CN103275912A - 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 - Google Patents
肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103275912A CN103275912A CN2013100995424A CN201310099542A CN103275912A CN 103275912 A CN103275912 A CN 103275912A CN 2013100995424 A CN2013100995424 A CN 2013100995424A CN 201310099542 A CN201310099542 A CN 201310099542A CN 103275912 A CN103275912 A CN 103275912A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- flic
- hcpa
- tir
- eae
- pcold
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗，属于生物制药领域。分别扩增出EHEC O157:H7的H7鞭毛(fliC)基因、菌毛(hcpA)基因、转位紧密素受体(tir)基因和紧密素(eae)基因，依次串联，克隆入表达载体pCold I中，获得重组质粒pCold-fliC-hcpA-tir-eae，在BL21(DE3)获得高效表达。经过高密度发酵和一系列的纯化程序获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获得目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体在体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫方面产生高效的免疫应答，免疫预防保护和治疗作用。
Description
一、技术领域
本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157：H7多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及亚单位疫苗，属于生物制药领域。
二、背景技术
肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是重要的食源性人兽共患病原，O157：H7是其重要的血清型。近20余年来，EHEC O157：H7引发的食物中毒在世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157：H7感染患者和无症状携带者可作为传染源。在动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌率较高。相对来讲，动物作为传染源要比人类更为重要，它往往是动物源食品污染的根源。
人类感染可引起严重的胃肠道和循环系统疾病，如出血性结肠炎(hemorrhagic Colitis，HC)、溶血尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)等，个别患者可因急性和慢性肾功能衰竭而死亡。动物感染一般不引发明显的临床症状，但能够长期甚至终生携带。EHEC动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌率较高。因此，防控EHEC O157：H7的重中之重是减少和控制动物带菌和排菌。
目前，对O157：H7的感染缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。由于O157：H7的暴发流行特点和治疗上的困难，疫苗研究就显得极为紧迫。有效的疫苗研制是预防和治疗O157：H7感染最简单、经济和快捷的手段。
选取与EHEC O157：H7粘附和定植密切相关的鞭毛(H7)、菌毛(HCP)和紧密素(Intimin)和转位紧密素受体(Tir)四个基因分别设计特异性引物对，扩增相应基因片段，并依次串联，构建重组菌，获得重组蛋白，制备亚单位疫苗，用于预防EHEC O157：H7在动物体内的定植。
三、发现内容
技术问题本发明目的在于构建EHEC O157：H7多价融合型重组菌，表达重组蛋白，进而研制亚单位疫苗。本发明在抗原选择上直接针对EHEC O157：H7重要的粘附因子，强调多个粘附因子的联合应用以产生最大的免疫保护作用，降低动物带菌率，进而减少人类感染EHEC的机会，保障人类身心健康。
技术方案本发明的具体实施方案如下：
肠出血性大肠杆菌O157：H7(EHEC O157：H7)多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及亚单位疫苗，其特征在于，所说的多价重组菌和重组蛋白为BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)。多价重组菌和重组蛋白的制备方法包括：
(1)肠出血性大肠杆菌O157：H7免疫多价融合型重组菌，其构建方法为：
根据GenBank中O157：H7EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点(下划线部分)，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：
fliC-P1：5-ggggagctcactattaccaacaaa-3 Sac I
fliC-P2：5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3 Xhol I
hcpA-P1：5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3 Xhol I
hcpA-P2：5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR I
tir-P1：5-gatgaattcgagccggatagccca-3 EcoR I
tir-P2：5-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3 Sal I
eae-P1：5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3 Sal I
eae-P2：5-ggctctagattattctacacaaaccgc-3 Xba I
O157：H7过夜培养物，1mL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；
扩增fliC片段的上下游引物分别加有Sac I和Xhol I酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有Sal I和Xba I酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；
扩增hcpA片段的上下游分别引物加有Xhol I和EcoR I酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoR I和Sal I酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟。
fliC-P1和fliC-P2、hcpA-P1和hcpA-P2、tir-P1和tir-P2、eae-P1和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和811bp。
将扩增的PCR产物用质量比1.2％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段。
