JP2013139481A - 髄膜炎菌のｎｍｂ１８７０のキメラ、ハイブリッドおよびタンデムポリペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】ＮＭＢ１８７０によって与えられる防御のファミリー特異性を克服するためのさらなる改善されたアプローチを提供すること、およびこれらのアプローチを、特に血清群Ｂに関して、髄膜炎菌疾患および／または感染に対する免疫を提供するために使用すること。
【解決手段】本発明は、ＮＭＢ１８７０の第一ファミリーの改変アミノ酸配列を含み、前記改変配列が、第一ファミリー由来の表面ループ配列の代わりにＮＭＢ１８７０の２番目のファミリー由来の少なくとも１つの（たとえば１、２、３、４、５、６または７）表面ループ配列を含む、ポリペプチドを提供する。
【選択図】なし

Description

ここで引用するすべての資料は、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。

（技術分野）
本発明は、免疫の分野、特に髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）などのＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原細菌によって引き起こされる疾患に対する免疫の分野に属する。

髄膜炎菌は、ヒト集団の約１０％の上気道にコロニー形成するグラム陰性莢膜形成細菌である。多糖及び複合体ワクチンは血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹに対して使用可能であるが、莢膜多糖は、ヒトにおける自己抗原であるポリシアル酸の重合体であるため、このアプローチは血清群Ｂには適用できない。血清群Ｂに対するワクチンを開発するために、外膜小胞（ＯＭＶ）に含まれる表面露出タンパク質が使用されてきた。これらのワクチンは血清殺菌性抗体応答を惹起し、疾患に対して防御するが、系統間防御を誘導することはできない［１］。一部の研究者は、それ故、ワクチンにおける使用のための特異的髄膜炎菌抗原に重点的に取り組んでいる［２］。

１つのそのような抗原は「ＮＭＢ１８７０」である。このタンパク質は、最初はＭＣ５８株由来の「７４１」タンパク質［参考文献３の配列番号２５３５および２５３６；本文中の配列番号１］として開示され、「ＧＮＡｌ８７０」［参考文献４−６、以下の参考文献２］および「ＯＲＦ２０８６」［７−９］とも称されてきた。このリポタンパク質はすべての髄膜炎菌血清群にわたって発現され、多数の髄膜炎菌系統において認められた。ＮＭＢ１８７０配列は３つのファミリー（ここではファミリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩと称する）に分類され、所与のファミリーに対して惹起された血清は、同じファミリー内では殺菌性であるが、その他の２つのファミリーの１つを発現する系統に対しては有効でない、すなわちファミリー内交差防御能があるが、ファミリー間交差防御能は存在しないことが認められた。
ＮＭＢ１８７０を使用して系統間防御を達成するためには、それ故、２つ以上のファミリーが使用される。別々のタンパク質を発現し、精製する必要を回避するため、１本のポリペプチド鎖に２または３のファミリーを含む、ハイブリッドタンパク質［１０−１２（特許文献1、特許文献２、特許文献３）］として種々のファミリーを発現することが提案された。いくつかのハイブリッドが試験され、有望な抗髄膜炎菌効果を与えている。

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ＮＭＢ１８７０によって与えられる防御のファミリー特異性を克服するためのさらなる改善されたアプローチを提供すること、およびこれらのアプローチを、特に血清群Ｂに関して、髄膜炎菌疾患および／または感染に対する免疫を提供するために使用することである。

本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
配列番号５７に少なくとも７０％の同一性を有し、以下の残基：Ｆ１４；Ｔ１６；Ｑ１８；Ｑ２０；Ｄ２１；Ｓ２２；Ｅ２３；Ｈ２４；Ｓ２５；Ｇ２６；Ｋ２７；Ｋ３１；Ｑ３３；Ｒ３５；Ｉ３６；Ｇ３７；Ｉ３９；Ｋ４８；Ｅ５１；Ｇ５２；Ｒ５４；Ｔ５６；Ａ６７；Ｇ６８；Ｋ７０；Ｔ７２；Ａ７８；Ａ７９；Ｎ８３；Ｋ８５；Ｄ９７；Ｄ１０２；Ｐ１０５；Ｇ１０７；Ｒ１０９；Ｓ１１４；Ｓ１１６；Ｌ１１８；Ｎ１２０；Ｑ１２１；Ａ１２２；Ｋ１３５；Ｔ１４７；Ｖ１４８；Ｎ１４９；Ｇ１５０；Ｉ１５１；Ｒ１５２；Ｈ１５３の１またはそれ以上が別のアミノ酸で置換されているかまたは欠失されているアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（項目２）
以下の残基：Ｆ１４；Ｔ１６；Ｑ１８；Ｑ２０；Ｄ２１；Ｓ２２；Ｅ２３；Ｈ２４；Ｓ２５；Ｇ２６；Ｋ２７；Ｋ３１；Ｑ３３；Ｒ３５；Ｉ３６；Ｇ３７；Ｋ４８；Ｅ５１；Ｇ５２；Ｒ５４；Ｔ７２；Ａ７９；Ｋ８５；Ｐ１０５；Ｇ１０７；Ｒ１０９；Ｌ１１８；Ｎ１２０；Ｑ１２１；Ａ１２２；Ｔ１４７；Ｖ１４８；Ｎ１４９；Ｇ１５０；Ｉ１５１；Ｒ１５２；Ｈ１５３の少なくとも１つが置換または欠失されている、請求項１に記載のポリペプチド。
（項目３）
Ｅ５１が欠失されている、請求項２に記載のポリペプチド。
（項目４）
以下の残基：Ｆ１４；Ｔ１６；Ｑ１８；Ｋ３１；Ｑ３３；Ｒ３５；Ｉ３６；Ｇ３７；Ｉ３９；Ｔ５６；Ｋ７０；Ｔ７２；Ａ７８；Ａ７９；Ｋ８５；Ｄ９７；Ｄ１０２；Ｓ１１４；Ｓ１１６；Ｌ１１８；Ｋ１３５の少なくとも１つが置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
（項目５）
Ｆ１４Ｌ；Ｔ１６Ｉ；Ｑ１８Ｋ；Ｑ２０Ｎ；Ｄ２１Ｎ；Ｓ２２Ｐ；Ｅ２３Ｄ；Ｈ２４Ｋ；Ｓ２５Ｉ；Ｓ２５Ｔ；Ｇ２６Ｄ；Ｋ２７Ｓ；Ｋ３１Ｑ；Ｑ３３Ｓ；Ｒ３５Ｌ；Ｉ３６Ｖ；Ｇ３７Ｓ；Ｉ３９Ｌ；Ｋ４８Ｑ；Ｇ５２Ｄ；Ｒ５４Ｋ；Ｔ５６Ｅ；Ａ６７Ｐ；Ｇ６８Ｎ；Ｋ７０Ｒ；Ｔ７２Ｈ；Ａ７８Ｔ；Ａ７９Ｋ；Ｎ８３Ｈ；Ｎ８３Ｙ；Ｋ８５Ｒ；Ｄ９７Ｅ；Ｄ１０２Ｅ；Ｐ１０５Ａ；Ｇ１０７Ｅ；Ｒ１０９Ｓ；Ｓ１１４Ｌ；Ｓ１１６Ｄ；Ｌ１１８Ｒ；Ｎ１２０Ｇ；Ｑ１２１Ｓ；Ａ１２２Ｅ；Ｋ１３５Ｒ；Ｔ１４７Ｉ；Ｖ１４８Ｇ；Ｎ１４９Ｅ；Ｇ１５０Ｋ；Ｉ１５１Ｖ；Ｒ１５２Ｈ；Ｈ１５３Ｅから選択される置換を含む、請求項２または請求項４に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記アミノ酸配列が配列番号５７に少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目７）
前記アミノ酸配列が配列番号５７に少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目８）
配列番号５８、配列番号５９または配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目９）
ＮＭＢ１８７０の第一ファミリーの改変アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該改変配列が、該第一ファミリー由来の表面ループ配列の代わりにＮＭＢ１８７０の第二ファミリー由来の少なくとも１つの（たとえば１、２、３、４、５、６または７）表面ループ配列を含む、ポリペプチド。
（項目１０）
アミノ酸配列：

式中、
（ａ）該Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８およびＢ９の各々は、（ｉ）配列番号Ｍのフラグメント；または（ｉｉ）（ｉ）の該フラグメントに少なくとも７５％の配列同一性を有するおよび／または（ｉ）の該フラグメント由来の少なくとも１０個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり；
（ｂ）該Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７およびＬ８の各々は、（ｉ）配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のフラグメント；または（ｉｉ）（ｉ）の該フラグメントに少なくとも７５％の配列同一性を有するおよび／または（ｉ）の該フラグメント由来の少なくとも１０個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、
但し、該Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７およびＬ８の少なくとも１つは配列番号Ｍのフラグメントではないことを条件とし、
Ｍは１、２または３であり、およびＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８は、Ｍに依存して以下のように選択される：

を含むポリペプチド。
（項目１１）
前記フラグメントが、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７および／またはＬ８の少なくとも１つ、およびＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８および／またはＢ９の２またはそれ以上由来の少なくとも１つのアミノ酸を含むことを条件とする、請求項１０に記載のポリペプチドのフラグメント。
（項目１２）
請求項１０または請求項１１において定義されるように、キメラアミノ酸配列：

を含み、該キメラ配列のＮ末端側またはＣ末端側のいずれかに、ＮＭＢ１８７０配列をさらに含み、該ＮＭＢ１８７０配列が、配列番号Ｍと同じＮＭＢ１８７０ファミリーである、ポリペプチド。
（項目１３）
式：
−Ａ−［Ｘ−Ｌ−］ _ｎ −Ｂ−
のハイブリッドポリペプチドであって、式中、Ｘはナイセリア属菌配列を含むアミノ酸配列であり、Ｌは選択的リンカーアミノ酸配列であり、Ａは選択的Ｎ末端アミノ酸配列であり、Ｂは選択的Ｃ末端アミノ酸配列であり、およびｎは２またはそれ以上であり、−Ｘ−部分の少なくとも１つはＮＭＢ１８７０配列である、ハイブリッドポリペプチド。
（項目１４）
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のハイブリッドポリペプチド。
（項目１５）
−Ｘ−部分の少なくとも１つが配列番号９５に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１３に記載のハイブリッドポリペプチド。
（項目１６）
配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３および９４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
参考文献１３に述べられている研究を補足して、発明者らは、野生型ポリペプチドのファミリー特異性を持たないキメラＮＭＢ１８７０を作製することを目的として、１つのＮＭＢ１８７０ファミリー由来の配列を別のファミリー内の対応する位置に代入した。

３つのファミリーすべての特徴を有するように１つのＮＭＢ１８７０を遺伝子操作するための代替策として、発明者らはまた、複数のファミリー由来のＮＭＢ１８７０配列を含む新たなハイブリッドおよびタンデムポリペプチドを作製し、それによって参考文献１０および１２に述べられている研究を補足した。

各々個々のＮＭＢ１８７０ファミリーは、同じＮＭＢ１８７０ファミリー内の株に対してのみ有効な抗体を惹起し得るが（たとえばマウスにおいて）、本発明のキメラ、ハイブリッドおよびタンデムポリペプチドは、２以上のファミリー由来のＮＭＢ１８７０ポリペプチドを認識する抗体を惹起することができる。

発明者らはまた、３つのこれまでに報告されたファミリーとは異なる配列を含む、ＮＭＢ１８７０の様々な新しい多型（ファミリーＩＶ）を同定した。

ＮＭＢ１８７０ファミリーの置換
参考文献１３は、キメラＮＭＢ１８７０ポリペプチドを作製するために、１つのＮＭＢ１８７０ファミリー由来の配列を別のＮＭＢ１８７０フレームワークに置換（代入）することを開示する。発明者らは、キメラに関してさらなる研究を行い、ファミリーＩ ＮＭＢ１８７０配列における置換のための多数の鍵となる残基を同定した。これらの残基の置換は、ファミリーＩＩポリペプチドと交差反応する抗体を惹起するポリペプチドの能力を改善し得る。

