ES2544529T3

ES2544529T3 - Nueva inmunoterapia contra diversos tumores como el cáncer gastrointestinal y gástrico

Info

Publication number: ES2544529T3
Application number: ES11711292.0T
Authority: ES
Inventors: Toni Weinschenk; Jens Fritsche; Steffen Walter; Peter Lewandrowski; Harpreet Singh
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2015-09-01
Anticipated expiration: 2031-03-15
Also published as: US11883462B2; US9993523B2; US11850274B2; SI3363456T1; US11077171B2; JP2020191875A; HRP20201467T1; CA2789857C; CA2789857A1; PH12016500949B1; KR102324499B1; TW202102534A; KR20210019139A; SG10201710446PA; DK3195873T3; KR20210019603A; US20130045191A1; EA202091242A2; EP3753570B1; EP2547354A2

Abstract

Péptido con una longitud total de entre 10 y 14 aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo siguiente: a) una secuencia consistente en la SEQ ID N. º 1 b) una variante de la SEQ ID N. º1 que induce que linfocitos T reaccionen con dicho péptido, siendo dicha variante seleccionada entre el grupo de las secuencias LFQILQGIVF, LYQILQGIVL, LYQILQGIVI, LFQILQGIVL y LFQILQGIVI.

Description

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especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.

Los péptidos originales descritos aquí se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, si una leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras».

Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo

1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr y Trp).

Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.

Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aún así, quedar englobados en la descripción del presente documento. Además, los aminoácidos que poseen grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los presentes en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también pueden ser utilizados como sustitutos para producir polipéptidos inmunógenos e inmunogénicos de acuerdo con la presente descripción.

Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.

El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación.

Preferiblemente, cuando los CTL específicos para un péptido de las SEQ ID N. º 1 a 33 se prueben contra los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la cual los péptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento máximo de la lisis respecto al valor de fondo es como máximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como máximo de alrededor de 1 µM, más preferiblemente como máximo de alrededor de 1 nM, y aún más preferentemente como máximo de alrededor de 100 pM, y más preferentemente como máximo de alrededor de 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por los CTL de más de un individuo, de al menos dos, y más preferiblemente de tres individuos.

Así pues, los epítopos de la presente invención pueden ser idénticos a los epítopos específicos de tumor o asociados a tumor naturales o pueden incluir epítopos que difieran como máximo en 4 residuos del péptido de referencia, siempre que conserven básicamente la misma actividad antigénica.

Abordajes inmunoterapéuticos para el tratamiento

La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha suscitado la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para intervenir sobre el crecimiento de los tumores. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar los mecanismos de defensa humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.

Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y destruir las

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células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Los linfocitos T CD8-positivos en particular, que reconocen las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) portadoras de péptidos que suelen tener de 8 a 12 residuos derivados de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) localizados en el citosol, desempeñan un importante papel en esta respuesta. Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).

Las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de células nucleadas y presentan péptidos derivados de la escisión proteolítica, principalmente de proteínas endógenas, citosólicas o nucleares, DRIPS y péptidos grandes. No obstante, los péptidos derivados de compartimentos endosómicos o de fuentes exógenas también se encuentran con frecuencia ligados a moléculas MHC de clase I. Esta vía no clásica de presentación por la clase I se denomina presentación cruzada en la bibliografía.

Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos o asociados a tumor y puedan ser empleadas como tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antígeno debe ser expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos sanos normales o, de hacerlo, debe serlo en cantidades comparativamente pequeñas. Y no sólo es conveniente que el antígeno de interés esté presente únicamente en un tipo de tumor, sino que lo esté también en altas concentraciones (número de copias del péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de proteínas que intervienen directamente en la transformación de una célula normal en una célula tumoral a causa de su función, por ejemplo porque intervienen en el control del ciclo celular o en la apoptosis. Además, también las dianas ulteriores de las proteínas que son las causantes directas de la transformación pueden estar reguladas al alza y, por tanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antígenos asociados indirectamente a los tumores también pueden ser las dianas para una estrategia de vacunación. En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoácidos del antígeno contenga epítopos, puesto que el péptido («péptido inmunogénico») derivado de un antígeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unirse a una molécula de MHC puede actuar como un epítopo de linfocito

T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T dotado del correspondiente TCR y la ausencia de tolerancia inmunitaria hacia ese epítopo en particular.

Por consiguiente, los TAA son el punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos para identificar y caracterizar los TAA están basados, entre otros, en el uso de CTL que pueden aislarse de pacientes o de individuos sanos, o en la generación de perfiles de transcripción diferenciales o patrones de expresión peptídica diferenciales entre los tumores y los tejidos normales (Lemmel et al. 450-54; Weinschenk et al. 5818-27).

No obstante, la identificación de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de células tumorales humanas no aporta información precisa acerca del uso de los antígenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblación individual de epítopos de esos antígenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epítopo concreto ha de ser mínima o nula. Por tanto, es importante seleccionar sólo aquellos péptidos derivados de proteínas sobreexpresadas o selectivamente expresadas que sean presentados ligados a moléculas de MHC y que sean diana de linfocitos T funcionales. Un linfocito T funcional se define como un linfocito T que tras la estimulación con un antígeno específico puede sufrir una expansión clonal y ser capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).

Los linfocitos T cooperadores desempeñan un papel importante en la coordinación de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8+, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra las células tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/péptido asociado a tumor. De esta forma, los epítopos de los péptidos asociados a tumores que son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.

Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor reconocidos por los CTL CD8-positivos (moléculas de MHC de clase I) o por los CTL CD4-positivos (moléculas de MHC de clase II) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales. Por consiguiente uno de los fines de la presente invención consiste en proveer composiciones de péptidos que contengan péptidos de unión a complejos MHC de cualquiera de las clases.

