células de mamífero no se limita, por supuesto, a la utilización de vectores retrovíricos. Existe una amplia variedad de otras técnicas disponibles para este procedimiento, incluyendo la utilización de vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores lentivíricos o pseudotipos de vectores retrovíricos. También pueden utilizarse técnicas de transducción física tales como el suministro de liposomas y mecanismos mediados por receptor y otros mecanismos de endocitosis. Esta invención puede utilizarse en conjunción con cualquiera de estos u otros métodos de transferencia génica habitualmente utilizados.

Los anticuerpos también pueden utilizarse para análisis diagnósticos in vivo. Generalmente, el anticuerpo está marcado con un radionucleótido (tal como 11 ln, "Te, 1 C, 131l, 3H, 32 P o 35 S) de forma que el tumor puede localizarse utilizando ¡nmunocentellografía. En una realización, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos se unen a los dominios extracelulares de dos o más dianas MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 y el valor de afinidad (Kd) es menor de 1 x 10 µ?.

Los anticuerpos para utilización diagnóstica pueden etiquetarse con sondas adecuadas para la detección con diversos métodos de imagen. Los métodos para la detección de sondas incluyen, sin limitarse a ellos, la microscopía de fluorescencia, de luz, confocal y electrónica; la espectroscopia y la imaginología por resonancia magnética; la fluoroscopia, la radiotomografía digital y la tomografía por emisión de positrones. Las sondas adecuadas incluyen, sin limitarse a ellas, fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluoróforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, fluorina-18 y otros radionúclidos emisores de positrones. Adicionalmente, las sondas pueden ser bi- o multifuncionales y ser detectables por más de uno de los métodos listados. Estos anticuerpos pueden marcarse directa o indirectamente con las mencionadas sondas. La unión de las sondas a los anticuerpos incluye la unión covalente de la sonda, la incorporación de la sonda al anticuerpo y la unión covalente de un compuesto quelante para la unión de la sonda, entre otros bien conocidos en la técnica. En inmunohistoquímica, la muestra de tejido enfermo puede ser fresca o congelada o estar insertada en parafina y fijada con un conservador tal como formalina. La sección fijada o insertada que contiene la muestra es puesta en contacto con un anticuerpo secundario y un anticuerpo primario etiquetado, donde el anticuerpo se utiliza para detectar las proteínas MST1R, UCHL5, S C4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB MUC6 expresadas in situ.

La presente invención proporciona así un péptido que comprende una secuencia que es seleccionada del grupo de secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la misma que es homologa al 85%, preferentemente al 90% y más preferentemente al 96%, a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la misma que inducirá a los linfocitos T a la reacción cruzada con el mencionado péptido.

Los péptidos de la invención tienen la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I.

En la presente invención, el término «homólogo» se refiere al grado de identidad entre secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir, secuencias de péptidos o polipéptidos. La mencionada «homología» se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias que se van a comparar. Las secuencias que se van a comparar en el presente documento pueden sufrir una adición o deleción (un gap o similares, por ejemplo) en la alineación óptima de las dos secuencias. Dicha homología de secuencia puede calcularse mediante la creación de una alineación, utilizando, por ejemplo, el algoritmo ClustalW. o programas disponibles de análisis de secuencias, más específicamente Vector NTI, GENETYX o herramientas de análisis proporcionadas por bases de datos públicas.

El experto en la técnica será capaz de evaluar si los linfocitos T inducidos por una variante de un péptido específico podrán reaccionar de forma cruzada con el propio péptido (Fong et al., 8809-14); (Appay et al., 1805-14; Colombetti et al., 2730-38; Zaremba et al., 4570-77).

Por «variante» de la secuencia de aminoácidos dada, los inventores se refieren a que las cadenas laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos de aminoácidos son alteradas (por ejemplo, reemplazándolas por la cadena lateral de otro residuo natural de aminoácido u otra cadena lateral) de forma que el péptido todavía es capaz de unirse a una molécula HLA sustancialmente de la misma forma que un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos dada en las secuencias SEQ ID n.° 1 a 33. Por ejemplo, un péptido puede modificarse de forma que al menos mantenga, o mejore, la habilidad para interactuar y unirse al surco de unión de una molécula MHC adecuada, tal como HLA-A*02 o -DR y, en ese sentido, al menos mantenga, o mejore, la habilidad para unirse al TCR del CTL activado.

Estos CTL pueden reaccionar posteriormente de forma cruzada con células y destruir las células que expresan un polípéptido que contiene la secuencia natural de aminoácidos del péptido cognado, como se define en los aspectos de la invención. Como se deriva de la literatura científica de la materia (Rammensee, Bachmann y Stevanovic) y de las bases de datos (Rammensee et al., 213-19), determinadas posiciones de péptidos de unión a HLA son típicamente residuos conservados que forman una secuencia central que se ajusta al motivo de unión del receptor HLA, que se define por características polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas de polipéptido que constituyen el surco de unión. De esta forma, el experto en la técnica sería capaz de modificar las secuencias de aminoácidos expuestas en las secuencias SEQ ID n.° 1 a 95, mediante el mantenimiento de los residuos conservados conocidos, y sería capaz de determinar si tales variantes mantienen la habilidad para unirse a moléculas MHC de clase I o II. Las variantes de la presente invención mantienen su habilidad para unirse al TCR de los CTL activados, que posteriormente pueden reaccionar de forma cruzada y destruir células que expresen un polipéptido que contenga la secuencia natural de aminoácidos del péptido cognado tal y como se define en los aspectos de la invención.

Los residuos de aminoácidos que no participan sustancialmente en las interacciones con el receptor de linfocitos T pueden modificarse mediante el reemplazo con otro aminoácido cuya incorporación no afecte sustancialmente a la reactividad del linfocito T ni elimine la unión al MHC relevante. Por lo tanto, aparte de la condición dada, el péptido de la invención puede ser cualquier péptido (término en el que los inventores incluyen oligopéptidos y polipéptidos) que incluya las secuencias de aminoácidos o una porción o variante de las mismas según se ha especificado.

Tabla 3: Variantes y motivo de los péptidos conforme a las secuencias SEQ ID n.° 1 a 33 También pueden ser adecuados péptidos más largos. También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque habitualmente tienen una longitud de entre 8 y 11 aminoácidos, sean generados por el procesamiento peptídico de proteínas o péptidos más largos que incluyan el epítopo. Se prefiere que los residuos que flanquean al epítopo real sean residuos que no afecten sustancialmente la escisión proteolítica necesaria para exponer al epítopo real durante el procesamiento.

En consecuencia, la presente invención también proporciona péptidos y variantes de epítopos MHC de clase I, donde el péptido o variante tiene una longitud total de entre 8 y 100 aminoácidos, preferentemente de entre 8 y 30 y, con la máxima preferencia, de entre 8 y 14 aminoácidos, a saber, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 aminoácidos.

Por supuesto, el péptido o variante conforme a la presente invención tendrá la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC puede analizarse con métodos conocidos en la técnica.

En una realización particularmente preferida de la invención, el péptido consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95.

«Consistir esencialmente en» se refiere a que un péptido conforme a la presente invención, además de la secuencia conforme a cualquiera de las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la misma, contiene fragmentos adicionales de aminoácidos localizados en los extremos N o C que no necesariamente forman parte del péptido que actúa como un epítopo para epítopos de moléculas MHC.

Sin embargo, estos fragmentos pueden ser importantes para proporcionar una introducción eficiente en las células del péptido conforme a la presente invención. En una realización de la presente invención, el péptido es una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos amino de la cadena invariante asociada al antígeno HLA-D (p33, en la siguiente «li»), como se deriva de la base de datos del NCBI, número de registro del GenBank X00497.