そこで本発明は、配列番号５７に少なくとも７０％の同一性を有し、以下の残基の１またはそれ以上が別のアミノ酸で置換されているかまたは欠失しているアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する：Ｆ１４；Ｔ１６；Ｑ１８；Ｑ２０；Ｄ２１；Ｓ２２；Ｅ２３；Ｈ２４；Ｓ２５；Ｇ２６；Ｋ２７；Ｋ３１；Ｑ３３；Ｒ３５；Ｉ３６；Ｇ３７；Ｉ３９；Ｋ４８；Ｅ５１；Ｇ５２；Ｒ５４；Ｔ５６；Ａ６７；Ｇ６８；Ｋ７０；Ｔ７２；Ａ７８；Ａ７９；Ｎ８３；Ｋ８５；Ｄ９７；Ｄ１０２；Ｐ１０５；Ｇ１０７；Ｒ１０９；Ｓ１１４；Ｓ１１６；Ｌ１１８；Ｎ１２０；Ｑ１２１；Ａ１２２；Ｋ１３５；Ｔ１４７；Ｖ１４８；Ｎ１４９；Ｇ１５０；Ｉ１５１；Ｒ１５２；Ｈ１５３。

以下の残基の少なくとも１個が置換されていることが好ましい：Ｆ１４；Ｔ１６；Ｑ１８；Ｋ３１；Ｑ３３；Ｒ３５；Ｉ３６；Ｇ３７；Ｉ３９；Ｔ５６；Ｋ７０；Ｔ７２；Ａ７８；Ａ７９；Ｋ８５；Ｄ９７；Ｄ１０２；Ｓ１１４；Ｓ１１６；Ｌ１１８；Ｋ１３５。これらの残基のいずれもが、参考文献１３における置換のためには選択されなかった。

置換または欠失のための好ましいアミノ酸は以下の通りである：Ｆ１４；Ｔ１６；Ｑ１８；Ｑ２０；Ｄ２１；Ｓ２２；Ｅ２３；Ｈ２４；Ｓ２５；Ｇ２６；Ｋ２７；Ｋ３１；Ｑ３３；Ｒ３５；Ｉ３６；Ｇ３７；Ｋ４８；Ｅ５１；Ｇ５２；Ｒ５４；Ｔ７２；Ａ７９；Ｋ８５；Ｐ１０５；Ｇ１０７；Ｒ１０９；Ｌ１１８；Ｎ１２０；Ｑ１２１；Ａ１２２；Ｔ１４７；Ｖ１４８；Ｎ１４９；Ｇ１５０；Ｉ１５１；Ｒ１５２；Ｈ１５３。Ｅ５１を除き、残基の置換が好ましいが、Ｅ５１については欠失が好ましい。

残基は、好ましくはファミリーＩＩまたはファミリーＩＩＩの中のＮＭＢ１８７０からの対応するアミノ酸で置換される。好ましい置換基は、それ故、以下の通りである：Ｆ１４Ｌ；Ｔ１６Ｉ；Ｑ１８Ｋ；Ｑ２０Ｎ；Ｄ２１Ｎ；Ｓ２２Ｐ；Ｅ２３Ｄ；Ｈ２４Ｋ；Ｓ２５Ｉ；Ｓ２５Ｔ；Ｇ２６Ｄ；Ｋ２７Ｓ；Ｋ３１Ｑ；Ｑ３３Ｓ；Ｒ３５Ｌ；Ｉ３６Ｖ；Ｇ３７Ｓ；Ｉ３９Ｌ；Ｋ４８Ｑ；Ｇ５２Ｄ；Ｒ５４Ｋ；Ｔ５６Ｅ；Ａ６７Ｐ；Ｇ６８Ｎ；Ｋ７０Ｒ；Ｔ７２Ｈ；Ａ７８Ｔ；Ａ７９Ｋ；Ｎ８３Ｈ；Ｎ８３Ｙ；Ｋ８５Ｒ；Ｄ９７Ｅ；Ｄ１０２Ｅ；Ｐ１０５Ａ；Ｇ１０７Ｅ；Ｒ１０９Ｓ；Ｓ１１４Ｌ；Ｓ１１６Ｄ；Ｌ１１８Ｒ；Ｎ１２０Ｇ；Ｑ１２１Ｓ；Ａ１２２Ｅ；Ｋ１３５Ｒ；Ｔ１４７Ｉ；Ｖ１４８Ｇ；Ｎ１４９Ｅ；Ｇ１５０Ｋ；Ｉ１５１Ｖ；Ｒ１５２Ｈ；Ｈ１５３Ｅ。このリストの中で残基２５と８３だけは２以上の好ましい置換を有し、その他はすべてファミリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩの２つにおいて同じアミノ酸を有する。

アミノ酸配列は、配列番号５７に少なくとも７０％の同一性、たとえば≧７５％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％の同一性を有する。

ポリペプチドは、宿主動物への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘導する能力を有することができ、好ましい実施形態ではＮＭＢ１８７０ファミリーＩ−ＩＩＩの各々の中の株に対して殺菌性である抗体を誘導し得る。殺菌性応答に関するさらなる情報は以下で述べる。

１つの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５７と比較して以下の位置に置換を有する、配列番号５８である：Ｆ１４；Ｔ１６；Ｑ１８；Ｑ２０；Ｄ２１；Ｓ２２；Ｅ２３；Ｈ２４；Ｓ２５；Ｇ２６；Ｋ２７；Ｋ３１；Ｑ３３；Ｒ３５；Ｉ３６；Ｇ３７；Ｋ４８；Ｇ５２；Ｒ５４；Ｔ７２；Ａ７９；Ｎ８３；Ｋ８５；Ｐ１０５；Ｇ１０７；Ｒ１０９；Ｌ１１８；Ｎ１２０；Ｑ１２１；Ａ１２２；Ｔ１４７；Ｖ１４８；Ｎ１４９；Ｇ１５０；Ｉ１５１；Ｒ１５２；Ｈ１５３。残基Ｅ５１は欠失された。
もう１つの置換配列は配列番号５９である。もう１つの置換配列は配列番号６０である。

置換のための表面ループ
配列番号１の表面ループは以下のように同定された：（１）アミノ酸１６４−１６８；（２）アミノ酸１７９−１８２；（３）アミノ酸１８８−１９６；（４）アミノ酸２０３−２０８；（５）アミノ酸２１６−２２４；（６）アミノ酸２３３−２３７；（７）アミノ酸２４７−２５１；および（８）アミノ酸２６２−２６３：

配列番号１を他の何らかのＮＭＢ１８７０配列と整列することにより、当業者はその配列内のループ（１）−（８）の位置を同定することができる。参照しやすいように、しかしながら、ここではループの座標を、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを使用して配列番号１と整列したとき、配列番号１内の上記で定義したループの第一アミノ酸残基に整列されるアミノ酸から始まり、配列番号１内の上記で定義したループの最後のアミノ酸で終了する、ＮＭＢ１８７０配列内の一連のアミノ酸と定義する。

１つのファミリー由来のループ配列の、もう１つのファミリーにおけるループ位置への置換は、多ファミリー抗原性を備えたキメラＮＭＢ１８７０を作製することを可能にする。

そこで本発明は、ＮＭＢ１８７０の第一ファミリーの改変アミノ酸配列を含み、前記改変配列が、第一ファミリー由来の表面ループ配列の代わりにＮＭＢ１８７０の２番目のファミリー由来の少なくとも１つの（たとえば１、２、３、４、５、６または７）表面ループ配列を含む、ポリペプチドを提供する。

本発明はまた、９つの部分にバックボーン配列と８つのループ挿入（バックボーン配列の各々の連続する部分の間に１つ）を含み、ループ配列の少なくとも１つが、バックボーン配列とは異なるＮＭＢ１８７０ファミリーからであるＮＭＢ１８７０配列から取られる、ポリペプチドを提供する。２以上の異なるＮＭＢ１８７０配列からの表面ループを使用することが好ましく、これらのループを１つのバックボーン配列に挿入することが可能である。そこで本発明は、以下のアミノ酸配列：

［式中、
（ａ）前記Ｂ_１、Ｂ_２、Ｂ_３、Ｂ_４、Ｂ_５、Ｂ_６、Ｂ_７、Ｂ_８およびＢ_９の各々は、（ｉ）配列番号Ｍのフラグメント；または（ｉｉ）（ｉ）の前記フラグメントに少なくともｍ％の配列同一性を有するおよび／または（ｉ）の前記フラグメント由来の少なくともｄ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり；
（ｂ）前記Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、Ｌ_７およびＬ_８の各々は、（ｉ）配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のフラグメント；または（ｉｉ）（ｉ）の前記フラグメントに少なくともｎ％の配列同一性を有するおよび／または（ｉ）の前記フラグメント由来の少なくともｅ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、
但し、前記Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、Ｌ_７およびＬ_８の少なくとも１つは配列番号Ｍのフラグメントではないことを条件とする］
を含むポリペプチドを提供する。

本発明はまた、前記ポリペプチドのフラグメントであって、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、Ｌ_７および／またはＬ_８の少なくとも１つおよびＢ_１、Ｂ_２、Ｂ_３、Ｂ_４、Ｂ_５、Ｂ_６、Ｂ_７、Ｂ_８および／またはＢ_９の２またはそれ以上からの少なくとも１つのアミノ酸を含むことを条件とするポリペプチドを提供する。そこで一部の実施形態では、最も小さなフラグメントは、１つのループ、そのループのＮ末端側に１個のアミノ酸およびそのループのＣ末端側に１個のアミノ酸を含む。

Ｍの値は１、２または３から選択され、Ｂ_１、Ｂ_２、Ｂ_３、Ｂ_４、Ｂ_５、Ｂ_６、Ｂ_７、Ｂ_８およびＢ_９およびＬ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、Ｌ_７およびＬ_８の定義はＭの値に依存して異なる。

「配列番号Ｍのフラグメント」の意味は以下の通りである：

同様に、「配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のフラグメント」は以下のように定義される：

たとえば本発明は、アミノ酸配列：

［式中、Ｂ_１は、配列番号１のアミノ酸１−１６３、または前記アミノ酸１−１６３に少なくともｍ％の配列同一性を有するおよび／または前記アミノ酸１−１６３からの少なくともｄ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり；Ｂ_２は、配列番号１のアミノ酸１６９−１７８、または前記アミノ酸１６９−１７８に少なくともｍ％の配列同一性を有するおよび／または前記アミノ酸１６９−１７８からの少なくともｄ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり；．．．；Ｂ_９は、配列番号１のアミノ酸２６４−２７４、または前記アミノ酸２６４−２７４に少なくともｍ％の配列同一性を有するおよび／または前記アミノ酸２６４−２７４からの少なくともｄ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり；Ｌ_１は、配列番号２のアミノ酸１６４−１６８、または前記アミノ酸１６４−１６８に少なくともｎ％の配列同一性を有するおよび／または前記アミノ酸１６４−１６８からの少なくともｅ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり；Ｌ_２は、配列番号２のアミノ酸１７９−１８２、または前記アミノ酸１７９−１８２に少なくともｎ％の配列同一性を有するおよび／または前記アミノ酸１７９−１８２からの少なくともｅ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり；．．．：Ｌ_７は、配列番号３のアミノ酸２６９−２７０、または前記アミノ酸２６９−２７０に少なくともｎ％の配列同一性を有するおよび／または前記アミノ酸２６９−２７０からの少なくともｅ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列である、等々］
を含むポリペプチドを提供する。

ｍの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９またはそれ以上から選択される。ｎの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９またはそれ以上から選択される。ｄの値は、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、１００またはそれ以上から選択される。ｅの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される。ｅの値は、好ましくは２０未満である。

本発明はまた、上記で定義されるキメラアミノ酸配列：

を含み、および前記キメラ配列のＮ末端側またはＣ末端側に、配列番号Ｍと同じＮＭＢ１８７０ファミリーであるＮＭＢ１８７０配列をさらに含むポリペプチドを提供する。それゆえポリペプチドは、（ｉ）特定ファミリー由来のＮＭＢ１８７０および（ｉｉ）同じファミリーからであるが、その表面ループの少なくとも１つが異なるＮＭＢ１８７０ファミリーに置換されているＮＭＢ１８７０の両方を含む。

本発明は、配列番号Ｑにｑ％［ｑの値は少なくともｒである］の全体的配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；配列番号Ｑに対する前記アミノ酸配列の配列同一性は、配列番号Ｑのバックボーン領域ではｑ％以上であり；および配列番号Ｑに対する前記アミノ酸配列の配列同一性は、配列番号Ｑのループ領域でｑ％未満である、ポリペプチドを提供する。ｒの値は、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および９９．５から選択される。

Ｑの値は１、２または３であり、ループ領域とバックボーン領域の境界は上記の表から適宜に選択される（Ｌ_１−Ｌ_８はループであり、Ｂ_１−Ｂ_９はバックボーンである）。