将Sac I和Xhol I酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pCold I片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0uL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用Sac I和Xhol I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到一条fliC片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC重组质粒；用Xho I和EcoR I酶切hcpA片段和pCold I-fliC重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC取4.0uL，hcpA片段取2uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，补水2uL，一同加入eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA重组质粒；用EcoR I和Sal I酶切tir片段和pCold I-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，补水3uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒；用Sal I和Xba I酶切eae片段和pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA-tir和eae各取4.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pCold I-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)。
(2)多价重组菌的构建、多价重组融合蛋白的表达和纯化
将BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)培养物按体积比2％接种于含100μg/mL有氨苄抗生素的LB中，37℃振荡培养至A＝0.6～0.8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0.5mM，继续15℃震荡培养24小时，诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，12000g离心25分钟，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为88kD目的蛋白，主要存在于菌体上清中，获得fliC-hcpA-tir-eae多价重组蛋白。
将上述诱导重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)经12000g离心10分钟，收集菌体，用1/10体积的螯合缓冲液重悬，再加入1mg/mL的溶菌酶，混匀后30℃作用2小时，超声波进行超声破碎，4℃12000g离心30分钟收集上清，0.45μM滤器过滤后上经过预处理(4倍柱体积的螯合缓冲液洗柱子)的Ni+亲和层析柱，加入洗脱缓冲液收集蛋白，即为经过纯化的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
(3)EHEC O157：H7多价融合蛋白亚单位疫苗的制备
将上述纯化的多价融合蛋白测定蛋白浓度，控制在0.2μg/μL。抗原与佐剂(ISA50V，法国Seppic公司生产)按照1∶1(V/V)进行分散处理制成油乳剂。
有益效果本发明的特点和优点如下：
1、本发明针对EHEC O157：H7重要的粘附因子串联构建了融合型重组菌。利用PCR，获得fliC、hcpA、tir和eae四个基因片段，并通过串联，最终克隆入表达质粒pCold中，成功构建pCold I-fliC-hcpA-tir-eae，转化入BL21中获得重组菌，即BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)。2、本发明成功获得BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)，经过37℃高密度发酵培养，15℃IPTG的诱导获得高效表达，表达量约占全菌蛋白的30％，经过纯化后获得重组融合型蛋白，即fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
3、本发明将纯化后的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白制备了亚单位疫苗，免疫了Balb/c小鼠和山羊，明确了上述表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，为更加安全而有效的防控肠出血性大肠杆菌的感染和致病提供了有效的技术方法。
四、附图说明
图1：pCold I-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒酶切鉴定。
M，DL-2000；1-3，pCold I-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒质粒Sac I/Xba I
图2：BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)重组菌电泳分析。
M，中分子量蛋白质Marker；1，BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)诱导后全菌蛋白；2，BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)诱导前全菌蛋白；3，BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)诱导后全菌蛋白上清
图3：免疫后小鼠血清中IgG滴度测定
图4：免疫组和对照组小鼠攻击排菌变化
图5：免疫后山羊粪便中IgG滴度测定
图6：免疫组和对照组山羊攻击排菌变化
五、具体实施方式
1、获取fliC、hcpA、tir和eae基因，并串联克隆入pCold I载体
根据GenBank中O157：H7EDL933(上海三踏生物科技有限公司)的fliC(序列号：L07388)、hcpA(序列号：NC_013008)、tir(序列号：AF125993)和eae(序列号：Z11541)基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点(下划线部分)，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：
fliC-P1：5-ggggagctcactattaccaacaaa-3 Sac I
fliC-P2：5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3 Xhol I
hcpA-P1：5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3 Xhol I
hcpA-P2：5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR I
tir-P1：5-gatgaattcgagccggatagccca-3 EcoR I
tir-P2：5-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3 Sal I
eae-P1：5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3 Sal I
eae-P2：5-ggctctagattattctacacaaaccgc-3 Xba I
O157：H7过夜培养物，1mL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；
扩增fliC片段的上下游引物分别加有Sac I和Xhol I酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有Sal I和Xba I酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有Xhol I和EcoR I酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoR I和SalI酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟。
fliC-P1和fliC-P2、hcpA-P1和hcpA-P2、tir-P1和tir-P2、eae-P1和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和811bp。将扩增的PCR产物用质量比1.2％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液(天根公司)后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子(天根公司)，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段。