Además, el péptido o variante puede modificarse más para mejorar la estabilidad y/o la unión a moléculas MHC con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria más potente. Los métodos para tal optimización de una secuencia de péptido son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o de enlaces no peptídicos.

En un enlace peptídico inverso, los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino que el enlace peptídico está invertido. Estas formas retro-inverso pueden hacerse utilizando métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, los descritos en Meziere et al., (1997), J. Immunol., 159, 3230-3237, incluidos aquí como referencia. Este enfoque implica la elaboración de pseudopéptidos que contienen cambios que involucran al esqueleto, y no a la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al., (1997) muestran que, para la unión a MHC y las respuestas de linfocitos T colaboradores, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos de tipo retro-inverso, que contienen uniones NH-CO en lugar de uniones peptídicas CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólísís.

Ejemplos de enlaces no peptídicos son -CH2-NH, -CH2S-, - CH2CH2-, -CH = CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos n.° 4 897445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas de polipéptidos que implica a polipéptídos sintetizados mediante procedimientos estándar y al enlace no peptídico sintetizado mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en presencia de NaCNBH3.

Los péptidos que comprenden las secuencias descritas más arriba pueden ser sintetizados con grupos químicos adicionales presentes en sus extremos amino y/o carboxilo, para potenciar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la afinidad de los péptidos. Por ejemplo, los grupos hidrofóbicos tales como los grupos carbobenzoxil, dansil o t-butiloxicarbonil pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. De la misma forma, se puede situar un grupo acetil o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonil en los extremos amino de los péptidos. Además, el grupo hidrofóbico, t-butiloxicarbonil, o un grupo amido se puede añadir a los extremos carboxilos de los péptidos.

Además, los péptidos de la invención pueden sintetizarse para alterar su configuración esférica. Por ejemplo, se puede utilizar el D-isómero de uno o más residuos de aminoácido del péptido, en lugar del L-isómero habitual. Más aún, al menos uno de los residuos de aminoácido de los péptidos de la invención puede sustituirse por uno de los residuos de aminoácido no naturales bien conocidos en la técnica. Alteraciones como éstas pueden servir para aumentar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la acción de unión de los péptidos de la invención.

De forma similar, un péptido o variante de la invención puede modificarse químicamente mediante la reacción de aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. En la técnica se conocen bien los ejemplos de tales modificaciones y se resumen, por ejemplo, en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3a edición, CRC Press, 2005, incluido aquí como referencia. Las modificaciones químicas de los aminoácidos incluyen, sin limitarse a ellas, la modificación por acilación, amidinación, piridoxilación de lisina, alquilación reductiva, trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), amidación de grupos carboxilo y modificación sulfhidrílica por oxidación con ácido perfórmico de cisteína en ácido cisteico, formación de derivados de mercurio, formación de disulfuros mezclados con otros compuestos de tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido iodoacético o iodoacetamida y carbamoilación con cianato en pH alcalino, pero sin limitarse a ellas. En este sentido, remitimos al experto en la técnica al capítulo 15 de la obra Current Protocols in Protein Science, de Coligan et al., (John Wiley and Sons, Nueva York, 1995-2000) para más información sobre la metodología relacionada con la modificación química de las proteínas.

En resumen, la modificación de, por ejemplo, residuos de arginilo en las proteínas suele estar basada en la reacción de compuestos vecinos de dicarbonilo tales como el fenilglioxal, el 2,3-butanodiona o el 1 ,2-ciclohexanodiona para formar un aducto. Otro ejemplo es la reacción de metilglioxal con residuos de arginina. La cisteína puede modificarse sin modificación concomitante de otros sitios nucleofilos tales como la lisina y la histidina. Como resultado, un gran número de reactivos están disponibles para la modificación de la cisteína. Las páginas web de empresas como Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) proporcionan información sobre reactivos específicos.

La reducción selectiva de los enlaces disulfuro en las proteínas también es habitual. Los enlaces disulfuro se pueden formar y oxidar durante el tratamiento térmico de medicamentos biológicos.

El reactivo K de Woodward se puede utilizar para modificar residuos específicos de ácido glutámico. Se puede utilizar N-(3-(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida para formar enlaces cruzados intramoleculares entre un residuo de lisina y un residuo de ácido glutámico.

Por ejemplo, el dietilpirocarbonato es un reactivo para la modificación de residuos histidilo en las proteínas. La histidina también puede modificarse utilizando 4-hidroxi-2-nonenal.

La reacción de residuos de lisina y otros grupos amino-á es útil, por ejemplo, en la unión de péptidos a superficies o en la interconexión de proteínas/péptidos. La lisina es el sitio de unión del poli(etilen)glicol y el principal sitio de modificación en la glicosilación de proteínas.

Los residuos de metionina de las proteínas pueden modificarse, por ejemplo, con iodoacetamida, bromoetilamina o cloramina T.

El tetranitrometano y el N-acetilimidazol pueden utilizarse para la modificación de residuos tirosil. La interconexión mediante la formación de ditirosina puede lograrse con iones de cobre/peróxido de hidrógeno.

Estudios recientes sobre la modificación del triptófano han utilizado N-bromosuccinimida, bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (escatol BPNS).

La correcta modificación de péptidos y proteínas terapéuticos con PEG suele relacionarse con una prolongación de la semivida circulatoria, mientras que la interconexión de proteínas con glutaraldehído, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se utiliza para la preparación de hidrogeles. La modificación química de los alérgenos para la inmunoterapia suele lograrse mediante carbamoilación con cianato de potasio.

Una realización preferida de la invención es un péptido o variante donde el péptido se modifica o incluye enlaces no peptídicos. En general, los péptidos y las variantes (al menos los que contienen enlaces peptídicos entre residuos de aminoácidos) se pueden sintetizar mediante el modo de poliamida Fmoc de síntesis de péptidos de fase sólida, tal y como se describe en Lu et al., (1981) y en las referencias ahí contenidas. La protección temporal del grupo N-amino se debe al grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonílo (Fmoc). La escisión repetitiva de este grupo protector muy lábil en bases se lleva a cabo utilizando piperidina al 20% en N.N-dimetilformamida. Las funcionalidades de la cadena lateral pueden estar protegidas como sus butil éteres (en el caso de la serina treonina y la tirosina), butil ésteres (en el caso del ácido glutámico y del ácido aspártico), derivado del butiloxicarbonilo (en el caso de la lisina y la histidina), derivado del tritilo (en el caso de la cisteína) y derivado del 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo (en el caso de la arginina). Cuando la glutamina o la asparagina son residuos carboxilo, se hace uso del grupo 4,4'-dimetoxibencihidrilo para la protección de las funcionalidades amido de la cadena lateral. El soporte de fase sólida se basa en un polímero polidimetil-acrilamido constituido a partir de los tres monómeros dimetilacrilamido (monómero esqueleto), bisacriloiletileno díamino (interconector) y acriloilsarcosino metil éster (agente funcionalizador). El agente péptido-resina ligado escindible utilizado es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético lábil en ácidos. Todos los derivados de aminoácidos se añaden como sus derivados anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la asparagina y la glutamina, que se añaden utilizando un procedimiento inverso de acoplamiento mediado por ?,?-diciclohexil-carbodümida/1 hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección son monitorizadas utilizando procedimientos analíticos de isotina, ácido trinitrobencenosulfonico o ninhidrina. Al completarse la síntesis, los péptidos se escinden del soporte de resina con eliminación concomitante de los grupos de protección de la cadena lateral mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% con una mezcla depuradora al 50%. Los depuradores utilizados habitualmente incluyen etanoditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo la elección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se esté sintetizando. Una combinación de metodologías de fase de solución y fase sólida para la síntesis de péptidos también es posible (véase, por ejemplo, Bruckdorfer, Marder y Albericio 29-43 y las referencias ahí citadas).