Ｑが１である場合、ループ領域内のアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号３の対応するループ領域にｑ％以上の配列同一性を有し得る。Ｑが２である場合、ループ領域内のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号３の対応するループ領域にｑ％以上の配列同一性を有し得る。Ｑが３である場合、ループ領域内のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２の対応するループ領域にｑ％以上の配列同一性を有し得る。

ハイブリッドおよびタンデムポリペプチド
参考文献１０−１３は、１本のポリペプチド鎖がＮＭＢ１８７０配列および異なる髄膜炎菌ポリペプチド配列を含むハイブリッドポリペプチドを開示する。たとえばＮＭＢ１８７０とＮａｄＡを含むハイブリッドが参考文献１０に開示されている。参考文献１２は、１本のポリペプチド鎖が多数のＮＭＢ１８７０配列、たとえば各ファミリーから１つのＮＭＢ１８７０配列を含む、タンデムポリペプチドと称される、ハイブリッドポリペプチドの特異的サブセットを開示する。本発明は、多くの新しいハイブリッドとタンデムポリペプチドを提供する。

一般に、ハイブリッドポリペプチドは、式：
−Ａ−［Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−
［式中、Ｘはナイセリア属菌配列を含むアミノ酸配列であり、Ｌは選択的リンカーアミノ酸配列であり、Ａは選択的Ｎ末端アミノ酸配列であり、Ｂは選択的Ｃ末端アミノ酸配列であり、およびｎは１より大きい整数である］
によって表わすことができる。

ｎの値は、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上であり得るが、好ましくは２または３である。−Ａ−配列は、好ましくはポリペプチドのＮ末端にあり、−Ｂ−配列は、好ましくはポリペプチドのＣ末端にある。

本発明によれば、−Ｘ−部分の少なくとも１つはＮＭＢ１８７０配列である。−Ｘ−部分としての使用のための好ましいＮＭＢ１８７０配列は、成熟Ｎ末端の近くで認められるポリグリシン配列までで、およびポリグリシン配列を含んで短縮されており、すなわちそれらはΔＧ配列である。配列番号１−３のΔＧ型は、それぞれ配列番号２２−２４である。

Ｘ部分に関して、特にＸ_１以外のものに関しては、天然リーダーペプチドは除外されるべきである。１つの実施形態では、リーダーペプチドは、ハイブリッドポリペプチドのＮ末端に位置する−Ｘ−部分のもの以外は欠失される、すなわちＸ_１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ_２．．．Ｘ_ｎのリーダーペプチドは除外される。これは、すべてのリーダーペプチドを欠失させ、Ｘ_１のリーダーペプチドを−Ａ−部分として使用することに等しい。

［−Ｘ−Ｌ−］の各々のｎの場合に関して、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は存在してもよくまたは存在しなくてもよい。たとえばｎ＝２であるとき、ハイブリッドは、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ等であり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、典型的には短い（たとえば２０またはそれ以下のアミノ酸、すなわち１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例は、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわちＧｌｙ_ｎ［ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上］）、およびヒスチジンタグ（すなわちＨｉｓ_ｎ［ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上］）を含む。他の適切なリンカーアミノ酸配列は当業者に明白である。有用なリンカーは、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成され、それによってクローニングと操作を助ける、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５）であり、Ｇｌｙ_４テトラペプチド（配列番号１６）はもう１つの典型的なポリグリシンリンカーである。もう１つの有用なリンカーは、場合によりＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチド（配列番号１８、ＢａｍＨＩから）またはＧｌｙ−Ｌｙｓジペプチド（配列番号１９、ＨｉｎｄＩＩＩから）が先行し得る、配列番号１７である。

−Ａ−は選択的Ｎ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（たとえば４０またはそれ未満のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例は、タンパク質輸送を指令するリーダー配列、あるいはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（たとえばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓ_ｎ［ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）を含む。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は当業者に明白である。Ｘ_１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、翻訳されたポリペプチドにおいてそのようなメチオニン残基を提供し得る（たとえば−Ａ−は１個のＭｅｔ残基である）。Ｍｅｔは、配列番号１７などのリンカー配列のＮ末端側または短い配列（たとえば配列番号２６）のＮ末端に存在し得る。−Ａ−配列の例は、配列番号２１、２６および４３を含む。

−Ｂ−は選択的Ｃ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（たとえば４０またはそれ未満のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例は、タンパク質輸送を指令する配列、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（たとえばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓ_ｎ［ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上］、たとえば配列番号２０を含む）、またはポリペプチドの安定性を高める配列を含む。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は当業者に明白である。１つの適切な−Ｂ−部分は、配列番号２０の上流のＬｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号４４）がＸｈｏＩ制限部位から生じる、配列番号４１である。

本発明の好ましいハイブリッドポリペプチドでは、Ｘ部分の１つが「タンパク質９３６」配列である。タンパク質９３６は、最初は参考文献３において配列番号２８８４（ここでは配列番号１４）として開示され、この配列のシグナル切断型がここでの配列番号２５である。本発明と共に使用するための「９３６」配列は、（ｉ）配列番号２５に少なくともｚ％の配列同一性を有する配列、および／または（ｉｉ）配列番号２５からの少なくともｆ個連続するアミノ酸のフラグメントを含む配列を包含する。ｚの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９またはそれ以上から選択される。ｆの値は、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、１００、１５０、２００またはそれ以上から選択される。

一部の好ましいハイブリッドポリペプチドは、９３６配列と２つのＮＭＢ１８７０配列を含む。２つのＮＭＢ１８７０配列は、２つの異なるファミリー、たとえばＩとＩＩ、ＩとＩＩＩ、またはＩＩとＩＩＩからである。好ましいハイブリッドは、９３６配列、ファミリーＩのＮＭＢ１８７０配列およびファミリーＩＩのＮＭＢ１８７０配列を含む。９３６は、好ましくはこれら３つの配列の最もＮ末端側である。配列番号２８、２９、３４および３５は、２つの異なるファミリー由来のＮＭＢ１８７０配列のＮ末端側に９３６配列を含むハイブリッドポリペプチドの例である。

たとえばｎ＝２である場合、Ｘ_１は「９３６」配列であり得、Ｘ_２はＮＭＢ１８７０配列であり得る。同様に、ｎ＝３である場合、Ｘ_１は「９３６」配列であり得、Ｘ_２は第一ファミリー由来のＮＭＢ１８７０配列であり得、およびＸ_２は２番目のファミリー由来のＮＭＢ１８７０配列であり得る。

本発明の好ましいタンデムポリペプチドでは、ｎは２または３である。

本発明の１４個の特異的ハイブリッドおよびタンデムポリペプチドを、指針として、以下のように配列番号から構築した配列番号２７−４０として開示する：

さらなる好ましい本発明のハイブリッドおよびタンデムポリペプチドは、ファミリーＩＶ配列を含む。それゆえ少なくとも１つのＸ部分は、（ｉ）配列番号９５に少なくともｖ％の配列同一性を有し得る、および／または（ｉｉ）配列番号９５からの少なくともｖｖ個連続するアミノ酸のフラグメントを含む。ｖの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９またはそれ以上から選択される。ｖｖの値は、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、１００、１５０、２００またはそれ以上から選択される。ファミリーＩＶ配列を含むことにより、２６９ｃｐｘ株に対する血清活性が改善され得る。

ＮＭＢ１８７０のフラグメントおよびドメイン
完全長ＮＭＢ１８７０配列（たとえば配列番号１）を使用するのではなく、本発明は、典型的にはフラグメントを使用する。たとえば成熟Ｎ末端（配列番号１におけるＣｙｓ−２０）の上流のアミノ酸は一般に除外される。好ましくは、ＮＭＢ１８７０のポリグリシン配列までのおよびポリグリシン配列を含むアミノ酸全部が欠失している、すなわち配列番号１のアミノ酸１−２６が欠失している、「ΔＧ」配列が使用される。配列番号２７−４０において、たとえば、上記の表はＮＭＢ１８７０のΔＧ形態（すなわち配列番号２２−２４）が使用されることを示す。

参考文献１３に開示されているように、ＮＭＢ１８７０は、Ａ、ＢおよびＣと称される３つのドメインに分けることができる。成熟プロセシングされたリポタンパク質Ｎ末端がＣｙｓ−２０である、ファミリーＩ配列（配列番号１）を例として挙げると、３つのドメインは（Ａ）１−１１９、（Ｂ）１２０−１８３および（Ｃ）１８４−２７４である：

ドメイン「Ａ」の成熟形態は、そのＣ末端のシステインから、「Ａ_成熟」と呼ばれる。

ＭＣ５８に関しては、ドメインは、「Ａ」＝配列番号４；「Ｂ」＝配列番号５；「Ｃ」＝配列番号６；および「Ａ_成熟」＝配列番号１３である。多数のＮＭＢ１８７０配列が公知であり［たとえば参考文献４、８および１０参照］、標準的な方法を用いて容易に整列できる。そのようなアラインメントにより、当業者は、ＭＣ５８配列における座標との比較によって所与のＮＭＢ１８７０配列内のドメイン「Ａ」（および「Ａ_成熟」）、「Ｂ」および「Ｃ」を同定することができる。参照しやすいように、しかしながら、ドメインを以下のように定義する：
−所与のＮＭＢ１８７０配列内のドメイン「Ａ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを使用して配列番号１と整列したとき、配列番号１のＭｅｔ−１に整列されるアミノ酸から始まり、配列番号１のＬｙｓ−１１９に整列されるアミノ酸で終了する、その配列のフラグメントである。
−所与のＮＭＢ１８７０配列内のドメイン「Ａ_成熟」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを使用して配列番号１と整列したとき、配列番号１のＣｙｓ−２０に整列されるアミノ酸から始まり、配列番号１のＬｙｓ−１１９に整列されるアミノ酸で終了する、その配列のフラグメントである。
−所与のＮＭＢ１８７０配列内のドメイン「Ｂ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを使用して配列番号１と整列したとき、配列番号１のＧｌｎ−１２０に整列されるアミノ酸から始まり、配列番号１のＧｌｙ−１８３に整列されるアミノ酸で終了する、その配列のフラグメントである。
−所与のＮＭＢ１８７０配列内のドメイン「Ｃ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを使用して配列番号１と整列したとき、配列番号１のＬｙｓ−１８４に整列されるアミノ酸から始まり、配列番号１のＧｌｎ−２７４に整列されるアミノ酸で終了する、その配列のフラグメントである。

ドメインを定義するための好ましいペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用する（たとえばＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用して、ギャップオープンペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５で）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのグローバル・アラインメント・アルゴリズム［１４］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ［１５］中のｎｅｅｄｌｅツールで好都合に実施される。

ＮＭＢ１８７０配列は、ここではファミリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩと称する３つのファミリーに分類される［４、１０］。ファミリーＩ−ＩＩＩの原型配列は、それぞれ配列番号１−３である。所与のＮＭＢ１８７０配列についてのファミリーを容易に決定するには、参考文献４の系統発生および樹状図法に従うことができ、３つの原型ＮＭＢ１８７０配列の各々とのペアワイズアラインメントも、最も近いファミリー適合を見出すために使用できる。配列は明確に３つのファミリーに分類され、ファミリーＩとＩＩの間の配列同一性は７４．１％、ファミリーＩとＩＩＩの間では６２．８％、およびファミリーＩＩとＩＩＩの間では８４．７％であり、各々のファミリー内での配列変動性は低い（たとえばファミリーＩ内では最小限９１．６％の同一性、ファミリーＩＩでは９３．４％およびファミリーＩＩＩでは９３．２％）。系統樹分析を必要とせずに配列のファミリーを決定する迅速な方法として、ある配列が、配列番号１に少なくとも８５％の配列同一性を有する場合はファミリーＩに位置づけ、配列番号２に少なくとも８５％の配列同一性を有する場合はファミリーＩＩに位置づけ、配列番号３に少なくとも８５％の配列同一性を有する場合はファミリーＩＩＩに位置づけることができる。

参考文献４の図６のアラインメントに基づき、ＮＭＢ１８７０の３つの原型ファミリー（配列番号１−３）についての例示的ドメインＡ、ＢおよびＣは以下の通りである：

本発明と共に使用するための好ましいドメインは、（ａ）配列番号４−１２の１またはそれ以上に少なくともｘ％の配列同一性を有する、および／または（ａ）配列番号４−１２の１またはそれ以上からの少なくともｙ個の連続アミノ酸配列のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。

ｘの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９またはそれ以上から選択される。ｙの値は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、４５、５０またはそれ以上から選択される。異なるファミリー由来のＮＭＢ１８７０配列を含むポリペプチドにおいて、各ファミリーについてのｘおよびｙの値は同じであるかまたは異なっていてもよい。