将Sac I和Xhol I酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pCold I(大连宝生物公司)片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0uL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用Sac I和Xhol I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC重组质粒；用Xho I和EcoR I酶切hcpA片段和pCold I-fliC重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC取4.0uL，hcpA片段取2uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，补水2uL，一同加入eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA重组质粒；用EcoR I和Sal I酶切tir片段和pCold I-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，补水3uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒；用Sal I和Xba I酶切eae片段和pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA-tir和eae各取4.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10(南京百思凯)感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pCold I-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21(DE3)(南京百思凯)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)。
2、多价重组菌的构建、多价重组融合蛋白的表达和纯化
将BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)培养物按体积比2％接种于含100μg/mL有氨苄抗生素的LB培养基(蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠5g/L)中，37℃振荡培养至A＝0.6～0.8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0.6mM，继续15℃震荡培养24小时，诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，12000g离心25分钟，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为88kD目的蛋白，主要存在于菌体上清中，获得fliC-hcpA-tir-eae多价重组蛋白。
将上述诱导重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)经12000g离心10分钟，收集菌体，用1/10体积的螯合缓冲液重悬，再加入1mg/mL的溶菌酶，混匀后30℃作用2小时，超声波进行超声破碎，4℃12000g离心30分钟收集上清，0.45μM滤器过滤后，加入到Ni+亲和层析柱(上海英俊公司)，加入洗脱缓冲液收集蛋白，即为经过纯化的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
3、EHEC O157：H7多价融合蛋白亚单位疫苗的制备
将上述纯化的多价融合蛋白测定蛋白浓度，控制在0.2μg/μL。抗原与佐剂ISA50V(法国Seppic公司生产)按照1∶1(V/V)进行分散处理制成油乳剂。
4、免疫试验
(一)小鼠试验
(1)实验动物选取雄性BALB/c小鼠(扬州大学购买)20只，18g-22g/只。
(2)实验动物的前处理在攻毒前所有组均给予5g/L链霉素溶液饮用3天，3天后粪检肠道排菌少于103CFU/g，灌胃攻菌后全部给予0.5g/L的链霉素溶液饮用。以排除肠道正常菌群，为O157：H7在小鼠体内驯化一个定居和生长的环境，在肠道中成为优势菌群，增加小鼠的易感性。并在攻毒前断水断食12小时，攻毒后6小时恢复饮水饮食，防止攻毒后细菌快速排出动物肠道，延长在其体内作用时间。
(3)免疫攻毒和分组情况将20只小鼠随机分为2组，每组10只，即实验组应用制备的亚单位疫苗，而对照组用等量的无菌磷酸盐缓冲液替代。采用背部及腹部皮下多点注射方式进行免疫，免疫1次，免疫剂量为25ug/只。免疫后35天后进行灌胃攻毒，剂量约为1×1010CFU/只。攻菌后密切观察各组小鼠的行为、摄食情况及精神状态的变化，详细统计各组小鼠死亡情况，并每隔两天收集小鼠新鲜粪便，测定粪便中排菌时间和排菌量的变化情况。
(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特异性IgG抗体的检测
小鼠免疫前后，对小鼠采取断尾方式采血制备血清，应用间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清IgG抗体效价。
(5)免疫效果确定依据
①抗体变化利用ELISA检测免疫后血清抗体变化，以重组抗原包被酶标板，结果表明：能够诱导高滴度的IgG，达到3.89×105以上，并且一致性良好。图3。
②攻毒保护情况35天攻毒，结果显示：免疫组小鼠存活率为10/10，对照组存活率为6/10。
③排菌量变化攻毒后24小时开始采集粪便，之后每隔两天采集一次，经过适当处理后涂布筛选性麦康凯平板，37℃培养18～24小时，取出平板计数，并对菌落用二重PCR进行鉴定，均为O157：H7。免疫组排菌时间缩短，免疫组攻毒之后第4天检测不到O157：H7，而对照组于第14天仍能检测到高达104CFU以上的排菌，图4。
(二)山羊试验
(1)实验动物选取雄性山羊(江苏省农业科学院羊场购买)10只，3月龄。
(2)实验动物的前处理在攻毒前所有山羊断食断水12小时，攻毒后6小时恢复饮水饮食，防止攻击后细菌快速排出动物肠道，延长在其体内作用时间。
(3)免疫攻毒和分组情况将10只山羊随机分为2组，5只/组。颈部多点注射免疫，免疫剂量为200ug/只。间隔21天后，进行2次免疫，二次免疫后14天后进行灌胃攻毒，剂量约为1×1010CFU/只。攻菌后密切观察各组羊的行为，并每隔2天收集山羊的新鲜粪便，测定粪便中排菌时间和排菌量的变化情况。
(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特异性IgG抗体的检测
山羊免疫前和二免后，耳静脉采血制备血清，应用间接ELISA方法检测免疫后血清IgG抗体效价。
(5)免疫效果确定依据
①抗体变化利用ELISA检测免疫后血清抗体变化，以重组抗原包被酶标板，结果表明：能够诱导高滴度的IgG，达到2.48×104以上。图5。
②攻毒保护情况对照山羊和免疫山羊没有任何不良反应，无死亡。
③排菌量变化攻毒后24小时开始采集粪便，之后每2天采集一次，经过适当处理后涂布筛选性麦康凯平板，37℃培养18～24小时，取出平板计数，并对菌落用二重PCR进行鉴定，均为O157：H7。免疫山羊不排菌，而对照山羊第12天仍然在排菌。图6。
Claims (7)
1.肠出血性大肠杆菌O157：H7多价融合型重组菌，其构建方法为：
根据GenBank中O157：H7EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：
fliC-P1：5-ggggagctcactattaccaacaaa-3 Sac I
fliiC-P2：5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3 Xhol I
hcpA-P1：5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3 Xhol I
hcpA-P2：5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR I
tir-P1：5-gatgaattcgagccggatagccca-3 EcoR I
tir-P2：5-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3 Sal I
eae-P1：5-ttagtcgaegctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3 Sal I