El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío, con la posterior trituración con éter dietílico, proporcionando el péptido en crudo. Cualquier resto de depurador se elimina por un procedimiento de extracción simple que, en la liofilización de la fase acuosa, proporciona el péptido en crudo libre de depuradores. Los reactivos para la síntesis de péptidos están disponibles, por ejemplo, en Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.

La purificación se puede efectuar mediante una cualquiera, o una combinación de las mismas, de las técnicas tales como la recristalización, la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio de iones, la cromatografía de interacción hidrofóbica y (normalmente) la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida utilizando, por ejemplo, separación por gradiente de agua/acetonitril.

El análisis de los péptidos puede efectuarse utilizando cromatografía en capa delgada, electroforesis, en particular, electroforesis capilar, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida, análisis de aminoácidos tras hidrólisis ácida y mediante espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como mediante análisis espectrométricos de masas MALDI y ESI-Q-TOF.

Otro aspecto más de la invención proporciona un ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) que codifica un péptido o variante de péptido de la invención. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA o combinaciones de los mismos, monocatenario y/o binario, o formas estabilizadas o naturales de polinucleótidos tales como, por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fósforotioato, y puede contener o no contener intrones, siempre que codifique el péptido. Por supuesto, sólo los péptidos que contienen residuos naturales de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos naturales son codificables por un polinucleótido. Otro aspecto más de la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido conforme a la invención.

Se han desarrollado una variedad de métodos para unir polinucleótidos, especialmente DNA, a vectores mediante, por ejemplo, extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, algunas secuencias de homopolímero complementarias se pueden añadir al segmento de DNA que se vaya a insertar en el DNA vector. El vector y el segmento de DNA se unen entonces mediante enlace de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de DNA recombinante.

Los conectores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción proporcionan un método alternativo de unión del segmento de DNA a los vectores. Los conectores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa de restricción están disponibles comercialmente de una serie de proveedores incluyendo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EUA Un método deseable de modificación del DNA que codifica el polipéptido de la invención emplea la reacción en cadena de la polimerasa tal y como se describe en Saiki et al., 487-91. Este método puede ser utilizado para introducir el DNA en un vector adecuado, por ejemplo mediante ingeniería en sitios de restricción adecuados, o puede utilizarse para modificar el DNA de otras formas útiles conocidas en la técnica. Si se utilizan vectores víricos, se prefieren vectores de adenovirus o de virus de viruela.

El DNA (o, en el caso de los vectores retrovíricos, el RNA) se puede expresar entonces en un huésped adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido o variante de la invención. Así, el DNA que codifica el péptido o variante de la invención se puede utilizar de acuerdo con técnicas conocidas, modificadas adecuadamente en vista de las enseñanzas contenidas en la presente invención, para construir un vector de expresión que se utiliza entonces para transformar una célula huésped adecuada para la expresión y producción del polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen las descritas en las patentes de EUA n.° 4440 859, 4 530 901, 4 582 800, 4 677 063, 4678 751, 4704 362, 4 710463, 4 757 006, 4766 075 y 4810 648.

El DNA (o, en el caso de los vectores retrovíricos, el RNA) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención, puede unirse a una amplia variedad de otras secuencias de DNA para su introducción en un huésped adecuado. El DNA acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, la forma de introducción del DNA en el huésped y de si se desea la integración o el mantenimiento episomal.

Generalmente, el DNA se inserta en un vector de expresión tal como un plásmido, en la orientación adecuada y con el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el DNA puede unirse a las secuencias adecuadas de nucleotidos de control regulador de traducción y transcripción reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles suelen estar disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el huésped mediante las técnicas habituales. Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar las células huésped transformadas. Una técnica de selección implica la incorporación en el vector de expresión de una secuencia de DNA, con los elementos de control que sean necesarios, que codifique un carácter seleccionable en la célula transformada, tal como la resistencia a antibióticos.

Alternativamente, el gen para dicho carácter seleccionable puede estar en otro vector, que es utilizado para cotransformar la célula huésped deseada.

Las células huésped que han sido transformadas por el DNA recombinante de la invención son cultivadas entonces durante un espacio de tiempo suficiente y en las condiciones adecuadas, conocidas por los expertos en la técnica en vista de las enseñanzas descritas en la presente invención, para permitir la expresión del polipéptido, que entonces se puede recuperar.

Se conocen muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (E. coli y Bacillus subtilis, por ejemplo), levaduras {Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo), hongos filamentosos {Aspergillus spec, por ejemplo) y células de plantas, animales e insectos. Preferentemente, el sistema pueden ser células de mamífero tales como células CHO disponibles en la colección ATCC de biología celular.

Un plásmido vector típico de célula de mamífero para la expresión constitutiva comprende el promotor SV40 o CMV con una cola de poli-A adecuada y un marcador de resistencia, como la neomicina. Un ejemplo es pSVL, disponible en Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA Un ejemplo de un vector de expresión inducible de mamífero es pMSG, también disponible en Pharmacia. Algunos vectores plásmidos de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416 y suelen estar disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos de integración de levadura (Ylps) e incorporan los marcadores seleccionabas de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de levadura (Ycps). Los vectores basados en el promotor CMV (de Sigma-Aldrich, por ejemplo) proporcionan una expresión estable o pasajera, una secreción o expresión citoplasmática, y el etiquetado amino o carboxilo en diversas combinaciones de FLAG, 3 x FLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones etiquetadas dualmente proporcionan flexibilidad en la detección.

La región reguladora del promotor de citomegalovirus (CMV) humano fuerte lleva los niveles de expresión de la proteína constitutiva hasta a 1 mg/L en las células COS. Para líneas celulares menos potentes, los niveles de proteína son típicamente de ~ 0,1 mg/L. La presencia del origen de replicacion de SV40 resultará en niveles altos de replicacion de DNA en células COS permisivas de replicacion de SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen de pMB1 (derivado del pBR322) para la replicacion en células bacterianas, el gen b-lactamasa para la selección de la resistencia a la ampicilina en bacterias, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de preprotripsina (PPT) pueden dirigir la secreción de las proteínas de fusión FLAG en el medio de cultivo para la purificación utilizando placas, resinas y anticuerpos ANTI-FLAG. Otros vectores y sistemas de expresión son bien conocidos en la técnica para su utilización con una variedad de células huésped.

La presente invención también hace referencia a una célula huésped transformada con un constructo vector de polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede ser o procariótica o eucariótica. Las células bacterianas pueden ser células huésped procarióticas preferidas en algunas circunstancias y son típicamente una cepa de E. coli tal como, por ejemplo, las cepas E. coli DH5 disponibles en Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, y RR1 disponible en American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EUA (n.° de ATCC 31 343). Entre las células huésped eucarióticas preferidas se incluyen células de mamífero, insecto y levadura, preferentemente células de vertebrados tales como las líneas celulares de colon y fibroblásticas humanas o de mono, rata o ratón. Las células huésped de levadura incluyen las YPH499, YPH500 y YPH501, que suelen estar disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA Entre las células huésped de mamíferos preferidas se incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles en ATCC como CCL61, células embrionarias de ratón suizo NIH NIH/3T3 disponibles en ATCC como CRL 1658, células COS-1 derivadas de riñon de mono disponibles en ATCC como células 293 y CRL 1650 que son células de riñon embrionario humano. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión de baculovirus. Un resumen con respecto a la elección de células huésped adecuadas para la expresión se puede encontrar, por ejemplo, en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence «Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», primera parte, segunda edición, ISBN 978-1-58829-262-9, y otras referencias conocidas para el experto en la técnica.