ドメイン「Ａ」の配列は、好ましくはａ_１からａ_２までの（両端を含む）アミノ酸長［ａ_１は１１０、１１５、１２０、１２５および１３０から選択され；およびａ_２は１１５、１２０、１２５、１３０および１３５から選択される］である。

ドメイン「Ｂ」の配列は、好ましくはｂ_１からｂ_２までの（両端を含む）アミノ酸長［ｂ_１は５５、６０、６５および７０から選択され；およびｂ_２は６０、６５、７０および７５から選択される］である。

ドメイン「Ｃ」の配列は、好ましくはｃ_１からｃ_２までの（両端を含む）アミノ酸長［ｃ_１は８０、８５、９０、９５および１００から選択され；およびｃ_２は８５、９０、９５、１００および１０５から選択される］である。

所望に応じて、ＮＭＢ１８７０の完全長形態を単一ＮＭＢ１８７０ドメイン（Ａ、ＢまたはＣ）によって、または２つのＮＭＢ１８７０ドメイン（ＡＢ、ＡＣまたはＢＣ）によって置き換えることができる。

ＮＭＢ１８７０の多型
ＮＭＢ１８７０の様々な多型がこれまでに報告されている。新たな配列が同定され、そこで本発明は、配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３および９４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。配列番号９４（参考文献１２の配列番号１４０も参照のこと）は、ファミリーＩとＩＩＩの間での組換えによって生じたと考えられる、ファミリーＩＶ配列の一例である。

ポリペプチド
本発明は、上述した様々なポリペプチドを提供する。

また、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。また、（ａ）配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から成る群より選択されるアミノ酸配列に配列同一性を有する、および／または（ｂ）配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から成る群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含む、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。配列同一性の程度は、好ましくは５０％以上（たとえば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）である。フラグメントは、好ましくは出発配列からの７またはそれ以上の連続アミノ酸（たとえば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上）を含む。

ＮＭＢ１８７０は、天然では髄膜炎菌におけるリポタンパク質である。また大腸菌において発現されるときには脂質化されていることが認められた。本発明のポリペプチドは、脂質化され得る、たとえばパルミトイル基を含む、Ｃ末端システイン残基を有し得る。

本発明の好ましいポリペプチドの特徴は、宿主動物への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘導する能力である。

本発明のポリペプチドは様々な手段によって、たとえば化学合成によって（少なくとも部分的に）、プロテアーゼを使用してより長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物からの精製等によって（たとえば組換え発現からまたは髄膜炎菌培養物から）作製できる。大腸菌宿主における異種発現は好ましい発現経路である（たとえばＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ_３）、ＢＬＲ等において）。

本発明のポリペプチドは、固体支持体に結合または固定化し得る。

本発明のポリペプチドは、検出可能標識、たとえば放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識を含み得る。これは免疫検定手法において特に有用である。

ポリペプチドは様々な形態をとり得る（たとえば天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、ジスルフィド架橋等）。

ポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋または実質的に単離された形態（すなわち他のナイセリア属菌または宿主細胞ポリペプチドを実質的に含まない）または実質的に単離された形態で作製される。一般に、ポリペプチドは非天然に生じる環境において提供される、たとえばそれらは天然に生じる環境から分離される。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、対照と比較してそのポリペプチドが富化された組成物中に存在する。それ自体として、精製ポリペプチドが提供され、精製とは、ポリペプチドが、他の発現ポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、実質的に含まないとは、組成物の９０％未満、通常は６０％未満、より一般的には５０％未満が他の発現ポリペプチドで構成されていることを意味する。

「ポリペプチド」という用語は、何らかの長さのアミノ酸重合体を指す。重合体は鎖状または分枝であり得、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、天然にまたは介入処置によって、たとえばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との複合などの何らかの他の操作または改変によって改変されたアミノ酸重合体を包含する。また、たとえばアミノ酸の１またはそれ以上の類似体（たとえば非天然アミノ酸等を含む）ならびに当技術分野で公知の他の改変を含むポリペプチドもこの定義に包含される。ポリペプチドは一本鎖または結合鎖として生じ得る。

核酸
本発明は、上記で定義した本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、（ａ）前記核酸からの少なくともｎ個の連続ヌクレオチド［ｎは１０またはそれ以上（たとえば１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００またはそれ以上）である］のフラグメント；および／または（ｂ）前記核酸に少なくとも５０％（たとえば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する配列、を含む核酸を提供する。

さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェンシー」条件下で（たとえば０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液中６５℃で）、本発明のポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。

本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（たとえばノーザンまたはサザンブロット法、または核酸マイクロアレイまたは「遺伝子チップ」において）および増幅反応（たとえばＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）および他の核酸手法において使用できる。

本発明の核酸は多くの方法で、たとえば全体または部分的に化学合成によって（たとえばＤＮＡのホスホラミダイト合成）、ヌクレアーゼ（たとえば制限酵素）を使用してより長い核酸を消化することによって、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから、より短い核酸またはヌクレオチドを連結すること（たとえばリガーゼまたはポリメラーゼを使用して）等によって、作製し得る。

本発明の核酸は、様々な形態、たとえば一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識、非標識等の形態をとり得る。

本発明の核酸は、好ましくは単離形態または実質的に単離された形態である。

本発明は、たとえばアンチセンスまたはプロービングのため、またはプライマーとしての使用のための、上述したものに相補的な配列を含む核酸を包含する。

「核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびまた改変骨格を含むもののようなそれらの類似体、およびまたペプチド核酸（ＰＮＡ）等を包含する。

本発明に従った核酸は、たとえば放射性または蛍光標識で標識し得る。これは、核酸を核酸検出手法において使用する場合、たとえば核酸がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等のような手法における使用のためのプライマーまたはプローブである場合、特に有用である。

本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（たとえば核酸免疫に適するもののようなクローニングまたは発現ベクター）およびそのようなベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。

殺菌性応答
本発明の好ましいポリペプチドは、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。殺菌性抗体応答はマウスにおいて好都合に測定され、ワクチン効果の標準的指標である［たとえば参考文献２の巻末注釈１４参照］。本発明のポリペプチドは、好ましくは以下の３つの群の系統の少なくとも２つの各々からの少なくとも１つの髄膜炎株に対して殺菌性である抗体応答を惹起し得る：
（Ｉ）ＭＣ５８、ｇｂ１８５（＝Ｍ０１−２４０１８５）、ｍ４０３０、ｍ２１９７、ｍ２９３７、ｉｓｓ１００１、ＮＺ３９４／９８、６７／００、９３／１１４、ｂｚ１９８、ｍ１３９０、ｎｇｅ２８、ｌｎｐ１７５９２、００−２４１３４１、ｆ６１２４、２０５９００、ｍ１９８／１７２、ｂｚ１３３、ｇｂ１４９（＝Ｍ０１−２４０１４９）、ｎｍ００８、ｎｍ０９２、３０／００、３９／９９、７２／００、９５３３０、ｂｚ１６９、ｂｚ８３、ｃｕ３８５、ｈ４４／７６、ｍ１５９０、ｍ２９３４、ｍ２９６９、ｍ３３７０、ｍ４２１５、ｍ４３１８、ｎ４４／８９、１４８４７。

（ＩＩ）９６１−５９４５、２９９６、９６２１７、３１２２９４、１１３２７、ａ２２、ｇｂ０１３（＝Ｍ０１−２４００１３）、ｅ３２、ｍ１０９０、ｍ４２８７、８６０８００、５９９、９５Ｎ４７７、９０−１８３１１、ｃ１１、ｍ９８６、ｍ２６７１、１０００、ｍ１０９６、ｍ３２７９、ｂｚ２３２、ｄｋ３５３、ｍ３６９７、ｎｇｈ３８、Ｌ９３／４２８６。

（ＩＩＩ）Ｍ１２３９、１６８８９、ｇｂ３５５（＝Ｍ０１−２４０３５５）、ｍ３３６９、ｍ３８１３、ｎｇｐ１６５。
たとえばキメラポリペプチドは、血清群Ｂの髄膜炎株ＭＣ５８、９６１−５９４５およびＭ１２３９の２またはそれ以上に対して有効な殺菌性応答を惹起し得る。

ポリペプチドは、好ましくは臨床的に関連する髄膜炎菌血清群Ｂ株の少なくとも５０％（たとえば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上）に対して殺菌性である抗体応答を惹起し得る。ポリペプチドは、血清群Ｂ髄膜炎菌の株および血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの少なくとも１つ（たとえば１、２、３、４）の株に対して殺菌性である抗体応答を惹起し得る。ポリペプチドは、淋菌および／またはＮ．ｃｉｎｅｒｅａの株に対して殺菌性である抗体応答を惹起し得る。ポリペプチドは、参考文献４の図５に示される系統樹の３つの主枝の少なくとも２つからの株に対して殺菌性である応答を惹起し得る。

ポリペプチドは、超毒性系統ＥＴ−３７、ＥＴ−５、クラスターＡ４、系統３、亜群Ｉ、亜群ＩＩＩ、および亜群ＩＶ−１［１６、１７］の少なくとも２つ（たとえば２、３、４、５、６、７）の中の髄膜炎株に対して殺菌性である抗体応答を惹起し得る。ポリペプチドは、付加的に１またはそれ以上の超侵襲性系統に対する殺菌性抗体応答を誘導し得る。

ポリペプチドは、以下の多座配列型（ＭＬＳＴ）の少なくとも２つ（たとえば２、３、４、５、６、７）の中の髄膜炎株に対して殺菌性である抗体応答を惹起し得る：ＳＴ１、ＳＴ４、ＳＴ５、ＳＴ８、ＳＴ１１、ＳＴ３２およびＳＴ４１［１８］。ポリペプチドはまた、ＳＴ４４株に対して殺菌性である抗体応答を惹起し得る。

ポリペプチドは、指定された系統またはＭＬＳＴ内のありとあらゆるＭｅｎＢ株に対して殺菌性抗体を誘導する必要はない；むしろ、特定超毒性系統またはＭＬＳＴ内の血清群Ｂ髄膜炎菌の４またはそれ以上の株の所与の群に関して、組成物によって誘導される抗体は、好ましくは群の少なくとも５０％（たとえば６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上）に対して殺菌性である。株の好ましい群は、以下の国々の少なくとも４カ国において単離された株を含む：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵ。血清は、好ましくは少なくとも１０２４（たとえば２^１０、２^１１、２^１２、２^１３、２^１４、２^１５、２^１６、２^１７、２^１８またはそれ以上、好ましくは少なくとも２^１４）の殺菌性力価を有する、すなわち血清は、たとえば参考文献２の巻末注釈１４に述べられているように、１：１０２４に希釈したとき特定株の試験細菌の少なくとも５０％を死滅させることができる。好ましいキメラポリペプチドは、血清を１：４０９６またはそれ以上に希釈したときもまだ殺菌性である、マウスにおける抗体応答を惹起することができる。

免疫
本発明のポリペプチドは、好ましくは免疫原性組成物として提供され、本発明は、薬剤としての使用のための本発明の免疫原性組成物を提供する。

本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において抗体応答を惹起するための方法を提供する。抗体応答は、好ましくは防御的および／または殺菌性抗体応答である。

本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、ナイセリア属菌（たとえば髄膜炎菌）感染から哺乳動物を防御するための方法を提供する。

本発明は、薬剤として（たとえば免疫原性組成物としてまたはワクチンとして）または診断試薬としての使用のための本発明のキメラポリペプチドを提供する。本発明はまた、哺乳動物におけるナイセリア属菌（たとえば髄膜炎菌）感染を予防するための薬剤の製造における本発明の核酸、ポリペプチドまたは抗体の使用を提供する。

哺乳動物は、好ましくはヒトである。ヒトは、成人または、好ましくは小児であり得る。ワクチンが予防的用途のためである場合、ヒトは、好ましくは小児（たとえば幼児または乳児）であり；ワクチンが治療的用途のためである場合、ヒトは、好ましくは成人である。小児用のワクチンはまた、たとえば安全性、用量、免疫原性等を評価するために、成人にも投与し得る。