A la luz de los efectos secundarios graves y los gastos que supone el tratamiento contra el cáncer es evidente la urgente necesidad de mejora de los métodos pronósticos y diagnósticos. Así pues, existe la necesidad de descubrir otros factores que puedan servir como biomarcadores para el cáncer en general y el cáncer gástrico en particular. Existe igualmente la necesidad de identificar factores que puedan ser utilizados en el tratamiento contra el cáncer en

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respuestas de los linfocitos T o las respuestas de anticuerpos contra el péptido o el péptido unido a moléculas de MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden ser utilizadas como marcadores pronósticos para decidir los pasos posteriores del tratamiento. Dichas respuestas también pueden ser utilizadas como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a través de diferentes medios, como por

5 ejemplo la vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, materiales autólogos, o la transferencia de linfocitos de donantes. En el ámbito de la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos pueden tenerse en cuenta para la evaluación de efectos secundarios. El control regular de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.

10 Los péptidos pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/péptido. Estos pueden ser utilizados como terapia, dirigiendo toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.

15 Además se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.

La presente invención se refiere a un péptido con una longitud total de entre 10 y 14 aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo: a) una secuencia consistente en la SEQ ID N. º 1; b) una variante de la SEQ ID N. º 1 que induce la reacción cruzada de linfocitos T con dicho péptido, en que dicha variante es seleccionada entre el grupo de secuencias LFQILQGIVF, LYQILQGIVL, LYQILQGIVI, LFQILQGIVL y LFQILQGIVI.

20 La Tabla 2 muestra los péptidos dados a conocer, sus respectivas SEQ ID N. º y las proteínas originarias de las que pueden surgir dichos péptidos. Todos los péptidos se unen a los alelos HLA A*024.

Tabla 2:Péptidos dados a conocer

SEQ ID Nº:: Código del péptido Secuencia Proteína(s) originaria(s)

1*: CDC2-001 LYQILQGIVF CDK1

2: ASPM-002 SYNPLWLRI ASPM

3: UCHL5-001 NYLPFIMEL UCHL5

4: MET-006 SYIDVLPEF MET

5: PROM1-001 SYIIDPLNL PROM1

6: MMP11-001 VWSDVTPLTF MMP11

7: MST1R-001 NYLLYVSNF MST1R

8: NFYB-001 VYTTSYQQI NFYB

9: SMC4-001 HYKPTPLYF SMC4

10: UQCRB-001 YYNAAGFNKL UQCRB

11: PPAP2C-001 AYLVYTDRL PPAP2C

12: AVL9-001 FYISPVNKL AVL9

13: NUF2-001 VYGIRLEHF NUF2

14: ABL1-001 TYGNLLDYL ABL1

15: MUC6-001 NYEETFPHI MUC6

16: ASPM-001 RYLWATVTI ASPM

17: EPHA2-005 VYFSKSEQL EPHA2

18: MMP3-001 VFIFKGNQF MMP3

19: NUF2-002 RFLSGIINF NUF2

20: PLK4-001 QYASRFVQL PLK4

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SEQ ID Nº:: Código del péptido Secuencia Proteína(s) originaria(s)

21: ATAD2-002 KYLTVKDYL ATAD2

22: COL12A1-001 VYNPTPNSL COL12A1

23: COL6A3-001 SYLQAANAL COL6A3

24: FANCI-001 FYQPKIQQF FANCI

25: RPS11-001 YYKNIGLGF RPS11

26: ATAD2-001 AYAIIKEEL ATAD2

27: ATAD2-003 LYPEVFEKF ATAD2

28: HSP90B1-001 KYNDTFWKEF HSP90B1

29: SIAH2-001 VFDTAIAHLF SIAH2

30: SLC6A6-001 VYPNWAIGL SLC6A6

31: IQGAP3-001 VYKVVGNLL IQGAP3

32: ERBB3-001 VYIEKNDKL ERBB3

33: KIF2C-001 IYNGKLFDLL KIF2C

* Péptido conforme a la presente invención

Otros péptidos de HLA A*024 interesantes

SEQ ID Nº:: Código del péptido Secuencia Proteína(s) originaria(s)

34: CCDC88A-001 QYIDKLNEL CCDC88A

35: CCNB1-003 MYMTVSIIDRF CCNB1

36: CCND2-001 RYLPQCSYF CCND2

37: CCNE2-001 IYAPKLQEF CCNE2

38: CEA-010 IYPDASLLI CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6

39: CLCN3-001 VYLLNSTTL CLCN3

40: DNAJC10-001 IYLEVIHNL DNAJC10

41: DNAJC10-002 AYPTVKFYF

42: EIF2S3-001 IFSKIVSLF EIF2S3, LOC255308

43: EIF3L-001 YYYVGFAYL EIF3L, LOC340947

44: EPPK1-001 RYLEGTSCI EPPK1

45: ERBB2-001 TYLPTNASLSF ERBB2

46: GPR39-001 SYATLLHVL GPR39

47: ITGB4-001 DYTIGFGKF ITGB4

48: LCN2-001 SYNVTSVLF LCN2

49: SDHC-001 SYLELVKSL LOC642502, SDHC

50: PBK-001 SYQKVIELF PBK

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SEQ ID Nº:: Código del péptido Secuencia Proteína(s) originaria(s)

51: POLD3-001 LYLENIDEF POLD3

52: PSMD14-001 VYISSLALL PSMD14

53: PTK2-001 RYLPKGFLNQF PTK2

54: RPS11-001 YYKNIGLGF RPS11

55: TSPAN1-002 VYTTMAEHF TSPAN1

56: ZNF598-001 DYAYLREHF ZNF598

57: ADAM10-001 LYIQTDHLFF ADAM10

58: MMP12-001 TYKYVDINTF MMP12

59: RRM2-001 YFISHVLAF RRM2

60: TMPRSS4-001 VYTKVSAYL TMPRSS4

61: TSPAN8-001 VYKETCISF TSPAN8

En otra forma de realización de la invención se dan a conocer péptidos de unión a HLA A*02 contra el cáncer gástrico. En las personas que son positivas para A*02 y/o A*24 se pueden emplear mezclas de los péptidos dados a conocer como tratamiento contra el cáncer gástrico. Se prefieren las mezclas de 2 a 20 péptidos y las mezclas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 péptidos.