La transformación de huéspedes celulares adecuados con un constructo de DNA de la presente invención se realiza con métodos bien conocidos que dependen típicamente del tipo de vector usado. Con respecto a la transformación de células huésped procarióticas, véase, por ejemplo, Cohén et al. (1972) Proc. Nati. Acad. ScL, EE. UU, 69, 2110, y Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. La transformación de las células de levadura se describe en Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. El método de Beggs (1978), Nature, 275, 104-109, también es útil. Con respecto a las células de vertebrados, los reactivos útiles en la transfeccion de tales células como, por ejemplo, el fosfato cálcico y el dextrán DEAE o las formulaciones de liposomas, están disponibles en Stratagene Cloning Systems o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA La electroporación también es útil para la transformación y/o transfeccion de células y es bien conocida en la técnica para la transformación de células de levadura, células bacterianas, células de insectos y células de vertebrados.

Las células transformadas correctamente, es decir, las células que contienen un constructo de DNA de la presente invención, se pueden identificar mediante técnicas bien conocidas tales como la PCR. Alternativamente, la presencia de la proteína en el sobrenadante se puede detectar utilizando anticuerpos.

Se apreciará que ciertas células huésped de la invención son útiles en la preparación de los péptidos de la invención como, por ejemplo, células de insectos, de levadura y bacterianas. Sin embargo, otras células huésped también pueden ser útiles en ciertos métodos terapéuticos. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos, tales como las células dendríticas, pueden ser utilizadas útilmente para expresar los péptidos de la invención de forma que puedan ser cargadas en las moléculas MHC adecuadas. De esta forma, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.

En una realización preferida, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o una célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante con fosfatasa acida prostética (PAP) se investigan actualmente para el tratamiento del cáncer de próstata (Sipuleucel-T) (Rini et al., 67-74; Small et al., 3089-94).

Otro aspecto más de la invención proporciona un método para producir un péptido o su variante, método que comprende el cultivo de una célula huésped y el aislamiento del péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo.

En otra realización, el péptido, el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención se utilizan en medicina. Por ejemplo, el péptido o su variante se pueden preparar para su inyección intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) o intramuscular (i.m.). Los métodos preferidos para la inyección del péptido incluyen las inyecciones s.c, i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos preferidos para la inyección de DNA incluyen las inyecciones i.d., i.m., s.c, i.p. e i.v. Se pueden administrar dosis de péptido o DNA de entre, por ejemplo, 50 g y 1,5 mg, preferentemente entre 125 g y 500 µ?, lo que dependerá del DNA o el péptido correspondiente. En ensayos previos se utilizaron con éxito dosis de este rango (Brunsvig et al., 1553-64; Staehler et al.).

Otro aspecto de la presente invención incluye un método in vitro para producir linfocitos T activados, método que comprende el contacto in vitro de linfocitos T con moléculas MHC humanas cargadas de antígenos expresadas en la superficie de una célula adecuada presentadora de antígenos durante un periodo de tiempo suficiente para activar el linfocito T de una forma propia de antígenos, donde el antígeno es un péptido conforme a la invención. Preferentemente, una cantidad suficiente del antígeno se utiliza con una célula presentadora de antígeno.

Preferentemente, la célula de mamífero carece o tiene un nivel o función limitada del transportador de péptido TAP. Entre las células adecuadas que carecen del transportador de péptido TAP se incluyen células de Drosophila, RMA-S y T2. TAP es el transportador asociado al procesamiento antigénico.

La línea celular humana T2 deficiente de carga de péptido está disponible en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA, con el n.° de catálogo CRL 1992; la línea 2 de Schneider de la línea celular de Drosophila está disponible en ATCC con el número de catálogo CRL 19 863; la línea celular de ratón RMA-S se describe en Karre et al., (1985).

Preferentemente, antes de la transfección, la célula huésped no expresa sustancialmente moléculas MHC de clase I. También se prefiere que la célula estimuladora exprese una molécula importante para proporcionar una señal coestimulante para linfocitos T tales como cualquiera de las B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3. Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase I y de las moléculas coestimuladoras están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.

En el caso de un epítopo MHC de clase I utilizado como un antígeno, los linfocitos T son CTL CD8+.

Si una célula presentadora de antígenos se transfecta para expresar tal epítopo, preferentemente la célula comprende un vector de expresión capaz de expresar un péptido que contiene las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una secuencia de aminoácidos variante de las mismas.

Pueden utilizarse una serie de métodos adicionales para generar CTL in vitro. Por ejemplo, en los métodos descritos en Peoples et al., (1995) y Kawakami et al., (1992) se utilizan linfocitos destructores de tumores autólogos en la generación de CTL. En Plebanski et al., (1995) se hace uso de linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) en la preparación de CTL. En Jochmus et al., (1997) se describe la producción de CTL autólogos mediante la sensibilización reiterada de células dendríticas con péptidos o polipéptidos, o mediante infección con un virus recombinante. Hill et al., (1995) y Jerome et al., (1993) hacen uso de linfocitos B en la producción de CTL autólogos. Adicionalmente, en la preparación de CTL autólogos pueden utilizarse macrófagos sensibilizados reiteradamente con péptidos o polipéptidos, o infectados con virus recombinante. S. Walter et al., (2003) describen la sensibilización in vitro de células T mediante la utilización de células artificiales presentadoras de antígenos (aAPC), que es también una forma adecuada para generar linfocitos T contra el péptido elegido. En este estudio, las aAPC se generaron mediante el acoplamiento de complejos MHC:péptido preformados en la superficie de partículas de poliestireno (microesferas) mediante bioquímica de biotina:estreptavidina. Este sistema permite el control exacto de la densidad de HC en las aAPC, lo que permite desencadenar de forma selectiva respuestas de linfocitos T específicas de antígeno de alta o baja avidez con gran eficiencia a partir de las muestras de sangre. Además de los complejos MHC:péptido, las aAPC deben portar otras proteínas con actividad coestimulante como anticuerpos anti-CD28 acoplados a su superficie. Además, tales sistemas basados en aAPC suelen requerir la adición de factores solubles adecuados como, por ejemplo, citocinas como la interleucina-12.

Las células alogénicas también pueden utilizarse en la preparación de linfocitos T y un método se describe en detalle en el documento WO 97/26328, incluido aquí como referencia. Por ejemplo, además de las células de Drosophila y las células 12, pueden utilizarse otras células para presentar antígenos tales como células CHO, células de insecto infectadas de baculovirus o células diana infectadas de vaccinia, de levadura o de bacterias. Adicionalmente, pueden utilizarse virus de plantas (véase, por ejemplo, Porta et al., 1994, donde se describe el desarrollo del virus del mosaico del garbanzo como un sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos foráneos.

Los linfocitos T activados que son dirigidos contra los péptidos de la invención son útiles en terapia. Asi, un aspecto más de la invención proporciona linfocitos T activados que pueden obtenerse por los métodos anteriores de la invención.

Los linfocitos T activados, producidos por el método descrito anteriormente, reconocerán selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de las secuencias SEQ ID n.° 1 a 95.

Preferentemente, el linfocito T reconoce la célula mediante la interacción a través de su TCR con el complejo péptido/HLA (por ejemplo, mediante unión). Los linfocitos T son útiles en un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, donde al paciente se le administra un número efectivo de linfocitos T activados. Los linfocitos T administrados al paciente pueden derivar del paciente y ser activados tal y como se describe más arriba (es decir, son linfocitos T autólogos). Alternativamente, los linfocitos T no son del paciente sino de otro individuo. Por supuesto, se prefiere que el individuo sea un individuo sano. Con «individuo sano», los inventores se refieren a que el individuo goza de buena salud general, preferentemente tiene un sistema inmunitario competente y, con mayor preferencia, no sufre ninguna enfermedad que pueda ser fácilmente diagnosticable y detectable.

