ES2562259T3

ES2562259T3 - Polipéptidos híbridos que incluyen secuencias fHBP meningocócicas

Info

Publication number: ES2562259T3
Application number: ES10765842.9T
Authority: ES
Inventors: Mariagrazia Pizza; Maria Scarselli; Rino Rappuoli; Marzia Monica Giuliani; Maria Arico
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2016-03-03
Anticipated expiration: 2030-08-27
Also published as: WO2011024072A2; CN102596240A; AU2010288240A1; AU2010288240B2; CN104650241A; NZ598458A; EP3017828A1; CA2772104A1; WO2011024072A3; JP2015110653A; NZ622048A; EP2470204A2; US20110076300A1; EP2470204B1; JP2013502918A; CN102596240B; BR112012004275A2

Abstract

Un polipéptido que comprende una primera secuencia de aminoácidos inmunogénica y una segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica, en el que la primera secuencia de aminoácidos inmunogénica es la SEC ID NO 23.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos híbridos que incluyen secuencias fHBP meningocócicas.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la inmunización y, en particular, la inmunización contra enfermedades causadas por bacterias patogénicas en el género Neisseria, tales como N. meningitidis 5 (meningococo).

Antecedentes de la técnica

Neisseria meningitidis es un patógeno bacteriano Gram negativo encapsulada. Aunque hay vacunas de polisacárido y conjugados disponibles contra los serogrupos A, C, W 135 e Y, este enfoque no puede ser aplicado al serogrupo B ya que el polisacárido capsular es un polímero de ácido polisiálico, que es un auto-antígeno en 10 seres humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serogrupo B, se han usado vesículas de membrana externa (VME). Estas vacunas generan respuestas de los anticuerpos bactericidas del suero y protegen contra la enfermedad, pero fallan al inducir protección de cepa cruzada [1]. Por lo tanto, algunos trabajadores se están centrando en antígenos meningocócicos específicos para su uso en vacunas (2].

Uno de tales antígenos es la proteína de unión a factor H meningocócica (fHBP), conocida también como proteína 15 "741", [SEC IDs 2535 & 2536 en ref. 3; SEC ID 1 en la presente memoria], "NMB1870" [refs. 4-6, después de ref. 2], "P2086”, "LP2086" u "ORF2086" [7-9]. Esta lipoproteína se expresa en todos los grupos meningocócicos y se ha encontrado en múltiples cepas. Las secuencias fHBP se han agrupado en tres familias [4] (denominadas en la presente memoria familias I, II y III), y el suero generado contra una familia determinada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras familias, es decir, hay una 20 protección cruzada intra-familiar, pero no inter-familiar.

Por lo tanto, para conseguir protección de cepa cruzada usando fHBP se usa más de una familia. Para evitar la necesidad de expresar y purificar proteínas separadas, se ha propuesto expresar diferentes familias como proteínas híbridas [10-12], incluyendo dos o tres de las familias en una única cadena polipeptídica. Las referencias 13 y 14 describen diversos enfoques basados en mutagénesis para modificar secuencias fHBP para 25 aumentar su cobertura en las familias I, II y III. La referencia 15 describe diversas formas adicionales de fBP que se modifican para mejorar la cobertura inter-familiar.

Un objeto de la invención es proporcionar enfoques adicionales y mejorados para superar la especificidad familiar de la protección proporcionada por fHBP, y usar estos enfoques para proporcionar inmunidad contra enfermedad y/o infección meningocócica, particularmente para el serogrupo B. 30

Divulgación de la invención

La fHBP de longitud completa tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 1) en la cepa MC58:

imagen1

35

<

La lipoproteína madura carece de los primeros 19 aminoácidos de la SEC ID NO: 1, y la forma ΔG de fHBP carece de los primeros 26 aminoácidos.

La secuencia MC58 (SEC ID NO: 1) está en la familia fHBP. Los anticuerpos generados usando la secuencia 40 MC58 tienen una alta actividad bactericida contra la cepa MC58, pero tienen una actividad mucho más baja contra las cepas que expresan una familia II o III fHBP. En algunas realizaciones, la invención se refiere a formas modificadas de fHBP, en las que la modificación o modificaciones mejoran la capacidad de la proteína para generar anticuerpos bactericidas de familias cruzadas. En otras realizaciones la invención se refiere a proteínas de fusión en las que una forma modificada de fHBP es fusionada a una segunda secuencia de aminoácidos, por 45 ejemplo a otro inmunógeno o a otra fHBP (incluyendo una fHBP modificada).

La invención proporciona un polipéptido que comprende una primera secuencia de aminoácidos inmunogénica y una segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica. En algunas realizaciones, las secuencias de aminoácidos primera y segunda pueden ser la misma; en otras realizaciones, son diferentes entre sí. Las segundas secuencias de aminoácidos inmunogénicas adecuadas se describen más detalladamente a continuación e incluyen, pero no 50

se limitan a: (a) antígenos no meningocócicos; (b) antígenos meningocócicos no fHBP; (c) antígenos meningocócicos fHBP de tipo salvaje; y (d) antígenos meningocócicos fHBP modificados, que pueden ser la misma o diferentes que la primera secuencia de aminoácidos inmunogénica. Las secuencias primera y segunda pueden estar dispuestas en cualquier orden desde el terminal N al terminal C.

De esta manera, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos 5 seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID Nos: 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 y 138.

Estos diversos polipéptidos tienen la habilidad de generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un animal huésped y, en realizaciones preferentes, pueden generar anticuerpos que son 10 bactericidas contra cepas en cada una de las tres familias I a III de fHBP. Más adelante se proporciona información adicional acerca de las respuestas bactericidas.

Segundas secuencias de aminoácidos inmunogénicas

Un polipéptido de la invención incluye una segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica. Pueden usarse varias de dichas segundas secuencias. 15

La segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica puede comprender un antígeno no meningocócico. Este será preferiblemente de un patógeno no-meningocócico, tal como una bacteria o un virus. Por ejemplo, la segunda secuencia podría comprender una secuencia de aminoácidos inmunogénica neumocócica o una secuencia de aminoácidos inmunogénica del virus de la hepatitis

La segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica puede comprender un antígeno meningocócico, distinto de 20 un antígeno fHBP. Por ejemplo, la segunda secuencia podría comprender una secuencia para el antígeno meningocócico 287, NadA, NspA, HmbR, NhhA, App, 936 u Omp85. Más adelante se proporcionan detalles adicionales de estas segundas secuencias. Los ejemplos de secuencias de polipéptidos que incluyen dichas segundas secuencias inmunogénicas son las SEC ID NOs: 102, 124, 125, 126, 127, 128 y 129.

La segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica puede comprender una secuencia de tipo salvaje o fHBP 25 modificada. Preferentemente, esta segunda secuencia de aminoácidos puede generar, cuando se administra a un sujeto como parte de un polipéptido de la invención, una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de meningococo de tipo salvaje que tiene una de las secuencias de aminoácidos SEC ID NOS: 1, 2 o 3. Por ejemplo, la segunda secuencia de aminoácidos puede comprender cualquiera de entre:

 Una secuencia seleccionada de entre las SEC ID NOs: 1, 2, y 3 (secuencias fHBP de tipo salvaje). 30

 Una secuencia seleccionada de entre las SEC ID NOs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78 (secuencias fHBP modificadas). En algunas de dichas realizaciones, la segunda secuencia inmunogénica es idéntica a la primera secuencia inmunogénica. 35

 Una secuencia de aminoácidos que tiene al menos x% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78.

El valor de x es al menos 80, por ejemplo, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más. 40

Los ejemplos de polipéptidos que incluyen dichas secuencias fHBP como la segunda secuencia inmunogénica son las SEC ID NOs: 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 y 138.

Las secuencias de aminoácidos inmunogénicas primera y segunda pueden ser unidas directamente mediante un enlace peptídico, de manera que (i) el aminoácido C-terminal de la primera secuencia de aminoácidos 45 inmunogénica esté directamente aguas arriba con respecto al aminoácido N-terminal de la segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica, o (ii) el aminoácido C-terminal de la segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica esté directamente aguas arriba con respecto al aminoácido N-terminal de la primera secuencia de aminoácidos inmunogénica. En otras realizaciones, sin embargo, las secuencias de aminoácidos inmunogénicas primera y segunda están separadas por una secuencia de aminoácidos de enlazador, mientras todavía forman 50 una única cadena polipeptídica traducida. Típicamente, dichas secuencia o secuencias de aminoácidos de enlazador -L- serán cortas {por ejemplo, 20 o menos aminoácidos es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación,

enlazadores de poli-glicina (es decir, que comprenden GIyn donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y marcadores de histidina (es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, por ejemplo, SEC ID NO: 95). Otras secuencias de aminoácidos de enlazador adecuadas serán evidentes para las personas con conocimientos en la materia. Un enlazador útil es GSGGGG (SEC ID NO: 81) o GSGSGGGG (SEC ID NO: 82), con el dipéptido Gly-Ser formado a partir de un sitio de restricción BamHI, ayudando de esta manera a la clonación y 5 manipulación, y en el que el tetrapéptido (Gly)4 es un enlazador poli-glicina típico. Otros enlazadores adecuados son ASGGGS (SEC ID NO: 93 por ejemplo, codificada por la SEC ID NO: 94) o un dipéptido Leu-Glu.

Más de una de estas segundas secuencias pueden estar presentes, proporcionando de esta manera secuencias inmunogénicas tercera, cuarta, quinta, etc., en el polipéptido. Dichos polipéptidos incluyen aquellos que comprenden una primera secuencia de aminoácidos inmunogénica, una segunda secuencia de aminoácidos 10 inmunogénica y una tercera secuencia de aminoácidos inmunogénica, en la que: las secuencias de aminoácidos primera y segunda se definen como anteriormente; y la tercera secuencia de aminoácidos se selecciona de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78. Las secuencias 15 primera y tercera pueden ser la misma o diferentes entre sí; la segunda secuencia puede ser la misma que la primera o que la tercera, o puede diferir de ambas. Los ejemplos de polipéptidos que incluyen las secuencias primera, segunda y tercera son las SEC ID NOs: 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 y 127.

Un grupo útil de polipéptidos comprende (i) dos secuencias de aminoácidos seleccionadas independientemente 20 de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78, y (ii) un antígeno meningocócico no fHBP. Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen las SEC ID NOs: 124, 125, 126, 127, 140, 141 y 142. Las dos secuencias de aminoácidos de la parte (i) pueden ser la misma o diferentes. El 25 antígeno no fHBP puede estar entre las dos secuencias de aminoácidos de la parte (i), hacia el terminal C de las dos secuencias de aminoácidos de la parte (i), o hacia el terminal N de las dos secuencias de aminoácidos de parte (i).

Antígenos meningocócicos no fHBP

Una composición de la invención puede incluir un antígeno 287. El antígeno 287 se incluyó en la secuencia del 30 genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [16] como gen NMB2132 (GenBank número de acceso GI: 7227388; SEC ID NO: 83 en la presente memoria). Desde entonces, se han publicado las secuencias del antígeno 287 de muchas cepas. Por ejemplo, las formas alélicas de 287 pueden observarse en las Figs. 5 y 15 de la referencia 17, y en el Ejemplo 13 y la Figura 21 de la referencia 18 (SEC IDs 3179 a 3184 en la misma). También se ha informado acerca de varios fragmentos inmunogénicos del antígeno 287. Los 35 antígenos 287 preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEC ID NO: 83; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 83, donde 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) 40 comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 83. Los antígenos 287 más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 83. Los antígenos 287 ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto. 45

Una composición de la invención puede incluir un antígeno NadA. El antígeno NadA se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [16] como gen NMB1994 (GenBank número de acceso GI: 7227256; SEC ID NO: 84 en la presente memoria). Desde entonces se han publicado muchas secuencias de antígeno NadA, y la actividad de la proteína como una adhesina de Neisseria está bien documentada. Se ha informado también acerca de varios fragmentos inmunogénicos de NadA. Los antígenos 50 NadA preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEC ID NO: 84; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n’ aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 84, donde ‘n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un 55 epítopo de la SEC ID NO: 84. Los antígenos NadA más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 84. Los antígenos NadA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto. La SEC ID NO: 6 es uno de dichos fragmentos. 60

Una composición de la invención puede incluir un antígeno NspA. El antígeno NspA se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [16] como gen NMB0663 (GenBank número de acceso GI: 7225888; SEC ID NO: 85 en la presente memoria). El antígeno se conocía previamente a partir de las referencias 19 y 20. Desde entonces se han publicado las secuencias del antígeno NspA de muchas cepas. Se ha informado también acerca de varios fragmentos inmunogénicos de NspA. Los antígenos NspA 5 preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEC ID NO: 85; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 85, donde ‘n’ es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEC 10 ID NO: 85. Los antígenos NspA más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 85. Los antígenos NspA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto.