前記使用および方法は、髄膜炎（特に細菌性髄膜炎）および菌血症を含むがこれらに限定されない疾患を予防する／治療するために特に有用である。

治療的処置の効果は、本発明の組成物の投与後にナイセリア属菌感染を観測することによって試験し得る。予防的処置の効果は、組成物の投与後にＮＭＢ１８７０に対する免疫応答を観測することによって試験し得る。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験被験者（たとえば１２−１６ヶ月齢の小児または動物モデル［１９］）に投与し、その後血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準パラメータを測定することによって決定できる。これらの免疫応答は、一般に組成物の投与の約４週間後に測定され、組成物の投与前に測定された値と比較される。ＳＢＡの少なくとも４倍または８倍の上昇が好ましい。組成物が２回以上投与される場合は、投与後の測定を２回以上実施してもよい。

本発明の好ましい組成物は、患者において、ヒト被験者の許容されるパーセンテージについての各々の抗原成分に対する血清保護の判定基準を上回る抗体力価を与えることができる。それ以上であれば宿主が抗原に対して血清転換したとみなされる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、そのような力価はＷＨＯなどの機関によって公表されている。好ましくは被験者の統計的に有意の標本の８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９３％以上、最も好ましくは９６−１００％が血清転換する。

本発明の組成物は、一般に直接患者に投与される。直接送達は、非経口的注射（たとえば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質空隙への）によって、または直腸、経口、膣、局所、経皮、鼻内、眼、耳、肺または他の粘膜投与によって達成され得る。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（たとえば皮下注射針）によってであり得るが、無針注射も選択的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は約０．５ｍｌである。

本発明は、全身および／または粘膜免疫を惹起するために使用され得る。

投与治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。複数回投与は、一次免疫スケジュールにおいておよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用され得る。一次投与スケジュールの後に追加投与スケジュールが続いてもよい。初回免疫の間（たとえば４−１６週間）および初回免疫と追加免疫の間の適切なタイミングは常套的に決定され得る。

本発明の免疫原性組成物は、一般に、それ自体が組成物を受容する患者に対して有害な抗体の産生を誘導しないいかなる物質であってもよく、過度の毒性を伴わずに投与することができる、医薬的に許容される担体を含有する。医薬的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含み得る。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等のような補助物質も、そのようなビヒクル中に存在し得る。適切な担体についての詳細な考察は参考文献２０に述べられている。

ナイセリア属菌感染は身体の様々な領域を侵し、それゆえ本発明の組成物は様々な形態で調製され得る。たとえば組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかで、注射用製剤として調製され得る。注射の前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製できる。組成物は、たとえば軟膏、クリームまたは粉末として、局所投与用に調製され得る。組成物は、たとえば錠剤またはカプセルとして、またはシロップとして（場合により香味料を添加して）、経口投与用に調製され得る。組成物は、微細粉末またはスプレーを使用して、たとえば吸入剤として肺投与用に調製され得る。組成物は、坐薬または膣坐薬として調製され得る。組成物は、たとえば点滴剤として、鼻、耳または眼投与用に調製され得る。

組成物は、好ましくは滅菌である。好ましくは発熱物質不含である。好ましくは、たとえばｐＨ６−ｐＨ８の間に、一般には約ｐＨ７に、緩衝されている。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合は、ヒスチジン緩衝剤を使用することが好ましい［２１］。本発明の組成物は、ヒトに関して等張性であり得る。

免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の免疫原、ならびに必要に応じて他の何らかの特定成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単回投与でまたは一連の投与の一部として、個体へのその量の投与が治療または予防のために有効であることを意味する。この量は、治療する個体の健康および身体的条件、治療する個体の年齢、分類学的グループ（たとえば非ヒト霊長動物、霊長動物等）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの製剤、医学的状況についての治療医師の評価、および他の関連因子に依存して異なる。その量は、常套的治験を通して決定され得る、比較的広い範囲内に属すると予想される。投与治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュール（たとえば追加抗原投与量を含む）であり得る。組成物は他の免疫調節剤と共に投与され得る。

本発明の組成物において使用し得るアジュバントは、以下を含むがこれらに限定されない：
Ａ．無機質含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する無機質含有組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩を含む。本発明は、水酸化物（たとえばオキシ水酸化物）、リン酸塩（たとえばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩等のような無機塩［たとえば参考文献２２の第８および９章参照］、または種々の無機化合物の混合物を含み、それらの化合物は何らかの適切な形態（たとえばゲル、結晶、非晶質等）をとり、吸着性であることが好ましい。無機質含有組成物はまた、金属塩の粒子として製剤され得る［２３］。

リン酸アルミニウムは、特にインフルエンザ菌糖抗原を含む組成物において、特に好ましく、典型的なアジュバントは、０．６ｍｇＡｌ^３＋／ｍｌで含有される、０．８４−０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比の非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムによる吸着、たとえば用量当たりの複合体につきＡｌ^３＋ ５０−１００μｇが使用され得る。組成物中に２以上の複合体が存在する場合、すべての複合体が吸着される必要はない。

Ｂ．油性乳剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する油性乳剤組成物は、ＭＦ５９［参考文献２２の第１０章；参考文献２４も参照のこと］（マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤された、５％スクアレン、０．５％トゥイーン８０および０．５％スパン８５）などのスクアレン−水乳剤を含む。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用し得る。水中油型乳剤アジュバントは本発明に関して有用である。

Ｃ．サポニン製剤［参考文献２２の第２２章］
サポニン製剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用し得る。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花においても認められるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮からのサポニンはアジュバントとして広く研究されてきた。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウの根）から商業的に入手できる。サポニンアジュバント製剤は、ＱＳ２１などの精製製剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質製剤を含む。ＱＳ２１はＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として市販されている。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む、これらの手法を用いた特定精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産の方法は参考文献２５に開示されている。サポニン製剤はまた、コレステロールなどのステロールを含み得る［２６］。

サポニンとコレステロールの組合せは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）［参考文献２２の第２３章］と呼ばれる特有の粒子を形成するために使用できる。ＩＳＣＯＭはまた、典型的にはホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質を含む。何らかの公知のサポニンがＩＳＣＯＭにおいて使用できる。好ましくは、ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌ Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１またはそれ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献２６−２８においてさらに説明されている。場合により、ＩＳＣＯＭは付加的な界面活性剤を含まなくてもよい［２９］。

サポニンに基づくアジュバントの開発の総説は参考文献３０および３１に見出される。

Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子
ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明におけるアジュバントとして使用できる。これらの構造は、一般に、場合によりリン脂質と組み合わせてまたはリン脂質と共に製剤されるウイルスからの１またはそれ以上のタンパク質を含む。それらは一般に非病原性で複製せず、また一般には天然のウイルスゲノムを全く含まない。ウイルスタンパク質は、組換えによって生産され得るかまたはウイルス全体から単離され得る。ビロゾームまたはＶＬＰにおける使用に適するこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質など）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）由来のタンパク質を含む。ＶＬＰは、参考文献３２−３７においてさらに論じられている。ビロゾームは、たとえば参考文献３８でさらに論じられている。

Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明における使用に適するアジュバントは、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、脂質Ａ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化された誘導体などの細菌または微生物誘導体を含む。

ＬＰＳの非毒性誘導体は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４本、５本または６本のアシル化された鎖を有する３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「微小粒子」形態は、参考文献３９に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「微小粒子」は、０．２２μｍの膜を通してろ過滅菌されるのに十分な程度に小さい［３９］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、アミノアルキルグリコサミニドホスフェート誘導体、たとえばＲＣ−５２９などのモノホスホリル脂質Ａミミックを含む［４０、４１］。

脂質Ａ誘導体は、ＯＭ−１７４などの大腸菌からの脂質Ａの誘導体を含む。ＯＭ−１７４は、たとえば、参考文献４２および４３に記述されている。

本発明におけるアジュバントとしての使用に適する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに連結されたメチル化されていないシトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列を包含する。パリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示された。

ＣｐＧは、ホスホロチオエート改変物などのヌクレオチド改変物／類似体を含み、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献４４、４５および４６は、可能な類似体置換、たとえば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント作用は、参考文献４７−５２においてさらに論じられている。

ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどの、ＴＬＲ９に関連し得る［５３］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのようにＴｈ１免疫応答を誘導することに特異的であり得るか、またはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのようにＢ細胞応答を誘導することにより特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献５４−５６で論じられている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。

好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能であるように構築される。場合により、２個のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれらの３’末端で結合して、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。たとえば参考文献５３および５７−５９参照。

細菌のＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用し得る。好ましくは、そのタンパク質は大腸菌（大腸菌易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ菌（「ＣＴ」）、または百日咳菌（「ＰＴ」）由来である。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は参考文献６０に、および非経口アジュバントとしては参考文献６１に述べられている。毒素または類毒素は、好ましくはＡとＢの両方のサブユニットを含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは無毒化突然変異を含む；好ましくは、Ｂサブユニットは突然変異していない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２などの解毒化ＬＴ突然変異体である。アジュバントとしてのＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、参考文献６２−６９に認められる。アミノ酸置換についての数に関する言及は、好ましくは、特にその全体が参照によりここに組み込まれる、参考文献７０に述べられているＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。

Ｆ．ヒト免疫調節剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するヒト免疫調節剤は、インターロイキン（たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７１］等）、インターフェロン（たとえばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインを含む。

Ｇ．生物接着剤および粘膜接着剤
生物接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用し得る。適切な生物接着剤は、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［７３］またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体などの粘膜接着剤を含む。キトサンおよびその誘導体も、本発明におけるアジュバントとして使用し得る［７４］。

Ｈ．微粒子
微粒子も、本発明におけるアジュバントとして使用し得る。生分解性で非毒性である材料（たとえばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等）とポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から形成される微粒子（すなわち、直径〜１００ｎｍから〜１５０μｍ、より好ましくは直径〜２００ｎｍから〜３０μｍ、最も好ましくは直径〜５００ｎｍから〜１０μｍの粒子）が好ましく、場合により負に荷電した表面（たとえばＳＤＳで）または正に荷電した表面（たとえばＣＴＡＢなどの陽イオン界面活性剤で）を有するように処理される。

Ｉ．リポソーム（参考文献２２の第１３および１４章）
アジュバントとしての使用に適するリポソーム製剤の例は、参考文献７５−７７に記載されている。

Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用に適するアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを含む［７８］。そのような製剤はさらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［７９］ならびにオクトキシノールなどの少なくとも１つの付加的な非イオン界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［８０］を包含する。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。

Ｋ．ポリフォスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤は、たとえば参考文献８１および８２に述べられている。

Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するムラミルペプチドの例は、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含む。

Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するイミダゾキノロン化合物の例は、参考文献８３および８４においてさらに記述されている、イミキモドおよびそのホモログ（たとえば「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）を含む。

本発明はまた、上記で同定したアジュバントの１またはそれ以上の態様の組合せを含み得る。たとえば以下のアジュバント組成物が本発明において使用し得る：（１）サポニンと水中油型乳剤［８５］；（２）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（たとえば３ｄＭＰＬ）［８６］；（３）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（たとえば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）［８７］；（５）たとえばＱＳ２１および／または水中油型乳剤と３ｄＭＰＬとの組合せ［８８］；（６）１０％スクアラン、０．４％トゥイーン８０（商標）、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびサブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズされるかまたはより大きな粒径の乳剤を生成するように渦攪拌されたｔｈｒ−ＭＤＰを含有する、ＳＡＦ；（７）２％スクアレン、０．２％トゥイーン８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）から成る群からの１またはそれ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有する、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１またはそれ以上の無機塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＰＭＬなど）。

免疫調節剤として働く他の物質は、参考文献２２の第７章に開示されている。

アルミニウム塩（リン酸アルミニウム、特にヒドロキシリン酸塩、および／または水酸化物、特にオキシ水酸化物）およびＭＦ５９は、非経口的免疫のための好ましいアジュバントである。毒素突然変異体は好ましい粘膜アジュバントである。ＱＳ２１は、単独であるいは１またはそれ以上の他のアジュバント、たとえばアルミニウム塩と組み合わせて使用し得る、ＮＭＢ１８７０のためのもう１つの有用なアジュバントである。

ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）等を含む。

さらなる抗原成分
本発明の組成物はＮＭＢ１８７０配列を含む。組成物が抗原の複合体または定義されていない混合物を含まないことは特に好ましく、たとえば組成物中に外膜小胞を含まないことは好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは異種宿主において組換え発現され、その後精製される。