In vivo, las células diana para los linfocitos T CD8+ conforme a la presente invención pueden ser células del tumor (que a veces expresa MHC de clase I) y/o células del estroma que rodean al tumor (células tumorales) (que a veces también expresan MHC de clase I; Dengjel et al., 4163-70).

Los linfocitos T de la presente invención se pueden utilizar como ingredientes activos de una composición terapéutica. De esta forma, la invención también proporciona un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipeptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, método que comprende la administración al paciente de un número efectivo de linfocitos T tal y como se definió anteriormente.

Con «expresado de forma aberrante», los inventores se refieren también a que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen es silencioso en el tejido del que deriva el tumor, pero sí se expresa en el tumor. Con «sobreexpresado», los inventores se refieren a que el polipéptido está presente a un nivel al menos 1,2 veces el presente en el tejido normal; preferentemente al menos 2 veces y, con mayor preferencia, al menos 5 o 10 veces el nivel presente en el tejido normal.

Se pueden obtener linfocitos T con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos anteriormente.

Los protocolos de este traslado conocido como traslado adoptivo de linfocitos T son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Dudley et al., 850-54; Dudley et al., 2346-57; Rosenberg et al., 889-97; Rosenberg et al., 1676-80; Yee et al., 16168-73); revisados en Gattinoni et al., 383-93, y Morgan et al.

Cualquier molécula de la invención, es decir, el péptido, el ácido nucleico, el vector de expresión, la célula, los CTL activados, el receptor de linfocitos T o el ácido nucleico que lo codifica, es útil para el tratamiento de trastornos, caracterizados por células que escapan a la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, cualquier molécula de la presente invención puede utilizarse como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula puede utilizarse por sí misma o en combinación con otra(s) molécula(s) de la invención o (una) molécula(s) conocida(s).

Preferentemente, el medicamento de la presente invención es una vacuna. Puede administrarse directamente al paciente, al órgano afectado o sistémicamente de forma i.d., i.m., s.c, i.p. o i.v., o aplicarse ex vivo a células derivadas del paciente o de una línea celular humana que posteriormente se administran al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias derivadas del paciente, que después se vuelven a administrar al paciente. Si el ácido nucleico se administra in vitro a las células, puede ser útil para las células su transfección para coexpresar citocinas de estimulación inmunitaria como la interleucina-2. El péptido puede ser sustancialmente puro, o estar combinado con un adyuvante de estimulación inmunitaria (véase más abajo) o utilizarse en combinación con citocinas de estimulación inmunitaria, o administrarse con un sistema de liberación adecuado como, por ejemplo, con liposomas. El péptido también puede conjugarse con un vehículo apropiado tal como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el mañano (véase el documento WO 95/18145, y Longenecker, 1993). El péptido también puede estar etiquetado, ser una proteína de fusión o ser una molécula híbrida. Se espera que los péptidos cuya secuencia se da en la presente invención estimulen los linfocitos T CD4 o CD8. Sin embargo, la estimulación de CTL CD8 es más eficiente en presencia de ayuda de linfocitos T colaboradores CD4. Así, para epítopos MHC de clase I que estimulan CTL CD8, las secciones o la pareja de fusión de una molécula híbrida proporciona de forma adecuada epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4+. Los epítopos estimulantes de CD4 y CD8 son bien conocidos en la técnica e incluyen a los identificados en la presente invención.

En un aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido con la secuencia de aminoácidos establecida en las secuencias SEQ ID n.° 1 a 33 y al menos un péptido adicional; preferentemente entre dos y 50, con mayor preferencia entre dos y 25, con aún mayor preferencia entre dos y 15 y con la máxima preferencia dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece péptidos. El/los péptido(s) pueden derivar de uno o más TAA específicos y pueden unirse a moléculas MHC de clase I.

El polinucleótido puede ser sustancialmente puro o estar contenido en un sistema de liberación o vector adecuado. El ácido nucleico puede ser DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA o una combinación de los mismos. Los métodos para designar e introducir dicho ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. En Pascólo et al., 117-22, por ejemplo, se proporciona un resumen. Las vacunas de polinucleótidos son fáciles de preparar, pero el modo de acción de estos vectores para inducir una respuesta inmunitaria no se conoce del todo. Entre los sistemas de liberación y vectores adecuados se incluyen DNA y/o RNA vírico, tales como los sistemas basados en adenovirus, virus de la vaccínia, retrovirus, virus del herpes, virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de un virus. Los sistemas de liberación no víricos incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos y son bien conocidos en la técnica de liberación de DNA. La liberación física mediante, por ejemplo, una «pistola genética» también puede utilizarse. El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico puede(n) ser una proteína de fusión, por ejemplo con un epítopo que estimule los linfocitos T para el correspondiente CDR opuesto, como se indicó anteriormente.

El medicamento de la invención también puede incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o mejoran de forma no específica la respuesta inmunitaria (por ejemplo, las respuestas inmunitarias a un antígeno mediadas por CTL y linfocitos T (TH) colaboradores y por eso se considerarían útiles en el medicamento de la presente invención. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, sin limitarse a ellos, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina o ligandos TLR5 derivados de flagelina, ligando FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferón-alfa o -beta, o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, lípido monofosforil A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de dextrano y basadas en [PLG] poli(láctidas co-glicólidas), talactoferrina SRL172, Virosomas y otras partículas de tipo vírico, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, mimetismo de pared celular bacteriana sintética y extractos micobacterianos, y otros adyuvantes patentados como Superfos, Quil o Detox de Ribi. Se prefieren los adyuvantes como el GM-CSF o el adyuvante de Freund. Se han descrito previamente varios adyuvantes inmunológicos (por ejemplo, MF59) específicos de células dendríticas y su preparación (Allison y Krummel, 932-33). También se pueden usar citocinas. Varias citocinas se han vinculado directamente a la migración influyente de células dendríticas a los tejidos linfoides (por ejemplo, TNF), acelerando la maduración de las células dendríticas a células eficientes presentadoras de antígenos para linfocitos T (por ejemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (patente de EUA n.° 5 849 589, específicamente incluidas aquí en su totalidad como referencia) y actuando como inmunoadyuvantes (por ejemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich, 1996).

También se ha informado que los oligonucleótidos inmunoestimulantes de CpG potencian los efectos de los adyuvantes en un enfoque de vacuna. Sin restringirse a consideraciones teóricas, los oligonucleótidos de CpG actúan mediante activación del sistema inmunitario innato (no adaptativo) mediante receptores Toll-Like (TLR), principalmente TLR9. La activación de TLR9 desencadenada por CpG potencia las respuestas celular y humoral específicas de antígeno a una amplia variedad de antígenos, incluyendo antígenos de proteína o péptido, virus vivos o destruidos, vacunas de células dendríticas, vacunas celulares autólogas y conjugados de polisacáridos en vacunas tanto profilácticas como terapéuticas. Más significativamente, potencia la maduración y diferenciación de las células dendríticas, lo que resulta en una activación potenciada de células THi y una fuerte generación de línfocitos T citotóxicos (CTL), incluso en ausencia de la ayuda de linfocitos T CD4. El sesgo muestral de THi inducido por la estimulación de TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes de vacuna como alum o adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueve un sesgo muestral de TH2- Los oligonucleótidos de CpG muestran una actividad de adyuvante aún mayor cuando se formulan o se coadministran con otros adyuvantes o en formulaciones tales como micropartículas, nanopartículas, emulsiones de lípidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta fuerte cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permiten que las dosis de antígeno se reduzcan en unos dos órdenes de magnitud, con respuestas de anticuerpo comparables a la vacuna de dosis completa sin CpG en algunos experimentos (Krieg, 471-84). La patente de EUA n.° 6 406 705 B1 describe la utilización combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes que no son ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un antagonista de TLR9 de CpG es dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble) de Mologen (Berlín, Alemania) que es un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención. Otras moléculas de unión a TLR tales como TLR 9, TLR 8 y/o TLR 7 de unión al RNA también pueden utilizarse.