Las composiciones de la invención pueden incluir un antígeno HmbR meningocócico. La secuencia HmbR de 15 longitud completa se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [16] como gen NMB1668 (SEC ID NO: 86 en la presente memoria). La invención puede usar un polipéptido que comprende una secuencia HmbR de longitud completa, pero frecuentemente usará un polipéptido que comprende una secuencia HmbR parcial. De esta manera, en algunas realizaciones, una secuencia HmbR usada según la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos i% de identidad de 20 secuencia con la SEC ID NO: 86, donde el valor de i es 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o más. En otras realizaciones, una secuencia HmbR usada según la invención puede comprender un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 86, donde el valor de j es 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más. En otras realizaciones, una secuencia HmbR usada según la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos (i) que tiene al menos el i% de identidad de secuencia con la SEC ID 25 NO: 86 y/o (ii) que comprende un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 86. Los fragmentos preferentes de j aminoácidos comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 86. Dichos epítopos comprenderán normalmente aminoácidos que están situados en la superficie de HmbR. Los epítopos útiles incluyen aquellos con aminoácidos implicados en la unión de HmbR a hemoglobina, ya que anticuerpos que se unen a estos epítopos pueden bloquear la capacidad de una bacteria para unirse a la hemoglobina del huésped. 30 La topología de HmbR, y sus residuos funcionales críticos, fueron investigados en la referencia 21. Los antígenos HmbR más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 86. Los antígenos HmbR ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto. 35

Una composición de la invención puede incluir un antígeno NhhA. El antígeno NhhA se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [16] como NMB0992 gen (GenBank número de acceso GI: 7226232; SEC ID NO: 87 en la presente memoria). Desde entonces se han publicado las secuencias de antígeno NhhA de muchas cepas, por ejemplo, refs 17 y 22, y se ha informado acerca de varios fragmentos inmunogénicos de NhhA. Se conoce también como Hsf. Los antígenos NhhA preferentes para su uso 40 con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEC ID NO: 87; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 87, donde 'n’ es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 87. Los 45 antígenos NhhA más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 87. Los antígenos NhhA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto.

Una composición de la invención puede incluir un antígeno App. El antígeno App se incluyó en la secuencia del 50 genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [16] como el gen NMB1985 (GenBank número de acceso GI: 7227246; SEC ID NO: 88 en la presente memoria). Desde entonces se han publicado muchas secuencias de antígeno App. Se ha informado también acerca de varios fragmentos inmunogénicos de App. Los antígenos App preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 55 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEC ID NO: 88; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 88, donde 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 88. Los antígenos App más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que 60 consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 88. Los antígenos App ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un

sujeto.

Una composición de la invención puede incluir un antígeno Omp85. El antígeno Omp85 se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [16] como gen NMB0182 (GenBank número de acceso GI:7225401; SEC ID NO: 89 en la presente memoria). Desde entonces se han publicado las secuencias de antígeno Omp85 de muchas cepas. Puede encontrarse información adicional acerca 5 de Omp85 en las referencias 23 y 24. Se ha informado también acerca de varios fragmentos inmunogénicos de Omp85. Los antígenos Omp85 preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEC ID NO: 89; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 89, donde ‘n’ es 7 o más (por ejemplo, 8, 10 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 89. Los antígenos OMP85 más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 89. Los antígenos Omp85 ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la 15 administración a un sujeto.

Una composición de la invención puede incluir un antígeno 936. El antígeno 936 se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [25] como gen NMB2091 (SEC ID NO: 98 en la presente memoria). Los antígenos 936 preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 20 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEC ID NO: 98; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEC ID NO: 98, donde 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 98. Los antígenos 936 más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido 25 meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98. El antígeno 936 es un buen compañero de fusión para fHBP (por ejemplo, véanse las referencias 108 y 109).

Polipéptidos

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse mediante diversos medios, por ejemplo, mediante síntesis química (al menos en parte), digiriendo polipéptidos más largos usando proteasas, mediante traducción de ARN, 30 mediante purificación a partir de cultivo celular (por ejemplo, a partir de expresión recombinante o a partir de cultivo de N. meningitidis). etc. La expresión heteróloga en un huésped E. coli es una ruta preferente de expresión.

fHBP es naturalmente una proteína en N. meningitidis. También se ha descubierto que se convierte en lípido cuando se expresa en E. coli con su secuencia líder nativa. Los polipéptidos de la invención pueden tener un 35 residuo de cisteína en el terminal N, que puede convertirse en lípido, por ejemplo, que comprende un grupo palmitoilo, que normalmente forma una tripalmitoil-S-gliceril-cisteína. En otras realizaciones los polipéptidos no se convierten en lípidos.

Una característica de los polipéptidos preferentes de la invención es la habilidad para inducir anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de su administración a un animal huésped. 40

Preferentemente, los polipéptidos se preparan en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libres de otros polipéptidos de Neisseria o de célula huésped) o en forma sustancialmente aislada. En general, los polipéptidos se proporcionan en un medio no natural, por ejemplo, se separan de su medio natural. En ciertas realizaciones, el polipéptido objetivo está presente en una composición que está enriquecida para el polipéptido en comparación con un control. De esta manera, se proporciona un polipéptido 45 purificado, donde purificado significa que el polipéptido está presente en una composición que está sustancialmente libre de otros polipéptidos expresados, donde sustancialmente libre se refiere a que menos del 90%, normalmente menos del 60% y más normalmente menos del 50% de la composición está formada por otros polipéptidos expresados.

Los polipéptidos pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, nativos, fusiones, glicosilados, no glicosilados, 50 convertidos en lípidos, puentes disulfuro, etc.).

Las SEC ID NOs 4 a 78 no incluyen una metionina N-terminal. Si un polipéptido de la invención se produce mediante traducción en un huésped biológico entonces se requiere un codón de inicio, que proporcionará una metionina N-terminal en la mayoría de los huéspedes. De esta manera, un polipéptido de la invención incluirá, al menos en una fase naciente, un residuo de metionina aguas arriba de dicha secuencia SEC ID NO. 55

En algunas realizaciones, el polipéptido tiene una única metionina en el terminal N seguida inmediatamente por la

secuencia SEC ID NO; en otras realizaciones puede usarse una secuencia aguas arriba más larga. Dicha una secuencia aguas arriba puede ser corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos Incluyen secuencias líder para dirigir la circulación de proteínas, o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (Por ejemplo, marcadores de histidina, es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 5 9, 10 o más, véase la SEC ID NO: 95). Otras secuencias de aminoácidos del terminal N adecuadas serán evidentes para las personas con conocimientos en la materia.

Un polipéptido de la invención puede incluir también aminoácidos, corriente abajo del aminoácido final de las secuencias SEC ID NO. Dichas extensiones C terminales pueden ser cortas (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 10 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos Incluyen secuencias líderes para dirigir la circulación de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación (por ejemplo, un dipéptido Leu-Glu) o purificación (por ejemplo, que comprenden marcadores de histidina, es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, véase la SEC ID NO: 95), o secuencias que mejoran la estabilidad del polipéptido. Pueden usarse combinaciones de estas, por ejemplo la SEC ID NO: 96, que proporcionan un dipéptido Leu-Glu y un marcador 15 hexa-histidina. Otras secuencias de aminoácidos C-terminales adecuadas serán evidentes para las personas con conocimientos en la materia.

El término “polipéptido” se refiere a polímeros de aminoácido de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar Interrumpido por no-aminoácidos. Los términos incluyen también un polímero de aminoácido que ha sido modificado de manera natural o mediante 20 Intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilaclón, transformación en lípido, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden ocurrir como cadenas sencillas o cadenas asociadas. 25

Los polipéptidos de la invención pueden ser unidos o inmovilizados a un soporte sólido.

Los polipéptidos de la invención pueden comprender un marcador detectable, por ejemplo, un marcador radioactivo, un marcador fluorescente o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil en las técnicas de inmunoensayo.

Tal como se divulga en la referencia 13, fHBP puede dividirse en tres dominios, denominados A, B y C. Tomando 30 la SEC ID NO: 1, los tres dominios son (A) 1-119, (B) 120-183 y (C) 184-274:

La forma madura del dominio "A", desde Cis-20 en su terminal N a Lis-119, se denomina ‘Amadura’.

imagen2

Se conocen múltiples secuencias fHBP y estas pueden alinearse fácilmente usando procedimientos estándares. Mediante dichos alineamientos, la persona con conocimientos puede identificar (a) dominios "A" (y ‘Amadura’), ‘B’ y ‘C’ en cualquier secuencia fHBP determinada mediante comparación con las coordenadas en la secuencia MC58, 35 y (b) residuos sencillos en las secuencias fHBP múltiples, por ejemplo, para identificar sustituciones. En aras de la referencia, sin embargo, los dominios se definen más abajo:

 Dominio ‘A’ en una secuencia fHBP determinada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinea con la SEC ID NO: 1 usando un algoritmo de alineamiento por pares, comienza con el aminoácido alineado con Met-1 de la SEC ID NO: 1 y termina con el aminoácido alineado con Lys-119 de la SEC ID 40 NO: 1.

 Dominio ‘Amadura’ en una secuencia fHBP determinada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinea con la SEC ID NO: 1 usando un algoritmo de alineamiento por pares, comienza con el aminoácido alineado con Cys-20 de la SEC ID NO: 1 y termina con el aminoácido alineado con Lys-119 de la SEC ID NO: 1. 45

 Dominio ‘B’ en una secuencia fHBP determinada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinea con la SEC ID NO: 1 usando un algoritmo de alineamiento por pares, comienza con el aminoácido

alineado con Gln-120 de la SEC ID NO: 1 y termina con el aminoácido alineado con Gly-183 de la SEC ID NO: 1.

 Dominio "C" en una secuencia fHBP determinada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinea con la SEC ID NO: 1 usando un algoritmo de alineamiento por pares, comienza con el aminoácido alineado con Lys-184 de la SEC ID NO: 1 y termina con el aminoácido alineado con Gln-274 de la SEC 5 ID NO: 1.

El algoritmo de alineamiento por pares preferente para definir los dominios es el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch [26], usando parámetros por defecto (por ejemplo, con penalización de abertura de hueco = 10,0, y con penalización de extensión de hueco = 0,5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo está convenientemente implementado en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [27]. 10

En algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos fHBP en un polipéptido de la invención es truncada para eliminar su dominio A es decir, el dominio A es omitido de una SEC ID.

En algunas realizaciones, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos tal como se ha descrito anteriormente, excepto que hasta 10 aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) en el extremo N-terminal y/o hasta 10 aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) en el extremo C-terminal se eliminan. De esta 15 manera, el polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 y 77, en el que dicho fragmento comprende los aminoácidos a a b de dicha SEC ID, en la que a 20 es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11, y en la que b es j, j-1, j-2, j-3, j-4, j-5, j-6, j-7, j-8, j-9 o j-10 donde j es la longitud de dicha SEC ID. Pueden usarse también truncamientos más largos (por ejemplo, hasta 15 aminoácidos, hasta 20 aminoácidos, etc.).