ＮＭＢ１８７０配列を含むほかに、細菌当たり２以上の抗原を標的するワクチンはエスケープ突然変異体を選択する可能性を低下させるので、本発明の組成物はまた、１またはそれ以上のさらなるナイセリア属菌抗原を含み得る。組成物中に含むためのナイセリア属菌抗原は、以下の１またはそれ以上を含むポリペプチドを包含する：
（ａ）参考文献８９に開示されている４４６個の偶数配列番号（すなわち２、４、６、．．．、８９０、８９２）；
（ｂ）参考文献９０に開示されている４５個の偶数配列番号（すなわち２、４、６、．．．、８８、９０）；
（ｃ）参考文献３に開示されている１６７４個の偶数配列番号２−３０２０、偶数配列番号３０４０−３１１４、およびすべての配列番号３１１５−３２４１；
（ｄ）参考文献２からの２１６０個のアミノ酸配列ＮＭＢ０００１−ＮＭＢ２１６０；
（ｅ）好ましくは組換え発現された、何らかのサブタイプの髄膜炎菌ＰｏｒＡタンパク質；
（ｆ）（ａ）−（ｅ）の変異体、ホモログ、オーソログ、パラログ、突然変異体等；または
（ｇ）髄膜炎菌からの外膜小胞試料［たとえば参考文献１８２参照］。

ナイセリア属菌ポリペプチド抗原に加えて、組成物は、他の疾患または感染に対して免疫するための抗原を含み得る。たとえば組成物は、以下のさらなる抗原の１またはそれ以上を含み得る：
−髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの糖抗原、たとえば血清群Ｃからの参考文献９１に開示されているオリゴ糖または参考文献９３のオリゴ糖。
−肺炎連鎖球菌からの糖抗原［たとえば９４、９５、９６］。
−不活性化ウイルスなどの、Ａ型肝炎ウイルスからの抗原［たとえば９７、９８］。
−表面および／またはコア抗原などの、Ｂ型肝炎ウイルスからの抗原［たとえば９８、９９］。
−ジフテリアトキソイド［たとえば参考文献１００の第３章］などの、ジフテリア抗原、たとえばＣＲＭ_１９７突然変異［たとえば１０１］。
−破傷風トキソイドなどの、破傷風抗原［参考文献１００の第４章］。
−場合によりパータクチンおよび／またはアグルチノーゲン２および３と組み合わせた、百日咳菌からの百日咳菌ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）などの、百日咳菌からの抗原［たとえば参考文献１０２および１０３］。
−インフルエンザ菌Ｂ型からの糖抗原［たとえば９２］。
−ＩＰＶなどのポリオ抗原［たとえば１０４、１０５］。
−麻疹、流行性耳下腺炎および／または風疹抗原［たとえば参考文献１００の第９、１０および１１章］。
−赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質などの、インフルエンザ抗原［たとえば参考文献１００の第１９章］。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからの抗原［たとえば１０６］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からのタンパク質抗原［たとえば１０７、１０８］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からの糖抗原。−化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）からの抗原［たとえば１０８、１０９、１１０］。
−黄色ブドウ球菌からの抗原［たとえば１１１］。

組成物は、これらのさらなる抗原の１またはそれ以上を含み得る。

毒素タンパク質抗原は必要に応じて無毒化され得る（たとえば化学的および／または遺伝学的手段による百日咳菌毒素の無毒化［１０３］）。

ジフテリア抗原を組成物に含める場合は、破傷風抗原および百日咳抗原も同時に含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合は、同時にジフテリアおよび百日咳抗原も同時に含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合は、同時にジフテリアおよび破傷風抗原も同時に含めることが好ましい。ＤＴＰの組合せは、それ故、好ましい。

糖抗原は、好ましくは複合体の形態である。複合体のための担体タンパク質は、以下でより詳細に論じる。

組成物中の抗原は、典型的には各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を惹起するのに十分である。

本発明の免疫原性成分は治療的（すなわち既存の感染を治療するため）または予防的（すなわち将来の感染を防ぐため）に使用し得る。

本発明の免疫原性組成物においてタンパク質抗原を使用する代替策として、抗原をコードする核酸（好ましくは、たとえばプラスミドの形態の、ＤＮＡ）を使用し得る。

本発明の特に好ましい組成物は、（ａ）髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、Ｃおよび（場合により）Ａからの糖抗原；（ｂ）インフルエンザ菌Ｂ型からの糖抗原；および／または（ｃ）肺炎連鎖球菌からの抗原の１つ、２つまたは３つを含む。

髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、Ｃおよび（場合により）Ａ
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹに対する多糖ワクチンは長年にわたって知られてきた。これらのワクチン（ＭＥＮＣＥＶＡＸ ＡＣＷＹ（商標）およびＭＥＮＯＭＵＮＥ（商標））は生物の莢膜多糖に基づいており、それらは青年および成人では有効であるが、小児においては十分な免疫応答を与えず、保護の期間も短く、使用することができない。

これらのワクチンにおける非複合多糖抗原と異なり、最近承認された血清群Ｃワクチン（Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）［１１２，９１］、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）およびＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標））は複合糖を含む。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）は、ＣＲＭ_１９７担体に複合したオリゴ糖抗原を有し、一方ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）は、破傷風トキソイド担体に複合した完全多糖（Ｏ−脱アセチル化）を使用する。Ｍｅｎａｃｔｒａ（商標）ワクチンは、血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡの各々からの複合莢膜糖抗原を含む。

本発明の組成物は、好ましくは、抗原が担体タンパク質に複合しているおよび／またはオリゴ糖である、髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、Ｃおよび（場合により）Ａの１またはそれ以上からの莢膜糖抗原を含む。たとえば組成物は、血清群Ｃ；血清群ＡおよびＣ；血清群Ａ、ＣおよびＷ１３５；血清群Ａ、ＣおよびＹ；血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹから；または血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの４つすべてからの莢膜糖抗原を含み得る。

用量当たりの各髄膜炎菌糖抗原の典型的な量は、１μｇ−２０μｇ、たとえば約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇまたは約１０μｇ（糖として表わされる）である。

混合物が血清群ＡおよびＣの両方からの莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比率（ｗ／ｗ）は１より上であり得る（たとえば２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）。
混合物が血清群Ｙおよび血清群ＣとＷ１３５の一方または両方からの莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比率（ｗ／ｗ）は１より上であり得（たとえば２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）および／またはＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比率（ｗ／ｗ）は１未満であり得る（たとえば１：２、１：３、１：４、１：５またはそれ以下）。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙからの糖についての好ましい比率（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。血清群Ｃ：Ｗ１３５：Ｙからの糖についての好ましい比率（ｗ／ｗ）は、１：１：１；１：１：２；１：１：１；２：１：１；４：２：１；２：１：２；４：１：２；２：２：１；および２：１：１である。各々の糖の実質的に等しい質量を使用することが好ましい。

莢膜糖は一般にオリゴ糖の形態で使用される。これらは、精製莢膜多糖の分画によって（たとえば加水分解によって）好都合に形成され、通常はその後所望サイズのフラグメントの精製が行われる。

多糖の分画は、好ましくは３０未満（たとえば血清群Ａについては１０−２０、好ましくは約１０；血清群Ｗ１３５およびＹについては１５−２５、好ましくは約１５−２０；血清群Ｃについては１２−２２等）のオリゴ糖への最終平均重合度（ＤＰ）を与えるように実施される。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色定量法によって好都合に測定できる［１１３］。

加水分解を実施する場合、加水分解物は、短いオリゴ糖を排除するために選別される［９２］。これは、限外ろ過とそれに続くイオン交換クロマトグラフィーなどの様々な方法で達成され得る。血清群Ａについては約６またはそれ以下の重合度を有するオリゴ糖は排除され、血清群Ｗ１３５およびＹについては約４未満のものは排除される。

好ましいＭｅｎＣ糖抗原は、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）において使用されるように、参考文献１１２に開示されている。

糖抗原は化学修飾し得る。これは、血清群Ａについての加水分解を低減するために特に有用である［１１４；以下参照］。髄膜炎菌糖のＯ−脱アセチル化が実施できる。オリゴ糖に関して、修飾は脱重合の前または後に起こり得る。

本発明の組成物がＭｅｎＡ糖抗原を含む場合、抗原は、好ましくは天然糖上のヒドロキシル基の１またはそれ以上が保護基によって置換された改変糖である［１１４］。この改変は加水分解に対する抵抗性を改善する。

髄膜炎菌莢膜多糖は、典型的には、多糖沈殿（たとえば陽イオン界面活性剤を使用する）、エタノール分画、低温フェノール抽出（タンパク質を除去するため）および超遠心分離（ＬＰＳを除去するため）の工程を含む方法によって作製される［たとえば参考文献１１５］。より好ましい方法は［９３］、しかしながら、多糖沈殿およびそれに続く低級アルコールを使用した沈殿多糖の可溶化を含む。沈殿は、テトラブチルアンモニウムおよびセチルトリメチルアンモニウム塩（たとえば臭化物塩）、臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩などの陽イオン界面活性剤を使用して実施できる。臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）は特に好ましい［１１６］。沈殿した物質の可溶化は、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオール等のような低級アルコールを使用して実施できるが、エタノールがＣＴＡＢ−多糖複合体を可溶化するのに特に適する。エタノールは、好ましくは５０％−９５％の最終濃度（エタノールと水の総含有量に基づく）を与えるように沈殿多糖に添加する。

再可溶化後、夾雑物を除去するために多糖をさらに処理し得る。これは、ごくわずかな汚染でさえも許容されない状況では（たとえばヒトワクチン生産のため）特に重要である。これは、典型的にはろ過、たとえば深層ろ過、活性炭を通したろ過、サイズろ過および／または限外ろ過の１またはそれ以上の工程を含む。夾雑物を除去するためにひとたびろ過されれば、多糖をさらなる処理および／または加工のために沈殿させ得る。これは、陽イオン交換によって（たとえばカルシウムまたはナトリウム塩の添加によって）好都合に実施できる。

精製に代わるものして、完全または部分的合成によって莢膜糖を入手してもよく、たとえばＨｉｂ合成が参考文献１１７に、ＭｅｎＡ合成が参考文献１１８に開示されている。

本発明の組成物は、少なくとも２つの血清群の髄膜炎菌からの莢膜糖を含む。糖は、好ましくは別々に調製され（何らかの分画、複合、改変等を含む）、その後本発明の組成物を与えるために混合される。

組成物が血清群Ａからの莢膜糖を含む場合は、しかしながら、加水分解の潜在的可能性を最小限に抑えるために使用の直前まで血清群Ａの糖を他の糖と組み合わせないことが好ましい。これは、血清群Ａ成分（典型的には適切な賦形剤と共に）を凍結乾燥形態で、および他の血清群成分（同じく適切な賦形剤と共に）を液体形態で保持して、使用時に液体成分を用いて凍結乾燥ＭｅｎＡ成分を再溶解することによって好都合に達成できる。アルミニウム塩アジュバントを使用する場合は、液体ワクチンを含むバイアルにアジュバントを入れ、アジュバントなしでＭｅｎＡ成分を凍結乾燥することが好ましい。

本発明の組成物は、それ故、（ａ）凍結乾燥形態の、髄膜炎菌血清群Ａからの莢膜糖；および（ｂ）液体形態の、組成物からのさらなる抗原、を含むキットから作製され得る。本発明はまた、髄膜炎菌血清群Ａからの凍結乾燥莢膜糖を、液体形態のさらなる抗原と混合することを含む、本発明の組成物を作製するための方法を提供する。

本発明はまた、（ａ）凍結乾燥形態の、髄膜炎菌血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹの２またはそれ以上からの莢膜糖を含む第一容器；および（ｂ）（ｉ）被験者への投与後、その被験者において超毒性系統Ａ４、ＥＴ−５および髄膜炎菌血清群Ｂの系統３の２またはそれ以上（たとえば２または３）に対して殺菌性である抗体応答を誘導することができる組成物、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹの１つからの莢膜糖または前記からの莢膜糖なし、および場合により（ｉｉｉ）髄膜炎菌莢膜糖を含まないさらなる抗原（下記参照）、の液体形態を含む第二容器を含むキットであって、容器（ｂ）の内容物による容器（ａ）の内容物の再溶解が本発明の組成物を与えるキットを提供する。

各々の用量内で、個々の糖抗原の量は一般に１−５０μｇ（糖の質量として測定される）であり、各々約２．５μｇ、５μｇまたは１０μｇが好ましい。 １：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１のＡ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙの重量比に関して、１の数字で表わされる量は、好ましくは約２．５μｇ、５μｇまたは１０μｇである。１：１：１：１比のＡ：Ｃ：Ｗ：Ｙの組成物および糖当たり１０μｇでは、それ故、各用量当たり４０μｇの糖が投与される。好ましい組成物は、用量当たりおよそ以下のμｇの糖を有する：