SEQ ID Nº:: Código del péptido Secuencia Proteína(s) originaria(s)

62: DIO2-001 ALYDSVILL DIO2

63: IGF2BP3-001 KIQEILTQV IGF2BP3

64: LMNB1-001 LADETLLKV LMNB1

65: WNT5A-001 AMSSKFFLV WNT5A

66: FAP-003 YVYQNNIYL FAP

67: COPG-001 VLEDLEVTV COPG, COPG2, TSGA13

68: COL6A3-002 FLLDGSANV COL6A3

69: COL6A3-003 NLLDLDYEL COL6A3

70: COL6A3-004 FLIDSSEGV COL6A3

71: PSMC2-001 ALDEGDIAL PSMC2

72: UBE2S-001 ALNEEAGRLLL UBE2S

73: KIF11-001 ILSPTVVSI KIF11

74: ADAM8-001 KLLTEVHAA ADAM8

75: CCNB1-001 ALVQDLAKA CCNB1

76: CDC6-001 ILQDRLNQV CDC6

77: F2R-001 TLDPRSFLL F2R

78: OLFM4-001 TLDDLLLYI OLFM4

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SEQ ID Nº:: Código del péptido Secuencia Proteína(s) originaria(s)

79: THY1-001 SLLAQNTSWLL THY1

80: CEP250-001 SLAEVNTQL CEP250

81: HIF1A-001 ALDGFVMVL HIF1A

82: KRAS-001 GVDDAFYTL KRAS

83: MET-001 YVDPVITSI MET

84: NCAPG-001 YLLSYIQSI NCAPG

85: NCAPG-002 QIDDVTIKI NCAPG

86: TOP-004 YLYGQTTTYL TOP2A

87: TOP-005 KLDETGNSL TOP2A

88: LAMC2-002 RLDDLKMTV LAMC2

89: AHR-001 LTDEILTYV AHR

90: CCNB1-002 ILIDWLVQV CCNB1

91: CEACAM6-001 VLYGPDVPTI CEACAM6

92: COPB1-001 SIFGEDALANV COPB1

93: HMMR-001 KLLEYIEEI HMMR

94: TPX2-001 KILEDVVGV TPX2

95: TOP-001 KIFDEILVNA TOP2A, TOP2B

Proteína 2 del ciclo de división celular (CDC2)

La cinasa de serina/treonina CDC2, también conocida como Cdk1 (cinasa dependiente de ciclina 1) desempeña un

5 papel esencial en el control del ciclo celular. Se sabe que es el principal regulador de la transición de la fase G2 a la fase M. Al final de la interfase se une a las ciclinas de tipo A. Tras la disgregación de la membrana nuclear, las ciclinas de tipo A son sustituidas por la ciclina B, que forma el factor promotor de la mitosis (MPF) con la Cdc2. El MPF es esencial para dirigir la célula a través del proceso de la mitosis.

La función de la Cdc2 en la mitosis no es redundante y no puede ser compensada por la actividad de otras Cdk

10 como las Cdk2, 4 y 6. En cambio, se ha descrito que la Cdc2 interviene en otras fases del ciclo celular como la transición entre las fases G1 y S, y es capaz de sustituir a las «Cdk de la interfase». Así pues, se ha considerado que la Cdc2 sería la única Cdk esencial para el ciclo celular.

La sobreexpresión de la Cdc2 se ha detectado en varios tipos de cáncer, con frecuencia relacionada con un mal pronóstico. Entre ellos se encuentran el carcinoma de próstata, los carcinomas de la cavidad bucal, el carcinoma

15 escamoso oral (OSCC), la leucemia mieloide aguda (LMA) (Qian et al.), el linfoma MALT inducido por H. pylori (Banerjee et al. 217-25) y el carcinoma de colon (Yasui et al. 36-41). En el carcinoma gástrico se ha descrito la sobreexpresión y/o el incremento de la actividad, lo que podría tener un papel causal. Los inhibidores de la Cdc2 y de otras Cdk han sido considerados como candidatos a fármacos para el tratamiento del cáncer (Shapiro 1770-83).

Proteína de huso anormal asociada a la microcefalia (ASPM)

20 El gen de la proteína de huso anormal asociada a la microcefalia (ASPM) es el ortólogo humano del gen de huso anormal de Drosophila (asp). Interviene en la regulación de la neurogénesis y su mutación causa microcefalia primaria autosómica recesiva. La ASPM está localizada en los polos del huso mitótico durante la mitosis. La sobreexpresión de ASPM ha sido sugerida como marcador y potencial diana terapéutica del glioblastoma. La reducción de la expresión mediante ARNsi inhibe la proliferación de las células tumorales y la proliferación de las

25 células madre (stem cells) neurales. La sobreexpresión de la ASPM también podría predecir el potencial invasivo/metastásico, la recurrencia precoz del tumor y el pronóstico malo en el carcinoma hepatocelular. La ASPM aparece regulada al alza en células inmortalizadas y en tejidos de cáncer de pulmón amicrocítico (Jung, Choi, and

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Kim 703-13).

Metaloproteasas de la matriz 3 (MMP3)

La MMP3, también llamada progelatinasa o estromalisina 1, es una endopeptidasa que descompone componentes de la matriz extracelular (MEC) como la fibronectina, la laminina, la elastina, la proteína central del proteoglucano y las regiones no helicoidales de los colágenos. Las MMP son importantes en varios procesos fisiológicos que requieren la reorganización de la matriz extracelular como la migración celular durante la embriogénesis, la remodelación tisular, la vascularización, la involución de la mama tras la lactancia y la cicatrización de las heridas. La MMP3 también interviene en la agregación plaquetaria. Entre las patologías en que aparece un incremento de la expresión y de la secreción de MMP3 se hallan las enfermedades inflamatorias autoinmunitarias y el cáncer.