Ácidos nucleicos

La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención tal como se define en las 25 reivindicaciones.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo, mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis fosforamidita de ADN) en su totalidad o en parte, digiriendo ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), uniendo ácidos nucleicos más cortos o nucleótidos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas), de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc. 30

Los ácidos nucleicos de la invención pueden adoptar diversas formas, por ejemplo, de cadena simple, de doble cadena, vectores, cebadores, sondas, marcados, no marcador, etc.

Los ácidos nucleicos de la invención están preferiblemente en forma aislada o sustancialmente aislada.

Los términos “ácido nucleico" incluyen ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas, y también ácidos peptidonucleicos (APN), etc. 35

El ácido nucleico según la invención puede estar marcado, por ejemplo, con un marcador radioactivo o fluorescente.

La invención proporciona también vectores (tales como plásmidos) que comprenden secuencias nucleótidas de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o expresión, tales como aquellos adecuados para inmunización de ácido nucleico) y células huéspedes no humanas transformadas con dichos vectores. 40

Respuestas bactericidas

Los polipéptidos preferentes de la invención pueden generar respuestas de anticuerpos contra meningococos. Las respuestas bactericidas de los anticuerpos se miden convenientemente en ratones y son un Indicador estándar de la eficacia de una vacuna [por ejemplo, véase la nota final 14 de la referencia 2]. Los polipéptidos de la invención pueden generar preferentemente una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra al menos 45 una cepa de N. meningitidis de entre cada uno de al menos dos de los siguientes tres grupos de cepas:

(I) MC58, gb185 (=M01-240185), m4030, m2197, m2937, iss1001, NZ394/98, 67/00, 93/114, bzl98, m1390, nge28, lnp17592, 00-241341, f6124, 205900, m198/172, bz133, gb149 (=M01-240149), nm008, nm092, 30/00, 39/99, 72/00, 95330, bz169, bz83, cu385, h44/76, m1590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847. (II) 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013), 50 e32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, c11, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, L93/4286. (III) M1239, 16889, gb355 (=M01-240355), m3369, m3813, ngp165.

Por ejemplo, un polipéptido puede generar una respuesta bactericida efectiva contra dos o tres de las cepas MC58, 961-5945 y M1239 de N. meningitidis serogrupo B.

Preferentemente, el polipéptido puede generar una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra al menos el 50% de las cepas meningocócicas de serogrupo B clínicamente relevantes (por ejemplo, el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más). El polipéptido puede generar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de 5 N. meningitidis serogrupo B y cepas de al menos uno (por ejemplo, 1, 2, 3. 4) de entre los serogrupos A, C, W135 e Y. El polipéptido puede generar una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de N. gonorrhoeae y/o N. cinerea. El polipéptido puede generar una respuesta que es bactericida contra cepas de al menos dos de las tres ramas principales del dendrograma mostrado en la Figura 5 de la referencia 4.

El polipéptido puede generar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de N.meningitidis en 10 al menos 2 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) de entre los linajes hiper-virulentos ET-37, ET-5, grupo A4, linaje 3, subgrupo I, subgrupo III y subgrupo IV-1 [28, 29]. Además, los polipéptidos pueden inducir respuestas bactericidas de anticuerpos contra uno o más linajes hiper-invasivos.

Los polipéptidos pueden generar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de N.meningitidis en al menos 2 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los siguientes tipos de secuencias multilocus: ST1, ST4. ST5, ST8, 15 ST11, ST32 y ST41 [30]. El polipéptido puede generar también una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas ST44.

No es necesario que el polipéptido induzca anticuerpos bactericidas contra todas las cepas MenB en los linajes especificados o MLST; al contrario, para un grupo determinado de cuatro o más cepas de meningococo serogrupo B en un linaje hiper-virulento particular o MLST, los anticuerpos Inducidos por la composición son 20 preferentemente bactericidas contra al menos el 50% (por ejemplo, el 60%, 70%, 80%, 90% o más) del grupo. Los grupos preferentes de cepas incluirán cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR y CU. Preferentemente, el suero tiene un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o mayor, preferentemente al menos 214), es decir, el suero es capaz de eliminar al menos el 50% de las bacterias de ensayo de una cepa particular cuando se diluye 1:1024, por 25 ejemplo, tal como se describe en la nota final 14 de la referencia 2. Los polipéptidos quiméricos preferentes pueden generar una respuesta de anticuerpos en ratones que permanece siendo bactericida incluso cuando el suero se diluye 1:4096 o más.

Inmunización

Un polipéptido de la invención puede ser usado como un componente activo de una composición inmunogénica y, 30 de esta manera, la invención proporciona una composición Inmunogénlca que comprende un polipéptido de la invención.

La divulgación proporciona también un procedimiento para generar una respuesta de anticuerpos en un mamífero, que comprende la administración de una composición imunogénica de la invención a un mamífero. La respuesta de anticuerpos es preferentemente una respuesta de anticuerpos protectora y/o bactericida. La 35 invención proporciona también polipéptidos de la invención para su uso en dichos procedimientos.

La divulgación proporciona también un procedimiento para proteger un mamífero contra una infección y/o una enfermedad debida a Neisseria (por ejemplo, contra meningitis meningocócica), que comprende la administración al mamífero de una composición inmunogénica de la invención.

La divulgación proporciona polipéptidos de la invención para su uso como medicamentos (por ejemplo, como 40 composiciones inmunogénicas o como vacunas) o como reactivos de diagnóstico. También proporciona el uso de ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir una infección de Neisseria (por ejemplo, meningocócica) en un mamífero.

El mamífero es preferentemente un ser humano. El ser humano puede ser un adulto o, preferentemente, un niño. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño 45 pequeño o un bebé); cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adulto. Una vacuna destinada a niños puede ser administrada también a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc.

Los usos y procedimientos son particularmente útiles para prevenir/tratar enfermedades incluyendo, pero sin limitarse a, meningitis (particularmente bacteriana, tal como meningitis meningocócica) y bacteriemia. 50

La eficacia del tratamiento terapéutico puede ser evaluada controlando la infección por Neisseria después de la administración de la composición de la invención. La eficacia del tratamiento profiláctico puede ser evaluada controlando las respuestas inmunes contra fHBP después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede ser evaluada administrándolas a sujetos de ensayo

(por ejemplo, niños de 12-18 meses de edad o modelos animales [31]) y determinando a continuación parámetros estándares que incluyen anticuerpos bactericidas del suero (ABS) y titulaciones ELISA (GMT). Estas respuestas inmunes se determinarán generalmente aproximadamente de 4 semanas después de la administración de la composición, y se compararán con valores determinados antes de la administración de la composición. Un aumento de ABS de al menos 4 veces u 8 veces es preferente. Cuando se administran más de una dosis de la 5 composición, pueden realizarse más de una determinación post-administración.

Las composiciones preferentes de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente que es superior al criterio para la sero-protección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpo asociado por encima del cual un huésped se considera que se ha sero-convertido contra el antígeno son bien conocidos, y dichos títulos se publican por 10 organizaciones tales como OMS. Preferentemente más del 80% de una muestra estadísticamente significativa de sujetos es sero-convertida, más preferentemente más del 90%, todavía preferentemente más del 93% y más preferentemente 96-100%.

Generalmente, las composiciones de la invención se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede realizarse mediante inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitonealmente, 15 intravenosamente, intramuscularmente o al espacio Intersticial de un tejido), o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración a través de una mucosa. La administración intramuscular en el muslo o la parte superior del brazo es preferente. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente puede usarse una inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de aproximadamente 0,5 ml. 20

La invención puede ser usada para generar inmunidad sistémica y/o mucosal.

El tratamiento con dosis puede ser un programa de dosis única o un programa con dosis múltiples. Las dosis múltiples pueden ser usadas en un programa de Inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de inmunización primaria puede ser seguido por un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis primarias (por ejemplo, entre 4-16 semanas) y entre la inmunización primaria y la 25 inmunización de refuerzo puede determinarse de manera rutinaria.

Generalmente, la composición inmunogénica de la invención incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquier sustancia que no induzca, por sí misma, la producción de anticuerpos perjudiciales para el paciente que recibe la composición, y que pueda ser administrada sin toxicidad indebida. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. También 30 puede haber sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes y emulsionantes, sustancias tamponadoras de pH y similares en dichos vehículos. Una extensa exposición de vehículos adecuados está disponible en la ref. 32.

Las infecciones por Neisseria afectan a varias zonas del cuerpo y, de esta manera, las composiciones de la invención pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como 35 Inyectables, bien como soluciones liquidas o suspensiones. Pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para la solución en, o la suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La composición puede ser preparada para administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvos. La composición puede ser preparada para administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente con sabor). La composición puede ser preparada para administración pulmonar, por 40 ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición puede ser preparada como un supositorio o pesario. La composición puede ser preparada para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas.

La composición es preferentemente estéril. Preferentemente, está libre de pirógenos. Está preferentemente tamponada, por ejemplo, entre pH 6 y pH 8, generalmente aproximadamente a pH 7. Cuando una composición 45 comprende una sal de hidróxido de aluminio, es preferente usar un tampón de histidina [33]. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.

Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de inmunógeno, así como cualquier otro componente especificado, según sea necesario. La expresión “cantidad inmunológicamente efectiva" se refiere a que la administración de esa cantidad a un Individuo, bien en una única dosis o bien como 50 parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado, la edad, el grupo taxonómico del Individuo a ser tratado (por ejemplo, un primate no humano, un primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar los anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del doctor que lleva a cabo el tratamiento y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté 55 incluida en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado mediante ensayos rutinarios. El tratamiento con dosis puede ser un programa de una única dosis o un programa con dosis múltiples (por ejemplo, que incluye dosis de refuerzo). La composición puede ser administrada junto con otros agentes

inmunoreguladores.

Los adyuvantes que pueden ser usados en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención puede incluir sales minerales tales 5 como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la ref. 34] o mezclas de diferentes compuestos minerales, donde los compuestos adoptan cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y donde es preferente la adsorción. Las composiciones que contienen minerales pueden ser formuladas también como una partícula de sal metálica [35] 10

Un adyuvante de fosfato de aluminio útil es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporción molar de PO4/Al de entre 0,84 y 0,92, incluido en 0,6 mg Al3+/ml.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno en agua, tales como MF59 [Capítulo 10 de la ref. 34; véase también la ref. 36) (5% 15 escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de Span 85, formulada en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). Pueden usarse también adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AlF).

Típicamente, las emulsiones de aceite en agua útiles incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, donde los aceites y los tensioactivos son biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite 20 en la emulsión son generalmente menores de 1 μm de diámetro, consiguiéndose estos pequeños tamaños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Las gotitas con un tamaño menor de 220nm son preferentes ya que pueden ser sometidas a esterilización con filtro.

La emulsión puede comprender aceites tales como aquellos que proceden de una fuente animal (tal como un pescado) o vegetal. Las fuentes para aceites vegetales incluyen frutos secos semillas y granos. El aceite de 25 cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los disponibles más comúnmente, ejemplifican los aceites de frutos secos. Puede usarse aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido del grano de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de alazor, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo, etc. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero puede usarse también el aceite de otros granos de cereal tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale, etc. Los ésteres 30 de ácidos grasos de 6-10 átomos de carbono de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no ocurren de manera natural en los aceites de semillas, pueden ser preparados mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de aceites de frutos secos y de semillas. Las grasas y los aceites de leche de mamífero pueden ser metabolizadas y, por lo tanto, pueden ser usadas en la práctica de esta invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites 35 puros a partir de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los pescados contienen aceites metabolizables que pueden ser recuperados fácilmente. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena tal como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden ser usados en la presente memoria. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades isopreno de 5 carbonos y se denominan generalmente terpenoides. El 40 aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado, no saturado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracohexaneno, que es particularmente preferente en la presente memoria. El escualano, el análogo saturado del escualeno, es también un aceite preferente. Los aceites de pescados, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Otros aceites preferentes son los tocoferoles 45 (véase más abajo). Pueden usarse mezclas de aceites.