本発明の好ましい組成物は、用量当たり５０μｇ未満の髄膜炎菌糖を含む。他の好ましい組成物は、用量当たり≦４０μｇの髄膜炎菌糖を含む。他の好ましい組成物は、用量当たり≦３０μｇの髄膜炎菌糖を含む。他の好ましい組成物は、用量当たり≦２５μｇの髄膜炎菌糖を含む。他の好ましい組成物は、用量当たり≦２０μｇの髄膜炎菌糖を含む。他の好ましい組成物は、用量当たり≦１０μｇの髄膜炎菌糖を含むが、理想的には、本発明の組成物は用量当たり少なくとも１０μｇの髄膜炎菌糖を含む。

Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）およびＮｅｉｓＶａｃ（商標）ＭｅｎＣ複合体は水酸化物アジュバントを使用しているが、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）はリン酸塩を使用している。本発明の組成物では、一部の抗原を水酸化アルミニウムに吸着させるが、他の抗原をリン酸アルミニウムに結合することが可能である。四価の血清群の組合せに関しては、たとえば、以下の置換が使用可能である：

三価の髄膜炎菌血清群の組合せに関しては、以下の置換が使用可能である：

インフルエンザ菌Ｂ型
組成物がインフルエンザ菌Ｂ型抗原を含む場合、典型的にはＨｉｂ莢膜糖抗原である。インフルエンザ菌Ｂ型からの糖抗原は周知である。

好都合には、Ｈｉｂ糖は、特に小児において、その免疫原性を増強するために担体タンパク質に共有結合される。一般に多糖コンジュゲートの作製、特にＨｉｂ莢膜多糖の作製は広く文書化されている［たとえば参考文献１１９−１２７等］。本発明はいかなる適切なＨｉｂコンジュゲートも使用し得る。適切な担体タンパク質は以下に述べられており、Ｈｉｂ糖についての好ましい担体は、ＣＲＭ_１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風トキソイド（「ＰＲＰ−Ｔ」）および髄膜炎菌の外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。

コンジュゲートの糖部分は多糖（たとえば完全長ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ））であり得るが、オリゴ糖（たとえば分子量〜１から〜５ｋＤａ）を形成するために多糖を加水分解することが好ましい。

好ましいコンジュゲートは、アジピン酸リンカーによってＣＲＭ_１９７に共有結合されたＨｉｂオリゴ糖を含む［１２８、１２９］。破傷風トキソイドも好ましい担体である。

本発明の組成物は、２以上のＨｉｂ抗原を含み得る。

組成物がＨｉｂ糖抗原を含む場合、水酸化アルミニウムアジュバントを同時に含まないことが好ましい。組成物がリン酸アルミニウムアジュバントを含む場合、Ｈｉｂ抗原はアジュバントに吸着され得るか［１３０］または吸着されなくてもよい［１３１］。

Ｈｉｂ抗原は、たとえば髄膜炎菌抗原と共に、凍結乾燥され得る。

肺炎連鎖球菌
組成物が肺炎連鎖球菌の抗原を含む場合、典型的には、好ましくは担体タンパク質に複合された、莢膜糖抗原である［たとえば参考文献９４−９６］。２以上の血清型の肺炎連鎖球菌からの糖を含むことが好ましい。たとえば５−１１の異なる血清型からの多糖を含む複合ワクチンのように［１３２］、２３の異なる血清型からの多糖の混合物が広く使用されている。たとえばＰｒｅｖＮａｒ（商標）［１３３］は、７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、 １８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）からの抗原を含み、各々の糖は還元的アミノ化によって個別にＣＲＭ_１９７に複合されており、０．５ｍｌ用量につき各々の糖２μｇ（血清型６Ｂ ４μｇ）を含み、コンジュゲートはリン酸アルミニウムアジュバント上に吸着されている。本発明の組成物は、好ましくは少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆを含む。コンジュゲートはリン酸アルミニウム上に吸着され得る。

肺炎球菌からの糖抗原を使用することの代替策として、組成物は１又はそれ以上のポリペプチド抗原を含み得る。肺炎球菌のいくつかの株についてのゲノム配列が使用可能であり［１３４、１３５］、適切なポリペプチド抗原を同定するために逆ワクチン学［１３６−１３９］に供することができる［１４０、１４１］。たとえば組成物は、参考文献１４２に定義されている、以下の抗原：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐｌ２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐｌ２８およびＳｐｌ３０の１又はそれ以上を含み得る。

一部の実施形態では、組成物は、肺炎球菌からの糖およびポリペプチド抗原の両方を含み得る。これらは単純な混合物として使用し得るか、または肺炎球菌糖抗原を肺炎球菌タンパク質に複合し得る。そのような実施形態のための適切な担体タンパク質は、以下の項に列挙する抗原を含む［１４２］。

肺炎球菌抗原は、たとえば髄膜炎菌および／またはＨｉｂ抗原と共に凍結乾燥し得る。

共有結合
本発明の組成物中の莢膜糖は、通常は担体タンパク質に複合される。一般に、複合は、糖をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換するので、糖の免疫原性を増強し、それゆえ免疫記憶のための感作を可能にする。複合は、小児ワクチンのために特に有用であり、周知の手法である［たとえば参考文献１４３および１１９−１２７に総説されている］。

好ましい担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの細菌毒素またはトキソイドである。ＣＲＭ_１９７突然変異型ジフテリア毒素［１４４、１４５、１４６］は特に好ましい。他の適切な担体タンパク質は、髄膜炎菌外膜タンパク質［１４７］、合成ペプチド［１４８、１４９］、熱ショックタンパク質［１５０、１５１］、百日咳菌タンパク質［１５２、１５３］、インフルエンザ菌からのプロテインＤ［１５４、１５５］、サイトカイン［１５６］、リンホカイン［１５６］、様々な病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１５７］、連鎖球菌タンパク質、ホルモン［１５６］、増殖因子［１５６］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［１５８］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからの毒素ＡまたはＢ［１５９］、鉄取り込みタンパク質［１６０］等を含む。好ましい担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

本発明の組成物内で、たとえば担体抑制の危険性を低下させるために、２以上の担体タンパク質を使用することが可能である。それゆえ種々の担体タンパク質が種々の血清群のために使用でき、たとえば血清群Ａの糖はＣＲＭ_１９７に複合し得るが、血清群Ｃの糖は破傷風トキソイドに複合し得る。特定糖抗原のために２以上の担体タンパク質を使用することも可能であり、たとえば血清群Ａの糖は、一部がＣＲＭ_１９７に複合し、その他が破傷風トキソイドに複合している２つの群であり得る。一般に、しかしながら、すべての糖について同じ担体タンパク質を使用することが好ましい。

単一担体タンパク質は２以上の糖抗原を担持し得る［１６１］。たとえば単一担体タンパク質は、血清群ＡおよびＣからの糖を自らに複合させ得る。この目標を達成するために、複合反応の前に糖を混合することができる。一般に、しかしながら、各血清群について別々のコンジュゲートを有することが好ましい。
１：５（すなわちタンパク質過剰）から５：１（すなわち糖過剰）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が好ましい。１：２から５：１の間の比率が好ましく、１：１．２５から１：２．５の間の比率がより好ましい。ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについては担体タンパク質過剰が好ましい。

コンジュゲートは、遊離担体タンパク質と共に使用し得る［１６２］。所与の担体タンパク質が本発明の組成物中に遊離形態と複合形態の両方で存在するとき、非複合形態は、好ましくは全体として組成物中の担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２重量％以下で存在する。

いかなる適切な複合反応も、必要に応じて適切なリンカーと共に、使用できる。

糖は、典型的には複合の前に活性化または官能基化される。活性化は、たとえば、ＣＤＡＰ（たとえば１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［１６３、１６４等］などのシアニル化試薬を含み得る。他の適切な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する；参考文献１２５の緒言も参照のこと。

リンカー基による結合は、何らかの公知の手順、たとえば参考文献１６５および１６６に述べられている手順を使用して実施し得る。１つの型の結合は、多糖の還元的アミノ化、生じたアミノ基とアジピン酸リンカー基の一方の末端とのカップリング、およびその後アジピン酸リンカー基の他方の末端へのタンパク質のカップリングを含む［１２３、１６７、１６８］。他のリンカーは、Ｂ−プロピオンアミド［１６９］、ニトロフェニル−エチルアミン［１７０］、ハロゲン化ハロアシル［１７１］、グリコシド結合［１７２］、６−アミノカプロン酸［１７３］、ＡＤＨ［１７４］、Ｃ_４−Ｃ_１２部分［１７５］等を含む。リンカーを使用する代わりに、直接結合が使用できる。タンパク質への直接結合は、多糖の酸化およびそれに続いて、たとえば参考文献１７６および１７７に述べられているような、タンパク質による還元的アミノ化を含み得る。

糖へのアミノ基の導入（たとえば末端＝Ｏ基を−ＮＨ_２で置換することによる）およびそれに続くアジピン酸ジエステル（たとえばアジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化および担体タンパク質との反応を含む工程が好ましい。もう１つの好ましい反応は、たとえばＭｅｎＡまたはＭｅｎＣに関して、プロテインＤ担体によるＣＤＡＰの活性化を使用する。

複合後、遊離糖と複合糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、接線限外ろ過、ダイアフィルトレーション等を含む、多くの適切な方法がある［参考文献１７８および１７９等も参照のこと］。

本発明の組成物が複合オリゴ糖を含む場合、オリゴ糖の作製が複合に先行することが好ましい。

外膜小胞
本発明の組成物は、ＯＭＶの典型的特徴である、抗原の複雑なまたは定義されない混合物を含まないことが好ましい。しかし、ＮＭＢ１８７０は、特にＯＭＶ作製のために使用される株において本発明のポリペプチドを過剰発現することにより、それらの効果を増強することが認められたので［６］、本発明はＯＭＶと共に使用できる。

このアプローチは、一般に、髄膜炎菌血清群Ｂの微小胞［１８０］、「天然ＯＭＶ」［１８１］、ブレブまたは外膜小胞［たとえば参考文献１８２−１８７等］の作製を改善するために使用し得る。これらは、たとえば免疫原性を高めるため（たとえば超発現免疫原）、毒性を低下させるため、鞘膜多糖合成を阻害するため、ＰｏｒＡ発現を下方調節する等のために遺伝子操作された細菌から作製され得る［１８８−１９１］。それらは過剰ブレブ形成株から作製され得る［１９２−１９５］。非病原性ナイセリア属菌からの小胞が含まれ得る［１９６］。ＯＭＶは界面活性剤を使用せずに作製され得る［１９７、１９８］。それらは、表面に非ナイセリア属菌タンパク質を発現し得る［１９９］。それらはＬＰＳ欠損であり得る。それらは組換え抗原と混合され得る［１８２、２００］。種々のクラスＩ外膜タンパク質サブタイプを有する細菌からの小胞、たとえば各々３つのサブタイプを示す２つの異なる遺伝子操作された小胞集団を使用する６つの異なるサブタイプ［２０１、２０２］、または各々３つのサブタイプを示す３つの異なる遺伝子操作された小胞集団を使用する９つの異なるサブタイプ等を使用し得る。有用なサブタイプは、Ｐｌ．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１、１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１；Ｐ１．１８−１，３，６を含む。

タンパク質発現
細菌発現の手法は当技術分野において公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して、コード配列（たとえば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’側）転写を開始することができるＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常はコード配列の５’末端に近接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、ＲＮＡ合成が開始される隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位にオーバーラップし得る、オペレーターと呼ばれる２番目のドメインを有し得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し、それによって特定遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーターは負に調節された（誘導的）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターなどの負の調節エレメントの不在下で起こり得る。加えて、正の調節は、存在する場合は通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に近接する（５’側）、遺伝子活性化タンパク質結合配列によって達成され得る。遺伝子活性化タンパク質の一例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｌａｃオペロンの転写を開始するのを助ける、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）である［Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。調節される発現は、それ故正または負のいずれかであり得、それによって転写を増強または低減し得る。

代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６］およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列を含む。さらなる例は、トリプトファン（ｔｒｐ）［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；欧州特許出願第００３６７７６号および同第０１２１７７５号］などの生合成酵素に由来するプロモーター配列を含む。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）“Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．”Ｉｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編集）］、バクテリオファージλＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８］およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する。興味深いもう１つのプロモーターは、誘導的アラビノースプロモーター（ｐＢＡＤ）である。

加えて、天然では生じない合成プロモーターも、細菌プロモーターとして機能する。たとえば、１つの細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列に連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを創製し得る［米国特許第４，５５１，４３３号］。たとえばｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターおよびｌａｃリプレッサーによって調節されるｌａｃオペロン配列の両方から成るハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に生じるプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に生じるプロモーターはまた、原核生物において一部の遺伝子の高レベル発現を生じさせるための適合性ＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合プロモーター系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］。加えて、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよび大腸菌オペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ特許出願第０２６７８５１号）。