La MMP3 se sobreexpresa en algunos tumores e interviene en la transición del epitelio al mesénquima (EMT). También podría intervenir en las etapas iniciales de la oncogénesis, desencadenando cambios epigenéticos que desembocan en la generación del fenotipo maligno (Lochter et al. 180-93). Se ha demostrado que los polimorfismos del promotor de la MMP3 que están asociados con los niveles de expresión influyen en el riesgo y en el pronóstico de algunos tipos de cáncer como el adenocarcinoma esofágico (Bradbury et al. 793-98) y el carcinoma escamoso oral (Vairaktaris et al. 4095-100)(Liu et al. 430-35). Los pacientes con cáncer gástrico positivo para H. pylori cuyas concentraciones séricas de MMP3 y MMP7 son elevadas presentan mayor invasión ganglionar y una supervivencia más corta. En una cohorte de 74 pacientes con cáncer gástrico, la MMP3 apareció expresada en el27% de los casos (Murray et al. 791-97).

c-Met

c-Met media las actividades potencialmente oncógenas del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF)/factor de dispersión, incluida la promoción del crecimiento celular, la motilidad, la supervivencia, la disolución de la matriz extracelular y la angiogénesis.

Con la unión al receptor, el HGF activa procesos de señalización posteriores (downstream) como las vías de Ras, fosfatidilinositol 3’-cinasa, fosfolipasa Cγ, y la relacionada con la proteína-cinasa activada por mitógenos (Dong et al. 5911-18; Furge et al. 10722-27; Furge, Zhang, and Van de Woude 5582-89; Montesano et al. 355-65; Naldini et al. 501-04; Ponzetto et al. 4600-08). La c-Met se expresa predominantemente en las células epiteliales. La activación oncógena de c-Met (también en tejidos malignos no epiteliales) puede ser consecuencia de procesos de amplificación/sobreexpresión, mutaciones activadoras, adquisición de bucles autocrinos de HGF/c-Met o de la fosforilación constitutiva (Di Renzo et al. 147-54; Ferracini et al. 739-49; Fischer et al. 733-39; Koochekpour et al. 5391-98; Li et al. 8125-35; Maulik et al. 41-59; Qian et al. 589-96; Ramirez et al. 635-44; Tuck et al. 22532)(Nakaigawa et al. 3699-705). La activación constitutiva de c-Met en ratones transgénicos que sobreexpresan el HGF promueve una oncogénesis generalizada (Takayama et al. 701-06;Wang et al. 1023-34). El silenciamiento de MET se traduce en la inhibición del crecimiento tumoral y de las metástasis (Corso et al. 684-93). La amplificación de MET ha sido asociada con la progresión del cáncer gástrico humano (Lin et al. 5680-89).

Ubiquitina hidrolasa carboxiterminal L5 (UCHL5)

La UCHL5, también llamada ubiquitina hidrolasa C-terminal (UCH37) o INO80R, es una desubiquitinasa asociada a proteosoma. Separa las cadenas de poli-ubiquitina fijadas a la proteína por el extremo distal rompiendo el enlace isopeptídico entre la Cys76 y la Lys48 del extremo C-terminal (Nishio et al. 855-60). En el núcleo, la UCHL5 está asociada con el complejo remodelador de la cromatina Ino80. Tras la unión de un proteosoma, se activa y podría contribuir a la regulación de la transcripción o a la reparación del ADN que se ha planteado como mediada por el Ino80 y el proteosoma.

Las proteasas específicas de la ubiquitina como la UCHL5 intervienen en varios procesos como el control de la progresión del ciclo celular, la diferenciación, la replicación y la reparación del ADN, la transcripción, el control de calidad de las proteínas, la respuesta inmunitaria y la apoptosis. La UCHL5 podría contribuir a la transformación maligna. Se ha demostrado que su actividad está regulada al alza en el tejido de carcinoma de cuello uterino humano en comparación con el tejido normal adyacente. Es capaz de desubiquitinizar y por tanto estabilizar el receptor del TGF-beta y los mediadores posteriores, las proteínas Smad, intensificando así la vía de señalización del TGF-beta. La vía de señalización del TGF-beta potenciada puede actuar como promotora del tumor en los estadios avanzados de progresión del cáncer, aunque posee una doble función y también puede actuar como supresora del tumor en los estadios iniciales y antes de la iniciación (Bierie and Moses 29-40;Horton et al. 138-43;Wicks et al. 8080-84;Wicks et al. 761-63).

Receptor de la proteína estimuladora de los macrófagos (MST1R)

El receptor MST1R (o RON) pertenece a la familia Met de tirosina-cinasas asociadas a receptores de la superficie celular y se expresa principalmente en las células epiteliales y en los macrófagos. El MST1R puede inducir la migración, la invasividad, la proliferación y la supervivencia de las células en respuesta a su ligando. Sus propiedades oncogénicas han sido demostradas in vitro y en modelos animales in vivo, y suele aparecer desregulado en los cánceres humanos (Dussault and Bellon, 2009). Los estudios clínicos han demostrado que la

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(TNF-alfa) en células del epitelio intestinal humano Caco-2 (Mochizuki et al., 2005).

Proteína unida a ubiquinol-citocromo c reductasa (UQCRB)

La proteína codificada por el gen UQCRB forma parte del complejo de la ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa. Se une a la ubiquinona y participa en la transferencia de electrones. Las mutaciones de este gen están asociadas con la deficiencia en el complejo mitocondrial III. Un seudogén ha sido descrito en el cromosoma X.