Los tensioactivos pueden clasificarse por su "EHL" (equilibro hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferentes tienen un EHL de al menos 10, preferentemente al menos 15 y más preferentemente al menos 16. La invención puede ser usada con tensioactivos que incluyen, aunque no se limitan a: tensioactivos de ésteres de sorbitán polioxietileno (denominados comúnmente Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros 50 de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP) y/u óxido de butileno (OB), comercializado bajo el nombre comercial DOWFAX™, tales como polímeros en bloque OE/OP lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos repetitivos de etoxi (oxi-1,2-etanodil), con octoxinol-9 (Triton X-100 o t-octilfenoxipolietoxietanol) siendo de particular interés; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); nonilfenol etoxilatos, tales como serie Tergitol™ NP: ésteres 55 grasos de polioxietileno derivados de alcoholes láurico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como tensioactivos Brij), tales como monolauril éter de trietelenoglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (conocidos

comúnmente como SPANs), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Los tensioactivos no jónicos son preferentes. Los tensioactivos preferentes para ser incluidos en la emulsión son Tween 80 (monooleato de sorbitán de polioxietileno), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Pueden usarse mezclas de tensioactivos, por ejemplo mezclas de Tween 80/Span 85. Una combinación de un éster de sorbitán de potioxietileno tal como monooleato de sorbitán de polioxietileno (Tween 80) y un octoxinol tal 5 como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) es también adecuada. Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de sorbitián de polioxietileno y/o un octoxinol.

Las cantidades preferentes de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de sorbitán de polioxietileno (tales como Tween 80) del 0,01 al 1% en particular aproximadamente el 0,1%; octil- o nonil-fenoxi polioxietanoles (tales como Triton X-100 u otros detergentes en la serie Triton) del 0,001 al 0,1%, en particular del 0,005 al 0,02%; éteres de 10 polioxietileno (tales como laureth 9) del 0,1 al 20%, preferentemente del 0,1 al 10% y en particular del 0,1 al 1% o aproximadamente el 0,5%.

Preferentemente, sustancialmente todas (por ejemplo, al menos el 90% en número) las gotitas de aceite tienen un diámetro menor de 1 μm, por ejemplo, ≤750nm, ≤500nm, ≤400nm, ≤300nm, ≤250nm, ≤220nm, ≤200nm o menor.

Una emulsión submicrométrica de escualeno específica útil es Tween 80 y Span 85. La composición de la 15 emulsión en volumen puede ser aproximadamente el 5% de escualeno, aproximadamente el 0,5% de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,5% de Span 85. En términos de peso, estas proporciones se convierten en el 4,3% escualeno, el 0,5% de polisorbato 80 y el 0,48% de Span 85. Este adyuvante es conocido como “MF59" [37-39], tal como se describe más detalladamente en el Capítulo 10 de la ref. 40 y el Capítulo 12 de la ref. 41. La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones citrato, por ejemplo, tampón 10mM de citrato de sodio. 20

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref. 341

Las formulaciones de saponina pueden ser usadas también como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneos de glucósidos de esterol y glucósidos triterpénicos que se encuentran en el tronco, las hojas, los tallos, las raíces e incluso en las flores de una amplia diversidad de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina ha sido estudiada ampliamente como adyuvante. La saponina 25 puede ser obtenida también comercialmente a partir de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lípidas, tales como ISCOMs. QS21 se comercializa como Stimulon™.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones 30 purificadas específicas usando estas técnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se divulga en la ref. 42. Las formulaciones de saponina pueden comprender también un esterol, tal como colesterol [43].

Pueden usase combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 de la ref. 34]. Típicamente, los ISCOMs incluyen también un 35 fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidlicolina. Puede usarse cualquier saponina conocida en los ISCOMs. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de entre QuilA, QHA y QHC. Los ISCOMs se describen más detalladamente en las refs. 43-45. Opcionalmente, los ISCOMs pueden estar libres de detergente adicional (46].

En las refs. 47 y 48 puede encontrase un estudio del desarrollo de adyuvantes basados en saponina. 40

D. Virosomas y partículas de tipo virus

Los virosomas y las partículas de tipo virus (PTV) pueden usase también como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus, combinadas o formuladas opcionalmente con un fosfolípido. Son generalmente no patogénicas, no replicantes y generalmente no contienen ninguno de los genomas virales nativos. Las proteínas virales pueden producirse de manera recombinante o pueden aislarse a 45 partir de virus completos. Estas proteínas vivales adecuadas para su uso en virosomas o PTV incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tal como HA o NA), virus de Hepatitis B (tal como proteínas de núcleo o de cápside), virus de Hepatitis E, virus de sarampión, virus de Sindbis, rotavirus, virus de enfermedad de pies y manos, retrovirus, virus Norwalk, virus de papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago-Qβ (tales como proteínas de cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tal como proteína p1 de retrotransposón Ty). Las PTV se 50 analizan más detalladamente en las refs. 49-54. Los virosomas se analizan más detalladamente, por ejemplo, en la ref. 55.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como

derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados de Lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas riboxilantes ADP y sus derivados detoxificados.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen un monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-deacilado (3dMPL). 3dLMF es una mezcla de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferente de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado se divulga en la ref. 56. Dichas °partículas pequeñas" 5 de 3dMPL son suficientemente pequeñas para filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 μm [56]. Otros derivados LPS no tóxicos Incluyen imitadores de monofosforil lípido A, tales como los derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por ejemplo, RC-529 [57, 58].

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en las refs. 50 y 60. 10

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleótida que contiene una citosina no metilada unida por un enlace fosfato a una guanosina). Se ha demostrado también que los ARN de doble hélice y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) son inmunoestimulantes.

Los CpGs pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y 15 pueden ser de cadena doble o única. Las referencias 61, 62, 63 divulgan posibles sustituciones análogas, por ejemplo, sustitución de guanosina por 2’-deoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se describe más detalladamente en las refs. 64-69.

La secuencia CpG puede estar dirigida a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [70]. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Th1, tal como CpG-A ODN o puede ser más específica 20 para Inducir una respuesta de célula B tal como CpG-B ODN. Los ODNs CpG-A y CpG-B se describen en las refs. 71-73. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonudeótido CpG se construye de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de ollgonucleótido CpG pueden ser unidas en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véanse, por ejemplo, las refs. 70 y 74-76. 25

Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimulantes es conocido como IC311™ [77]. De esta manera, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos un (y preferentemente múltiples) motivos Cpl (es decir, citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferentemente 30 múltiples) secuencias de tripéptido Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un deoxinucletóido que comprende una secuencia de 26 unidades méricas 5'- (1C)13-3' (SEC ID NO: 79). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende una secuencia de aminoácido de 11 unidades méricas KLKLLLLLKLK (SEC ID NO: 80).

Las toxinas ADP-ribosilantes bacterianas y sus derivados detoxificados pueden ser usados como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina “LT” termolábil de E. coli), cólera 35 ("CT") o pertussis ("PT). El uso de toxinas ADP-ribosilantes detoxificadas como adyuvantes de mucosa se describe en la ref. 78 y como adyuvantes parenterales en la ref. 79. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende ambas subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación desintoxicante; preferentemente la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT detoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ADP-ribosilantes y sus 40 derivados detoxificados, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes puede encontrase en las refs 80-87. Un mutante CT útil es CT-E29H [88]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de las toxinas ADP-ribosilantes expuestas en la ref. 89.

E. Inmunomodulares humanos 45

Los inmunomoduladores humanos adecuados para uso como adyuvantes en la invención Incluyen citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [90], etc.) [91], interferones (por ejemplo, Interferón-ɣ), factor estimuiador de colonia de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomoduiador preferente es IL-12.

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos 50

Los bioadhesivos y mucoadhesivos pueden ser usados también como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico [92] o mucoadhesivos tales como derivados de enlace cruzado de ácido poliacrílico, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosano y sus derivados pueden ser usados también como adyuvantes en la invención

[93].

H. Micropartículas

Las micropartículas pueden ser usadas también como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 μm de diámetro, más preferentemente de ~200nm a ~30 μm de diámetro, y más preferentemente de ~500 nm a ~10 μm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables 5 y no tóxicos (por ejemplo, un poli(α-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoester, un polianhídrido, una policaprolactona, etc), siendo preferente poli(lactida-co-glicólido), opcionalmente tratados para tener una superficie con carga negativa (por ejemplo, con SDS) o una superficie con carga positiva (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

1. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la ref, 34) 10

Los ejemplos de formulaciones de liposoma adecuados para su uso como adyuvantes se describen en las refs. 94-96.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno (97]. Dichas formulaciones pueden incluir además tensioactivos de éster de sorbitán de 15 polioxietileno en combinación con un octoxinol [98] así como éteres de polioxietilenalquilo o tensioactivos de ésteres en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol [99]. Los éteres de polioxietileno preferentes se seleccionan de entre el grupo siguiente: éter de polioxietileno-9-lauril (laureth 9), éter de polioxiebleno-9- eteoril, éter de polioxietileno-8-eteoril, éter de polioxietileno-4-lauril, éter de polioxietileno-35-lauril y éter de polioxietileno-23-lauril. 20

K. Polifosfaceno (PCPP)

Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en las refs. 100 y 101.

L. Péptidos de muramilo

Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-Isoglutamina (thr-MDP, n-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramiI-L-alanII-D-25 isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2'-dipalmitoiI-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de imidazoquinolona

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo "Resiquimod 3M", descritos más detalladamente en las refs. 102 y 103. 30

La invención puede comprender además combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvantes pueden ser usadas en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [104]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL (105]; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) 1- un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21)+ 3dMPL + IL-12 35 (opcionalmente + un esterol) [106]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [107]; (6) SAF, que contiene 6% de escualano, 0,4% de Tween 80™, 5% polímero en bloque plurónico L121, y thr-MDP, bien microfluidizado en una emulsión submicrométrica o bien sometido a agitación voticial para generar una emulsión con un tamaño de partícula más grande. (7) Sistema adyuvante Rii™ (SAR), (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80 y uno o más componentes de pared 40 celular bacteriana de entre el grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared celular (EPC), preferentemente MPL + EPC (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se divulgan en el capítulo 7 de la ref. 34.

El uso de adyuvante de hidróxido de aluminio y/o de fosfato de aluminio es particularmente preferente, y los 45 antígenos generalmente se adsorben en estas sales. Otras combinaciones preferentes de adyuvantes incluyen combinaciones de adyuvantes Th1 y Th2 tales como CpG y alum o resiquimod & alum. Puede usarse una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Componentes antigénicos adicionales

Las composiciones de la invención incluyen polipéptidos que incluyen secuencias fHBP modificadas. Sería útil 50

que la composición no incluyera mezclas complejas o no definidas de antígenos, por ejemplo, es preferente que no incluya vesículas de membrana externa en la composición. Preferentemente, los polipéptidos de la invención se expresan de manera recombinante en un huésped heterólogo y a continuación se purifican.

Además de incluir un polipéptido que contiene una secuencia fHBP, una composición de la invención puede incluir también uno o más antígenos de Neisseria adicionales, ya que una vacuna dirigida a más de un antígeno 5 por bacteria reduce la posibilidad de seleccionar mutantes de escape. De esta manera, una composición puede incluir un segundo polipéptido que, cuando se administra a un mamífero, genera una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra meningococo. El segundo polipéptido no será una fHBP meningocócica, pero puede ser, por ejemplo, una secuencia 287, una secuencia NadA, una secuencia 953, una secuencia 936, etc. Una composición puede incluir uno o más de entre: un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 90; un polipéptido 10 que comprende la SEC ID NO: 91 y/o un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 92 o 139 (véanse las refs. 108 y 109).

Una composición que comprende un primer polipéptido que comprende una fusión de un antígeno 936 y al menos una fHBP modificada, un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 90 y un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 92 es útil. El primer 15 polipéptido puede comprender, por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID NOs: 124, 125, 126, 127, 128, 129.