機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位も、原核生物における外来遺伝子の発現のために有用である。大腸菌では、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含む。ＳＤ配列は、ＳＤ配列と大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基対合により、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．”Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編集）］。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させること［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．”Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ］。

プロモーター配列はＤＮＡ分子に直接連結され得、その場合、Ｎ末端の第一アミノ酸は常に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望する場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによってまたは細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロでのインキュベーションによってタンパク質から切断され得る（欧州特許出願第０２１９２３７号）。

通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終結コドンの３’側に位置する調節領域であり、それ故プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指令する。転写終結配列は、しばしば、転写を終結するのを助けるステムループ構造を形成することができる約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例は、大腸菌におけるｔｒｐ遺伝子ならびに他の生合成遺伝子などの、強力なプロモーターを有する遺伝子由来の転写終結配列を含む。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望する場合）、対象コード配列および転写終結配列を含む、上述した成分は、発現構築物へと組み立てられる。発現構築物はしばしば、細菌などの宿主で安定に維持され得る染色体外エレメント（たとえばプラスミド）のような、レプリコンにおいて維持される。レプリコンは複製システムを有しており、それ故発現のためまたはクローニングと増幅のためにレプリコンが原核生物宿主において維持されることを可能にする。加えて、レプリコンは高コピー数または低コピー数のプラスミドであり得る。高コピー数プラスミドは一般に、約５−約２００、通常は約１０−約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含む。高コピー数または低コピー数のいずれかのベクターが、宿主へのベクターおよび外来タンパク質の作用に依存して選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターと共に細菌ゲノムに組み込まれ得る。組込みベクターは、通常、ベクターを組み込むことを可能にする細菌染色体に相同な少なくとも１つの配列を含む。組込みは、ベクターと細菌染色体における相同なＤＮＡの間での組換えから生じると思われる。たとえば様々なバチルス属株由来のＤＮＡで構築された組込みベクターは、バチルス属菌染色体に組み込まれる（欧州特許出願第０１２７３２８号）。組込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。

通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された細株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーは細菌宿主において発現され得、細菌をアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリンなどの薬剤に対して耐性にする遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９］。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるような生合成遺伝子を含み得る。

あるいは、上述した成分の一部は形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上述したようにレプリコンにおいて維持されるかまたは組込みベクターへと開発される選択マーカーから成る。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかである、発現および形質転換ベクターは、多くの細菌への形質転換のために開発された。たとえば発現ベクターは、中でも特に、以下の細菌のために開発された：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許出願第０３６２５９号および同第０６３９５３号；国際公開広報第８４／０４５４１号］、大腸菌［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；欧州特許出願第００３６７７６号、同第０１３６８２９号および同第０１３６９０７号］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第４，７４５，０５６号］。

外因性ＤＮＡを細菌宿主に導入する方法は当技術分野において周知であり、通常はＣａＣｌ_２または二価カチオンおよびＤＭＳＯなどの他の薬剤で処理した細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、電気穿孔法によって細菌細胞に導入することができる。形質転換手順は通常、形質転換する細菌種によって異なる。たとえば［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許出願第０３６２５９号および同第０６３９５３号；国際公開広報第８４／０４５４１号、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）“Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．Ｂｏｙｅｒ ａｎｄ Ｓ． Ｎｉｃｏｓｉａ編集）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］、［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ａｎｄ Ｒ． Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編集）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］参照。

総則
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、たとえばＸを「含む」組成物は、独占的にＸだけから成ってもよく、または付加的な何か、たとえばＸ＋Ｙを包含してもよい。

数値ｘに関する「約」という用語は、たとえばｘ±１０％を意味する。

「実質的に」という語は、「完全に」を排除せず、たとえばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という語は本発明の定義から削除され得る。

「配列同一性」は、好ましくは、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝ｌのパラメータでアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムによって決定される。

血清群の後、髄膜炎菌分類は、血清型、血清亜型および次に免疫型、および標準命名法リストの血清群、血清型、血清亜型および免疫型を含み、各々コロンによって分けられ、たとえばＢ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９。血清群Ｂ内で、一部の系統は他の系統より頻繁に疾患を引き起こし（超侵襲性）、一部の系統は他の系統より重症形態の疾患を引き起こし（超毒性）、およびまた別の系統はまれにしか疾患を引き起こさない。７つの超毒性系統が認められており、すなわちサブグループＩ、ＩＩＩおよびＩＶ−Ｉ、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスターおよび系統３である。これらは多座位酵素電気泳動 （ＭＬＥＥ）によって定義されたが、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）も髄膜炎菌を分類するために使用されてきた［参考文献１８］。４つの主要な超毒性クラスターは、ＳＴ３２、ＳＴ４４、ＳＴ８およびＳＴ１１複合体である。

一般に、本発明は、参考文献４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３および２０に特定して開示されている様々なＮＭＢ１８７０配列を含まないが、これらのＮＭＢ１８７０配列は、たとえばキメラ配列の構築等のために、本発明に従って使用され得る。

（発明を実施するための形態）
置換
配列番号５９は、ファミリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩからのＮＭＢ１８７０のキメラとして参考文献１３に開示されている。このポリペプチドは、以下で同定される、配列番号１の７つの領域における置換によって誘導される：

このキメラは、各々のＮＭＢ１８７０ファミリー由来の髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体を惹起したが、ファミリーＩＩおよびファミリーＩＩＩに対する応答は一貫して高くなかった。

ファミリーＩポリペプチドのＢＣドメインのＮＭＲから導かれる３Ｄ構造を含む、様々なアプローチを組み合わせることにより、発明者らは、残基１６２−１６８（２番目の下線領域）が髄膜炎菌ＭＣ５８（ファミリーＩ）と２９９６（ファミリーＩＩ）の間で保存されるアミノ酸のパッチによって取り囲まれていることを見出した。それ故置換はＭＣ５８ポリペプチドの表面に広汎な２９９６様領域を作り出し、それは、なぜこの置換を含むキメラがファミリーＩＩ株に対して殺菌性応答を惹起し得るかを説明することができた。

３番目の下線領域における置換（ＡｌａＧｌｙの代わりにＰｒｏＡｓｎ）は、おそらく、ポリペプチドの折りたたみを変化させる高度の剛性および低い殺菌活性を導入する、局所的骨格構造を変化させたと考えられる。

（ｉ）ファミリーＩＩ内での配列アラインメント、および（ｉｉ）ファミリー内の血清交差反応性の比較に基づき、良好な抗ＩＩ応答を惹起するキメラの能力を改善し得る多くのアミノ酸残基が同定された。これらの残基は、（ａ）ＮＭＲ構造に基づき、表面露出性で、それゆえ免疫アクセス可能であり；（ｂ）抗２９９６血清によって死滅しなかったファミリーＩＩ株内で保存されており；および（ｃ）タンパク質の疎水性ポケット内ではない。配列番号２に従って番号付けると、これらの残基は、Ｄ１２１；Ｄ１６５；Ａ１８０；Ｇ１８１；Ｋ１８３；Ｔ１８５；Ｔ１８７；Ａ１９１；Ａ１９２；Ｈ１９６；Ｋ１９８；Ａ２１３；Ｓ２３４；およびＧ２６１であった。Ｄ１２１およびＤ１６５を除き、これらの残基の各々は、２９９６配列に対して惹起される抗血清に抵抗性であるこれらの株において保存されていた。Ｄ１２１は３つの株の１つでＮであり、Ｄ１６５は３つの株の２つにおいてＳである。

そこで配列番号５７を、完全長ＮＭＢ１８７０配列の一部として存在する、配列番号６０を与えるように変化させた。

配列番号５７内のＫＬＰＥＧＧＲ ７量体配列（配列番号６１）をＱＬＰＤＧＫ ６量体（配列番号６２）で置換した。それ故１個のアミノ酸が欠失される。これら２つの配列をどのように整列するかに依存して、欠失される残基はＥ５１、Ｇ５２、Ｇ５３またはＲ５４と同定できる。最終的結果は、名目上どの残基が欠失すると言われるかには依存せず、参考文献４におけるアラインメントに基づき、欠失される残基はＥ５１として最も良好に表わされる。

タンデムポリペプチド
参考文献１２に述べられているように、３つのＮＭＢ１８７０ファミリーすべてのトリプルタンデムを、３つのファミリーをＮ末端からＣ末端にＩ−ＩＩＩ−ＩＩの順序で並べて作製した。Ｃ末端ヒスチジンタグを伴ってまたは伴わずに、このポリペプチドは、ファミリーＩおよびＩＩＩのＮＭＢ１８７０を有する髄膜炎菌に対して優れた免疫応答を惹起した（血清殺菌力価≧１：１２８が、試験した株の１００％に対して典型的に認められた）が、ＮＭＢ１８７０ファミリーＩＩの株に対する応答はより弱かった（≧１：１２８の力価は、試験株の６０％に対して典型的に認められた）。特に、３つの別々のタンパク質の混合物を使用したときよりもタンデムポリペプチドを使用したときに応答がより低かった。これに対し、ＩＩ−ＩＩＩタンデムは良好な結果を与え、それ故ファミリーＩＩ配列はタンデム発現アプローチと本質的に不適合というわけではない。

ファミリーＩおよびＩＩに対する応答は重要であるが、ファミリーＩＩＩ株は比較的まれである。ファミリーＩＩ株に対する効果を改善するため、ここで３つのアプローチを使用した：（ａ）ファミリーの順序をＩ−ＩＩ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＩＩ−ＩまたはＩＩ−Ｉ−ＩＩＩに変更した；（ｂ）ファミリーＩＩＩ配列を除外し、ファミリーＩおよびＩＩをＩ−ＩＩまたはＩＩ−Ｉのいずれかとして発現させた；または（ｃ）ファミリーＩおよびＩＩを９３６−Ｉ−ＩＩまたは９３６−ＩＩ−Ｉのいずれかとして「タンパク質９３６配列」の下流で発現させた。これらのポリペプチドを様々なリンカー、リーダー等と共に、および／またはＣ末端ポリ−Ｈｉｓタグを伴ってまたは伴わずに発現させた。

これらの３つのアプローチの実施形態を配列番号２７−３８として示す：

これらのタンパク質を、マウスを免疫するために使用した。フロイント完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ＭＦ５９水中油型乳剤、およびＭＦ５９と免疫刺激性オリゴヌクレオチドの混合物を含む、種々のアジュバントを試験した。マウスの血清を殺菌性アッセイにおいて試験した。

一般に、配列番号２８と２９は等しく有効であった。配列番号３４は、時として配列番号２８より良好な活性を示した。３つのファミリー全部を含むタンパク質について、最も良好な結果は一般に配列番号３７に関して認められた。

ファミリーＩＩ配列
ＮＭＢ１８７０ファミリーＩＩの５つの異なる株：Ｍ３１５３、Ｍ００−０２４３１４３；１０００、ＮＧＨ３８およびＭ０５７９を選択した。ｐＥＴ大腸菌発現ベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入するためのフラグメントを増幅するために以下のプライマーを使用した。配列はΔＧ配列として増幅した；「キメラΔＧ」配列において、プライマーはＮ末端に配列番号６６を付加した。正プライマーはＮｄｅＩ部位を提供した；逆プライマーはＸｈｏＩ部位を提供した。

新たなＮＭＢ１８７０配列
ＮＭＢ１８７０についての広汎な配列情報が入手可能である［たとえば参考文献４、７、８および１０］。さらなる新しいＮＭＢ１８７０配列が見出された。これらの配列は、配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、６３、６４、６５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３および９４である。

種々のＮＭＢ１８７０タンパク質に対して惹起した血清をＮＭ１１７株に対して試験した。殺菌活性は、同種血清に関するよりもファミリーＩ、ＩＩまたはＩＩＩのタンパク質に対して惹起した血清の方がより低かった。同様に、ＮＭ１１７配列に対して惹起した血清は、ＮＭＢ１８７０ファミリーＩ、ＩＩまたはＩＩＩの株に対して比較的低いＳＢＡ活性を有していた。

本発明は、例示としてのみ上記で説明されており、本発明の範囲と精神から逸脱することなく修正を行い得ることは了解される。

参考文献（その内容は全体が参照によりここに組み込まれる）

配列表の簡単な説明

Claims (1)

1. 明細書中に記載の発明。