eae-P2：5-ggctctagattattctacacaaaccgc-3 Xba I
O157：H7过夜培养物，1mL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；
扩增fliC片段的上下游引物分别加有Sac I和Xhol I酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有Sal I和Xba I酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有Xhol I和EcoR I酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoR I和SalI酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟；
fliC-P1和fliC-P2、hcpA-P1和hcpA-P2、tir-P1和tir-P2、eae-P1和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和811bp；
将扩增的PCR产物用质量比1.2％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段；
将Sac I和Xhol I酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pCold I片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0uL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用Sac I和Xhol I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC重组质粒；用Xho I和EcoR I酶切hcpA片段和pCold I-fliC重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC取4.0uL，hcpA片段取2uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，补水2uL，一同加入eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA重组质粒；用EcoR I和Sal I酶切tir片段和pCold I-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0uL，补水3uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒；用Sal I和Xba I酶切eae片段和pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA-tir和eae各取4.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pCold I-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)。
2.权利要求1所述肠出血性大肠杆菌O157：H7多价融合型重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)表达的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，
将权利要求1所述BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)培养物按体积比2％接种于含100μg/mL有氨苄抗生素的LB中，37℃振荡培养至A＝0.6～0.8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0.5mM，继续15℃震荡培养24小时，诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，12000g离心25min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为88kD目的蛋白，主要存在于菌体上清中，获得fliC-hcpA-tir-eae多价重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，将权利要求3所述经过0.6mM IPTG诱导的重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)菌液经12000g离心10分钟，收集菌体，用1/10体积的螯合缓冲液重悬，再加入1mg/mL的溶菌酶，混匀后30℃作用2小时，超声破碎，4℃12000g离心30分钟收集上清，0.45μM滤器过滤后上亲和层析柱，加入洗脱缓冲液收集蛋白，即为经过纯化的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
5.用权利要求1所述肠出血性大肠杆菌O157：H7多价融合型重组菌制备的疫苗。
6.用权利要求2-4之一所述重组蛋白制备的疫苗。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，将权利要求2-4之一所述重组蛋白作为抗原，与佐剂ISA50V按照体积比1∶1进行分散处理制成油乳剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310099542.4A CN103275912B (zh) | 2012-03-15 | 2013-03-10 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012100309158A CN102586311A (zh) | 2012-03-15 | 2012-03-15 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 |
| CN201210030915.8 | 2012-03-15 | ||
| CN2012100309158 | 2012-03-15 | ||
| CN201310099542.4A CN103275912B (zh) | 2012-03-15 | 2013-03-10 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103275912A true CN103275912A (zh) | 2013-09-04 |
| CN103275912B CN103275912B (zh) | 2016-03-02 |
Family
ID=46475536
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012100309158A Withdrawn CN102586311A (zh) | 2012-03-15 | 2012-03-15 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 |
| CN201310099542.4A Active CN103275912B (zh) | 2012-03-15 | 2013-03-10 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012100309158A Withdrawn CN102586311A (zh) | 2012-03-15 | 2012-03-15 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN102586311A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103540606A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-01-29 | 湖南大学 | 表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用 |
| CN110156881A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-23 | 余文庚 | 一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物 |