Una composición que comprende un primer polipéptido que comprende una fusión de un antígeno 936 y al menos una fHBP modificada, un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 90 y un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 139 es útil. El primer 20 polipéptido puede comprender, por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID NOs: 124, 125, 126, 127, 128, 129, y preferentemente comprende la SEC ID NO: 126. Esta composición puede incluir vesículas meningocócicas de membrana externa tal como se describe en la presente memoria, pero preferentemente no las incluye.

Los antígenos para su inclusión en las composiciones incluyen polipéptidos que comprenden uno o más de entre: 25

(a) las 446 SEC IDs pares (es decir, 2, 4, 6.., 890, 892) divulgadas en la referencia 110.

(b) las 45 SEC IDs pares (es decir, 2, 4, 6,.., 88, 90) divulgadas en la referencia 111;

(c) las 1.674 SEC IDs pares 2-3020, las SEC IDs pares 3040-3114, y todas las SEC IDs 3115-3241, divulgadas en la referencia 3;

(d) las 2160 secuencias de aminoácidos NMB0001 a NMB2160 de la referencia 2; 30

(e) una proteínas PorA meningocócica, de cualquier subtipo, expresada preferentemente de manera recombinante;

(f) una variante, homólogo, ortólogo, parálogo, mutante, etc. de (a) a (e); o

(g) una preparación de vesícula de membrana externa a partir de N. meningitidis [por ejemplo, véase la ref. 173], pero preferentemente no. 35

Además de los antígenos de polipéptido de Neisseria, la composición puede Incluir antígenos para inmunizar contra otras enfermedades o Infecciones. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos adicionales:

 un antígeno sacárido de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/u Y, tal como el sacárido divulgado en la ref. 112 de serogrupo C [véase también la ref. 113] o en la ref. 114. 40

 un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 115, 116, 117].

 un antígeno de virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 118, 119].

 un antígeno de virus de hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo, 119, 120].

 un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la ref. 121], por 45 ejemplo, el mutante CRM197 [por ejemplo, 122].

 un antígeno de tétano, tal como un toxoide de tétano [por ejemplo, capítulo 4 de la ref. 121].

 un antígeno de Bordetella pertussis, tal como una holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina

filamentosa (FHA) de B.pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, refs. 123 & 124].

 un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 113).

 antígenos de polio [por ejemplo, 125, 126], tal como IPV.

 antígenos de sarampión, paperas y/o rubeola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de la ref. 121]. 5

 antígenos de gripe [por ejemplo, capítulo 19 de la ref. 121), tales como las proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa.

 un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 127].

 un antígeno de proteínas de Streptococcus agalactiae (estreptococo grupo B) [por ejemplo, 128, 129].

 un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae (estreptococo grupo B). 10

 un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo grupo A) [por ejemplo, 129, 130, 131].

 un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo 132].

La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales.

Los antígenos tóxicos de proteínas pueden ser detoxificados cuando sea necesario (por ejemplo, detoxificación de toxina pertussis mediante medios químicos y/o genéticos [124]). 15

Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición, es preferente incluir también antígeno de tétano y antígenos de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tétano es preferente incluir también antígenos de difteria y pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de pertussis es preferente incluir también antígenos de difteria y tétano. De esta manera, las combinaciones DTP son preferentes. Los antígenos sacáridos están preferentemente en forma de conjugados. Las proteínas vehículo para los conjugados 20 se describen más detalladamente más adelante.

Típicamente, cada uno de los antígenos en la composición estará presente en una concentración de al menos 1 μg/ml. En general, la concentración de un antígeno determinado será suficiente para generar una respuesta inmune contra ese antígeno.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser usadas terapéuticamente (es decir, para tratar una 25 infección existente) o profilácticamente (es decir, para prevenir una infección futura).

Como una alternativa al uso de antígenos de proteínas en las composiciones inmunogénicas de la invención, puede usarse ácido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo, en forma de un plásmido) que codifica el antígeno.

En algunas realizaciones, una composición de la invención comprende, además de la secuencia fHBP, antígenos 30 de sacárido capsulares conjugados de 1, 2, 3 o 4 de los serogrupos meningocócicos A, C, W135 e Y. En otras realizaciones, una composición de la invención comprende, además de la secuencia fHBP, al menos un antígeno de sacárido capsular neumocócico conjugado.

Serogrupos meningocócicos Y, W135, C y A

Las vacunas actuales de serogrupo C (Menjugate™ [133, 112], Meningitec™ y NeisVac-C™) incluyen sacáridos 35 conjugados. Menjugate™ y Meningitec™ tienen antígenos de polisacárido conjugados con un vehículo CRM197, mientras que NeisVac-C™ usa el polisacárido completo (de-O-acetilado) conjugado con un vehículo de toxoide de tétano. La vacuna Menactra™ contiene antígenos de sacárido capsular conjugados de cada uno de los serogrupos Y, W135 y A.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir antígenos de sacárido capsular de uno o más 40 serogrupos meningocócicos Y, W135, C y A, donde los antígenos se conjugan con proteínas vehículo y/o son oligosacáridos. Por ejemplo, la composición puede incluir un antígeno de sacárido capsular de entre: serogrupo C; serogrupos A y C; serogrupos A, C y W135; serogrupos A, C e Y; serogrupos C, W135 e Y; o de todos los cuatro serogrupos A, C, W135 e Y.

Una cantidad típica de cada antígeno sacárido meningocócico por dosis es de entre 1 μg y 20 μg, por ejemplo, de 45 aproximadamente 1 μg, aproximadamente 2,5 μg, aproximadamente 4 μg, aproximadamente 5 μg o aproximadamente 10 μg (expresado como sacárido).

Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, la proporción (p/p) de sacárido MenA:sacárido MenC puede ser mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y y uno o ambos serogrupos C y W135, la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenW135 puede ser mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) y/o la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenC puede ser menor que 1 (por ejemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 o 5 menor). Las proporciones (p/p) preferentes para sacáridos de serogrupos A:C:W135:Y son 1:1:1:1, 1:1:1:2, 2:1:1:1, 4:2:1:1, 8:4:2:1, 4:2:1:2, 8:4:1:2, 4:2:2:1, 2:2:1:1, 4:4:2:1, 2:2:1:2, 4:4:1:2 y 2:2:2:1. Las proporciones (p/p) preferentes para los sacáridos de los serogrupos C:W135:Y son 1:1:1, 1:1:2, 1:1:1, 2:1:1, 4:2:1, 2:1:2, 4:1:2, 2:2:1 y 2:1:1. Es preferente el uso de una masa sustancialmente Igual de cada sacárido.

Los sacáridos capsulares pueden ser usados en forma de oligosacáridos. Estos se forman de manera 10 conveniente mediante fragmentación de polisacárido capsular purificado (por ejemplo, mediante hidrólisis), que será seguida normalmente por la purificación de los fragmentos del tamaño deseado.

La fragmentación de polisacárido se realiza preferentemente para proporcionar un grado medio final de polimerización (GP) en el oligosacárldo menor de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, preferentemente de aproximadamente 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferentemente de 15 aproximadamente 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C, etc.). el GP puede medirse convenientemente mediante cromatografía de Intercambio iónico o mediante ensayos colorimétricos [134].

Si se realiza una hidrólisis, el hidrolizado se dimensionará para eliminar oligosacáridos de longitud corta [113]. Esto puede conseguirse de diversas maneras, tal como mediante ultrafiltración seguida de cromatografía de intercambio iónico. Preferentemente, los oligosacáridos con un grado de polimerización menor o igual a 6 se 20 eliminan para el serogrupo A, y aquellos menores de aproximadamente 4 se eliminan preferentemente para los serogrupos W135 e Y.

Los antígenos de sacárido MenC preferentes se divulgan en la referencia 133, tal como los usados en Menjugate™.

El antígeno de sacárido puede ser modificado químicamente. Esto es particularmente útil para reducir la hidrólisis 25 para el serogrupo A [135; véase más adelante]. Puede realizarse una de-O-acetilación de sacáridos meningocócicos. Para los oligosacáridos, la modificación puede tener lugar antes o después de la despolimerización.

Cuando una composición de la invención Incluye un antígeno de sacárido MenA, el antígeno es preferentemente un sacárido modificado en el que uno o más de los grupos hidroxilo en el sacárido nativo ha sido sustituido o han 30 sido sustituidos por un grupo bloqueador [135]. Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis.

Conjugación covalente

Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención estarán conjugados normalmente con proteínas vehículo. En general, la conjugación mejora la inmunogenicidad de los sacáridos ya que los convierte de antígenos T-Independientes a antígenos T-dependientes, permitiendo de esta manera la preparación para 35 memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para las vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida.

Las proteínas vehículo típicas son toxinas bacterianas, tales como toxinas de difteria o tétano, o sus toxoides o mutantes. El mutante CRM197 de toxina de difteria [136] es útil, y es el vehículo en el producto PREVNAR™. Otras proteínas vehículo adecuadas incluyen complejos de proteína de membrana externa de N. meningitidis 40 [137], péptidos sintéticos [138, 139], proteínas de choque térmico [140, 141], proteínas de pertussis [142, 143], citoquinas [144], linfoquinas [144], hormonas [144], factores del crecimiento [144], proteínas artificiales que comprenden epítopos celulares CD4+ T humanos múltiples de varios antígenos derivados de patógenos [145] tales como N19 [146], proteína D de H. influenzae [147-149], pneumolisina [150] o sus derivados no tóxicos [151], proteína PspA de superficie meningocócica [152], proteínas de adsorción de hierro [153], toxina A o B de C. 45 difficile [154], exoproteína A recombinante de P. aeruginosa (rEPA) [155], etc.

Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada con cualquier conector adecuado cuando sea necesario.

Típicamente, el sacárido se activará o se funcionalizará antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo, 1-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato 50 [156, 157, etc.]. Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidracidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU, etc.

Las uniones por medio de un grupo conector pueden ser realizadas usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 158 y 159. Otro tipo de unión implica la animación

reductora del polisacárido, el acoplamiento del grupo amino resultante a un extremo de un grupo conector de ácido adípico y, a continuación, el acoplamiento de una proteína al otro extremo del grupo conector de ácido adípico [160, 161]. Otros conectores incluyen B-propionamido [162], nitrofenil-etilamina [163], haluros de haloacilo [164], uniones glicosídicas [165], ácido 6-aminocaproíco [166], ADH [167], fracciones C4 a C12 [168] etc. Como una alternativa al uso de un conector, puede usarse una unión directa. Las uniones directas a la proteína pueden 5 comprender oxidación del polisacárido seguida de aminación reductora con la proteína, tal como se describe, por ejemplo, en las referencias 169 y 170.

Un procedimiento que implica la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo, sustituyendo los grupos terminales =O por -NH2) seguido de derivación con un diéster atípico (por ejemplo, N-hidroxisuccinimido diéster de ácido adípico) y reacción con proteína vehículo es preferente. Otra reacción preferente usa activación 10 CDAP con proteína vehículo D, por ejemplo, para MenA o MenC.

Vesículas de membrana externa

Es preferente que las composiciones de la invención no incluyan mezclas complejas o no definidas de antígenos, que son características típicas de VMEs. Sin embargo, la invención puede ser usada junto con VMEs, ya que se ha descubierto que la fHBP mejora su eficacia [6], en particular sobre-expresando los polipéptidos de la invención 15 en las cepas usadas para preparación de VME, de manera que el polipéptido es visualizado sobre la superficie VME.

Este enfoque puede ser usado en general para mejorar las preparaciones de microvesículas de N.meningitidis serogrupos B [171], “VME nativas” [172], vacuolas o vesículas de membrana externa [por ejemplo, refs. 173 a 178, etc.]. Éstas pueden ser preparadas a partir de bacterias que han sido manipuladas genéticamente [179-182], 20 por ejemplo, para aumentar la inmunogenicidad (por ejemplo, para hiper-expresar inmunógenos), para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacárido capsular, para reducir la expresión PorA, etc. Pueden ser preparadas a partir de cepas de hiper-vacuolización [183-186]. Pueden incluirse vesículas de una Neisseria no patogénica [187]. Pueden prepararse VMEs sin el uso de detergentes [188, 189]. Pueden expresar proteínas no Neisseria en su superficie [190]. Pueden estar con depleción de LPS. Pueden mezclase con antígenos 25 recombinantes [173, 191]. Pueden usarse vesículas de bacterias con diferentes subtipos de proteína de membrana exterior clase I, por ejemplo, seis subtipos diferentes [192, 193] usando dos poblaciones diferentes de vesículas modificadas genéticamente cada una mostrando tres subtipos, o nueve subtipos diferentes usando tres poblaciones diferentes de vesículas modificadas genéticamente cada una mostrando tres subtipos. etc. Los subtipos útiles incluyen: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1; 30 P1.18-1,3,6.