Otros ejemplos de adyuvantes útiles incluyen, sin limitarse a ellos, CpG modificados químicamente (por ejemplo, CpR, Idera), análogos de dsRNA tales como Poli(l:C) y derivados de los mismos (por ejemplo, AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(l:C12U), RNA o DNA bacteriano no CpG así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas tales como ciclofosfamida, sunitinib, Bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, otros anticuerpos direccionalizados a estructuras clave del sistema inmunitario (por ejemplo, receptor anti-TNFalpha, anti-TGFbeta, anti-CD40) y SC58175, que pueden actuar terapéuticamente y/o como un adyuvante. El experto en la técnica puede determinar fácilmente las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención sin experimentación excesiva.

Los adyuvantes preferidos son imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, interferón-alfa, oligonucleótidos de CpG y sus derivados, poli-(l:C) y sus derivados, RNA, sildenafil, y formulaciones particuladas con PLG o virosomas.

En una realización preferida, en la composición farmacéutica conforme a la invención el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en factores estimuladores de colonias, tales como el Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF, sargramostim), imiquimod, resiquimod, e inferferón-alfa.

En una realización preferida, en la composición farmacéutica conforme a la invención el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en factores estimuladores de colonias tales como el Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF, sargramostim), imiquimod y resiquimod.

En una realización preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es imiquimod o resiquimod.

Esta composición se utiliza para su administración parenteral tal como la administración oral, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Para ello, los péptidos y opcionalmente otras moléculas se disuelven o se suspenden en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes, tales como soluciones reguladoras, aglutinantes, agentes blásticos, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos también pueden administrase junto con sustancias de estimulación inmunitaria, tales como las citocinas. Una lista detallada de los excipientes que pueden utilizarse en tal composición puede extraerse, por ejemplo, de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. La composición puede utilizarse para la prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades cancerosas o adenomatosas. Pueden encontrarse formulaciones de ejemplo en el documento EP2113253.

La presente invención proporciona un medicamento que es útil en el tratamiento del cáncer, en particular del cáncer gástrico, el carcinoma de células renales, el cáncer de colon, el carcinoma no microcítico de pulmón, el adenocarcinoma, el cáncer de próstata, la neoplasia benigna y el melanoma maligno.

La presente invención incluye además un equipo de reactivos que comprende: (a) un envase que contiene una composición farmacéutica como se describió anteriormente, en solución o en forma liofilizada; (b) opcionalmente un segundo envase que contiene una solución reconstituyente o diluyente para la formulación liofilizada; y (c) opcionalmente, instrucciones para (i) la utilización de la solución o (ii) la reconstitución y/o la utilización de la formulación liofilizada.

El equipo de reactivos puede comprender además uno o más (iii) amortiguadores, (iv) diluyentes, (v) filtros, (vi) agujas o (v) jeringuillas. El envase es preferentemente una botella, un vial, una jeringuilla o un tubo de ensayo; y puede ser un envase multiuso. Preferentemente, la composición farmacéutica está liofilizada.

Los equipos de reactivos de la presente invención comprenden preferentemente una formulación liofilizada de la presente invención en un envase adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o utilización. Entre los envases adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales (por ejemplo, viales de cámara dual), jeringuillas (tales como jeringuillas de cámara dual) y tubos de ensayo. El envase puede estar hecho de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Preferentemente, el equipo de reactivos y/o el envase contienen instrucciones sobre o relacionadas con el envase que indican los pasos para la reconstitución y/o la utilización. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada debe reconstituirse en las concentraciones de péptido descritas anteriormente. La etiqueta puede indicar además que la formulación es útil o está destinada para su administración subcutánea.

El envase que contenga la formulación puede ser un vial multiuso, lo que permite administraciones repetidas (por ejemplo, de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El equipo de reactivos puede comprender además un segundo envase que comprenda un diluyente adecuado (por ejemplo, una solución de bicarbonato sódico).

Al mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final de péptidos en la formulación reconstituida es preferentemente de al menos 0,15 mg/mL/péptido (= 5µg) y preferentemente no mayor de 3 mg/mL/péptido (= 1500µg). El equipo de reactivos puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones de uso.

Los equipos de reactivos de la presente invención pueden tener un envase único que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas conforme a la presente invención con o sin otros componentes (por ejemplo, otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos) o pueden tener un envase distinto para cada componente.

Preferentemente, los equipos de reactivos de la invención incluyen una formulación de la invención embalada para su utilización en combinación con la coadministración de un segundo compuesto (tal como adyuvantes (por ejemplo, GM-CSF), un agente quimioterapéutico, un producto natural, una hormona o antagonista, un inhibidor o agente de la antiangiogénesis, un agente de inducción de la apóptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de la misma. Los componentes del equipo de reactivos pueden estar previamente combinados a complejos o bien cada componente puede estar en un envase distinto antes de la administración al paciente. Los componentes del equipo de reactivos pueden proporcionarse en una o más soluciones líquidas, preferentemente en una solución acuosa, más preferentemente en una solución acuosa estéril. Los componentes del equipo de reactivos también pueden proporcionarse en forma de sólido, que se pueden convertir en líquidos mediante la adición de disolventes adecuados, que se proporcionan preferentemente en un envase distinto.

El envase de un equipo de reactivos terapéutico puede ser un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una jeringuilla o cualquier otro medio de inclusión de un sólido o un líquido. Normalmente, cuando hay más de un componente, el equipo de reactivos contendrá un segundo vial u otro envase, lo que permite una dosificación por separado. El equipo de reactivos también puede contener otro envase para un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, un equipo terapéutico de reactivos contendrá un equipo (por ejemplo, una o más agujas, jeringuillas, cuentagotas, pipetas, etc.) que permite la administración de los agentes de la invención que son componentes del presente equipo de reactivos.

La presente formulación es aquella que es adecuada para la administración de los péptidos por cualquier ruta aceptable tal como la oral (enteral), la nasal, la oftálmica, la subcutánea, la intradérmica, la intramuscular, la intravenosa o la transdérmica. Preferentemente, la administración es s.c. y, con la máxima preferencia, i.d. La administración puede realizarse mediante bomba de infusión.

Puesto que los péptidos de la invención derivados de MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB y MUC6 fueron aislados del cáncer gástrico, el medicamento de la invención se utiliza preferentemente para tratar el cáncer gástrico.

La presente invención se describirá ahora en los siguientes ejemplos que describen realizaciones preferidas de la misma, sin limitarse a ellos, no obstante. Para los propósitos de la presente invención, todas las referencias aquí citadas se incorporan en su totalidad como referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Identificación de péptidos asociados a tumores presentados en la superficie celular Muestras de tejido Las instituciones Kyoto Prefectural University of Medicine (KPUM), Kyoto, Japón, Osaka City University Gradúate School of Medicine (OCU), Osaka, Japón, y University Hospital de Tubinga, Alemania, proporcionaron tejidos de tumor de pacientes. Antes de la cirugía, se obtuvieron los consentimientos por escrito de todos los pacientes. Los tejidos se congelaron por choque térmico en nitrógeno líquido inmediatamente después de la cirugía y se almacenaron hasta el aislamiento de los TUMAP a -80 °C.