El gen UQCRB puede ser un oncogén potencial o un gen supresor de tumores en el adenocarcinoma ductal pancreático (Harada et al. 13-24). Se ha hallado sobreexpresado en el carcinoma hepatocelular (Jia et al. 1133-39).

Receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico humano (ERBB3)

El ERBB3 codifica un miembro de la familia de tirosina-cinasas de receptor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Es activado por las neurorregulinas, por otros receptores ERBB y no ERBB, así como por otras cinasas, y a través de mecanismos novedosos. En pasos posteriores (downstream) interactúa sobre todo con la vía de la fosfoinositol 3-cinasa/supervivencia AKT/mitógena, pero también con GRB, SHC, SRC, ABL, rasGAP, SYK y el regulador de la transcripción EBP1 (Sithanandam and Anderson 413-48). La sobreexpresión del ERBB3 se ha constatado en muchos tipos de cáncer entre ellos el cáncer gástrico, donde podría jugar un papel etiológico clave e influye negativamente en el pronóstico (Kobayashi et al. 1294-301)(Slesak et al. 2727-32). (Zhang et al. 2112-18) hallaron que la sobreexpresión del ERBB3 era más frecuente en el cáncer gástrico de tipo difuso (26,2%) que en el tipo intestinal (5,0%). En ambos tipos la sobreexpresión estaba asociada con un pronóstico malo. Las estrategias dirigidas contra elERBB3 en el tratamiento contra el cáncer incluyen aptámeros de ARN contra el dominio extracelular (Chen et al. 9226-31), el bloqueo de su expresión génica mediante factores de transcripción sintéticos (Lund et al. 9082-91), inhibidores que son moléculas pequeñas como el isómero de la vitamina E γ-tocotrienol (Samant and Sylvester 563-74), ARNmi (Scott et al. 1479-86) y ARNsi (Sithanandam et al. 1847-59).

Prominina 1 (Prom1)

Función: La prominina-1, también llamada CD133, fue identificada como una molécula específica de las células madre hematopoyéticas CD34+ (Yin et al., 1997) y ha demostrado ser un marcador de las células madre normales y de las células madre cancerosas (CSC) en diversos tejidos. Está localizada principalmente en las protrusiones de la membrana plasmática, y podría intervenir en la organización de la topología de la membrana o en el mantenimiento de la composición lipídica de la membrana plasmática. Se ha sugerido que una isoforma de corte y empalme de la prominina-1 llamada AC133-2 y que carece de un pequeño exón de 27 aminoácidos podría ser un marcador de células madre aún mejor (Mizrak et al., 2008; Bidlingmaier et al., 2008).

Solo un pequeño porcentaje de células tumorales suele ser positivo para la prominina-1, como cabe esperar de un marcador de CSC. Según el tipo de tumor, el número de células positivas por masa tumoral varía entre el 1% y el 15% siendo mayoritariamente de en torno al 2%.

La prominina-1 ha sido asociada con la formación del tumor, la angiogénesis y la quimiorresistencia (Zhu et al., 2009a) (Bruno et al., 2006; Hilbe et al., 2004) (Bertolini et al., 2009). No obstante, las células positivas para la prominina-1 pueden ser dianas del sistema inmunitario, puesto que son destruidas por las células NK (Castriconi et al., 2007; Pietra et al., 2009) y los linfocitos T citotóxicos (Brown et al., 2009).

Si bien en muchas entidades tumorales se ha demostrado que las células positivas para la prominina-1 son funcionalmente CSC y su expresión ha sido asociada con frecuencia con un pronóstico malo, todavía existe controversia. Algunos informes afirman que la identificación de CSC no es ni necesaria ni suficiente (Cheng et al., 2009; Wu and Wu, 2009). Posiblemente la combinación de la prominina-1 con otras moléculas como la CD44, o incluso combinaciones múltiples como prom1(+), CD34(+), CD44(+), CD38(-), CD24(-) sirva como buenos marcadores de CSC (Zhu et al., 2009b; Fulda and Pervaiz, 2010).

En el cáncer gástrico difuso se ha sugerido la expresión de PROM1 por un análisis informático (Katoh and Katoh, 2007) y se ha descrito la sobreexpresión en el cáncer gástrico en comparación con el tejido estomacal normal a nivel de la proteína (Smith et al., 2008). Con todo, (Boegl and Prinz, 2009) describieron que la expresión de la prominina-1 estaba reducida en el cáncer gástrico, sobre todo en los estadios avanzados, y afirmaron que su expresión estaba más correlacionada con la angiogénesis –que también aparece reducida en los estadios avanzados– que con el crecimiento del tumor. Un estudio con estirpes celulares de cáncer gástrico (Takaishi et al., 2009) indica que la CD44, pero no la prominina-1, es un marcador de CSC para el cáncer gástrico.

Metaloproteinasa de la matriz 11 (MMP11)

A semejanza de otras MMP, la MMP11 es una endopeptidasa que interviene en procesos que requieren la remodelación de tejidos, tales como el desarrollo, la curación de heridas y la formación de la cicatriz. También podría regular negativamente la homeostasis de las grasas al reducir la diferenciación de los adipocitos. En contraste con otras MMP, no puede hidrolizar moléculas características de la matriz extracelular, excepto el colágeno VI. No obstante, se han descubierto otros sustratos como la alfa 2-macroglobulina, ciertos inhibidores de proteasas de

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serina (serpinas) como la alfa-1-antitripsina, la proteína 1 de unión al factor de crecimiento insulinoide y el receptor de la laminina. En el cáncer, la MMP11 se expresa mayoritariamente en las células estromales que rodean el tejido tumoral. Esto se ha demostrado en numerosas entidades tumorales. Se ha afirmado que la MMP11 se sobreexpresa en el estroma de la mayoría de los carcinomas invasivos humanos, pero raramente en sarcomas y en otros tumores no epiteliales. En la mayoría de casos, aunque no en todos, la MMP11 se expresa en las células del estroma directamente adyacentes al tumor, mientras que las células tumorales, los tejidos normales y las células estromales alejadas del tumor son negativas. Las concentraciones elevadas de MMP11 están correlacionadas con un fenotipo maligno/gran invasividad y un pronóstico malo. Con todo, en casos de carcinoma papilar de tiroides, la expresión de la MMP11 apareció inversamente relacionada con la naturaleza agresiva del tumor. La MMP11 se ha hallado tanto en el tejido tumoral como en el suero sanguíneo de pacientes con cáncer gástrico, y su expresión está correlacionada con la metástasis (Yang et al.). Asimismo, (Deng et al. 274-81) demostraron que la MMP11 se expresa mucho en estirpes de células tumorales y en tumor primario de cáncer gástrico –en contraste con otros tipos de cáncer no exclusivamente en el estroma–y que aparentemente potencia la proliferación de las células tumorales.

Subunidad beta del factor de transcripción nuclear Y (NFYB)

La NFYB, denominada también CBF-B o CBF-A es, aparte de la NFYA y la NFYC, un componente del factor de transcripción basal heterotrimérico NF-Y (también factor de unión a CCAAT o CBF) que se une a los motivos CCAAT –o los motivos complementarios, ATTGG, llamados caja Y– presentes en los promotores y en los intensificadores (enhancers) de numerosos genes. Entre los genes diana de NF-Y se encuentran genes de MHC de clase II, el receptor del PDGF beta, varias proteínas de choque térmico, el gen de reparación de emparejamientos erróneos hMLH1 y la topoisomerasa II alfa.

El NFYB no es un oncogén clásico, pero su función podría contribuir a la oncogénesis. En primer lugar, muchos genes del ciclo celular como la ciclina A, la ciclina B1, Aurora A y cdk1 son dianas del NF-Y. Las células quedan detenidas en la fase G2/M si el NFYB no es funcional. (Park et al.) demuestran que la regulación al alza de la ciclinaB2 y de otros genes relacionados con el ciclo celular en el adenocarcinoma colorrectal es debida a la actividad del NF-Y. En segundo lugar, la actividad del NF-Y impide la apoptosis. Las células que carecen de NF-Y sufren la apoptosis debido a la activación de p53 y a la reducción de la transcripción de genes anti-apoptósicos cuyos promotores contienen cajas CCAAT, como Bcl-2 (Benatti et al. 1415-28). En tercer lugar, sus propiedades oncogénicas se ven potenciadas en combinación con otros factores de transcripción. Por ejemplo, la p53 mutada se une a las proteínas NF-Y y p300, lo que aumenta la expresión de los genes del ciclo celular inducidos por la NF-Y.

ABL1

La proteína tirosina-cinasa c-Abl transita entre el núcleo y el citoplasma de la célula. La c-Abl nuclear interviene en la inhibición del crecimiento celular y en la apoptosis, en tanto que la c-Abl citoplasmática puede intervenir en la dinámica de la actina, la morfogénesis y la transducción de señales inducida por estímulos extracelulares como los generados por factores de crecimiento y por ligandos de integrinas. Se ha descrito que la c-Abl citoplasmática promueve la mitogénesis.

La actividad de la proteína c-Abl está regulada negativamente por su dominio SH3 y la deleción de este dominio transforma el ABL1 en un oncogén. En la leucemia mieloide crónica (LMC) el gen se activa por translocación dentro del gen BCR (breakpoint cluster region; región de agrupamiento de fracturas) situado en el cromosoma 22. La proteína de fusión resultante BCR-ABL se localiza en el citosol y permite a las células proliferar sin ser reguladas por las citocinas (Zhao et al.). La actividad de la c-Abl también está regulada al alza en tumores sólidos, tal y como se ha demostrado en el carcinoma de mama y en el NSCLC. La sobreexpresión no es suficiente y la actividad cinasa constitutiva exige la fosforilación de la proteína. En las células de cáncer de mama, la fosforilación de la c-Abl es inducida por las tirosina-cinasas de la membrana plasmática, entre ellas las SFK, los miembros de la familia del EGFR y el receptor del IGF-1. No se han detectado proteínas de fusión ABL en tumores sólidos (Lin and Arlinghaus, 2008). Se ha demostrado que el ABL se expresa en el carcinoma gástrico y en los microvasos asociados, lo cual plantea su posible papel en la angiogénesis. Resulta destacable que el gen A asociado a la citotoxina de H. pylori (CagA) conduce a la activación de la c-Abl, que a su vez fosforila el EGFR, lo cual bloquea la endocitosis del EGFR (Bauer, Bartfeld, and Meyer 156-69). Varios inhibidores de tirosina-cinasas son más o menos específicos de la Abl. El imatinib (Gleevec) se utiliza como tratamiento de primera línea contra la LMC y también ha sido aprobado para pacientes con tumores estromales gastrointestinales (GIST) avanzados, puesto que una de sus dianas es KIT (Pytel et al. 66-76)(Croom and Perry, 2003). Otros inhibidores utilizados en oncología son el dasatinib y el nilotinib (Pytel et al. 66-76)(Deremer, Ustun, and Natarajan 1956-75).

Cinasa similar a Polo 4 (Plk4)

Los miembros de la familia de la cinasa Polo (Plk1-4) son importantes durante la división celular, puesto que regulan varias etapas durante la mitosis. La Plk4 es una organizadora de la formación y la duplicación del centríolo (Rodrigues-Martins et al. 1046-50). Si bien la Plk1 es sin duda un oncogén, la función de la Plk4 en el cáncer es ambigua. La regulación a la baja y la sobreexpresión de la Plk4 han sido asociadas con el cáncer en el ser humano, el ratón y la mosca (Cunha-Ferreira et al. 43-49). Por ejemplo, en el cáncer colorrectal la Plk4 se ha hallado sobreexpresada, pero un pequeño grupo de pacientes presentó una fuerte regulación a la baja de la misma

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secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la invención. Como se puede deducir de la bibliografía (Rammensee, Bachmann, and Stevanovic) y de las bases de datos científicas (Rammensee et al. 213-19), ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA son normalmente residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión del receptor HLA, que está definida por las propiedades polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen la hendidura de unión. Las variantes de la presente invención conservan la capacidad para unirse a los TCR de los CTL activados, que después pueden reaccionar con células y matar las que expresan un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la invención.

Tabla 3: Variantes y motivos descritos de los péptidos acordes con las SEQ ID N. º 1 a 33

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CDC2-001: Código del péptido L Y Q I L Q G I V F

SEQ ID 1: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ASPM-002: Código del péptido S Y N P L W L R I

SEQ ID 2: Variantes F

L

F

F: L

F
F

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

UCHL5-001: Código del péptido N Y L P F I M E L

SEQ ID 3: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MET-006: Código del péptido S Y I D V L P E F

SEQ ID 4: Variantes F

L

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

PROM-001: Código del péptido S Y I I D P L N L

SEQ ID 5: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

MMP11-001: Código del péptido V W S D V T P L T F

SEQ ID 6: Variantes Y

F

L

I

Y: L

Y: I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MST1R-001: Código del péptido N Y L L Y V S N F

SEQ ID 7: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

NFYB-001: Código del péptido V Y T T S Y Q Q I

SEQ ID 8: Variantes F

L

F

F: L

F
F

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

SMC4-001: Código del péptido H Y K P T P L Y F

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SEQ ID 9: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

UQCRB-001: Código del péptido Y Y N A A G F N K L

SEQ ID 10: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAP2C-001: Código del péptido A Y L V Y T D R L

SEQ ID 11: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

AVL9-001: Código del péptido F Y I S P V N K L

SEQ ID 12: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

NUF2-001: Código del péptido V Y G I R L E H F

SEQ ID 13: Variantes F

L

I

F: L

F: I

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ABL1-001: Código del péptido T Y G N L L D Y L

SEQ ID 14: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MUC-006: Código del péptido N Y E E T F P H I

SEQ ID 15: Variantes F

F

L

F
F

F: L

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ASPM-001: Código del péptido R Y L W A T V T I

SEQ ID 16: Variantes F

F

L

F
F

F: L

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

EPHA2-005: Código del péptido V Y F S K S E Q L

SEQ ID 17: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MMP3-001: Código del péptido V F I F K G N Q F

SEQ ID 18: Variantes Y

L

I

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

PROM-001: Código del péptido S Y I I D P L N L

SEQ ID 5: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

MMP11-001: Código del péptido V W S D V T P L T F

SEQ ID 6: Variantes Y

F

L

I

Y: L

Y: I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MST1R-001: Código del péptido N Y L L Y V S N F

SEQ ID 7: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

NFYB-001: Código del péptido V Y T T S Y Q Q I

SEQ ID 8: Variantes F

L

F

F: L

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

F
F

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

SMC4-001: Código del péptido H Y K P T P L Y F

SEQ ID 9: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

UQCRB-001: Código del péptido Y Y N A A G F N K L

SEQ ID 10: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAP2C-001: Código del péptido A Y L V Y T D R L

SEQ ID 11: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

AVL9-001: Código del péptido F Y I S P V N K L

SEQ ID 12: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

NUF2-001: Código del péptido V Y G I R L E H F

SEQ ID 13: Variantes F

L

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ABL1-001: Código del péptido T Y G N L L D Y L

SEQ ID 14: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MUC-006: Código del péptido N Y E E T F P H I

SEQ ID 15: Variantes F

F

L

F
F

F: L

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ASPM-001: Código del péptido R Y L W A T V T I

SEQ ID 16: Variantes F

F

L

F
F

F: L

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

EPHA2-005: Código del péptido V Y F S K S E Q L

SEQ ID 17: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MMP3-001: Código del péptido V F I F K G N Q F

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SEQ ID 18: Variantes Y

L

I

Y: L

Y: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

NUF2-002: Código del péptido R F L S G I I N F

SEQ ID 19: Variantes Y

L

I

Y: L

Y: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

PLK4-001: Código del péptido Q Y A S R F V Q L

SEQ ID 20: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ATAD2-002: Código del péptido K Y L T V K D Y L

SEQ ID 21: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

COL12A1-001: Código del péptido V Y N P T P N S L

SEQ ID 22: Variantes F

F

I

F
F

F: I

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(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

COL6A3-001: Código del péptido S Y L Q A A N A L

SEQ ID 23: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

FANCI-001: Código del péptido F Y Q P K I Q Q F

SEQ ID 24: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

RSP11-001: Código del péptido Y Y K N I G L G F

SEQ ID 25: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ATAD2-001: Código del péptido A Y A I I K E E L

SEQ ID 26: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ATAD2-003: Código del péptido L Y P E V F E K F

SEQ ID 27: Variantes F

L

I

50

E11711292

03-08-2015

(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

HSP90B1-001: Código del péptido K Y N D T F W K E F

SEQ ID 28: Variantes F

L

I

F: L

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SIAH2-001: Código del péptido V F D T A I A H L F

SEQ ID 29: Variantes Y

L

I

Y: L

Y: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

SLC6A6-001: Código del péptido V Y P N W A I G L

SEQ ID 30: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

IQGAP3-001: Código del péptido V Y K V V G N L L

SEQ ID 31: Variantes F

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ERBB3-001: Código del péptido V Y I E K N D K L

SEQ ID 32: Variantes F

51 5

10

15

20

25

30

35

E11711292

03-08-2015

(contin: uación)

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

F

I

F
F

F: I

Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

KIF2C-001: Código del péptido I Y N G K L F D L L

SEQ ID 33: Variantes F

F

I

F
F

F: I

También pueden ser adecuados péptidos más largos. También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, sean generados por el procesamiento de péptidos más largos o proteínas que incluyen el epítopo real. Se prefiere que los residuos que flanquean el epítopo de interés sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestión proteolítica necesaria para exponer el epítopo durante el procesamiento.