Cuando las vesículas están presentes en una composición, la cantidad puede ser especificada en términos de proteína total en la vesícula. Una composición puede incluir entre 1 y 100 μg/ml de vesículas, por ejemplo entre 15-30 μg/ml o preferentemente una dosis más baja, por ejemplo, 2-10 μg/ml.

Más adelante se proporcionan detalles adicionales acerca de las vesículas. 35

Expresión de proteínas

Las técnicas de expresión bacteriana son conocidas en la técnica. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar una transcripción corriente abajo (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de transcripción que está colocada normalmente próxima al extremo 5’ de la secuencia codificadora. Esta región 40 de Iniciación de transcripción incluye normalmente un sitio de unión de ARN polimerasa y un sitio de iniciación de transcripción. Un promotor bacteriano puede tener también un segundo dominio denominado un operador, que puede sobreponerse a un sitio de unión de ARN polimerasa adyacente en el que se inicia la síntesis de ARN. El operador permite una transcripción regulada negativa (inducible), ya que una proteína represora de gen puede unirse al operador y de esta manera puede inhibir la transcripción de un gen específico. Puede producirse una 45 expresión constitutiva en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, la regulación positiva puede conseguirse por una secuencia de unión de proteína activadora de gen que, si está presente, está normalmente próximal (5') a la secuencia de unión de ARN polimerasa. Un ejemplo de proteína activadora de gen es la proteína activadora por catabolito (PAC), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Por lo tanto, la expresión 50 regulada puede ser positiva o negativa, aumentando o reduciendo de esta manera la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056], y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. 55 Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids. Res. 9:731; patente US 4.738.921; EP-A-0038776 y EP-A-0121775]. El sistema promotor de β-lactamasa (bla) [Weissman (1981) " The cloning of interferon and other

mistakes". en Interferon 3 (ed. I. Gresser)], los sistemas promotor de PL lambda bacteriófago [Shimatake et al. (1981) Natura 292:128] y T5 [patente US 4.689.406] proporcionan también secuencias promotoras útiles. Otro promotor de Interés es un promotor arabinosa inducible (pBAD).

Además, los promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza funcionan también como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago 5 pueden unirse con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente US 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido que comprende secuencias de promotor trp y de operón lac que está regulado por el represor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sd. 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que ocurren de manera natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a ARN 10 polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que ocurre de manera natural de origen no bacteriano puede acoplarse también a ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema ARN polimerasa/promotor bacteriófago T7 es un ejemplo de sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J Mol Biol 189113; Tabor et al., (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Además, un promotor híbrido puede comprender también un promotor bacteriófago y una región de operador E. 15 coli (EP-A-O 267 851).

Además de una secuencia promotora funcional, un sitio de unión de ribosoma eficiente es también útil para la expresión de genes exteriores en procariotas. En E. coli, el sitio de unión de ribosoma se denomina secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud situada 3-11 nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación. Se cree que la secuencia SD promueve la unión de 20 ARNm al ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el extremo 3' del ARNr 16S de E. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA". En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. E Goldberger)]. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con sitio de unión de ribosoma débil [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli", en Molecular Cloning: A Laboratory Manual]. 25

Una secuencia promotora puede estar unida directamente a la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el terminal N será siempre una metionina, que está codificada por el codón de Inicio ATG. Si se desea, la metionina en el terminal N puede ser escindida de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa específica para metionina N terminal bacteriana (EP-A-0219237). 30

Normalmente, las secuencias de terminación de transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras situadas hacia el extremo 3’ con respecto al codón de parada de traslación, y de esta manera junto con el promotor flanquean la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede ser traducido al polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tipo 35 horquilla que ayudan a terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli, así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, una secuencia de señal (si se desea), una secuencia codificadora de interés, y una secuencia de terminación de transcripción, se colocan 40 juntas en constructos de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen frecuentemente en un replicón, tal como un elemento extra-cromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un huésped, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga en una célula procariota para su expresión o su clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de número de copia alto o bajo. Un plásmido de número de copia alto tendrá 45 generalmente un número de copia comprendido entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de número de copia alto contendrá preferentemente al menos aproximadamente 10 y más preferentemente, al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector con número de copla alto o bajo, dependiendo del efecto del vector y de la proteína externa en el huésped. 50

De manera alternativa, los constructos de expresión pueden ser integrados en el genoma bacteriano con un vector integrante. Los vectores integrantes contienen normalmente al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores integrantes construidos con ADN de varias cepas Bacillus se integran en el cromosoma de Baciillus (EP-A-55 0127328). Los vectores integrantes pueden comprender también secuencias de bacteriófagos o transposones.

Normalmente, los constructos extra-cromosómicos y de expresión integrantes pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que proporcionan bacterias

resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Ref. Microbiol. 32:469]. Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como aquellos en las vías biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

De manera alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente pueden colocarse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación comprenden normalmente un marcador seleccionable que se 5 mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector integrante, tal como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y de transformación, bien replicones extra-cromosómicos o bien vectores integrantes, han sido desarrollados para su transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión, entre otras, para las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582, EP-A-0036259 y EPA-0063953, WO84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 10 292:128, Amann et al. (1985) Gene 40:183, Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113, EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [patente US 4.745.056].

Los procedimientos de introducción de ADN exógeno en huéspedes bacterianos son bien conocidos en la técnica 15 y normalmente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. También puede Introducirse ADN en células bacteriana mediante electroporación. Los procedimientos de transformación varían normalmente con la especie bacteriana a transformar. Véase, por ejemplo [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 y EP-A-0063953; WO84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 20 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 25 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus]. 30

Células huéspedes

La invención proporciona una bacteria que expresa un polipéptido de la invención. La bacteria puede ser un meningococo. La bacteria puede expresar el polipéptido, de manera constitutiva, pero en algunas realizaciones la expresión puede estar bajo el control de un promotor inducible. La bacteria puede hiper-expresar el polipéptido (véase la ref. 294). La expresión del polipéptido puede no ser variable de fase. 35

La invención proporciona también vesículas de membrana externa preparadas a partir de una bacteria de la invención. También se proporciona en la presente memoria un procedimiento para producir vesículas a partir de una bacteria de la invención. Las vesículas preparadas a partir de estas cepas incluyen preferentemente el polipéptido de la invención, que debería estar en una forma inmunoaccesible en las vesículas, es decir, un anticuerpo que pueda unirse a un polipéptido purificado de la invención debería ser capaz también de unirse al 40 polipéptido que está presente en las vesículas.

Las vesículas de membrana externa incluyen cualquier vesícula proteoliposómica obtenida mediante alteración o vacuolización de una membrana externa meningocócica para formar vesículas a partir de la misma que incluyen componentes proteicos de la membrana externa. De esta manera, el término incluye VMEs (algunas veces denominadas "ampollas"), microvesículas (MVs [195] y "VMEs nativas' ("VMENs" [196]). 45

Las MVs y las VMENs son vesículas de membrana que ocurren de manera natural que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan al medio de cultivo. Las MVs pueden obtenerse cultivando Neisseria en medio de caldo de cultivo, separando células enteras de las MVs más pequeñas en el medio de caldo de cultivo (por ejemplo, mediante filtración o centrifugación a baja velocidad para formar gránulos de solo las células y no de las vesículas más pequeñas) y, a continuación, recoger las MVs del medio carente de 50 células (por ejemplo, mediante filtración mediante precipitación diferencial o agregación de MVs, mediante centrifugación a alta velocidad para formar gránulos de MVs). Las cepas para su uso en la producción de MVs pueden seleccionarse generalmente en base a la cantidad de MVs producidas en el cultivo, por ejemplo, las refs. 197 y 198 describen Neisseria con alta producción de MV.

Las VMEs se preparan artificialmente a partir de bacterias, y pueden prepararse usando tratamiento con 55 detergente (por ejemplo, con deoxicolato), o con medios no detergentes (por ejemplo, véase la referencia 199). Las técnicas para la formación de VMEs incluyen el tratamiento de bacterias con un detergente de sal ácido biliar

(por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodeoxicólico, ácido ursodeoxicólico, ácido deoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., siendo el deoxicolato de sodio [200 y 201] preferente para tratar Neisseria) a un pH suficientemente alto para no precipitar el detergente [202]. Pueden realizarse otras técnicas sustancialmente en ausencia de detergente [199] usando técnicas tales como sonicación, homogenización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, pulverización, prensa francesa, mezcla, etc. Los procedimiento que usan poco o 5 ningún detergente pueden retener antígenos útiles tales como NspA [199]. De esta manera, un procedimiento puede usar un tampón de extracción de VME con aproximadamente el 0,5% de deoxicolato o menos, por ejemplo, aproximadamente el 0,2%, aproximadamente el 0,1%, <0,05% o cero.

Un procedimiento útil para la preparación de VME se describe en la referencia 203 e implica una ultrafiltración en VMEs crudas, en lugar de centrifugación a alta velocidad. El procedimiento puede implicar una etapa de 10 ultracentrifugación después de realizar la ultrafiltración.

Las vesículas para su uso con la invención pueden prepararse a partir de cualquier cepa meningocócica. Las vesículas serán normalmente de la cepa de serogrupo B, pero es posible prepararlas a partir de serogrupos diferentes al B (por ejemplo, la referencia 202 describe un procedimiento para el serogrupo A), tal como A, C, W135 o Y. La cepa puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier 15 serosubtipo y cualquier inmunotipo (por ejemplo, L1, L2, L3, L3,3,7, L10; etc.). Los meningococos pueden ser de cualquier linaje adecuado, incluyendo linajes hiper-invasivos e hiper-virulentos, por ejemplo, cualquiera de los siete linajes hiper-virulentos siguientes: subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1; complejo ET-5; complejo ET-37, grupo A4, linaje 3.

Además de codificar un polipéptido de la invención, las bacterias de la invención pueden tener una o más 20 modificaciones adicionales. Por ejemplo, pueden tener un gen fur modificado [204]. La referencia 212 enseña que la expresión nspA debería aumentar con la inactivación simultánea de porA y cps, y estas modificaciones pueden ser usadas. Más mutantes knockout de N. meningitidis para la producción de VME se divulgan en las referencias 212 a 214. La referencia 205 divulga la construcción de vesículas a partir de cepas modificadas para expresar seis subtipos diferentes PorA. Puede usarse también una Neisseria mutante con niveles bajos de endotoxina, 25 obtenida desactivando las enzimas implicadas en la biosíntesis de LPS [206, 207]. También pueden usarse estos u otros mutantes con la invención.

De esta manera, en algunas realizaciones, una cepa usada con la invención puede expresar más de un subtipo PorA. Se han construido las cepas PorA 6-valentes o 9-valentes anteriormente. La cepa puede expresar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de los subtipos PorA: P1.7,16, P1.5-1,2-2, P1.19,15-1, P1.5-2,10, P1.12-1,13, P1.7-2,4, P1.22,14, 30 P1.7-1,1 y/o P1.18-1,3,6. En otras realizaciones, una cepa puede reducirse para la expresión de PorA, por ejemplo, en la que la cantidad de PorA se ha reducido al menos el 20% (por ejemplo, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95%,, etc.), o incluso se ha desactivado, con relación a los niveles de tipo salvaje (por ejemplo, con relación a la cepa H44/76).