Aislamiento de péptidos HLA de muestras de tejido Se obtuvieron mezclas de péptidos HLA de muestras de tejido congelado por choque térmico mediante precipitación inmunitaria de tejidos sólidos conforme a un protocolo ligeramente modificado (Falk, K., 1991; Seeger, F.H.T., 1999) utilizando el anticuerpo específico de HLA-A, -B, -C W6/32, el anticuerpo específico de HLA-A*02 BB7.2, la sefarosa activada por CNBr, el tratamiento ácido y la ultrafiltración.

Métodos Las mezclas de péptidos HLA obtenidas se separaron conforme a su hidrofobicidad mediante cromatografía en fase invertida (sistema nanoAcquity UPLC, Waters) y los péptidos de elución se analizaron en un espectrómetro de masas híbrido LTQ- Orbitrap (ThermoFisher Scientific) equipado con una fuente ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron directamente en la columna analítica microcapilar de silicio fundido (75 µ?? i.d. x 250 mm) envasados con 1,7 µ?t? de material de fase invertida C18 (Waters) aplicando una tasa de flujo de 400 nL por minuto. Posteriormente, los péptidos se separaron utilizando un gradiente binario de 180 minutos en dos pasos del 10% al 33% B a una tasa de flujo de 300 nL por minuto. El gradiente estaba compuesto de disolvente A (0,1% de ácido fórmico en agua) y disolvente B (0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo). Se utilizó un capilar de vidrio con revestimiento de oro (PicoTip, New Objective) para la introducción en la fuente nano-ESI. El espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap se utilizó en el modo dependiente de datos utilizando una estrategia TOP5. En resumen, se inició un ciclo de escaneado con un escaneado completo de exactitud de masa elevada en orbitrap (R = 30 000), seguido de escaneados MS/MS también en orbitrap (R = 7500) en los 5 iones precursores más abundantes con exclusión dinámica de iones previamente seleccionados. Los espectros de masa en tándem fueron interpretados por SEQUEST y control manual adicional. La secuencia de péptido identificada se aseguró mediante comparación de la pauta de fragmentación del péptido natural generada con la pauta de fragmentación de un péptido de referencia sintético de secuencia idéntica. La figura 1 muestra un espectro de ejemplo obtenido de tejido tumoral para el péptido CDC2-001 asociado a MHC de clase I y su perfil de elución en el sistema UPLC.

EJEMPLO 2 Perfil de expresión de los genes que codifican los péptidos de la invención No todos los péptidos identificados como presentados en la superficie de células de tumor por moléculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, puesto que la mayoría de estos péptidos derivan de proteínas celulares normales expresadas por muchos tipos celulares. Sólo algunos de estos péptidos están asociados a tumores y tienen probabilidad de inducir linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento para el tumor del que derivan. Con el fin de identificar dichos péptidos y minimizar el riesgo de autoinmunidad inducido por vacunación, los inventores se centraron en aquellos péptidos que derivan de proteínas que están sobreexpresadas en células en comparación con la mayoría de los tejidos normales.

El péptido ideal derivará de una proteína que es única para el tumor y que no está presente en ningún otro tejido. Para identificar péptidos que derivan de genes con un perfil de expresión similar al ideal, los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y genes, respectivamente, de los que derivaron y se generaron perfiles de expresión de estos genes.

Fuentes de RNA y preparación Varias clínicas (véase el ejemplo 2) proporcionaron especímenes de tejido seccionado quirúrgicamente tras obtener el consentimiento informado por escrito de cada paciente. Los especímenes de tejido de tumor se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la cirugía y después se homogeneízaron con mortero y mano de mortero bajo nitrógeno líquido. El RNA total se preparó de estas muestras utilizando reactivo TRI (Ambíon, Darmstadt, Alemania) seguido de una limpieza con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos métodos se efectuaron conforme al protocolo del fabricante.

El RNA total de tejidos humanos sanos se obtuvo comercialmente (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Holanda; BioChain, CA, EUA). El RNA de varios individuos (entre 2 y 123 individuos) se mezcló de tal forma que al RNA de cada individuo se le dio el mismo peso. Los leucocitos se aislaron de muestras de sangre de 4 voluntarios sanos.

La calidad y la cantidad de todas las muestras de RNA se calculó con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) utilizando el equipo de RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimentos de micromatrices El análisis de la expresión génica de todas las muestras de RNA de tejido normal y tumoral se efectuó con micromatrices de oligonucleótidos Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Todas las etapas se efectuaron conforme al manual de Affymetrix. En resumen, el cDNA bicatenario se sintetizó de 5-8 µg del RNA total, utilizando SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) tal y como se describe en el manual. La transcripción in vitro se efectuó con el equipo de reactivos BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EUA) para las matrices U133A o con el equipo de reactivos GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) para las matrices U133 Plus 2.0, seguida de la fragmentación, hibridación y tinción de cRNA con estreptavidina-ficoeritrina y anticuerpo antiestreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imágenes se escanearon con el escáner Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o el escáner Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), y los datos se analizaron con el programa GCOS (Affymetrix), utilizando la configuración predeterminada para todos los parámetros. Para la normalización, se utilizaron 100 genes de mantenimiento proporcionados por Affymetrix. Los valores de expresión relativa se calcularon a partir de los ratios de los registros de señal proporcionados por el programa y la muestra normal de riñon se estableció arbitrariamente en 1,0.

Los perfiles de expresión de los genes fuente de la presente invención que están muy sobreexpresados en el cáncer gástrico se muestran en las figuras 2A-2B.

EJEMPLO 3 Inmunogenia in vitro para péptidos IMA941 presentados por MHC de clase I Con el fin de obtener información con respecto a la inmunogenia de los TUMAP de la presente invención, realizamos investigaciones utilizando una plataforma de estimulación in vitro bien establecida ya descrita en Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, y Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978. Con este sistema pudimos mostrar resultados positivos de inmunogenia (es decir, de expansión de linfocitos T específicos) para 47 de 54 TUMAP analizados restringidos a HLA-A*2402 y para 3 de 3 TUMAP analizados restringidos a HLA-A*0201 de la invención, demostrando que estos péptidos son epitopos de linfocitos T contra los que existen linfocitos T precursores de CD8+ en humanos (Tabla 4).

Sensibilización in vitro de linfocitos T CD8 + Con el fin de efectuar estimulaciones in vitro mediante células artificiales presentadoras de antígenos (aAPC) cargadas con complejo MHC-péptido (pMHC) y anticuerpo anti-CD28, en primer lugar aislamos linfocitos T CD8 de productos frescos de leucaféresis de HLA-A*24 o de capas leucocitarias de HLA-A*2 de donantes sanos obtenidas del banco de sangre de Tubinga.

Los linfocitos T CD8 se enriquecieron o directamente o bien las PBMC (células mononucleares de sangre periférica) se aislaron primero utilizando un medio estándar de separación de gradiente (PAA, Cólbe, Alemania). Las PBMC o los linfocitos CD8 aislados se incubaron hasta su utilización en un medio de linfocitos T (TCM) consistente en RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con suplemento de suero AB humano inactivado por calor al 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania), 100 U/ml de penicilina / 100 g/ml de estreptomicina (Cambrex, Cologne, Alemania), 1 mM de piruvato de sodio (CC Pro, Oberdorla, Alemania), 20 pg/ml de gentamicina (Cambrex). En esta etapa del cultivo, se añadieron 2,5 ng/ml de citocinas IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Alemania) y 10 U/ml de citocinas IL-2 (Novartis Pharma, Núremberg, Alemania) al medio TCM. El aislamiento de los linfocitos CD8+ se efectuó mediante selección positiva utilizando microesferas CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania).

La generación de esferas revestidas de pMHC/anti-CD28, las estimulaciones de linfocitos T y la lectura se efectuaron tal y como se describió anteriormente (Walter et al., 4974-78) con pequeñas modificaciones. En resumen, se produjeron moléculas HLA-A*0201 y HLA-A*2402 recombinantes cargadas con péptidos biotinilados carentes del dominio de transmembrana y biotinilados en el extremo carboxi de la cadena pesada. Ab 9,3 CD28 antihumano de lgG2a de ratón purificado y coestimulador (Jung, Ledbetter y Muller-Eberhard, 4611-15) se biotiniló químicamente utilizando sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina tal y como recomienda el fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las esferas utilizadas fueron partículas de poliestireno revestidas de estreptavidina de 5,6 µ?t? de largo (Bangs Laboratories, Illinois, EUA). Las pMHC utilizadas como controles inmunógenos alto y bajo fueron A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGILTV de Melan-A/MART-1 modificado) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5), respectivamente. 800000 esferas / 200 µ? se revistieron en placas de 96 pocilios en presencia de 600 ng de anti-CD28 de biotina más 200 ng de pMHC de biotina relevante (esferas de alta densidad). Se iniciaron las estimulaciones en placas de 96 pocilios mediante la coincubación de 1 x 106 linfocitos T CD8+ con 2 x 105 esferas revestidas lavadas en 200 µ? de TCM con un suplemento de 5 ng/ml de IL-12 (PromoCell) durante 3-4 días a 37 °C, 5% de C02 y humedad relativa del 95%. La mitad del medio se intercambió entonces por TCM fresco con un suplemento de 80 U/ml de IL-2 y la incubación se mantuvo durante 3-4 días a 37 °C. Este ciclo de estimulación se efectuó durante un total de tres veces.

Finalmente, se efectuaron análisis de multímeros mediante la tinción de células con multímeros A*2402 o A*0201 fluorescentes (producidos tal y como se describe en Altman, 1996) y clon SK1 de anticuerpo CD8-FITC (BD, Heidelberg, Alemania) o adicionalmente con un marcador de viabilidad (tinción Violet o Aqua viva/muerta (Invítrogen, Karlsruhe, Alemania)), y se colocaron en un citómetro LSRII SORP o un FACSCalibur de cuatro colores (BD) (BD; dieciocho colores, equipado con azul (488 nm), violeta (405 nm), rojo (640 nm) y verde (532 nm), respectivamente. Las células específicas de péptido se calcularon como porcentaje del total de linfocitos T CD8 + . La evaluación del análisis de multímeros se efectuó utilizando los programas FCSExpress o FlowJo (Tree Star, Oregón, EE. UU). La sensibilización in vitro de linfocitos CD8+ de multimero+ específicos se detectó mediante la selección adecuada y mediante la comparación con estimulaciones de control negativo. La inmunogenia para un antígeno dado se detectó si se halló que al menos un pocilio evaluable estimulado in vitro de un donante sano contenía linfocitos T CD8+ específicos tras la estimulación in vitro (es decir, que la fracción de población de células de multímero+ en este pocilio constituía al menos el 1% de los linfocitos CD8+, la frecuencia se situaba al menos 10 veces por encima de la media de los controles negativos correspondientes (estimulación con multímero irrelevante y tinción con multímero relevante) y las células no se encontraban en la diagonal de la representación).

Inmunogenia in vitro para péptidos IMA941 Para 47 de 54 péptidos HLA-A*2402 analizados y para 3 de 3 péptidos HLA-A*0201 analizados se pudo demostrar la inmunogenia in vitro mediante la generación de líneas de linfocitos T específicas de péptidos. En la figura 3 se muestran algunos resultados de ejemplo de cítometría de flujo después de la tinción de multímeros específicos de TUMAP para dos péptidos de la invención, junto con el control negativo correspondiente. En la tabla 4 se resumen los resultados para los péptidos 54 A*2402 y 3 A*0201 de la invención.

Tabla 4: Inmunogenia in vitro de péptidos HLA de clase I de la invención Los resultados de los experimentos de inmunogenia in vitro efectuados por Immatics muestran el porcentaje de pocilios y donantes positivos analizados entre los evaluabies. Al menos cuatro donantes y 48 pocilios fueron evaluabies para cada péptido. 5 25 Los siguientes péptidos ya se describieron en otras solicitudes de Immatics y se incluyeron en las vacunas IMA901 (MET-001 y TOP-001), IMA910 (MET-001 y TOP-001) e IMA950 (IGF2BP3-001 ). Puesto que, por ejemplo, MET-001 conduce a reacciones in vivo extremadamente buenas, los datos pueden interpretarse como un indicativo de la utilidad clínica de los péptidos de la invención.

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Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Péptido que comprende una secuencia que es seleccionada del grupo de secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la misma que es homologa al menos al 80%, preferentemente al 90 y más preferentemente al 95% a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o una variante de la mismas que induce la reacción cruzada de linfocitos T con dicho péptido, donde dicho péptido no es un polipéptido completo.

2. Péptido conforme a la reivindicación 1, donde dicho péptido o variante tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferentemente entre 8 y 30, y con la máxima preferencia entre 8 y 14 aminoácidos.

3. Péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que tiene la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II.

4. Péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el péptido consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos conforme a las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95.

5. Péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el péptido es modificado y/o incluye enlaces no peptídicos.

6. Péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el péptido es una proteina de fusión, que comprende en particular aminoácidos amino de la cadena invariante (li) asociada al antigeno HLA-DR.

7. Ácido nucleico, que codifica un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, siempre que el péptido no sea la proteina humana completa.

8. Ácido nucleico conforme a la reivindicación 7 que es DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA o combinaciones de los mismos.

9. Vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 u 8.

10. Péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 u 8 o vector de expresión conforme a la reivindicación 9 para su utilización en medicina.

11. Célula huésped que comprende un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 u 8 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 9.

12. Célula huésped conforme a la reivindicación 11 que es una célula presentadora de antígeno.

13. Célula huésped conforme a la reivindicación 12, donde la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.

14. Método de producción de un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el método el cultivo de la célula huésped conforme a la reivindicación 11 y el aislamiento del péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo.

15. Método in vitro de producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, comprendiendo el método el contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de clase I o II con carga de antígenos expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar dichos CTL de una forma propia de antígeno, donde dicho antígeno es gn péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. Método conforme a la reivindicación 15, donde el antígeno es cargado en moléculas MHC de clase I o II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígenos.

17. Método conforme a la reivindicación 15, donde la célula presentadora de antígenos comprende un vector de expresión capaz de expresar dicho péptido que contiene las secuencias SEQ ID n.° 1 a SEQ ID n.° 95 o dicha secuencia variante de aminoácidos.

18. Linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos con el método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que reconocen de forma selectiva una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

19. Método de destrucción de células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el método la administración al paciente de un número efectivo de linfocitos T citotóxicos (CTL) tal y como se ha definido en la reivindicación 15.

20. Utilización de un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 u 8, un vector de expresión conforme a la reivindicación 9, una célula conforme a la reivindicación 11 a 13, o un linfocito T citotóxico activado conforme a la reivindicación 18 como medicamento o en la fabricación de un medicamento.

21. Utilización conforme a la reivindicación 20, donde el medicamento es una vacuna.

22. Utilización conforme a las reivindicaciones 20 o 21, donde el medicamento es activo contra el cáncer.

23. Utilización conforme a la reivindicación 22, donde las mencionadas células de cáncer son células de cáncer gástrico, gastrointestinal, colorrectal, pancreático, pulmonar o renal.