En consecuencia, la presente invención también proporciona péptidos y variantes de epítopos de MHC de clase I en los que el péptido o variante tienen una longitud total de entre 10 y 14 aminoácidos.

Por supuesto, el péptido o variante conforme a la presente invención tendrá la capacidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC se puede analizar con métodos conocidos en la técnica.

En una forma de realización preferida de la invención el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N. º 1.

«Consiste esencialmente en» significa que un péptido conforme a la presente invención, además de la secuencia conforme a cualquiera de las SEQ ID N. º 1 a SEQ ID N. º 95 o una variante de las mismas, contiene segmentos adicionales de aminoácidos localizados en los extremos N-y/o C-terminal que no forman parte necesariamente del péptido que funciona como un epítopo para el epítopo de moléculas MHC.

No obstante, dichos segmentos pueden ser importantes para facilitar la introducción eficaz del péptido conforme a la presente invención en las células. En una forma de realización de la presente invención, el péptido es una parte de una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo “Ii”) tal y como aparece en el NCBI, número de acceso de GenBank X00497.

Además, el péptido o variante puede incluir enlace peptídicos inversos o enlaces no peptídicos. En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, y que se incorporan en la presente memoria como referencia. Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere y cols. (1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para la unión al MHC y las respuestas de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.

Enlaces no peptídicos son, por ejemplo: -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos 4.897.445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la obtención de polipéptidos con procedimientos estándar y la síntesis del enlace no peptídico mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en

52

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LSRII SORP (BD; dieciocho colores, equipado con azul (488 nm), violeta (405 nm), rojo (640 nm) y verde (532 nm), respectivamente.

Las células específicas de péptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos T CD8+. La evaluación del análisis multimérico se efectuó con el software FCSExpress o FlowJo (Tree Star, Oregón, EE. UU.). 5 La sensibilización in vitro de los linfocitos CD8+ multímero+ específicos se detectó aplicando el acotamiento de subpoblaciones (gating) adecuado y comparando los resultados con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad para un antígeno dado quedaba confirmada si al menos un pocillo estimulado in vitro y evaluable de un donante sano contenía una línea de linfocitos T CD8+ específica después de la estimulación in vitro (esto es, el pocillo contenía al menos un 1% de multímero+ específico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células

10 multímero+ específicas era al menos 10x de la mediana de las estimulaciones de los respectivos controles negativos (estimulación con el multímero irrelevante y tinción con el multímero relevante) y las células no estaban localizadas en la diagonal de la gráfica).

Inmunogenicidad in vitro de los péptidos de IMA941

En 47 de los 54 péptidos HLA-A*2402 y en 3 de los 3 péptidos HLA-A*0201 analizados, la inmunogenicidad in vitro

15 se pudo demostrar con la generación de líneas de linfocitos T específicos de ese péptido. En la Figura 3 se muestran a modo de ejemplo los resultados de la citometría de flujo de dos péptidos de la invención tras la tinción de multímeros específicos de TUMAP junto con la de los controles negativos correspondientes. Los resultados correspondientes a los 54 péptidos A*2402 y a los 3 péptidos A*0201 se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Inmunogenicidad in vitro de los péptidos HLA de clase I

Los resultados de los experimentos de inmunogenicidad in vitro llevados a cabo por Immatics presentan el porcentaje de donantes y de pocillos que dieron positivo entre los evaluables. Como mínimo resultaron evaluables cuatro donantes y 48 pocillos de cada péptido. La SEQ ID N. º 1 es la de la invención.

SEQ ID Nº:: Antígeno Donantes positivos/evaluables [%] Pocillos positivos/evaluables [%]

1: CDC2-001 83 28

2: ASPM-002 67 32

18: MMP3-001 11 1

4: MET-006 67 21

3: UCHL5-001 75 12

7: MST1R-001 50 13

33: KIF2C-001 17 2

9: SMC4-001 73 10

17: EPHA2-005 0 0

5: PROM1-001 83 26

6: MMP11-001 33 11

8: NFYB-001 50 7

16: ASPM-001 17 3

20: PLK4-001 60 5

14: ABL1-001 83 18

26: ATAD2-001 33 3

21: ATAD2-002 17 1

27: ATAD2-003 0 0

12: AVL9-001 100 31

22: COL12A1-001 0 0

63 (continuación)

23: COL6A3-001 0 0

24: FANCI-001 17 1

28: HSP90B1-001 50 7

15: MUC6-001 83 22

13: NUF2-001 100 50

19: NUF2-002 50 6

11: PPAP2C-001 83 29

25: RPS11-001 17 3

29: SIAH2-001 50 8

30: SLC6A6-001 17 1

10: UQCRB-001 83 24

31: IQGAP3-001 100 24

32: ERBB3-001 83

CCDC88A-001: 0 0

CCNB1-003: 33 3

CCND2-001: 17 10

CCNE2-001: 0 0

CEA-010: 40 3

CLCN3-001: 33 6

DNAJC10-001: 50 15

DNAJC10-002: 33 3

EIF2S3-001: 17 1

EIF3L-001: 100 29

EPPK1-001: 17 1

GPR39-001: 50 6

ITGB4-001: 67 20

LCN2-001: 17 1

SDHC-001: 33 3

PBK-001: 0 0

POLD3-001: 67 7

PSMD14-001: 17 1

PTK2-001: 17 4

TSPAN1-002: 17 1

64

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Claims

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