En algunas realizaciones una cepa puede hiper-expresar (con relación a la cepa de tipo salvaje correspondiente) 35 ciertas proteínas. Por ejemplo, las cepas pueden hipar-expresar NspA, proteína 287 [208], fHBP [194], TbpA y/o TbpB [209], superóxido dismutasa Cu,Zn [209], HmbR, etc.

Un gen que codifica un polipéptido de la invención puede estar integrado en el cromosoma bacteriano o puede estar presente en forma episomal, por ejemplo, dentro de un plásmido.

De manera ventajosa para la producción de vesículas, un meningococo puede ser fabricado genéticamente para 40 asegurar que la expresión del polipéptido no esté sujeta a la variación de fase. Los procedimientos para reducir o eliminar la variabilidad de fase de la expresión génica en meningococos se divulgan en la referencia 210. Por ejemplo, un gen puede sr sustituido bajo el control de un promotor constitutivo o inducible, o eliminando o sustituyendo el motivo de ADN que es responsable de su variabilidad de fase.

En algunas realizaciones, una cepa puede incluir una o más mutaciones knockout y/o de hiper-expresión 45 divulgadas en las referencias 211 a 214. Los genes preferentes para la reducción y/o la desactivación incluyen: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB [211], (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB [212], (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB [213], y (d) CtrA, CtrB, 50 CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB y/o SynC [214].

Cuando se usa un cepa mutante, en algunas realizaciones puede tener una o más, o todas, las características siguientes: (I) LgtB y/o GalE reducido o desactivado para truncar los LOS meningocócicos; (10 TbpA aumentado; (iii) NhhA aumentado; (iv) Omp85 aumentado; (v) LbpA aumentado; (v1) NspA aumentado; (vii) PorA desactivo; (viii) FrpB reducido o desactivado; (ix) Opa reducido o desactivado; (x) Opc reducido o desactivado; (xii) complejo 55 de gen cps eliminado. Un LOS truncado puede ser aquel que no incluya un epítopo sialil-lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, podría ser un LOS con deficiencia de galactosa. Los LOS pueden no tener cadena α.

Dependiendo de la cepa meningocócica usada para preparar las vesículas, pueden incluir o no el antígeno fHBP nativo de la cepa [215].

Si hay presente LOS en una vesícula, es posible tratar la vesícula para unir sus LOS y componentes proteicos (conjugación "Intra-ampolla" [214]).

General 5

El término “que comprende” incluye “que incluye” así como “que consiste”, por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

El término "aproximadamente" con relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x ±10%.

La palabra "sustancialmente” no excluye "completamente”, por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra 10 "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención.

La "identidad de secuencia” se determina preferentemente mediante el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman según la implementación en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de hueco afín con parámetros penalización de abertura de hueco = 12 y penalización de extensión de hueco = 1.

Después del serogrupo, la clasificación meningocócica incluye el serotipo, el serosubtipo y a continuación el 15 inmunotipo, y la nomenclatura estándar enumera el serogrupo, el serotipo, el serosubtlpo y el inmunotlpo, cada uno separado por dos puntos, por ejemplo, B:4:P1.15:L3,7,9. Dentro del serogrupo B, algunos linajes causan enfermedades frecuentemente (hiper-invasivos), algunos linajes causan formas más severas de enfermedad que otros (hiper-virulentos) y otros rara vez causan enfermedad. Se reconocen siete linajes hiper-virulentos, concretamente los subgrupos I, III y IV-1, complejo ET-5, complejo ET-37, grupo A4 y linaje 3. Estos se han 20 definido mediante electroforesis de enzimas multilocus (EEML), pero también se ha usado tipificación de secuencias multilocus (TSML) para clasificar los meningococos [ref. 30]. Los cuatro grupos hiper-virulentos principales son los complejos ST32, ST44. ST8 y ST11.

En general, la invención no Incluye las diversas secuencias de PHBP específicamente divulgadas en las referencias 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 216. 25

Modos para realizar la invención

Ejemplo 1

Con la secuencia MC58 de tipo salvaje (SEC ID NO: 1) como una referencia, la referencia 15 preparó 72 secuencias fHBP modificadas. Estas son las SEC ID Nos: 4 a 75. Mediante una vía de diseño similar, los presentes inventores proporcionan ahora las SEC ID NOs: 77 y 78. 30

Los polipéptidos han sido expresados en E. coli con una metionina de terminal N seguida inmediatamente por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO. Los polipéptidos han sido combinados con adyuvante de hidróxido de aluminio, algunas veces con IC31™ incluido también y, a continuación, se han usado para inmunizar ratones. Los antisueros a partir de los ratones se han analizado en un ensayo bactericida contra un panel de cepas meningocócicas. El panel incluía cepas de cada una de las tres familias fHBP. También se usó el polipéptido 35 MC58 de tipo salvaje de las familias 1 y II para inmunizar ratones para una comparación.

El polipéptido que incluía SEC ID NO: 78 proporcionó resultados particularmente buenos. Los sueros contra este polipéptido eran bactericidas contra cinco cepas diferentes de la familia I MC58, NM008, M4030, GB185, NZ) y cuatro cepas diferentes de la familia II (961-5945, M3153, C11, M2552). Los títulos eran en general más bajos contra las cepas que cuando se usa una secuencia de tipo salvaje de una familia particular, pero ninguna de las 40 secuencias de tipo salvaje mostró una buena actividad bactericida intrafamiliar. De esta manera, las modificaciones aumentan efectivamente la protección cruzada entre cepas de fHBP.

Ejemplo 2

Varias de las secuencias fHBP modificadas se han fusionado a: (i) entre sí; (ii) secuencias fHBP de tipo salvaje; u (iii) otros antígenos meningocócicos. Estos se expresaron con o sin un marcador poli-histidina C-terminal y 45 purificadas a partir de E. coli usando IMAC.

Las proteínas de fusión se clasificaban en cuatro categorías principales: (a) fusiones de dos secuencias fHBP modificadas, que pueden ser iguales o diferentes; (b) fusiones de tres secuencias fHBP modificadas, que pueden ser iguales o diferentes; (c) fusiones de una secuencia fHBP de tipo salvaje a una o dos secuencias fHBP modificadas; y (d) fusiones de una secuencia fHBP modificada a un antígeno meningocócico no fHBP. Estas 50 diversas proteínas de fusión comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos:

(a) fusiones de dos secuencias fHBP modificadas, que pueden ser iguales o diferentes

9C-9C: SEC ID NO: 132

10A-10A: SEC ID NO: 134

10A-9C: SEC ID NO: 135

8B-8B: SEC ID NO: 138

9C-10A: SEC ID NO: 133

(b) fusiones de tres secuencias fHBP modificadas, que pueden ser iguales o diferentes

10A-10A-10A: SEC ID NO: 113

10A-10A-9C: SEC ID NO: 117

10A-9C-10A: SEC ID NO: 112

10A-9C-9C: SEC ID NO: 118

8B-8B-8B: SEC ID NO: 123

9C-10A-10A: SEC ID NO: 105

9C-10A-9C: SEC ID NO: 108

9C-9C-10A: SEC ID NO: 104

9C-9C-9C: SEC ID NO: 107

(c) fusiones de una secuencia fHBP de tipo salvaje a una o dos secuencias fHBP modificadas

10A-MC58: SEC ID NO: 131

10A-10A-MC58: SEC ID NO: 114

10A-MC58-10A: SEC ID NO: 115

10A-MC58-9C: SEC ID NO: 116

10A-9C-MC58: SEC ID NO: 111

MC58-10A: SEC ID NO: 137

MC58-10A-10A: SEC ID NO: 121

MC58-10A-9C: SEC ID NO: 119

MC58-9C: SEC ID NO: 136

MC58-9C-10A: SEC ID NO: 120

MC58-9C-9C: SEC ID NO: 122

9C-10A-MC58: SEC ID NO: 109

9C-MC58: SEC ID NO: 130

9C-MC58-10A: SEC ID NO: 106

9C-MC58-9C: SEC ID NO: 110

9C-9C-MC58: SEC ID NO: 103

(d) fusiones de una secuencia fHBP modificada a un antígeno meningocócico no fHBP. Por ejemplo:

936-10A-10A: SEC ID NO: 126

936-10A-9C: SEC ID NO: 125

936-9C-10A: SEC ID NO: 124

936-9C-9C: SEC ID NO: 127

936-10A: SEC ID NO: 129

936-9C: SEC ID NO: 128

NB: La secuencia 1OA es la SEC ID NO: 23; la secuencia 9C es la SEC ID NO: 20; la secuencia 8B es SEC ID NO: 17; la secuencia MC58 es SEC ID NO: 97 (es decir, aminoácidos 27-274 de la SEC ID NO: 1); y la secuencia 936 es la SEC ID NO: 98, incluyendo su propia metionina N-terminal.

Por ejemplo, para hacer la fusión 9C-9C la secuencia que codifica PATCH_9C (SEC ID NO: 20) se unió a través de un sitio de restricción BamHI y un enlazador de glicina (que codifica de esta manera la SEC ID NO: 81) a una 5 segunda copia de la secuencia de codificación, seguido por un sitio de restricción XhoI y un marcador hexa-histidina C-terminal (SEC ID NO: 95). Una secuencia aguas arriba proporcionó una metionina N-terminal, proporcionando la secuencia de 511 unidades méricas expresada final siguiente (SEC ID NO: 99, que comprende la SEC ID NO: 132):

10

imagen3

De manera similar, para hacer la fusión 10A-10A-10A, tres secuencias que codifican PATCH_10A (SEC ID NO: 23) se unieron a través de un sitio de restricción BamHI y un enlazador de glicina (codificando de esta manera SEC ID NO: 81), seguido de un sitio de restricción XhoI y un marcador hexa-histidina C-terminal (SEC ID NO: 95). Una secuencia aguas arriba proporcionó una metionina N-terminal, dando la secuencia de 762 unidades méricas expresada final siguiente (SEC ID NO: 100, que comprende la SEC ID NO: 113): 15

imagen4

De manera similar, para hacer la fusión 10A-MC58 la secuencia que codifica PATCH_10A (SEC ID NO: 23) se unió a través de un sitio de restricción BamHI y un enlazador de glicina (codificando de esta manera la SEC ID NO: 81) a la secuencia MC58 (codificando SEC ID NO: 97), seguido por un sitio de restricción XhoI y un marcador

hexa-histidina C-terminal (SEC ID NO: 95). Una secuencia aguas arriba proporcionó una metionina N-terminal, dando una secuencia de 509 unidades méricas expresada (SEC ID NO: 101, que comprende la SEC ID NO: 131):

imagen5

De manera similar, para hacer la fusión 936-9C la secuencia que codifica 936 (SEC ID NO: 98) fue unida a través 5 de un sitio de restricción BamHI y un enlazador de glicina (codificando de esta manera la SEC ID NO: 81) a la secuencia MC58 (que codifica SEC ID NO: 97), seguido por un sitio de restricción XhoI y un marcador hexa-histidina C-terminal (SEC ID NO: 95). Una secuencia aguas arriba proporcionó una metionina N-terminal, dando la secuencia de 442 unidades méricas expresada final siguiente (SEC ID NO: 102, que comprende la SEC ID NO: 128): 10

imagen6

Las proteínas de fusión se usaron para inmunizar ratones. Para la comparación, se usaron también los siguientes antígenos: fHBP de tipo salvaje de la cepa MC58 o 2996; fHBP 9C o 10A modificada; y se usaron también un híbrido de las familias I, II y III tal como se describe en la referencia 13. Los sueros resultantes se ensayaron para determinar su actividad bactericida contra un panel de cepas de familias I, II y III de fHBP. Los títulos eran los 15 siguientes después de dos inmunizaciones usando una mezcla de alum + IC31™ como adyuvante:

Familia fHBP: I II III

: MC58 NM008 M4030 GB195 NZ 5945 M3153 C11 M2552 M1239

MC58: >8192* 512 2048 <16 64 <64 <64 <64 <16 32

2996: <64 <16 <16 <16 <64 4096 512 64 256 128

10A: 1024 <16 1024 <16 64 64 <64 <64 <16 <16

9C: 8192 256 2048 <16 <64 512 <64 <64 <16 <16

936-10A: 8192 256 4096 1024 512 8192 2048 128 512 64

10A-MC58: >32768 2048 >8192 2048 2048 8192 1024 256 512 512

936-9C-10A: 16384 256 8192 2048 4096 8192 1024 512 1024 256

9C-9C-MC58: 16384 512 4096 64 64 256 <64 <64 <16 <16

9C-10A-9C: >32768 1024 8192 4096 4096 8192 2048 512 1024 256

10A-9C-: 8192* 2048 >8192 512 1024 8192 2048 <32 512 1024

10A

10A-10A-10A: 2048 16 2048 1024 1024 8192 2048 256 512 512

II-III-I: >32768 >16384 >8192 2048 1024 16384 4096 512 512 1024

Aunque las secuencias MC58 (familia I) y 2996 (familia II) muestran eficacia sólo contra las cepas con fHBP homólogo, la eficacia cruzada entre cepas se mejora mucho con las proteínas de fusión de la invención. Además, la eficacia de las secuencias 9C y 10A modificadas se mejora fusionando las mismas a 936 o a la secuencia MC58 fHBP de tipo salvaje. La fusión 9C-10A-9C muestra muy buenos resultados en el panel completo. 5

De esta manera, la fusión de las secuencias modificadas a otros antígenos ofrece una manera general de mejorar su capacidad de generar respuestas inmunes anti-meningocócicas.

Estudio de adyuvantes

Los polipéptidos PATCH_2S, PATCH_5bis, PATCH_5penta, PATCH_9C, PATCH_9F y PATCH_10A, junto con la secuencia fHBP de tipo salvaje de la cepa 2996, se usaron para inmunizar ratones con hidróxido de aluminio 10 (Al-H) y/o adyuvante (s) IC31™. Los sueros se ensayaron contra un panel de diez cepas de meningococo diferentes.

La combinación de Al-H+IC31™ proporcionó mejores resultados que solo Al-H cuando se ensayó con proteínas de fusión que contenían PATCH_9C y/o PATCH_10A y/o la secuencia MC58 de fHBP de tipo salvaje y/o antígeno 936 por ejemplo convirtiendo la eficacia contra sólo 1/10 de las cepas con Al-H en una eficacia contra 15 9/10 de las cepas cuando se usa una proteína de fusión que contiene 936 fusionada a dos copias de PATCH_10A (SEC ID NO: 18).

Usando la secuencia 936-10A-10A o una secuencia 936-9C-10A, los títulos bactericidas contra un panel de 10 cepas fueron:

: 936-10A-10A 936-9C-10A

: Al-H Al-H + IC31 Al-H Al-H IC31

A: 8192 ≥2768 8192 ≥32768

B: <16 4096 128 2048

C: 512 8192 1024 ≥8192

D: 256 2048 512 4096

E: 16 1024 256 4096

F: 64 8192 2048 16384

G: 128 2048 1024 4096

H: 16 1024 1024 4096

I: 64 4096 128 2048

J: 64 32 256 1024

20

Por lo tanto, con una excepción, la adición de IC31 mejoró los títulos.

936-10A-10A

La fusión 936-10A-10A se seleccionó para estudios adicionales (es decir, SEC ID NO: 126). Este polipéptido se formuló con Al-H en una composición que incluía 9 mg/ml de NaCl e histidina 10 mM, pH 6,5. Se mezclaron agua para inyección y tampón histidina y, a continuación, se añadió NaCl para proporcionar una osmolaridad final de 25 308 mOsm/kg. Se añadió Al-H para proporcionar una concentración Al+++ final de 3 mg/ml. El polipéptido se añadió para proporcionar una concentración final de 100 μg/ml, se dejó durante 15 minutos bajo agitación a

temperatura ambiente y, a continuación, se almacenó durante la noche a 4°C. Justo antes de la administración, se añadió IC31™ (con una relación molar 25:1 de péptido:ADN, 1 μmol de péptido) como una suspensión acuosa, mezclando volúmenes iguales. La mezcla final era isotónica y a un pH fisiológico. La adsorción de polipéptido fue > 90% (similar al nivel observado con solo Al-H).

Los animales (ratones hembra CDL de 6 semanas de edad), 8 por grupo, recibieron 20 μg de polipéptido 5 adyuvante por vía intraperitoneal en el día 0, con dosis de refuerzo en los días 21 y 35. Las muestras de sangre para el análisis fueron tomadas el día 49 y se analizaron mediante un ensayo bactericida, en presencia de complemento de conejo o humano, contra un panel de 11 cepas meningocócicas. Los títulos fueron los siguientes:

: Complemento de conejo Complemento humano

A: 16384 1024

B: 2048 512

C: 4096 >512

D: 4096 256

E: 4096 256

F: 8192 64

G: 4096 256

H: 1024* 256

I: 4096 -

J: 1024 256

K: - 512

* = título bacterioestático

10

Se observaron resultados similares independientemente de si el polipéptido 936-10A-10A tenía o no un marcador polihistidina C-terminal, pero, dependiendo del adyuvante usado, algunas veces se observó un mejor título cuando se usó el polipéptido 936-10A-10A con un marcador de histidina.

El polipéptido 936-10A-10A fue sustituido para el polipéptido el "936-fHBP 'en la vacuna “5CVMB”'divulgada en la referencia 108, para dar una mezcla de tres polipéptidos que tenían las secuencias de aminoácidos SEC ID NOs: 15 90, 139 y 126. Esta mezcla se denomina en adelante "5CVMB*”. Los títulos bactericidas eran similares, pero, al igual que anteriormente, dependiendo del adyuvante usado, algunas veces se observó un mejor título cuando se usó el polipéptido 936-10A-10A con un marcador de histidina.

Una mezcla 5CVMB* en la que 936-10A-10A tenía un marcador de purificación de histidina C-terminal se combinó con 2,5μg (medidos como proteína) de vesículas de membrana externa de la vacuna MeNZB™. Esta 20 mezcla (“5CVMB* + ¼ MV”) se comparó con 5CVMB* solo, con 5CVMB, o con 5CVMB en combinación con 10 μg de las VMEs. Los sueros obtenidos después de una inmunización con estas cuatro composiciones se ensayaron para determinar su actividad bactericida contra a un panel de 13 cepas, la sustitución del polipéptido 936-fHBP de 5CVMB con 936-10A-10A mejoró la cobertura de cepas, en presencia o ausencia de VMEs: el porcentaje de cepas para las que el título bactericida era > 1024 era siete puntos porcentuales más alto con 25 5CVMB* en comparación con 5CVMB, y era de 15 puntos porcentuales más alto con 5CVMB* + ¼ VME en comparación con 5CVMB + VME. Se observaron diferentes resultados usando un panel de cepas diferente.

Híbridos NL096

La referencia 15 divulga una secuencia de fHBP denominada “NL096” (SEC ID NO: 76 en la presente memoria). Esta proteína fHBP puede proporcionar sueros que son bactericida para de casi la totalidad de un panel de 11 30 cepas y, cuando se usa un adyuvante de hidróxido de aluminio, la cobertura de cepas conseguida por NL096 es superior a la cobertura conseguida por PATCH_10A.

De esta manera, se han diseñado híbridos de la secuencia NL096, incluyendo:

936-10A-NL096: SEC ID NO: 140

936-NL096-P10A: SEC ID NO: 141

936-NL096-NL096: SEC ID NO: 142

Cada una de estas tres secuencias puede ser expresada con una secuencia N-terminal (por ejemplo, con un único residuo de metionina) y/o con un marcador de histidina C-terminal, por ejemplo, para añadir la SEC ID NO: 96 en el extremo C-terminal.

Referencias 5

[1] Jodar et al. (2002) Lancet 359(9316):1499-1508.

[2] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.

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[211] WO01/09350.

[212] WO02/09746. 5

[213] WO02/062378.

[214] WO2004/014417.

[215] WO2004/046177.

[216] WO2004/094596

Nombres alternativos para las secuencias 1 a 78 en la lista de secuencias 10

SEC ID NO:: Descripción SEC ID NO: Descripción

1: fHBP, cepa MC58-familia I 40 PATCH_11L

2: fHBP, cepa 961-5945 & 2996 – familia II 41 PATCH_12

3: fHBP, cepa M1239-familia III 42 PATCH_12B

4: LOOP2 43 PATCH_12C

5: PATCH_1 44 PATCH_12C

6: PATCH_2 45 PATCH_12E

7: PATCH_2S 46 PATCH_12F

8: PATCH_2T 47 PATCH_12G

9: PATCH_2FAT 48 PATCH_12H

10: PATCH_3 49 PATCH_12I

11: PATCH_5 50 PATCH_12L

12: PATCH_5bis 51 PATCH_12M

13: PATCH_5tris 52 PATCH_12N

14: PATCH_5tetra 53 PATCH_13

15: PATCH_5penta 54 PATCH_13B

16: PATCH_8 55 PATCH_13C

17: PATCH_8B 56 PATCH_14

18: PATCH_9 57 PATCH_14B

19: PATCH_9B 58 PATCH_14C

20: PATCH_9C 59 PATCH_14D

21: PATCH_9D 60 PATCH_15A

22: PATCH_9E 61 PATCH_15B

23: PATCH_10A 62 PATCH_16A

24: PATCH_10B 63 PATCH_16B

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende una primera secuencia de aminoácidos inmunogénica y una segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica, en el que la primera secuencia de aminoácidos inmunogénica es la SEC ID NO 23.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que la segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica es (a) un 5 antígeno no meningocócico; (b) un antígeno no fHBP; (c) un antígeno fHBP meningocócico de tipo salvaje; o (d) una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs 23, 20, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78. 10
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs 126, 124, 125, 133, 134, 135, 112, 113, 117, 118, 104, 105, 108, 111, 114, 115, 116, 131, 137, 119, 121, 120, 109, 106, 129, 100, 101, 99, 102, 103, 107, 110, 122, 123, 127, 128, 130, 132, 136, 138, 140, 141, 142, 77 y 78.
4. Un polipéptido que comprende una primera secuencia de aminoácidos inmunogénica, una segunda secuencia 15 de aminoácidos inmunogénica y una tercera secuencia de aminoácidos inmunogénica, en el que:

la primera secuencia de aminoácidos inmunogénica es la SEC ID NO 23;

la segunda secuencia de aminoácidos inmunogénica es (a) un antígeno no meningocócico; (b) un antígeno no fHBP meningocócico; (c) un antígeno fHBP meningocócico de tipo salvaje; o (d) una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs 23, 20, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 20 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78; y

la tercera secuencia de aminoácidos inmunogénica es seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs 23, 20, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 25 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78.
5. Ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Un plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 30
7. Una célula huésped no humana transformada con el plásmido según la reivindicación 6.
8. Célula huésped según la reivindicación 7, en la que la célula es una bacteria meningocócica.
9. Vesículas de membrana preparadas a partir de la célula huésped de la reivindicación 8, en las que las vesículas incluyen un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
10. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 35 a 4 o una vesícula según la reivindicación 9.
11. Composición según la reivindicación 10, que comprende un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 90, un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 139, y un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 126.
12. Composición según la reivindicación 11, que incluye vesículas de membrana externa meningocócicas. 40
13. Composición según la reivindicación 11, que no incluye vesículas de membrana externa meningocócicas.
14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que incluye un adyuvante, preferiblemente en la que el adyuvante comprende una sal de aluminio.
15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende además un segundo polipéptido que, cuando es administrado a un mamífero, genera una respuesta de anticuerpos que es bactericida 45 contra meningococo, con la condición de que el segundo polipéptido no sea una fHBP meningocócica.
16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que comprende además un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y.
17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, que comprende además un sacárido capsular neumocócico conjugado.
18. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, para su uso en un procedimiento para aumentar una respuesta de anticuerpos en un mamífero.
19. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, para su uso en un procedimiento 5 de protección de un mamífero contra una infección y/o enfermedad por Neisseria.