| CN112481236A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-03-12 | 武汉理工大学 | 一种重组蛋白INP-AidH及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102747024A (zh) * | 2012-06-19 | 2012-10-24 | 江苏省农业科学院 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 |
| CN103804474B (zh) * | 2013-12-31 | 2016-01-27 | 李越希 | E. coli O157: H7鞭毛蛋白H7抗原片段的表达、纯化及应用 |
| CN109055415A (zh) * | 2018-08-16 | 2018-12-21 | 湖北大学 | 一种有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体及其应用 |
-
2012
- 2012-03-15 CN CN2012100309158A patent/CN102586311A/zh not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-03-10 CN CN201310099542.4A patent/CN103275912B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JUAN XICOHTENCATL-CORTES,ET AL: "The Type 4 Pili of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Are Multipurpose Structures with Pathogenic Attributes", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》, vol. 191, no. 1, 31 January 2009 (2009-01-31), pages 411 - 421 * |
| 张雪寒 等: "出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与Hly融合基因的构建和表达", 《中国兽医学报》, vol. 30, no. 5, 31 May 2010 (2010-05-31), pages 647 - 650 * |
| 张雪寒 等: "肠出血性大肠杆菌O157：H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性", 《江苏农业学报》, vol. 27, no. 5, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 1021 - 1025 * |
| 彭丽娟: "肠出血性大肠埃希菌O157：H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 01, 15 January 2010 (2010-01-15), pages 061 - 11 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103540606A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-01-29 | 湖南大学 | 表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用 |
| CN103540606B (zh) * | 2013-11-06 | 2015-09-23 | 湖南大学 | 表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用 |
| CN110156881A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-23 | 余文庚 | 一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物 |
| CN112481236A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-03-12 | 武汉理工大学 | 一种重组蛋白INP-AidH及其制备方法和应用 |
| CN112481236B (zh) * | 2020-11-25 | 2023-06-06 | 武汉理工大学 | 一种重组蛋白INP-AidH及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102586311A (zh) | 2012-07-18 |
| CN103275912B (zh) | 2016-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103275912B (zh) | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 | |
| CN102068690A (zh) | 多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法 | |
| CN103497934B (zh) | 鸡传染性支气管炎病毒疫苗株（hf2株）及其应用 | |
| CN102181457B (zh) | 密码子优化的艰难梭菌外毒素b氨基端基因序列及其核酸疫苗 | |
| CN103421832A (zh) | 包含氟苯尼考耐药基因蛋白的卵黄抗体及制备与应用 | |
| CN106389475B (zh) | 脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用 | |
| CN102604993B (zh) | 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法 | |
| CN102747024A (zh) | 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗 | |
| CN103276003A (zh) | 一种免疫调节型抗鸡柔嫩艾美耳球虫病重组乳酸菌及其制备方法 | |
| CN103275890A (zh) | 一株鳗弧菌（鳗利斯顿氏菌）强毒菌株及其应用 | |
| CN102676421B (zh) | 一种支气管败血波氏杆菌基因缺失菌株及由其制备的疫苗和应用 | |
| CN101020894B (zh) | 一株无毒2型猪链球菌及其制备方法、应用 | |
| CN105483149A (zh) | 广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法 | |
| CN102277373A (zh) | 一种减毒沙门氏菌分泌表达的日本血吸虫疫苗表达载体及其应用 | |
| CN101829321A (zh) | 一种预防黄颡鱼红头病的疫苗 | |
| CN107653231A (zh) | 鸭源性冠状病毒弱毒株ibvdcv35及其应用 | |
| CN105753992A (zh) | 铜绿假单胞菌重组蛋白Vac11及制备方法和应用 | |
| CN107281486A (zh) | 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN113754782A (zh) | 一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用 | |
| CN102732442A (zh) | 一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失菌及其应用 | |
| CN105732778A (zh) | 铜绿假单胞菌重组蛋白OprL及制备方法和应用 | |
| CN101948792B (zh) | O157:h7增强粘膜免疫多价融合型重组菌及疫苗 | |
| Banerji et al. | Efficacy of Baptisia tinctoria in the treatment of typhoid: its possible role in inducing antibody formation | |
| CN102940875B (zh) | Paa蛋白及由其制备的抗体与应用 | |
| CN105754978A (zh) | 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac14及制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |