MX2008011360A - Compuestos inmunodulares y tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobreproduccion de citoquinas inflamatorias. - Google Patents

Compuestos inmunodulares y tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobreproduccion de citoquinas inflamatorias.

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MX2008011360A
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Abstract

La invención es concerniente con el uso de compuestos inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobreproducción de citoquinas inflamatorias, tales como enfermedades seleccionadas del grupo que consiste de asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, prostatitis, enfermedad de intestino inflamatorio, diabetes y artritis reumatoide, dichos compuestos son de fórmula general (I): (ver fórmula (I)) en donde: - m y n, independientemente entre sí, son un número entero que fluctúa de 1 a 4, - X e Y representan -COOH, -O-P(O) (OH)2, -O-S02(OH), -NH2, -OH, -CONH(CH2)n1-NH2, -CO-NH-CH(COOH) -(CH2)n1-COOH, -CO-NH-CH(COOH) - (CH2)n1-NH2, -O-CO-(CH2)n1-NH2, -O-CO-(CH2)n1-CHOH- CH2OH, -O-CO-(CH2)n1-OH, -O-CO-(CH2)n1-COOH, -O-CO-(CH2)n1-CHO, -O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2 -COOH, -R1 y R2 cada uno designan un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico saturado o insaturado de cadena recta o ramificada, que tiene de 2 a 18 átomos de carbono, que está sin sustituir o lleva uno a tres substituyentes seleccionados de entre hidroxilo, dihidroxifosforiloxi, alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, alcoxi de 2 a 18 átomos del carbono, aciloxi de 2 a 18 átomos del carbono en la porción acilo, amino, acilamino.

Description

COMPUESTOS INMUNOMODULADORES Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA SOBREPRODUCCION DE CITOQUINAS INFLAMATORIAS DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención es concerniente con el uso de compuestos inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobreproducción de citoquinas, inflamatorias, tales como enfermedades seleccionadas de un grupo consiste de asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, prostatitis, enfermedad de intestino inflamatorio, diabetes y artritis reumatoide . Han habido recientemente avances principales en el entendimiento del mecanismo de activación del sistema inmune innato mediante señales microbianas. También se ha vuelto claro que tal activación del sistema inmune innato es esencial para iniciar respuestas inmunes adaptables y para determinar el tipo de respuestas adaptables que son generadas. Conjuntamente, estas observaciones han generado una enorme renovación de interés en procedimientos racionales al desarrollo de inmunoterapia . Dos descubrimientos principales han sido cruciales al entendimiento incrementado de la activación inmune innata: (1) El papel de las células dendriticas (DC) como las células que presentan antigeno responsables por la inducción de respuesta inmunes en varias, (2) El descubrimiento de receptores semejantes a Toll (TLR) y otros receptores de "reconocimiento de patrón" que detectan la presencia de estructuras microbianas, que conducen a la estimulación del sistema inmune innato. Sallusto y Lanzavecchia reportaron por primera vez que las DC inmaduras a partir de monocitos humanos en un medio complementado con GM-CSF e IL-4 (Sallusto F, Lanzavecchia A. J Exp Med 1994,179:1109-18) . Sin embargo, se hizo rápidamente evidente que, además de GM-CSF e IL-4, se requería un factor de maduración adicional para obtener DC maduras que fueran plenamente funcionales como células que representan antígeno (APC) . Las DC maduras son capaces de iniciar y direccional la respuesta inmune adaptable. Tales señales de maduración pueden ser provistas mediante productos microbianos. Se ha demostrado que estos productos actúan por medio de TLR. Once TLR han sido identificados, capaces de reconocer diferentes productos microbianos. TLR4 es el receptor que reconoce específicamente el poliliposacár ido bacteriano (LPS) , uno de los estimuladores más potentes del sistema inmune innato conocidos. La solicitud internacional O 2005 007699 describe el uso de elementos de enlace específicos, en particular de moléculas de anticuerpos de IL-13 humanas y especialmente aquellas que neutralizan la actividad de IL-13, en la diagnosis de alteraciones IL-13 relacionadas, en las que se incluyen asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad del intestino inflamatorio y linfoma de Hodgkin. Sin embargo, todavía son necesarias investigaciones para saber el papel exacto de IL-13 en la inmunomodulación y la interpretación de resultados concernientes con el estudio de la ruta IL-13/IL-4 de naturaleza hipotética, como se muestra en las dos publicaciones recientes. La publicación "IL-4/IL-13 pathway genetics strongly influence serum IgE levéis and childhood asthma" por Michael Kabesch et al., (J. Allergy Clin. Immunol. Volumen 117, Número 2) afirma que la producción IgE, una marca de asma y enfermedad atópica, puede estar bajo control genético que involucra genes de la ruta IL-4 e IL-13. Debido a que la connotación o cambio de IgE es fundamental para la inmunidad y supervivencia humana, la regulación de IgE es delicada. Aunque la ruta de IL-4 e IL-13 puede influenciar el desarrollo de asma principalmente por medio de su efecto sobre la regulación de IgE. Los resultados dados indican que este puede no ser exclusivamente el caso. La publicación "IL-4/IL-13 pathway genetics strongly influence serum IgE levéis and childhood asthma" de Michael Kabesch et al., (J. Allergy Clin. Immunol. Volume 117, Number 2) describe los hallazgos principales enlazados con pruebas clínicas que han cambiado el manejo de asma y que no tienen y que merecen estudio adicional se reporta que IL-4, una citoquina que es requerida para la respuesta IgE célula B, es critica a la respuesta de hipersensibilidad Tipo I y que IL-4 fue por consiguiente una de las primeras citoquinas ha ser fundadas en estudios de clínicos de asma al usar una forma soluble a la cadena del receptor a de IL-4 (el sIL-4Ra), que se enlaza a e inactiva IL-4. IL-13 es otra citoquina que tiene otros de los muchos efectos como IL-4 pero que no es inhibida por sIL-4a. La conclusión es que estudios futuros podrían intentar por consiguiente inhibir IL-4 como IL-13 simultáneamente para el tratamiento del asma. La presente invención depende de la demostración de los inventores de que las moléculas como se describen posteriormente en la presente son agonistas eficientes de TLR4 con un buen perfil de seguridad, que son aptas de inducir la maduración completa de DC monocitos-derivadas funcionales, también como la activación de otros tipos de células que estresan de TLR . Las DC tratadas con compuestos de acuerdo con la invención son aptas de inducir la activación de célula T primaria y favorecer respuestas inmunes celulares de Thl . Los inventores también demostraron que los compuestos de acuerdo con la invención son aptos de disminuir notablemente la secreción de IL-13 por células CD4 + T activadas policlonalmente mediante anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Además, cuando uno de los compuestos eran administrados por las rutas i.p. o i.n. en un modelo murino de asma, los inventores demuestran una prevención de las respuestas alérgicas producidas por la sensibilización de antígeno y exposición a aerosol consecuente del antigeno. Los parámetros inmunológicos medidos sugieren una disminución relativa en respuesta Th2, que pueden explicar el mecanismo mediante el cual los compuestos de acuerdo con la invención están actuando en este modelo de asma. Adicionalmente , los autores demostraron que el compuesto de la invención es apto de disminuir la presencia de diabetes en ratones diabéticos no obesos . La presente invención es concerniente con un método para tratamiento de animales de sangre caliente en los que se incluyen humanos, que sufren de una enfermedad o alteración relacionada con la sobreproducción de citoquinas inflamatorias, que comprende la administración a un paciente en necesidad de la misma de una cantidad apropiada de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un compuesto inmunomoduladora de la siguiente fórmula general (I): X- ( CH2 ) m-C* 1H-CO-NH- ( CH2 ) n- C* 2H-CH2-Y ( I ) en donde : - m y n, independientemente entre si, son un número entero que fluctúa de 1 a , - X e Y, cada uno designan ya sea un grupo en estado neutro o cargado, seleccionado de los siguientes grupos: - carboxilo -OH, - dihidroxifosforiloxi -0-P (0) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(0H), - amino -NH2, - hidroxilo -OH, [ (amino (Ci~Cio) alquil] aminocarbonilo -CONH (CH2) ni~ NH2, n es un número entero de 1 a 10, [dicarboxi (Ci-C5) alquil] aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni-COOH, n es un número entero de 1 a 5, { carboxi [ amino (C1-C5 ) alquil ] } aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni-NH2, n es un número entero de 1 a 5, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ??-??2, n es un número entero de 1 a 15, dihidroxi (Ci-C10) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) nl-CHOH-CH2OH, n es un número entero de 1 a 10, - hidroxi (C1-C10) alcanoiloxi-O-CO- (CH2) nl-OH, n es un número entero de 1 a 10, - carboxi (Ci-C10) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) nl-COOH, n es un número entero de 1 a 10, - oxo (C1-C5) alcanoiloxi - -O-CO- (CH2) nl-CHO, n es un número entero de 1 a 5, - [carboxi (C1-C10) alcanoil ] amino (C1-C15) alcanoiloxi -0-CO- (CH2) ni-NH-CO- (CH2) n2-C00H, n es un número entero de 1 a 15, - Ri y R2 cada uno designan un grupo acilo derivado de de un ácido carboxilico saturado o insaturado de cadena recta o ramificada, que tiene de 2 a 18 átomos de carbono, que está sin sustituir o lleva uno a tres subst ituyentes seleccionados de entre hidroxilo, dihidroxifosforiloxi , alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, alcoxi de 2 a 18 átomos del carbono, aciloxi de 2 a 18 átomos del carbono en la porción acilo, amino, acilamino, - C*i y C*2, independientemente entre si, son átomos de carbono asimétricos en configuración R, S o en forma racémica RS o una sal, solvato o isómero del mismo, estable farmacéuticamente, opcionalmente en conjugación o mezcla con un diluyente o portador aceptable farmacéuticamente, no tóxico, inerte . La invención es concerniente más en particular con un método como define anteriormente en la presente, en donde: - X es seleccionado de los siguientes grupos: - carboxilo -OH, - dihidroxifosforiloxi -0-P (0) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(0H), - amino -NH2, [ (amino (Ci-Cio) alquil] aminocarbonilo -CONH (CH2) nl-NH2, n es un número entero de 1 a 10, [dicarboxi (C1-C5) alquil] aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni-COOH, n es un número entero de 1 a 5, { carboxi [amino (C1-C5) alquil ] } aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni_NH2, n es un número entero de 1 a 5, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -0-C0- (CH2) nl-NH2, n es un número entero de 1 a 15 e Y es seleccionado de los siguientes grupos: - dihidroxifosforiloxi -0-P (0) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(0H) , - amino - NH2, - hidroxilo - OH, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni-NH2, n es un número entero de 1 a 15, dihidroxi (C1-C10) alcanoiloxi -0-C0- (CH2) ni-CH0H-CH20H, n es un número entero de 1 a 10, - hidroxi (C1-C10) alcanoiloxi-O-CO- (CH2) ni-OH, n es un número entero de 1 a 10, - carboxi (C1-C10) alcanoiloxi -0-CO- (CH2) ni-COOH, n es un número entero de 1 a 10, - oxo (C1-C5) alcanoiloxi - -O-CO- (CH2) ni-CHO, n es un número entero de 1 a 5, - [carboxi (C1-C10) alcanoil] amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni-NH-CO- (CH2) n2-COOH, n es un número entero de 1 a 15. La invención es concerniente más en particular con un método como se define anteriormente, en donde: - X es seleccionado de los siguientes grupos: - carboxilo -OH, - dihidroxifosforiloxi -0-P (0) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02 (OH) , - amino -NH2, [ (amino (Ci-Cio) alquil ] aminocarbonilo -CONH (CH2) ni~ NH2, n es un número entero de 1 a 6, [dicarboxi (Ci-C5) alquil] aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni-C00H, n es un número entero de 1 a 5, { carboxi [amino (C1-C5) alquil] } aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni_NH2, n es un número entero de 1 a 5, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni-NH2, n es un número entero de 1 a 12 e Y es seleccionado de los siguientes grupos: - dihidroxifosforiloxi -0-P (0) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(0H), - amino - NH2, - hidroxilo - OH, - amino (0?-0?5) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) NX-NH2, n es un número entero de 2 a 12, dihidroxi (CÍ-CIO) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) nl-CH0H-CH20H, n es un número entero de 3 a 7 , hidroxi (C1-C10) alcanoiloxi-O-CO- (CH2) ??-??, n es un número entero de 2 a 6, - carboxi (Ci-Cio) alcanoiloxi -O-CO- (CH2 ) ni-COOH , n es un número entero de 3 a 6, - oxo (C1- C5 ) alcanoiloxi - -O-CO- (CH2 ) ni~CHO, n es un número entero de 2 a 5, - [carboxi (C1-C10) alcanoil] amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni-NH-CO- (CH2) n2-COOH, n es un número entero de 2 a 12. La invención es concerniente más en particular con un método como se define anteriormente, en donde: - X es seleccionado de los siguientes grupos: -COOH, -O-P(O) (OH)2, -0-S02 (OH) , -NH2, -CO-NH- (CH2) 3-NH2, o -CONH- ( CH2 ) 6-NH2 , -CO-NH-CH (COOH) -CH2-COOH, -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) „-NH2, -O-CO- (CH2) 5-NH2 e - Y es seleccionado de los siguientes grupos: -O-P(O) (OH)2, -0-S02 (OH) , -NH2, -OH, -0-CO-CH2-NH2 (2-aminoetanoiloxi) , -O-CO- (CH2 ) 2-NH2 (3-aminopropanoiloxi), -O-CO- (CH2) 5-NH2 (6-aminohexanoiloxi) o -O- CO- (CH2) 11- H2 ( 12-aminododecanoiloxi ) , -O-CO- (CH2) 4-CHOH-CH2OH (6, 7-dihidroxiheptanoiloxi ) , -O-CO- (CH2) 5-OH ( 6-hidroxihexanoiloxi) , -O-CO- (CH2) 2-COOH (3-carboxipropanoiloxi) , -O-CO- (CH2) 4-CHO ( 6-oxohexanoiloxi ) , -O-CO- (CH2) 5-NH-CO- (CH2) 2-COOH ( 3-carboxipropanoil-ami-nohexanoiloxi ) . La invención es concerniente más particular con un método como se define anteriormente, en donde Ri y R2 son escogidos de entre: -CO-CH2-C*H [O-CO- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3, (3 (Ci20) Cu) , -CO-CH2-C*HOH- (CH2) 10-CH3, (3 (HO) Ci4) , -CO-CH3, (C2), -CO-CH2-NH-CO-C*H [O-CO- (CH2) 8-CH3] - (CH2) 5-CH3, ( [2 (C10O)C8]NC2) , -CO-C*H [O-CO- (CH2) 4-CH3] - (CH2) 5-CH3, (2 (C60) C8) , -CO-(CH2)i6-CH3, (C18), -CO-CH2-C*H [0-CH2-C6H5] - (CH2) 10-CH3, (3 (BnO) Cu) , -CO-CH2-C*H[0-P(0) (0H)2] - (CH2) 10-CH3 , (3[(OH)2- P(0)0]C14) , C* correspondiente a un átomo de carbono asimétrico en configuración R, S, o en forma racémica RS, en las fórmulas mencionadas anteriormente. La invención es concerniente en particular con un método como se define en la presente, en donde: - Ri es escogido de entre: -CO-CH2-C* H [0-C0- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3, (3 (Ci20) C14) , -CO-CH2-C* HOH- (CH2) 10-CH3, (3 (HO) d4) , -CO-CH3, (C2), -CO-CH2-NH-CO-C**1H [0-C0- (CH2) 8-CH3] - (CH2) 5-CH3, ( [2 (C10O)C8]NC2) , -CO-C'^H [0-C0- (CH2) 4-CH3] - (CH2) 5-CH3, (2 (C60) C8) , -C0- (CH2) i6-CH3, (C18), - R2 es escogido de entre: -CO-CH2-C**2H [0-C0- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3, (3 (C12O) C14) , -CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3, (3 (HO) C14) , -CO-CH2-C+*2H [0-CH2-C6H5] - (CH2) 10-CH3, (3 (BnO) Cu) , -CO-CH2-C**2H[0-P(0) (0H)2] - (CH2) 10-CH3, (3[(OH)2- P(0)0]Ci4) . C**1 y C**2 correspondientes con átomos de carbono asimétricos en configuración R o S o en forma racémica RS, en las fórmulas mencionadas anteriormente. La invención también es concerniente con un método como se define anteriormente, en donde el compuesto administrado tiene la fórmula general (II) X- (CH2)m-C H-CO-NH- (CH2) 3-C+2H-CH2-Y (II) I I HRx NHR2 En donde X, Y, Ri, R2, y m son como se definen anteriormente, C*1 está en configuración R, S o es la forma racémica RS y C*2 está en configuración R. La invención es concerniente más en particular con un método como se define anteriormente, en donde el compuesto administrado es seleccionado de entre aquéllos de fórmula (II) en donde : - X = -O-P(O) (OH)2, Y = -O-P(O) (OH)2, Ri = -CO-CH2-C* H [O-CO- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3, R2 = -CO-CH2-C+ *2HOH- (CH2) 10-CH3, m = 2, C*1 está en configuración S, C**2 está en configuración R; C**1 y C**2 están en configuración R, esto es (3S, 9R) -3- [ ( R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4 -oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxi-tetradecanoilamino ] -decan-1 , 10-diol (l,10)-bis-dihidrogenofosfato (OM-294-DP (S,R)), - X = -O-P(O) (OH) 2, Y = -O-CO- (CH2) 4-CHOH-CH2OH, Rx = -CO-CH2-C"1H [O-CO- (CH2) i0-CH3] -(CH2)io-CH3, R2 = -CO-CH2-C+*2HOH- (CH2) io-CH3, m = 2, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, C**1 y C**2 están en configuración R, esto es, (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxi tetradecanoil amino] -decan-1 , 10-diol 1-dihidrogenofosfato 10-(6, 7-dihidroxiheptanoato) (OM-197-MP-HD (S,R)), - X = - COOH, Y = - O-CO- (CH2) 4-CHOH-CH20H, Ri = - CO-CI^-C**^ [O-CO- (CH2) xo-CH3] - (CH2) 10-CH3, R2 = - CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3, m = 1, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, C**1 y C**2 están en configuración R, esto es ácido N-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoil ] -L-aspartico, cc-N- { (4R)-5-hidroxi-4-[ ( R) -3-hidroxitetradecanoilamino] pentil } amida 5-0- (6, 7-dihidroxiheptanoato) (OM-197-MC-HD (S,R)), - X = -0-P (0) (OH) 2, Y = - O-CO- (CH2) 5-NH2, Ri = - C0-CH2-C**1H [O-CO- (CH2) 10-CH3] -(CH2)10-CH3, R2 = - CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3, m = 2, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, c**1 y c**2 están en configuración R, esto es (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxi-tetradecanoilamino ] -decan-1 , 10-diol 1-dihidrogeno fosfato 10-(6-aminohexanoato) (OM-197-MP-CA (S,R) ) , - X = - NH2, Y = -0-P(0) (0H)2, Ri = " CO-CH2-C**lH[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, R2 = - CO-CH2-C**2HOH- (CH2) i0-CH3,m = 4, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, c**1 y C**2 están en configuración R, es decir ( 5S, 11R) -l-amino-5- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -6-oxo-7-aza-ll- [ (R) -3-hidroxi-tetradecanoilamino] -dodecan-12-ol 12-dihidrogeno fosfato (0M-294-BA-MP (S, R) ) . La invención también es concerniente con un método como se define anteriormente, para el tratamiento de animales de sangre caliente en los que se incluyen humanos, que sufren de una enfermedad o alteración relacionada con una superproducción de citoquinas inflamatorias o marcadores de enfermedad inflamatoria mediante linfocitos T activados, monocitos o células que presentan antigeno en el organismo, en donde los citoquina inflamatorias o marcadores de enfermedad inflamatoria pertenecen al grupo que consisten de IL-1, IL-4, IL-5 IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IFN -, TNF -, y MCP La invención es concerniente más en particular con un método como se define anteriormente, en donde la enfermedad es seleccionada del grupo que consiste de asma, diabetes, dermatitis atópica, rinitis alérgica, prostatitis, enfermedad de intestino inflamatorio y artritis reumatoide. La invención también es concerniente más en particular con un método como se define anteriormente, que consiste de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquier compuesto de fórmula (I) como se define anteriormente de la invención en un portador excipiente o formulación aceptable farmacéuticamente, vía una ruta mucosal o parenteral. La invención también es concerniente más particular con un método como se define anteriormente, que consiste en administrar una cantidad terapéutica efectiva de fórmula (I) como se define anteriormente de la invención, preferiblemente vía las rutas peritoneal, subcutánea, oral, intranasal, sublingual o en aerosol. La invención es concerniente más en particular con composiciones farmacéuticas gastro-resistentes que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) como se define anteriormente en la asociación con un portador gastro-resistente tal como surfactantes de poloxamero hidrofilico tales como poloxamer 407 (Lutrol F-127) . Portadores coloidales tales como nanopart iculas poliméricas o micropart iculas también son formulaciones apropiadas para la administración oral de la fórmula (I) cuando se usan polímeros entéricos tales como polímeros de metacrilato. De manera más convencional, el uso de tabletas o cápsulas gastro-resistentes se obtiene mediante el uso de un recubrimiento entérico o podría ser también una alternativa para la ruta oral. La invención también es concerniente más en particular con un método como se define anteriormente, en donde las dosificaciones necesarias de las moléculas inmunomoduladoras de fórmula (I) como se define anteriormente de la invención fluctúan de 0.01 a 50 mg/m2 en humanos. La invención también es concerniente con el uso de por lo menos un compuesto de fórmula (I) como se define anteriormente para la preparación de un fármaco para la prevención o tratamiento de una enfermedad o alteración tal como asma, diabetes, dermatitis atópica, rinitis alérgica, prostatitis, enfermedad de intestino inflamatorio y artritis reumatoide, relacionada con la sobreproducción de citoquinas inflamatorias o marcadores de enfermedad inflamatoria. La invención también es concerniente con compuestos de fórmula (I) como se definen anteriormente y los farmacéuticos que contienen los compuestos en asociación con un portador aceptable fisiológicamente. Los compuestos de fórmula (I) como se definen anteriormente, de la presente invención, pueden ser preparados de acuerdo con el método descrito en WO 00/00460 y WO 01/46127, en relación con la preparación y uso de compuestos de fórmula (I) en el tratamiento de cánceres o como adyuvantes. La invención será descrita adicionalmente en detalle en la siguiente descripción de la síntesis de compuestos OM-294-DP (S,R), OM-197-MP-HD (S,R), OM-197-MC-HD (S,R), OM-197-MP-AC (S,R) y OM-294-BA-MP (S,R) y de sus propiedades biológicas .
EJEMPLOS EJEMPLO 1: (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -?-???-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] -decan-1 , 10-diol 1-dihidrogenofosfato 10- (6-aminohexanoato) (= OM-197-MP-AC (S,R)) (Esquema de Reacción 1) 1. (2R) -5- (benciloxicarbonilamino) -2-¿(R) -3-benciloxitetra-decanoi lamino]-! - (2-tetrahidropiraniloxi) pentano (C-l) A una solución de ( 2R) -5- (benciloxicarbonilamino) -2-[ (R) -3-bencil oxitetra-decanoyiamino]pentan-l-ol ( PCT O00146127A1) (2.5 g ; 4.39 mmol) en CH2C12 anhidro (83 mi) a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón se agregaron sucesivamente 3 , 4 -dihidro-2H-pi.rano (DHP) (1.4 mi, 15.38 mmol) luego p-toluenesulfonato de piridinio (PPTS) (441 mg, 1.75 mmol) . La solución fue agitada durante 18 horas a temperatura ambiente, luego diluida con CH2CI2 (100 mi), lavada con NaHC03 acuoso al 5%, luego con H20. La fase orgánica fue secada sobre MgS04, filtrada y concentrada. La purificación mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (AcOEt/pet. Éter 4/1) dio el compuesto C-l (2.86 g; 100%) como un sólido cristalino blanco. (Rf = 0.66 en AcOEt/pet. éter 4/1; U.V. y fosfomolibdato) . C39H6o 206. IS/MS: m/z 653.5 ([M+H]+), 675.5 ([M+Na]+) . Punto de fusión = 84-86°C. 2. (2R) -5-amino-2-¿ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino]-l- (2-tetrahidropiraniloxi ) -pentano (C-2) Una solución del compuesto C-l (2.5 g; 4.4 mmol) en EtOH (150 mi) que contiene trietilamina (4 mi) fue hidrogenada en presencia de Pd al 10% sobre C a temperatura ambiente y bajo presión atmosférica de hidrógeno durante 3.5 horas. El catalizador fue removido mediante filtración, lavado con etanol y el filtrado fue concentrado y secado bajo alto vacio para dar la amina libre C-2 (2.15 g; 96%) como un sólido blanco amorfo. C3iH54 204. IS/MS: m/z 519.5 ([M+H]+) . 3. (S) - (a) -[ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-Y-butiro-lactona (C-3) A una solución de ácido (R)-3-dodecanoiloxitetradecanoico [Bull. Chem. Soc. Jpn 60_ (1987) , 2205-2214] (2.16 g; 5.1 mmol) en THF anhidro (28 mi) a -15°C y bajo atmósfera de argón se agregaron sucesivamente N-met ilmorfolina (0.56 mi; 5.1 mmol; 1 eq) y cloroformiato de isobutilo (657 µ?; 5.1 mmol; 1 eq) . Después de una hora bajo agitación a -15°C, se agregó bromhidrato de L-homoserina lactona (916 mg; 5.1 mmol; 1 eq) como una solución en 0.72 M NaHCC>3 acuoso (14 mi, 2 eq) . La mezcla de reacción fue agitada durante 20 horas a temperatura ambiente. La mezcla fue diluida con Et20 (130 mi), la fase orgánica fue separada y lavada con H20 luego secada sobre gS04, filtrada y concentrada. La purificación mediante cristalización (volumen mínimo de CH2CI2 y exceso de pentano a 0°C) dio el compuesto C-3 (2.17 g; 85%) como un sólido blaNCO. C30H55NO5. IS/MS: m/z 510.5 ( [M+H]+) , 532.5 ([M+Na]+) . Punto de fusión = 79-80°C. 4. (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxyietradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] -10- ( 2-tetrahidropiranil ) oxi-decan-l-ol (C-4) A una solución del compuesto C-2 (638 mg, 1.23 mmol, 1.3 eq) en CH2C12 anhidro (1.5 mi) a 20-21°C se agrega el compuesto C-3 (483 mg, 0.95 mmol) . La solución fue agitada durante 3 días a 20-21°C; el solvente fue evaporado bajo presión reducida. La purificación mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (CH2Cl2/acetona 5/1 a 1/1) dio el alcohol C-4 (829 mg, 85%) como un sólido blanco. C 61 H 109N 3O9 . IS/MS: m/z 1029.0 ([M+H]+), 1051.0 ([M+Na]+) . Punto de fusión = 81-82°C. 5. Dibencilfosfato de (3S, 9R) -3- [ (R) -3-Dodecanoil-oxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] -10- (2-tetrahidropiranil) oxi-decan-l-ol (C-5) A una solución del alcohol C-4 (120 mg; 0.12 mmol) y ltf-tetrazol (25 mg; 0.35 mmol; 3 eq) en THF anhidro (5 mi) a temperatura ambiente y bajo atmósfera argón se agregó N,N- dibencildietilfosforamidita (85%, 95 µ?; 0.27 mmol; 2.3 eq) . Después de 45 minutos bajo agitación, la mezcla de reacción fue enfriada a - 40°C, luego se agregó una solución de mCPBA (57-86%; 75 mg; 0.43 mmol; 3,7 eq) en CH2C12 (3 mi) . Después de 45 min a - 40°C, la mezcla fue calentada y se agregó una solución saturada de a2S203 (3 mi) y la mezcla fue agitada durante 10 minutos. La solución fue diluida con éter, la fase orgánica fue separada y lavada con Na2S203 saturado (5x), luego con NaHC03 saturado (2x) . la fase orgánica fue secada sobre MgS04, filtrada y concentrada. La purificación mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (CH2Cl2/acetona 4/1 luego 2/1) dio el fosfato de dibencilo C-5 (126 mg; 84%) como un sólido amorfo . 6. 1- (dibencilfosfato) de (_3S_, 9R) -3- [ (R) -3-dode-canoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-benciloxi-tetradecanoilamino] -decan-1, 10-diol (C-6) A una solución de HC1 al 1% en methanol (25 mi) a 0°C se agregó una solución del compuesto C-5 (700 mg, 0.54 mmol) en CH2C12 (2.5 mi) . Después de 45 minutos bajo agitación a 0°C, la mezcla de reacción fue neutralizada con NaHC03 acuoso al 5%, diluida con CH2C12, luego la fase orgánica fue separada. La fase acuosa fue extraída con ??2012 (3x) , luego las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre MgS04, filtradas y concentradas para dar el alcohol C-6 (640 mg; 98%) . 7. 1-dibencil fosfato 10- ( 6-benciloxicarbonilaminohexanoato) de (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4 -???-5-aza-9- [ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] -decan-1, 10-diol (C-7) A una solución del compuesto preparado anteriormente C-6 (640 mg, 0.53 mmol . ) y ácido 6- (benciloxicarbonilamino) hexanoico (423 mg, 1.60 mmol.) en CH2CI2 anhidro (25 mi) a 0°C y bajo flujo de argón, se agregó en sucesión clorhidrato de 1- ( 3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimida disponible comercialmente (306 mg, 1.60 mmol.) y 4 -dimet ilaminopiridina (20 mg, 160 µp??? . ) . Luego la mezcla de reacción es agitada durante 30 minutos a 0°C y después de esto durante toda la noche a temperatura ambiente. Luego el medio de reacción es lavado con agua y una solución de HC1 1N seguida por separación de capas. La capa orgánica es secada sobre gS04, filtrada y evaporada. Al llevar a cabo una purificación de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (4/1 luego 2/1 de CH2Cl2/acetona eluyente) , se recupera el producto de reaccción de acoplamiento C-7 (537 mg; 71%) . RMN 13C (62,89 Hz , CDCI3), d en ppm: 173.18, 171.16, 170.38, 169.60, 156.30, 138.23, 136.50, 135.38, 135.28, 128.42, 128.26, 128.17, 127. 79 , 127.74, 127.44, 76.48, 71.15, 70.84, 69.47, 69.39, 69.31, 66.25, 65.62, 64.37, 49.78, 47.76, 41.41, 41.34, 40.57, 38.97, 34.22, 34.16, 33.96, 33.57, 32.95, 31.70 , 29.15, 28.95, 28.32, 25.87, 25.46, 25.02, 28.80, 24.18, 22.49, 13.94. 8. 1-dihidrogenfosfato 10- ( 6-aminohexanoato ) de (3S, 9R) -3-[ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4 -oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] -decan-1 , 10-diol (C-8) (= OM-197-MP-AC (S,R)) Una solución del compuesto C-7 (500 mg, 0.35 mmol . ) en una mezcla de 5/2 de CH2CI2 /etanol (70 mi) que contiene ácido acético (10 mi) es hidrogenada en presencia de Pd sobre carbono que contiene 10% de Pd a temperatura ambiente y bajo presión atmosférica de hidrógeno durante 12 a 24 horas. El catalizador es filtrado. El fitrado es evaporado a sequedad y luego el residuo es secado mediante succión de una bomba de vacio para obtener C-8 (368 mg, rendimiento cuantitativo) .
ES/MS: proporción m/z 1047.9 [M+H]+; 1069.8.
Esquema de Reacción 1 0-7 C-8 OM-197-MP -AC-lS.Rl EJEMPLO 2 (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxltetradecanoilamino] -decan-1 , 10-diol 1-dlhidrogenofosfato 10- (6, 7-dihidroxiheptanoato) (= OM-197-MP-HD (S,R) ) (Esquema de Reacción 2) 1. ß-heptenoato de bencilo (C-9) A una solución de ácido 6-heptenoico (4.71 g, 36.75 mmol) en AcOEt (80 mi) a 0°C se agregó sucesivamente trietilamina (15.3 mi, 110.24 mmol), bromuro de bencilo (13.1 mi, 110.24 mmol) y Bu4NI (6.79 g, 18.37 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada a 0°C durante 2 horas y concentrada in vacuo. El residuo es tomado en AcOEt, la fase orgánica fue lacada con una solución acuosa saturada de NaHC03 y H20. La fase orgánica fue secada sobre MgS04 y el solvente removido in vacuo. La cromatografía instantánea del residuo sobre gel de sílice (n-heptano/EtOAc, 9:1) proporciona el compuesto C-9 (6.00 g; 75%) como un aceite incoloro. RMN 13C (62.89 MHz, CDC13) : 24.42, 28.34, 33.37, 34.13, 66.08, 114.73, 128.19, 128.55, 136.16, 138.37, 173.43. 2. 6, 7-epoxiheptanoato de bencilo (C-10) A una solución de m-CPBA (2.76 g, 12.29 mmol) en CH2CI2 (50 mi) a 0°C se agregó lentamente una solución de C-9 (1.79 g, 8.19 mmol) en CH2CI2 (20 mi) . La solución fue agitada a 0°C for 2 horas, luego a temperatura ambiente durante 18 horas.
La solución fue diluida con CH2CI2 y la fase orgánica fue lavada con una solución acuosa saturada de Na2S203 (5 x) . La fase orgánica fue ¦ secada sobre MgS04 y el solvente removido in vacuo. La cromatografía instantánea del residuo sobre el gel de sílice (n-heptano/EtOAc, 5:1) proporcionó el compuesto C-10 (1.54 g; 80%) como un aceite incoloro. RMN 13C (62.89 MHz , CDCI3) : 24.60, 25.39, 32.00, 34.02, 46.86, 51.91, 66.04, 128.11, 128.46, 136.01, 173.17. 3. 6, 7-isopropilidenheptanoato de bencilo (C-ll) A una solución de C-10 (1.54 g, 6.59 mmol) in acetona (50 mi) a temperatura ambiente se agregó ácido sulfúrico (0.42 mi, 7.9 mmol) . La solución fue agitada durante 3 horas, diluida con éter dietílico y la fase orgánica lavada con una solución acuosa saturada de NaHC03. La fase orgánica fue secada sobre MgS04 y el solvente removido in vacuo para dar C-ll (1.73 g) como un aceite amarillo pálido que fue usado en la siguiente etapa sin purificación adicional. 4. Ácido 6, 7-isopropilidenheptanoico (C-12) Una solución del compuesto C-ll (1.53 g) en EtOAc (20 mi) que contiene Et3N (3.65 mi, 26.16 mmol) fue hidrogenada en presencia de Pd sobre carbono que contiene 10% de Pd a temperatura ambiente y bajo presión atmosférica de hidrógeno durante 3 horas. El catalizador es filtrado y el filtrado es evaporado a sequedad. La cromatografía instantánea del residuo sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 5:1) proporcionó el compuesto C-12 (0.63 g; 54% sobre 2 etapas) como un aceite incoloro. 5. (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-OXO-5-aza-9- [ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] -decan-1 , 10-diol 1-dibencilfosfato 10- ( 6, 7-isopropilidenheptanoato) (C-13) A una solución del compuesto preparado anteriormente C-6 (248 mg, 0.21 mmol . ) y el compuesto ácido 6,7-isopropilidenheptanoico (C-12) (92 mg, 0.45 mmol.) en CH2CI2 seco (5 mi) a 0°C y bajo flujo de argón, se agregaron en sucesión clorhidrato de 1- ( 3-dimethilaminopropil ) -3-etilcarbodiirnida disponible comercialmente (91 mg, 0.47 mmol.) y 4-dimetilaminopiridina (catalítico) . Luego la mezcla de reacción es agitada durante 30 minutos a 0°C y después de esto durante toda la noche a temperatura ambiente. Luego el medio de reacción es lavado con agua y una solución de HC1 1N seguida por separación de capas. La capa orgánica es secada sobre MgSÜ , filtrada y evaporada. Al llevar a cabo una purificación por cromatografía instantánea sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 99:1), se recupera el procducto de reacción de acoplamiento C- 13 (240 mg; 83%) . ES/MS: m/z 1390 [M+H]+; 1411 [M+Na]+. 6. (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino ] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] -decan-1, 10-diol 1-dihidrogenfosfato 10- ( 6, 7-dihidroxiheptanoato) (C-14) (= 0M-197 -MP-HD (S,R)) Una solución del compuesto C-13 (180 mg, 0.13 mmol.) en una mezcla de 5/2 de CH2CI2 /etanol (21 mi) que contiene ácido acético (3 mi) es hidrogenada en presencia de Pd sobre carbono que contiene 10% de Pd a temperatura ambiente y bajo presión atmosférica de hidrógeno durante 12 a 36 horas. El catalizador es filtrado. El filtrado es evaporado a sequedad y luego el residuo es usado mediante succión de una bomba de vacio para obtener C-14 (139 mg, rendimiento cuantitativo) .
ES/MS: m/z 1079 [M+HJ+; 1101 [M+Na]+.
Esquema de Reacción 2 C-9 C-13 C- 14 OM-197-MP-H0 (S,R) EJEMPLO 3 (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -?-???-5-aza-9- [ (R) -3-hiydroxitetradecanoilamino] -decan-1 , 10-dlol 1,10-bls-dihidrogenofosfato) (= OM-294-DP (S,R)) (Esquema de Reacción 3) 1. (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiIoxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] -decan-1, 10-diol (C- 15) A una solución de ( 2R) -5-amino-2-[ ( R) -3-benciloxitetradecanoilamino]pentan-l-ol ( PCT WO00146127A1 ) (8 g, 18.4 mmol) en CH2CI2 anhidro (60 mi) a 25°C se agregó el compuesto C-3 (9 g, .17.5 mmol) en CH2C12 anhidro (28 mi) . La solución fue agitada durante 3 días a 20-21°C. La suspensión fue diluida con CH2C12 (66 mi) y calentada a 30°C para obtener una solución clara. Se agregó lentamente acetonitrilo (320 mi) a la solución. La solución fue enfriada a 20°C y agitada durante 2 horas. El precipitado fue filtrado, lavado con acetonitrilo y secado bajo vacio para obtener C-15 (13.7 g, 83%) como un sólido blanco. Punto de fusión = 103 °C. 2. (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] -decan-1, 10-diol 1, 10-bis- (dibencilfosfato) (C-16) A una solución de C-15 (1.02 g 1.08 mmol) y lfí-tetrazol (454 mg; 6.48 mmol; 6 eq) en THF anhidro (46 mi) a temperatura ambiente y bajo argón se agregó N, N-dibencildietilfosforamidita (85%, 1.50 mi; 4.97 mmol; 4.6 eq) . Después de 30 minutos bajo agitación, la mezcla de reacción fue enfriada a -20°C, luego se agregó una solución de mCPBA (57-86%; 1.32 g; 7.67 mmol; 7.4 eq) en CH2CI2 (30 mi) . Después de 45 minutos a -20°C, la solución fue calentada a 0°C y se agregó una solución saturada de Na2S203 (25 mi) y la mezcla fue agitada durante 10 minutos. La solución fue diluida con éter, la fase orgánica fue separada y lavada con Na2S203 saturado (5x), luego con NaHC03 saturado (2x) . La fase orgánica fue secada sobre MgSC , filtrada y concentrada. La purificación mediante cromatografía instantánea sobre gel de (CH2Cl2/acetona 4/1 luego 3/1) dio C-16 (1.38 g; 87%) como aceite incoloro. 3. (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino ] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] -decan-1, 10-diol 1,10-bis-dihidrogenofosfato) (C-17) (= OM-294-DP (S,R) ) Una solución del compuesto C-16 (2.7 g, 1.84 mmol) en isopropanol (150 mi) fue hidrogenado sobre 10% Pd sobre C (320 mg) a temperatura ambiente y bajo presión atmosférica de hidrógeno durante 3 horas. El catalizador fue removido mediante filtración a través de una membrana de millipore. El filtrado fue concentrado y secado bajo alto vacío para dar C-17 (1.8 g; 98%) como un sólido amorfo.
Esquema de Reacción 3 a de C-15 C-17 C-16 OM-294-DP (S,R) EJEMPLO 4 a-N-{ (4R) -5-hidroxi-4- [ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] -pentil} amida 5-0- (6, 7-dihidroxiheptanoato) de ácido N- f -3-dodecanoiloxitetradecanoilami.no] -L-aspártico, (=OM-197-MC-HD (S,R)) (Esquema de reacción 4) 1. a-N-{ (4R) -5-hidroxi-4- [ (R) -3-benciloxitetra-decanoilamino] pentil } amida- -bencil éster del ácido N-[(R)-3-dodecanoi loxitetradecanoilamino] -L-aspártico, 5-0- (6,7-isopropilidenheptanoato) (C-18) A una solución del compuesto ot-N- { ( 4R) -5-hidroxi- -[ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] pentil } amida-ß-bencil éster de ácido N- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -L-aspártico, (PCT WO00146127A1) (1.14 g, 1.09 mmol) y el compuesto de ácido 6, 7-isopropiliden heptanoico (C-12) (487 mg, 2.48 mmol) en CH2CI2 anhidro (30 mi) a 0°C y bajo flujo de argón, se agregaron en sucesión clorhidrato de 1- ( 3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimida disponible comercialmente (485 mg, 2.53 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (43 mg, 0.35 mmoles) . Luego la mezcla de reacción es agitada durante 30 minutos a 0°C y después de esto durante toda la noche a temperatura ambiente. Luego el medio de reacción es lavado con agua y una solución de HC1 1N seguida por separación de capas. La capa orgánica es secada sobre MgS04, filtrada y evaporada. Al llevar a cabo una purificación de cromatografía instantánea purificación sobre gel de sílice (CH2Cl2/acetona, 9:1), se recupera el producto de reacción de acoplamiento C-18 (1.20 g; 76%) como un sólido blanco. ES/MS: m/z 1255 [M+Na]+. 2. g-N-{ (4R) -5-hidroxi-4- [ (R) -3-hidroxitetradecanoil-amino] -pentil } amida del ácido N- [ (R) -3-dodecanoiloxitet radecanoi lamino] -L-aspártico, 5-0- (6,7-dihidroxiheptanoato) , (C-19) (= OM-197-MC-HD (S,R) ) Una solución del compuesto C-18 (1.20 g, 0.97 mmol) en una mezcla de 2/1 de CH2CI2 /etanol (50 mi) que contiene ácido acético (5 mi) es hidrogenada en presencia de Pd sobre carbono que contiene 10% Pd a temperatura ambiente y bajo presión atmosférica hidrógeno durante 12 a 36 horas. El catalizador es filtrado. El filtrado es evaporado a sequedad y el residuo es luego secado mediante succión de una bomba de vacio para obtener C-19 (1 g, rendimiento cuantitativo). ES/MS: m/z 1012 [M+H]+; 1034 [M+Na]+.
Esquema de reacción 4 C-18 C-19 -197-HC-HD (S^) EJEMPLO 5 (5S,11R) -l-amino-5- [ (R) -3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino] -6-oxo- 7-aza-ll- [ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] -dodecan-12-ol 12-dihidrogenofosfato (= OM-294-BA-MP (S,R) ) (esquema de reacción 5) 1. ISf- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoil ] Ac-benciloxicarbonilo-L-lisina (C-20) A una solución de ácido (R)-3-dodecanoiloxitetradecanoico P-109 [Bull. Chem. Soc. Jpn (0 (1987), 2205-2214] (153 mg; 0.36 mmoles) en THF anhidro (4 mi) a -15°C y bajo atmósfera de argón se agregaron sucesivamente N-metilmorfolina (40 µ?; 0.36 mmol; 1 eq) y cloroformiato de isobutilo (47 µ?; 0.36 mmol; 1 eq) . Después de 30 minutos bajo agitación a -15°C, se agregó una solución de H-L-Lisina ( Z ) -OH disponible comercialmente (100 mg; 0.36 mmol; 1 eq) en CH3CN/H2O (3.5/1 (4.5 mi) que contiene EtsN (0.16 mi) . La mezcla de reacción fue agitada durante 20 horas a temperatura ambiente. Luego el solvente fue evaporado y la capa acuosa fue enfriada a 0°C, acidificada con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico hasta pH = 3 y extraída con AcOEt (3x) . La capa orgánica fue secada sobre MgSC>4, filtrada y evaporada. Al llevar a cabo una purificación de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (1/1 éter de petróleo/AcOEt eluyente que contiene 0.25% de ácido acético) seguido por coevaporación de tolueno dio C-20 (172 mg; 70%) como sólido cristalino blanco.
S: (ES+) m/z 690.0 [M+H]\ 707.0 [M+NH4]+, 712.0 [M+Na]+, 727.5 [M+K] + . 13c-NMR (62.89 MHz , CDCI3), d en ppm: 174.90, 173.73, 170.66, 156.98, 136.53, 128.57, 128.17, 128.05, 71.27, 66.79, 52.24, 41.32, 40.47, 34.59, 34.24, 31.99, 31.45, 29.72, 29.43, 29.25, 25.29, 25.07, 22.76, 22.27, 14.19. 2. (5S, 11R) -l-benciloxicarbonilamino-5- [ (R) -3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino] -6-oxo-7-aza-ll- [ (R) -3-benciloxitetra-decanoilamino] -dodecan-12-ol (C-21) . A una solución de C-20 (150 mg; 0.22 mmol) y (2R)-5-amino-2- [ (R) -3-benciloxitetradecanoilamino] pentan-l-ol WZ-10b (PCT WO00146127A1) (95 mg; 0.22 mmol.; 1.0 eq) en CH2CI2 anhidro (3 mi) a 0°C se agregó HOAt ( l-hidroxi-7 -azabenzotriazol ) disponible comercialmente (36 mg, 0.26 mmol, 1.2 eq.) y N, ' -diisopropilcarbodiimida disponible comercialmente (41 µ?, 0.22 mmol, 1.2 eq.) . La mezcla de reacción fue agitada durante 1 hora a 0°C y después de esto durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción fue lavada subsecuentemente con agua, una solución de HC1 1N y una solución saturada de NaHCC>3 seguid por separación de capas. La capa orgánica fue secada sobre MgSÜ4, filtrada y evaporada. Al llevar a cabo una purificación de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (3/1 CH2CI2 /acetona eluyente), se recuperó C-21 (165 mg; 68%) como un sólido cristalino blanco. S: (ES+) m/z 1105.8 [M+H]+, 1128.0 [M+Na]+, 13C-NMR (62.89 MHz , CDC13), d en ppm: 173.56, 172.20, 171.87, 170.23, 156.82, 138.32, 136.69, 128.53, 128.47, 128.09, 128.00, 127.91, 127.82, 76.77, 71.48, 71.15, 66.59, 64.77, 53.1, 51.39, 41.71, 41.63, 40.46, 39.45, 34.57, 34.51, 34.12, 31.97, 29.70, 29.51, 29.41, 29.25, 28.69, 25.38, 25.29, 25.19, 25.09, 22.74, 22.50, 14.18. 3. 12-dibencil fosfato de (5S, 11R) -l-benciloxicarbonilamino-5-[ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino ] -6-oxo-7-aza-ll - [ ( R) -3-benciloxitetradecanoilamino] -dodecan-12-ol (C-22) . A una solución de C-21 (150 mg; 0.14 inmoles) y 1H-tetrazol (29 mg; 0.41 mmol; 3 eq) en THF anhidro (8 mi) a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón se agregó de ?,?-dibencil dietilfosforamidita (85%, 110 1,; 0.31 mmol; 2.3 eq) . Después de 30 minutos bajo agitación, la mezcla de reacción fue enfriada abajo a -20°C, luego una solución de mCPBA (57-86%; 87 g; 0.50 mmol; 3.7 eq) en CH2C12 (6 mi) fue agregada. Después de 45 minutos a -20°C, la solución fue calentada a 0°C y se agregó una solución saturada de Na2S203 (5 mi) y la mezcla fue agitada durante 20 minutos. La solución fue diluida con éter, la fase orgánica fue separada y lavada con Na2S203 saturado (5x), luego con NaHC03 saturado (2x) . La fase orgánica fue seca sobre gS04, filtrada y concentrada. La purificación mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (CH2Cl2/acetona 4/1 luego 2/1) dio C-22 (149 mg; 81%) como sólido amorfo. MS : (IS+) m/z 1366.0 [M+H]+, 1383.5 [M+NH„]+, 1388.5 [M+Na]+, 1088.0 [M- (BnO) 2OPOH) +H] +, RMN 13C (62.89 MHz, CDC13), en ppm: 173.51, 171.77, 171.27, 169.95, 156.67, 138.32, 136.69, 135.66 (d) , 135.55 (d) , 128.69, 128.51, 128.43, 128.03, 127.77, 127.69, 76.49, 71.28, 71.20, 69.66 (d) , 69.58 (d) , 68.72 (d) , 66.51, 52.82, 48.62 (d) , 41.76, 41.46, 40.46, 39.01, 34.54, 34.06, 31.96, 29.68, 29.49, 29.39, 29.22, 27.95, 25.29, 25.18, 25.05, 22.73, 22.45, 14.17,,,, . 4. 12-dihidrogenofosfato de ( 5S , 1 IR) -l-amino-5- [ ( R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -6-oxo-7-aza-ll- [ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] -dodecan-12-ol 12-(C-23) (= OM-294-BA-MP (S,R)) . Una solución del compuesto C-22 (130 mg, 0.095 mmol . ) en una 3/1 mezcla de CH2C12 /etanol (20 mi) que contiene el ácido acético (3 mi) es hidrogenada en presencia de Pd sobren carbono que contiene 10% Pd a temperatura ambiente y bajo presión atmosférica de hidrogeno durante 36 horas. El catalizador es filtrado. El filtrado es evaporado a sequedad y el residuo está luego seco mediante succión de una bomba de vacío obtener C-23 (84 mg, 91%) . MS : (IS+) m/z 962.0 [ +H]+, 984.0 [M+Na]+.
Es<|iieiii<i De Reacción 5 C-20 0-21 0-22 0-23 O -294-BA-MP <S.R> Actividades biológicas de los compuestos de acuerdo con la invención EJEMPLO 6 Efecto regulador in Vitro de 197-MP-CA de OM y OM-294-DP sobre LPS indujo (IL-12 y TNF -a) inflamatorias y citosimas (IL-10) anti-inflamatorias sobre células de DC murinas. Protocolo : Células de médula ósea fueron aisladas y cultivadas como se describe posteriormente en la presente: El fémur y tibias de dos ratones C57BL/7 macho, de 6 semanas de edad (Charles Rio Laboratorios Francia) fueron removidos, separadas del músculo y tendones, y desinfectados con etanol al 70%. Ambos extremos de cada hueso fueron cortados y la médula ósea fue lavada con HBSS (Gibco BRL) utilizando una jeringa con una aguja calibre 26. La suspensión celular resultante fue centrifugada durante 5 minutos a 500g y lavada en HBSS. Las células fueron resuspendidas a 3xl05 células/ml en RPMI-1640 (Gibco BRL) complementado con L-glutamina 2 mM (Sigma), 100 de U/ml de penicilina (Sigma), 100 pg/ml de estreptomicina (Sigma) , ß-mercaptoetanol 50 µ? (Sigma), FCS al 10% inactivado térmicamente (Sigma) y 15 ng/ml rG -CSF murino (R&D) . Para generar células dendriticas (DC) derivadas de medula ósea (BM) , leucocitos de BM fueron cultivados en cajas de petri bacteriológicas, de 100-mm (Falcon 1029) durante 8 días a 37°C en CO2 al 5%. En el día O, 10 mi de suspensión celular fueron agregados por caja. En el día 3, otros 10 mi de medio recién preparado fueron agregados a cada caja y en el día 6, 9 mi de medio de cultivo superior fueron removidos cuidadosamente de cada caja y reemplazados por 10 mi de medio nuevo . Las células no adherentes de los cultivos celulares B de 8 días fueron recolectadas, centrifugadas durante 5 minutos a 500 g y resuspendidas a 1.25xl06 células/ml en RPMI complementado que contiene 10 ng/ml de GM-CSF. Luego las células fueron sembradas en placas de cultivo de tejido de 24 cavidades (lxlO6 células/cavidad) e incubadas durante una hora y media a 37°C en CO2 al 5% en ausencia o presencia de OM-294-DP u OM-197-MP-AC (0.01-100 pg/ml/200 µ?/cavidad) . Luego se agregó LPS (E.coli 026: B6, Sigma), a 1 pg/ml, y las placas fueron incubadas adicionalmente . Después de una incubación de 20 horas, los sobrenadantes fueron recolectados para el análisis de citoquinas. Las concentraciones de IL-12p70, IL-10, y TNF - a en los sobrenadantes del cultivo DC fueron medidos mediante ELISA utilizando pares Ab apareados de BD Pharmingen. Se uso el sustrato de peroxidasa quimiolumicente Supersignal ELISA Pico (BD Pharmingen) para la detección de luminometria (cortador de multietiqueta Wallac 1420 -2) . Los análisis fueron efectuados de acuerdo con las instrucciones de fabricante.
Resultados : a) Efecto OM-197-MP-AC y OM-294-DP sobre la producción de IL-12 e IL-10 inducida por LPS. Los resultados de la producción de IL-12 e IL-10 inducida por LPS son mostrados en la figura 1. b) Efecto de OM-197-MP-AC y OM-294-DP sobre la producción de TNF-OÍ LPS-inducida . Los resultados sobre la producción de TNF-a LPS-inducida son mostrados en la figura 2.
Conclusión : Los resultados anteriores muestran claramente que tanto OM-197-MP-AC como O -294-DP disminuyen la producción inducida por LPS de las citoquinas inflamatorias (IL-12 y TNF - a) , y en contraste sorprendente incrementan la producción de la citoquina antiinflamatoria IL-10, sugiriendo que los compuestos de la invención podrían actuar como agentes antiinflamatorios terapéuticos.
EJEMPLO 7 Efectos directos de una serie de cuatro derivados triacinados sobre células CD4+ T humanas. Protocolo : Una serie de cuatro compuestos de la presente invención (el OM-197-MP-CA, 0 - 197 -MAESTRO DE CEREMONIAS-HD, OM-294-BA-MP, OM- 197-MP-HD) fueron probados directamente como se resume posteriormente en la presente. Células CD4+ naturales fueron clasificadas magnéticamente del donador de sangre saludable (recubrimiento de pH regulado). Las células fueron estimuladas en presencia o no de dosis graduadas de derivado de triacilo (0,02; 0,2; 2 y 20 g/ml) utilizando anti-CD3 placa-enlazado (5 pg/ml) y el anti-CD28 soluble (1 pg/ml) . Después de 6 días, los niveles de citosina (IFN - ? y IL-13) fueron probados en los sobrenadantes del cultivo utilizando ELISA.
Resul ados : Los resultados para la producción de citoquina son mostrados en la figura 3. La proliferación de célula T fue también probada pero fue modificada por los compuestos de la invención .
Conclusión : La producción de IL-13 (histogramas blancos) por células CD4+ T es reducida en presencia de 197- P-AC de OM, OM 197-MC-HD, OM 294-BA-MP, OM 197-MP-HD mientras que la producción de IFN -? la producción (histogramas oscuros) y la proliferación de célula T permanecieron sin afectar. Esto representa un desplazamiento hacia una respuesta de Thl en presencia de las cuatro moléculas triaciladas probadas.
EJEMPLO 8 Efecto de 197-MP-AC de OM en un modelo de asma Puesto que en el ejemplo previo se ha demostrado que las moléculas triaciladas probadas disminuyen la producción de una citoquinas probablemente involucrada en la patología de asma (i. e. IL-13) los inventores tienen como objetivo en la presente investigar los efectos en vivo de un miembro de la serie (197-MP-AC de OM) en la modulación de diferenciación de Th2 de células auxiliares T naturales y el desarrollo subsecuente de asma alérgica. En el presente estudio, los inventores han investigado primero (parte a) el efecto de 197-MP-AC de OM dado durante la fase de sensibilización sobre el desarrollo de asma alérgica inducida por LACK y entonces el efecto de la molécula probada terapéuticamente (parte b) .
Parte a) Tratamiento "Profiláctico" de asma Protocolo : Ratones e inducción de asma alérgica: Ratones hembra Balb/c de ByJ de 6 semanas de edad fueron comprados del Centre d' Elevage Janvier (CERJ, Le Genest-St-Isle, Francia) . Todos los ratones fueron sensibilizados mediante 2 inyecciones i.p. de 10 g de proteína LACK precipitada en 2 mg de Alum (la Ciencia de PerBio Francia SAS, Brebiéres, Francia) en los días 0 y 7.
Los animales fueron divididos en grupos, como sigue: - Ratones LACK sensibilizados y atacados con solución salina (4 ratones) - Ratones LACK sensibilizados y atacados Ratones tratados con OM-197-MP-AC, LACK sensibilizados y atacados. Los ratones del tercer grupo fueron tratados intraperitonealmente con 1 mg/Kg (20 pg por ratón) de OM-197-MP-AC. Los ratones fueron tratados en los días: -1, 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 y 11. Del día 16 al día 21, los ratones de los grupos B y C fueron expuestos a un ataque de aerosol de 20 minutos diariamente de una solución de LACK (0.15%) mientras que los ratones del grupo de solución salina recibieron una solución salina como control.
Hipersensibilidad de via aérea (AHR) : La AHR fue medida para todos los ratones un día después del último tratamiento con antigeno mediante pletismografia de cuerpo entero (Emka) en respuesta a concentraciones incrementadas (6-25 mg/ml) de metacolina inhalada (acetil metil colina, Sigma) . La AHR es expresada como pausa mejorada (Penh, Véase figura 4), un parámetro adimensional correlacionado perfectamente con el cumplimiento de via aérea y valor calculado de resistencia, que se correlaciona con la medición de resistencia de vía aérea, impedancia y presión intrapleural .
Reactivos : - Proteina recombinante LACK fue producida en E. coli y purificada como se describe por Mougneau et al., 1995. - O -197-MP-AC, lote DL040906 a una concentración de 0.98 mg/ml, fue de OM PHARMA. - mAbs Anti- EM-95 fueron una donación DNAX (Palo Alto, CA, Estados Unidos de América) . - Metacolina (acetil metil colina) fue comprada de Sigma (San Quentin Fallavier, Francia) . - Perlas de arreglo de CBA (Encorve el juego) fueron compradas de BD Biosciences.
Títulos de anticuerpo: Todos los ratones fueron sangrados mediante punción del corazón un día después del último aerosol. La IgE total fue cuantificada mediante ELISA utilizando mAbs anti-IgE EM-95 de ratas como recubrimiento de anticuerpo y mAbs anti-IgE de rata acoplados a biotina como anticuerpo secundario como se describe (Julia et al., 2002).
Análisis de células de lavado bronquioalveolar (BAL) (porcentaje de eosinofilos) : Ratones individuales fueron sangrados y se inserto una cánula a su tráquea. Los pulmones fueron lavados 3 veces con 1 mi de PBS caliente. Las células fueron lavadas con PBS, resuspendidas en 300 µ? y contadas utilizando una cámara de Burker-Türk . Para el conteo de célula BAL diferencial, se hicieron preparaciones de citospina teñidos con coloración de Wright/Giemsa . Los números respectivos de neutrófilos, eosinofilos y otras células mononucleares fueron determinados mediante examen microscópico. Solamente el porcentaje de eosinofilos (Figura 5) es reportado en la presente.
Análisis de contenido de citoquina de pulmón: Para investigar el contenido de citoquina en el pulmón de animales tratados y sin tratar, extractos de proteina fueron preparados de pulmones de ratones wt LACK-sensibilizado y PBS-atacados (grupo de "control") ratones wt LACK-sensibilizados y atacados (grupo "asma"), los ratones de wt tratados con OM-197-MP-AC (grupo" OM-197") . El contenido de IL-4, IL-5, IL-13 fueron analizados mediante por análisis multiplex utilizando arreglo de FACS.
Resultados : Medición de hipersensibilidad de vía aérea (AHR) : Los ratones LACK-sensibili zados tratados o sin tratar (véase lo anterior) fueron enseguida atacados con el aerosol diario de LACK durante cinco días consecutivos. Un día después del último aerosol, la AHR fue medida mediante pletismografia de cuerpo entero en respuesta a concentraciones incrementadas de metacolina en aerosol. Como esperaba, los ratones LACK-sensibili zados y atacados con solución salina no desarrollaron AHR cuando fueron expuestos a metacolina, mientras que los ratones LACK sensibilizados y atacados sin tratar desarrollaron una fuerte AHR, como se refleja por los altos valores de Penh (Figura 4) . En contraste agudo, los ratones LACK-sensibili zados y atacados, que fueron tratados con OM-197-MP-AC no exhibieron AHR.
Conclusión : La hipersensibilidad de vía aérea en la exposición de los ratones al antigeno en aerosol, medida en presencia de metacolina, fue reducida de regreso a niveles de control (solución salina) mediante el tratamiento con OM-197-MP-AC .
Caracterización del porcentaje de eosinófilos en lavados bronquio-alveolares (BAL) : Los resultados son reportados en la Figura 5.
Los ratones LACK-sensibilizados que recibieron aerosoles de solución salina no exhibieron eosinófilos en BAL, mientras que los ratones LACK-sensibilizados que recibieron ataques de aerosol de LACK si. Además, los ratones tratados con OM 197-MP-AC exhibieron 3 veces menos eosinófilos que los ratones de control sin tratar (Figura 5) .
Conclusión : Tratamientos con OM-197-MP-AC disminuyeron fuertemente la eosinofilia de BAL Medición de Inmunoglobulina (Ig) en sueros: Los resultados para IgE son demostrados en la figura 6: Los títulos de IgE total (Figura 6) fueron significativamente disminuidos cuando ratones fueron tratados con un compuesto de OM 197-MP-AC.
Conclusión : Así, los sueros de ratones tratados con OM-197-MP-AC contenían dos veces menos el IgE menos en total en comparación con sueros de ratones desafiados sensibilizados sin tratar (esto es, "los animales asmáticos") .
Medición de citoquinas de pulmón : Para investigar adicionalmente los efectos de OM-197-MP-AC profiláctico en inflamación de vía aérea alérgica, se extrajeron proteínas de pulmones tanto de ratones WT tratados como sin tratar y las citoquinas que se sabe que juegan un papel importante en asma (IL-4, IL-5 e IL-13) fueron cuantificadas mediante análisis multiplex utilizando perlas de arreglo de CBA y FACSarray. Los datos fueron normalizados a la cantidad total de proteína y dados como el pg de citoquina por mg de proteína de pulmón. En tanto que las cantidades de IL-4, IL-13, e IL-5 estuvieron debajo del límite de detección en pulmones de ratones LACK-sensibil izados y PBS-ata ados (véase "control" en la Figura 7) las cantidades de estas citoquinas se incrementaron espectacularmente en los ataques con LACK (véase "Asma" en la Figura 7) . En contraste, los pulmones de ratones LACK-sensibilizados y atacados que habían sido tratados con OM-197-MP-AC contenían 5 veces menos IL-4 (p=0.0003,) 5 veces menos IL-5 (p=0.0003) y 3.5 veces menos IL-13 (p=0.003) que los ratones sin tratar (Véase "OM-197" en la Figura 7). Además de IL-4, IL-5, e IL-13, otras citoquinas fueron cuantificadas mediante análisis multiplex utilizando perlas de arreglo de CBA y FACSarray. Los resultados principales son reportados posteriormente en la presente. También se encontró que IFN-? era regulada ascendentemente en pulmones de ratones LACK-sensibili zados y atacados en comparación con ratones LACK-sensibili zados y atacados con PBS . Los pulmones de ratones tratados con OM-197-MP-AC contenían dos veces menos IFN-? que aquéllos de ratones sin tratar. KC es la quimiocina homologa funcional de IL-8 humana o CXCL8 y se enlaza a CXCR2 expresado tanto por neutrófilos como eosinófilos. Por supuesto, KC puede permitir el reclutamiento de granulositos a tejidos inflamados. En tanto que KC estaba presente en cantidad muy baja pulmones de ratones LACK-sensibilizados y PBS-atacados , su expresión se incrementó altamente después de los ataques con aerosol de LACK. La cantidad de KC producida en pulmones fue reducida a la mitad después del tratamiento con OM-197-MP-AC . La citoquina pro-inflamatoria, IL-6 fue encontrada en pulmones de ratones LACK-sensibilizados y PBS-atacados y se incremento ligeramente después de los aerosoles de LACK. Los pulmones de ratones tratados con O -197- P-AC exhibieron 1.5 menos IL-6 que aquéllos de ratones sin tratar. Se encontró que la quimiocina CP-1 era expresada en pulmones de ratones sensibilizados y PBS-atacados y fue ligeramente regulada ascendentemente después del ataque. Los pulmones de ratones que fueron tratados con OM-197-MP-AC contenían 1.8 veces menos MCP-1 que aquéllos de los animales sin tratar. Las cantidades de TNF-a en pulmones de ratones tratados y sin tratar no produjeron diferencias significativas.
IL-9 no fue detectada en ninguna de las muestras. Tomados conjuntamente, estos datos indican claramente que el OM-197-MP-AC profiláctico induce no solamente una fuerte disminución de Th2 citoquinas que son cruciales para inducir la inflamación de vía aérea alérgica y AHR, sino que también una disminución de otro citoquinas y quimiosinas que contribuyen a la inflamación del pulmón y al reclutamiento de células efectoras inflamatorias tales como eosinófilos.
Conclusión general para el ejemplo 8 a: Este estudio demuestra claramente un papel protector de una de las moléculas de la invención, O -197-MP-AC en el desarrollo de asma alérgica. Los tratamientos de OM-197-MP-AC que comienzan justo antes de la fase de sensibilización inhibieron el desarrollo de AHR, y disminuyeron fuertemente la eosinofilia de BAL. Además, las cantidades de IgE totales fueron disminuidas en el estudio de ratones que habían sido tratados con OM-197-MP-AC . Los datos también muestran que los tratamientos con OM 197-MP-AC deterioraron principalmente el desarrollo de citoquinas involucradas en asma y la secreción de otras citoquinas inflamatorias. Un mecanismo posible sería aquel de OM- 197-MP-AC podría inducir una respuesta inmunosupresora específica que controlaría el desarrollo de Th2 y la inflamación de la vía aérea subsecuente.
Parte b) Tratamiento "Terapéutico" de asma Protocolo : Las diferencias principales comparadas con el protocolo previo (parte a) son: "Los ratones fueron tratados con OM-197-MP-AC i.p. solamente en días 15, 17 y 19 (esto es, por lo menos 1 semana después de la segunda sensibilización) a una dosis de 1 mg/Kg (20 ng/ratón) . "Las citoquinas de pulmón medidas mediante análisis múltiplex utilizando el arreglo de FACS fueron IL-4, IL-5, IL-13, IFN -? e IL-10.
Resultados : Número de Células total y eosinófilos en BAL: Dos días después del último aerosol, los ratones fueron sacrificados y las células de BAL cosechadas. Como se esperaba, los ratones LACK-sensibilizados sin tratar exhibieron una afluencia masiva de células de BAL después de los ataques con LACK (20 veces más células en comparación con los ratones PBS-atacados ) (Figura 8). Muy interesantemente, el reclutamiento de cédulas BAL fue deteriorado por 90% después de administraciones terapéuticas con OM-197-MP-AC (p <0.01) (Figura 9), con 40-45 veces menos de eosinófilos en comparación con los ratones sin tratar.
Conclusión : OM-197-MP-AC provisto tres veces terapéuticamente fue apto de disminuir espectacularmente la extravasión celular pulmonar y eosinofilia en BAL.
Mediciones de citoquinas de pulmón Puesto que la eosinofilia de vía aérea fue reducida drásticamente después del tratamiento terapéutico con OM-197-MP-AC, se busca analizar IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 e IFN-? contenido del pulmón (Figura 10). Por supuesto, cuando compara con pulmones de ratones sin tratar, las cantidades del Th2-citoquinas: IL-4, IL-5 e IL-13 fueron reducidos fuertemente en pulmones de ratones tratados. Los niveles IL-4 estaban reducidos al 90%, las cantidades de IL-13 de 85%, y las cantidades de IL-5 por 70% después del tratamiento con OM-197-MP-AC (de p <0.00005 a 0.005).
Conclusión : Claramente OM-197-MP-AC cuando es proporcionado terapéuticamente sólo tres veces fue apto de disminuir el nivel de Th2 citoquina. Esto no fue debido a un desplazamiento hacia Thl citoquina, puesto que los niveles de IFN-? permanecieron bajos ((1.5 a 3 pg/ml) para todos los ratones que fueron reducidos en los ratones tratados. Las cantidades de IL-10 que tanto una Th2 y una citoquina inmunosupresora , fueron bajos y no fueron incrementados significativamente en el tratamiento.
Medición de niveles de IgE : Con el fin de caracterizar finamente el status inmunes de ratones después del tratamiento terapéutico con 0M-197-MP-AC, se analizó la IgE LACK-especifica en suero de ratones y en aquéllos de ratones sin tratar mediante ELISA. Mientras que los niveles de IgE LACK-especificos se incrementaron 7 después de exposición de aerosol LACK, los sueros de ratones tratados con OM-197-MP-AC contenían 2 veces menos de IgE LACK-especifico (p <0.05) en comparaciones en ratones tratados con LACK sin tratar.
Conclusión : Claramente OM-197-MP-AC cuando es proporcionado terapéuticamente disminuyo los niveles de IgE LACK-especificos de suero.
Conclusión general por ejemplo 8b. Se demostró en la presente que, que el producto de la invención, OM-197-MP-AC, cuando es proporcionado terapéuticamente, disminuyo claramente la eosinofilia, también como el nivel de Th2 citoquinas tales como IL-4, IL-5, e IL-13, y también el nivel del IgE alérgeno-específica.
Conclusión general para ejemplo 8 Claramente, OM-197-MP-AC fue activo tanto preventiva como terapéuticamente activo in vivo en un modelo de asma, tal como se juzga por sus efectos sobre muchas lecturas asma-relevantes.
EJEMPLO 9 Efecto de OM-197-MP-AC mediante otras rutas de administración en el modelo murino de asma Los resultados presentados en el ejemplo 8 muestran que OM-197-MP-AC es efectivo en la prevención de respuestas en el modelo LACK murino de asma, cuando es administrado por ruta i.p. Otras maneras de administración, más compatibles con el uso humano, fueron por consiguiente investigadas en este modelo (intranasal, intragastrico , subcutáneo) .
Protocolo : 43 Ratones BALB/c ByJ hembra de 6 meses de edad fueron compradas del Centre d' Elevage Janvier (CERJ, Le Genest-St-Isle, Francia) . Todos los ratones fueron sensibilizados mediante dos inyecciones i.p. de 10 pg de proteina LACK precipitada en 2 mg de Alum (PerBio Science France SAS, Brebiéres, Francia) en los días 1 y 8 (Julia el al del et . , 2002) .
OM-197-MP-AC fue administrado del día 0 al día 12 como se describe posteriormente en la presente. Todos los ratones fueron atacados del. día 16 al día 20 ya se con una solución de LACK (0.15%) o con PBS como se indica posteriormente en la presente. Los grupos experimentales fueron los siguientes: El grupo A: ratones sin tratar, de LACK-sensibilizados y PBS-atacados (3 ratones) - Grupo B: ratones LACK-sensibilizados y atacados sin tratar (7 ratones) - Grupo C: ratones ??-197-MP-AC-tratados, i.p. LACK-sensibilizados y apartados (5 ratones) - Grupo D: ratones tratados con OM-197-MP-AC, i.g. LACK-sensibilizados y atacados (7 ratones) - Grupo E: ratones tratados con OM-197-MP-AC, s.c.
LACK-sensibilizados y atacados (7 ratones) . - Grupo F: ratones tratados con OM-197-MP-AC, i.n. LACK-sensibilizados y atacados (7 ratones) - Grupo G: ratones tratados con aerosoles OM-197-MP-AC, LACK-sensibilizados y atacados (7 ratones) Los ratones de los grupos C, D, E, y G fueron tratados en los días: 0, 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11, mientras que los ratones del grupo F (ruta intranasal) fueron solamente tratados en los días 0, 4, 7, y 11.
Los ratones de los grupos C y E fueron tratados i.p. y s.c. respectivamente con 1 mg/Kg (20 g por ratón) de OM-197-MP-AC. Los ratones de los grupos D fueron tratados intra-gástricamente con 50 mg/Kg (1 mg por ratón) de OM-197-MP-AC . Los ratones de los grupos F fueron tratados con i.n. con 20 µg de OM-197-MP-AC en un volumen de 20 µ? de (OM-197-MP-AC a 2 mg/ml, 10 µ? /nost rilo . ) Los ratones del grupo G recibieron aerosoles de una solución de OM-197-MP-AC a al 0.2% (2 mg/ml) por 10 minutos.
Reactivos : - La proteina recombinante LACK fue producida en E. coli y purificada como se describe (Mougneau et al., 1995) . - OM-197-MP-AC, lote #050323, a la concentración de 2.2 mg/ml y lote #050322, a la concentración de 2.17 mg/ml fueron provistos por OM PHARMA y usados para las administraciones orales y todas las otras administraciones, respectivamente . - Anti-IgE (R35-118) acoplada a biotina, fue comprada de BD Biosciences (Le Pont de Claix, Francia) . Los mAbs E -95 Anti-IgE fueron una donación de DNAX (Palo Alto, CA, Estados Unidos de América) .
- El tratamiento Intranasal fue efectuado después de la anestesia ligera de los ratones que utilizando isoflurano (Aerrane, Baxter) .
Títulos de anticuerpo : Todos los ratones fueron sangrados mediante punción del corazón 2 días después del último aerosol. La IgE total fue cuantificada mediante ELISA utilizando mAbs anti-IgE EM-95 como anticuerpo de recubrimiento y mAbs anti-IgE de rata acoplados a biotina como anticuerpo secundario como se describe en cualquier parte de la presente (Julia el al del et . , 2002).
Análisis de célula de lavado bronquioalveolar (BAL) : Ratones individuales fueron sangrados y una cánula fue insertada a sus traqueas. Los pulmones fueron lavados 3 veces con 1 mi de PBS calentado. Las células fueron lavadas con PBS, resuspendidas en 300 µ? y contadas utilizando una cámara de Burker-Türk . Para conteos de células BAL diferenciales, preparaciones del citospina fueron elaboradas y teñidas con Wright/Giemsa.
Resultados : a) Los números respectivos de neutrófilos, los eosinófilos, linfocitos y otras células mononucleares fueron determinados mediante examen microscópico y son reportados en la Figura 11 para cada ruta de administración probada. Como los inventores habían reportado previamente en ejemplo 8, los ratones tratados i.p. con OM-197- P-AC exhibieron tanto un porcentaje reducido como números reducidos de eosinófilos en BAL. Sin embargo, los contenidos de células BAL de ratones tratados de s.c. y i.g con OM-197- P-AC no produjeron diferencias con aquéllos de los ratones sin tratar. En contraste, tanto las frecuencias (no mostradas) ratones que habían recibido OM-197-MP-AC i.n. Además, los ratones tratados con aerosoles del OM-197-MP-AC exhibieron la misma tendencia como en los animales tratados i.n Conclusión : Por lo menos OM-197-MP-AC fue significativamente eficiente tanto en las rutas i.p. y las rutas intranasal para disminuir significativamente en este modelo el número de eosinófilos en los lavados bronquio-alveolares de ratones sensibilizados a un alérgeno. En acuerdo con los datos previos (ejemplo 8), encontró que en los ratones tratados i.p. con OM-197- P-AC exhibieron cantidades reducidas de IgE total (Figura 12). Además, los ratones que habían recibido inyecciones i.n. de OM-197-MP-AC también exhibieron títulos reducidos de IgE en el suero total. En contraste, los ratones tratados i.g., s.c. o con aerosoles presentaron cantidades similares IgE en el suero total en comparación con los ratones sin tratar.
Conclusión : OM-197-MP-AC administrado ya sea mediante i.p. o por mediante la ruta intranasal disminuyo significativamente los niveles de IgE significativamente totales en este modelo de asma .
EJEMPLO 10 Efecto incrementado de OM-197-MP-AC formulado mediante la ruta de administración oral en el modelo murino de asma Los resultados presentados en el ejemplo 9 muestran que OM-197-MP-AC no es efectivo en la prevención de respuestas alérgicas en el modelo LACK murino de asma, cuando es administrado sin formular por la ruta oral. Un análisis de formulación con el fin de incrementar la actividad de OM-197-MP-AC por la ruta oral fue por consiguiente investigado en este modelo. Por consiguiente, en este estudio se investigo si el compuesto de forma OM PHARMA triacilado OM-197-MP-AC protegería a los ratones contra la inflamación de vías aéreas alérgicas cuando es proporcionado como formulación gast ro-intest inal resistente (OM-197-MP-AC con Lutrol® F 127, también conocido como poloxamer 407) .
Protocolo : La formulación de ??-197-MP-AC/Lutrol® F 127 fue preparada el mezclar 12.875 mi de una solución de OM-197-MP-AC a 4.35 mg/ml y 5.6 mi de Lutrol F127 a 50 mg/ml. El volumen administrado fue de 330 µ? .
Reactivos y equipo Se proporciono solución salina como aerosoles del control La proteina LACK recombinante fue producida en E. coli. y purificada sobre una columna de afinidad de Ni-NTA. Hidróxido de aluminio (Alum) fue comprado de Pierce La centrifuga usada fue una Cytospin 4 (Thermo-Shandon, Cheschire, Reino Unido de la Gran Bretaña) , los cito-portaobjetos fueron comprados de Thermo-Shandon y los teñidos de Wright y Giemsa de Sigma. Los aerosoles fueron dados utilizando un nebulizador ultra-son ultramed (Medicalia, Forenze, Italia) El arreglo de perlas de CBA IL-4 fue comprado de BD Biosciences. El arreglo de FACS fue comprado de BD Biosciences.
Animales : - Ratones hembra BALB/c de 6 semanas de edad fueron comprados del Centre d' Elevage Janvier, Francia y fueron mantenidos bajo condiciones libres de patógenos especificas en la instalación del animal. Fueron alimentados con una dieta estándar proporcionada por Safe (Augy, Francia).
Protocolo : 15 ratones de BAL/c (en los que se incluyen los ratones para los grupos del control A y B, mostrados también en los ejemplos 8 y 9) fueron usados para este experimento. A: Ratones sin tratar LACK-sensibilizados y atacados con solución salina (3 ratones) . B: Ratones sin tratar LACK-sensibilizados y atacados (6 ratones) Tratamiento profiláctico F: Ratones tratados con OM-197-MP-AC (oral) LACK-sensibilizados y atacados (6 ratones) Los ratones del grupo F fueron tratados oralmente en los días 0, 2, 3, 4, 7, 9, 10 11, y 12 con 1 mg de OM-197-AC formulado . En día 1 y día 8, los ratones fueron sensibilizados i.p. con LACK/Alum. Del dia 16 al día 20, todos los grupos excepto los ratones del grupo A fueron atacados con aerosoles de una solución de LACK (0.15%) . el Grupo A recibió una solución salina (NaCl 0.9%) durante 40 minutos en lugar de esto.
En el día 22, todos los ratones serán sacrificados. Para todos los animales, BAL y pulmones sin nodos linfáticos bronquiales fueron cosechados. Las células BAL serán contadas y los contenidos celulares serán analizados después de examen microscópico de citospinas siguiendo el teñido de wright /giemsa . Además, los pulmones de cada grupo fueron cosechados y congelados en nitrógeno líquido para análisis de contenido de citoquinas adicional. Para investigar el contenido de citoquinas, extractos de proteína a partir de pulmones de ratones LACK-sensibilizados y PBS-desafiados (grupo A) . Los ratones LACK-sensibilizados y desafiados (grupo B) y ratones wt tratados con OM-197-MP-AC formulado (grupo F) . La cantidad de IL-4 fue analizada mediante análisis múltiplex utilizando el arreglo FACS.
Resultados : Los números respectivos de neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, y otras células mononucleares fueron determinados mediante examen microscópico y son reportados en la Figura 13. En contraste con los resultados reportados en el ejemplo 8 (y Figura 11) en donde el contenido de célula BAL de ratones que habían sido tratados i.g con OM-197-MP-AC (sin formular) , cuando OM-197-MP-AC fue con Lutrol, el número de neutrófilos, eosinófilos (p <0.05), linfocitos, y otras células mononucleares fueron reducidos a la mitad en BAL de ratones que habían recibido OM-197-MP-AC formulado (Véase Figura 13) . Además, las cantidades de IL-4 fueron analizadas en pulmones de ratones tratados y sin tratar. Mientras que los contenidos en el pulmón de IL-4 fueron muy bajos indetectables en los animales PBS-desafiados , las cantidades de IL-4 se incrementaron 20 veces en ratones de de control sin tratar LACK-desafiados . Después del tratamiento oral con OM-197-MP-AC formulado (Véase Figura 14), las cantidades de IL-4 en los pulmones disminuyeron el 75% (p <0.01) Conclusión : Cuando es formulado apropiadamente, OM-197-MP-AC oral fue apto de disminuir significativamente en este modelo el número de eosinófilos en los lavados bronquio-alveolares de ratones sensibilizados a un alérgeno. Esta disminución fue correlacionada con una disminución en IL-4.
EJEMPLO 11 Efecto de OM-197-MP-AC sobre ratones diabéticos no obesos (NOD) . Hasta ahora, se proporcionaron ejemplos de la eficacia in vivo de OM-197-MP-AC solamente en un modelo murino de asma. En este ejemplo, se proporciona alguna evidencia que OM-197-MP-AC es también activo en otra patología inflamatoria: diabetes .
Protocolo : Se demostró previamente que OM-197-MP-AC y otras moléculas triaciladas disminuyen la inflamación de vía aérea en animales asmáticos. En este estudio, se investigó si OM-197-MP-CA seria apto de inducir protección, en otro modelo de enfermedad inflamatoria murina: el modelo de diabetes de MOD (diabéticos no obesos ) . Un grupo de 10 ratones NOD de hembras de 6 semanas de edad hembra fueron tratados durante 10 semanas ya sea con 0.01, 0.1, y 1 mg/kg de OM-197-MP-AC . Un grupo de 6 ratones MOD hembras que reciben 200 µ? de PBS i.p. 3 veces a la semana fue usado como control. En esta serie de experimentos, el tratamiento fue conseguido hasta que los ratones habían llegado a 16 semanas de edad. Éste es el punto en el tiempo cuando los animales de control comienzan a desarrollar diabetes manifiesta. Los resultados en términos de incidencia de diabetes fueron comparados con aquellos obtenidos en los animales de control. La diabetes fue verificada una vez a la semana mediante prueba de glucosuria, utilizando bandas de prueba (Glukotest®, Roche, Francia), dos veces a la semana cuando las diabetes apareció. La diabetes fue confirmada ala evaluar la glicemia (> 3mg/ml) con bandas de prueba (Glucotrend®) . La presencia de diabetes en los grupos experimentales diferentes es graficada (Véase Figura 15) utilizando el método de Kaplan-Meier , esto es, la gráfica de subrevivencia acumulativa no paramétrica. La comparación estadística entre las curvas es efectuada utilizando la prueba de logrank (Manto-Cox) que proporciona los valores de 2 correspondientes. 0M-197-MP-AC a dosis de 1 mg/kg fue significativamente activo (p = 0.0321), y a la dosis de 0.1 mg/kg el compuesto de la invención exhibió una tendencia positiva (p = 0.0543) . En otro experimento utilizando una dosis de OM-197-MP-AC de 0.3 mg/Kg, los resultados obtenidos a la semana 27 muestran un valor p significativa de 0.0362. A la semana 27, el 82% de los animales fueron encontrados diabéticos en el grupo de control y 27% en el grupo tratado con OM-197-MP-AC (0.3 mg/Kg) exhibieron la enfermedad.
EJEMPLO 13 Toxicologia : endotoxicidad de LAL La Endotoxicidad fue determinada primero para MLOM-197-MP-AC y para O -294-DP mediante la prueba cromogénica de lisado de amebocitos de Limulus (Chromogenic - LAL de Bio-Whittaker, equipo n° 50-65OU) .
Protocolo : Esta prueba es basada en la activación mediante lipopolisacárido (LPS) o productos de estructura comparable mediante una cascada enzimática presente en la LAL. Esta activación enzimática es demostrada por la división de un cromógeno enlazado a un péptido mediante una. La reacción enzimática se lleva a cabo a 37°C y la formación del cromógeno con el paso del tiempo es medida a 405 nm. El tiempo necesario para llegar a hacer 0.2 unidades de D.O. es registrado y la actividad del endotóxica calculada en relación con un estándar de LPS (la curva estándar) . Los resultados son expresados en EU (unidad de endotoxina) en relación con una preparación estandarizada de LPS de E.coli (1 EU corresponde a 0.08 ng LPS equivalente) .
Resultados : Ambos OM-197-MP-AC y OM-294-DP mostraron muy poca o ninguna actividad de Limulus en el análisis de LAL cromogenico.
Conclusión : OM-197-MP-AC y OM-294-DP son muy débilmente endotóxicos (por lo menos 106 veces de disminución) cuando se comparan con LPS.
EJEMPLO 14 Toxicología : pirogenicidad en conejos Finalmente OM-197-MP-AC y OM-294-DP fueron probados en cuanto a su pirogenicidad potencial en conejos.
Protocolo : 3 conejos blancos de Nueva Zelanda/grupo fueron inyectados i.v. ya se con OM-197-MP-AC o OM-294-DP a diferentes dosis (de acuerdo con la Pharmacopoeia 2001 europeo, Método 2.6.8) . Productos: OM-197-MP-AC a 0.0009, 0.009, 0.09, 0.9 mg/Kg y OM-294-DP a 0.001, 0.01, 0.1 y 1 mg/Kg. Animales: Lectura: Incremento de temperatura Resultados : Ambos compuestos fueron considerados no pirogénicos in vivo, puesto que el umbral pirogénico de OM-197-MP-AC no fue alcanzado a la dosis más alta probada (0.9 mg/kg) , y la pirogenicidad de OM-294-DP fue solamente alcanzada entre 0.01 y 0.1 mg/kg.
REFERENCIAS Byl, B., Libin, M . , Bauer, J. , Martin, O. R. , De Wit, D., Davies, G., Goldman, M., and Willems, F. (2003) . OM197-MP- AC induces the maturation of human dendritic cells and promotes a primary T cell response. Int Immunopharmacol 3, 417-425. Julia, V., Hessel, E. M., Malherbe, L . , Glaichenhaus , N . , O'Garra, A . , and Coffman, R. L. (2002) . A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to actívate specific T cells long after antigen exposure . Immunity 16, 271-283. Mougneau, E . , Altare, F. , Wakil, A . E . , Zheng, S., Copolla, T., Wang, Z.-E., Waldmann, R., Locksley, R., and Glaichenhaus, N. (1995) . Expression cloning of a Leishmania major protective T cell antigen. Science 268, 563-566. Verán, J. , Mohty, M . , Gaugler, B . , Chiavaroli, C, and Olive, D. (2004) . OM-197-MP-AC adjuvant properties: the in vitro maturation of normal and leukemic dendritic cells in a serum-free culture model. Immunobiology 209, 67-77.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Secreción de IL-12 (paneles izquierdos) e IL-10 (paneles derechos) mediante DC murinos estimulados por LPS (1 µg/ml) solo o primero durante 90 minutos con las concentraciones indicadas (en µg/ml) de O -197-MP-AC (A) o 294-DP (B) y luego mediante LPS (1 µg/ml) por 20 horas adicionales. Los sobrenadantes fueron recolectados de los cultivos de DC y analizados mediante ELISA en cuanto a la presencia de IL-12 e IL-10.
Figura 2: Secreción de TNF -a mediante DC murinos estimulados por LPS (1 iq/ml) solo, o primero durante 90 minutos con las concentraciones indicadas (en el de 294-DP (294), o de OM-197-MP-AC (197), y luego mediante LPS (1 µg/ml) por 20 horas adicionales. Los sobrenadantes fueron recolectados de los cultivos de DC y analizados mediante ELISA en cuanto a la presencia de TNF - a. Figura 3: Efecto de dosis incrementadas de los cuatro compuestos probados (OM-197-MP-AC, n=5; OM-197-MC-HD, n=5; OM-294-BA-MP, n=7; OM-197-MP-HD, n=3) sobre la producción de IFN-? e IL-13 de células CD4+ T humanas seguidas de una activación policlonal. Los resultados son expresados como la mediana (±p25/p75) de n experimentos independientes y muestran el porcentaje (%) de proliferación o producción del citosina de células tratadas contra las células sin tratar (consideradas como 100%, véase linea de puntos) . El análisis estadístico fue efectuado utilizando una prueba de Mann-Whitney sin aparear no parametrica (2 colas) . Figura 4 : AHR mediante plet ismografía de cuerpo entero (Emka) en respuesta a concentraciones incrementadas (6-25 mg/ml) de metacolina inhalada un día después del último ataque de antígeno. Los animales fueron tratados como se describe en la sección de protocolo. Se muestran los resultados ("valor de pausa mejorada " promedio +/- SEM) para animales tratados con solución salina (como en el grupo del control negativo, n = 4), animales LACK-tratados sin tratar (como el grupo del control positivo, n = 8), y ratones LACK atacados tratados con OM-197-MP-AC (n = 8) . Figura 5: Porcentaje de eosinófilos en lavados bronquio-alveolares analizado mediante examen microscópico de preparaciones del citospina teñidas con coloración de right /Giemsa . Los grupos estudiados son los mismos como aquéllos usados en Figura 4. La linea de puntos indica en toda la gráfica el valor obtenido en los animales asmáticos sin tratar . Figura 6: Todos los ratones fueron tratados como se describe en la sección de protocolo, y fueron sangrados mediante punción del corazón un dia después del último aerosol. IgE total fue cuantificada mediante ELISA utilizando mAbs anti-IgE EM-95 de rata como anticuerpo de recubrimiento mAbs anti-IgE de rata acoplados a biotina como anticuerpo secundario como se describe (Julia el al del et., 2002) . Cada punto corresponde a un solo animal. Los grupos estudiados son los mismos como aquéllos usados en las Figuras 4 y 5. Figura 7: Extractos de proteina (400 1) fueron preparados de pulmones izquierdos de ratones wt LACK-sensibilizados y PBS-atacados (control) , ratones mezcla wt LACK-sensibilizados y atacados (Asma), ratones wt tratados con OM-197-MP-AC (OM-197) . El contenido de IL-4, IL-5 e IL-13 fueron analizados mediante análisis de múltiplex utilizando un arreglo de FACS . Los resultados son dados en pg / mi. Las lineas de puntos indican en todas las gráficas los valores obtenidos en animales asmáticos sin tratar. Figura 8 : Los ratones fueron tratados terapéuticamente tres veces como se escribe en la sección de método, se efectuaron lavados en ratones individuales sangrados con una cánula insertada en su tráguea. Los pulmones fueron lavados 3 veces con 1 mi de PBS calentado. Las células fueron lavadas con PBS, resuspendidas en 300 µ?, y contadas utilizando una cámara de Burker-Türk . Para conteo de células BAL diferencial, se elaboraron preparaciones de citospina y se tiñeron con coloración de Wright/Giemsa. Los grupos probados fueron: ratones wt LACK-sensibilizados y PBS-atacados (Control) , ratones LACK-sensibilizados y atacados (Asma) y ratones wt tratados con M-197-MP-AC (OM-197) . El número total de células BAL fue determinado mediante examen microscópico de preparaciones de citospina teñidas con coloración de right/Giemsa . Las leneas de punto en toda la gráfica indican el valor obtenido en animales asmáticos sin tratar. Figura 9: Porcentaje de eosinófilos en BAL analizados mediante examen microscópico de preparaciones del citospina fueron teñidas con coloración de Wright/Giemsa. Los ratones fueron tratados terapéuticamente tres veces como se describe en la sección de método, las células de BAL fueron cosechadas como se explica en la Figura 8. Los grupos (terapéuticos) estudiados son los mismos que aquéllos usados en la Figura 8. La linea puntos indica en toda la gráfica el valor obtenido en animales asmáticos sin tratar. Figura 10: Para analizar el contenido de citosina en el pulmón, los pulmones fueron cosechados izquierdos para preparar extractos de proteina. 400 µ? fueron recuperados para cada pulmón izquierdo. Las citosinas fueron medidas mediante análisis múltiplex utilizando un arreglo de FACS, y los resultados son dados en pg/ml. Los grupos (terapéuticos) estudiados en los mismos que aquellos en las Figuras 8 y 9. Las lineas de puntos indican en todas las gráficas los valores obtenidos en animales asmáticos sin tratados. Figura 11: Número de eosinófilos, neutrófilos, y linfocitos BAL murinos. Las células fueron obtenidas y lavadas como se describe en la sección de protocolo. Para conteo de células BAL diferencial se elaboraron preparaciones de citospina se tiñeron con Wright /Giemsa . Por lo menos 400 fueron puntadas para cada portaobjeto y el número de eosinófilos, neutrófilos y linfocitos fueron determinados mediante examen microscópico. La linea puntos indica en toda la gráfica el valor obtenido en animales asmáticos sin tratar. Figura 12: medición de de IgE Alérgeno-especifico en sueros murinos fueron sangrados mediante punción al corazón dos días después del último aerosol y los sueros fueron prepararon.
IgE LACK-especí fica fue medida mediante ELISA. Se reportan los resultados (ng/ml) de ratones individuales, el valor medio en cada grupo es representado por una barra. * = P <0,05. La linea de puntos indica en toda la el valor obtenido en animales asmáticos sin tratar. Figura 13: Número de eosinófilos, neutrófilos y linfocitos en BAL murinos. Las células fueron obtenidas y lavadas como se describe en la sección de protocolo. Para conteo de células de BAL diferenciales, preparaciones de citospina fueron elaboradas y teñidas con Wright /Giemsa . Por lo menos 400 células fueron puntuadas para cada portaobjeto y el números de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y otras células (macrófagos, células dendriticas y pnuemocitos) fueron determinados mediante examen microscópico. Los 3 grupos probados fueron descritos en la sección de protocolo del ejemplo 10. La linea puntos indica en toda la gráfica el valor obtenido en animales asmáticos sin tratar. Figura 14: Para analizar el contenido de citosina en el pulmón, los pulmones fueron cosechados y los pulmones izquierdos fueron usados para preparar extracto de proteina. 400 µ? fueron recuperados por cada pulmón izquierdo. La IL-4 fue medida mediante arreglo de FACS y los resultados son dados en pg/ml. Los 3 grupos probados fueron descritos en la sección de protocolo del ejemplo 10. La linea de puntos indica en toda la gráfica el valor obtenido en animales asmáticos sin tratar..
Figura 15: presencia de diabetes en ratones NOD. Los ratones fueron tratados i.p. ya sea con PBS (6 animales), o las 3 dosis indicadas de OM-197-MP-AC (3 grupos de 10 animales) . La diabetes fue verificada una vez a la semana mediante prueba de glucosuria (Glukotest) y dos veces a la semana cuando apareció la diabetes. La diabetes fue conservada al evaluar la glicemia (> 3 mg/ml) con bandas de prueba (Glucotrend®) . La presencia de diabetes en los grupos experimentales diferentes es graficada (Véase Figura 15) utilizando el método de Kaplan-Meier , esto es una gráfica de subrevivencia acumulativa no paramétrica. La comparación estadística entre las curvas es efectuada utilizando la prueba de logrank (Manto-Cox) que proporciona los valores ?2 correspondientes: OM-197-MP-AC 1 mg/kg p= 0.321; 0.1 mg/kg = 0.0543.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para el tratamiento de animales de sangre caliente, en los que se incluyen humanos, que sufren de una enfermedad o alteración relacionada con la sobreproducción de citoquinas inflamatorias, caracterizado porque comprende la administración a un paciente en necesidad del mismo una cantidad apropiada de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un compuesto inmunomodulador de la siguiente fórmula general (I) : X- (CH2)m-C*±H-CO-NH- (CH2) n-C+2H-CH2-Y (I) HRx NHR2 en donde: - m y n, independientemente entre si, son un número entero que fluctúa de 1 a 4 , - X e Y, cada uno designan ya sea un grupo en estado neutro o cargado, seleccionado de los siguientes grupos: - carboxilo -OH, - dihidroxifosforiloxi -O-P (O) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(OH), - amino -NH2, - hidroxilo -OH, — [ ( amino ( Ci_Cío ) lqui 1 ] a inoca boni 1o ~CONH (CH2 ) ni- NH2, n es un número entero de 1 a 10, [dicarboxi (C1-C5) alquil ] aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni-COOH, n es un número entero de 1 a 5, {carboxi [amino (C1-C5) alquil] } aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni~NH2, n es un número entero de 1 a 5, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni_NH2, n es un número entero de 1 a 15, dihidroxi (C1-C10) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) nl-CHOH-CH2OH, n es un número entero de 1 a 10, - hidroxi (C1-C10) alcanoiloxi-O-CO- (CH2) nl-OH, n es un número entero de 1 a 10, - carboxi (C1-C10) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) m-COOH , n es un número entero de 1 a 10, - oxo (C1-C5) alcanoiloxi - -O-CO- ( CH2 ) ni~CHO, n es un número entero de 1 a 5, - [carboxi (C1-C10) alcanoil] amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni-NH-CO- (CH2) n2-COOH, n es un número entero de 1 a 15, - Ri y R2 cada uno designan un grupo acilo derivado de de un ácido carboxilico saturado o insaturado de cadena recta o ramificada, que tiene de 2 a 18 átomos de carbono, que está sin sustituir o lleva uno a tres substituyentes seleccionados de entre hidroxilo, dihidroxifosforiloxi, alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, alcoxi de 2 a 18 átomos del carbono, aciloxi de 2 a 18 átomos del carbono en la porción acilo, amino, acilamino, - C*i y C*2, independientemente entre si, son átomos de carbono asimétricos en configuración R, S o en forma racémica RS o una sal, solvato o isómero del mismo, estable farmacéuticamente, opcionalmente en conjugación o mezcla con un diluyente o portador aceptable farmacéuticamente, no tóxico, inerte . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: - X es seleccionado de los siguientes grupos: - carboxilo -OH, - dihidroxifosforiloxi -0-P (0) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(0H), - amino -NH2, [ (amino (Ci-Cio) alquil] aminocarbonilo -CONH (CH2) ni~ NH2, n es un número entero de 1 a 10, [dicarboxi (C1-C5) alquil] aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni-C00H, n es un número entero de 1 a 5, ( carboxi [amino (C1-C5) alquil ]} aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni-NH2, n es un número entero de 1 a 5, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ??-??2, n es un número entero de 1 a 15 e Y es seleccionado de los siguientes grupos: - dihidroxifosforiloxi -O-P (O) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(0H), - amino - NH2, - hidroxilo - OH, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni_NH2, n es un número entero de 1 a 15, - dihidroxi (C1-C10) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) nl-CHOH- CH2OH, n es un número entero de 1 a 10, - hidroxi (C1-C10) alcanoiloxi-O-CO- (CH2) ni-OH, n es un número entero de 1 a 10, - carboxi (C1-C10) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni-COOH, n es un número entero de 1 a 10, - oxo (C1-C5) alcanoiloxi - -O-CO- (CH2) ni-CHO, n es un número entero de 1 a 5, - [carboxi (C1-C10) alcanoil] amino (C1-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) ni-NH-CO- (CH2) n2-COOH, n es un número entero de 1 a 15. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque: - X es seleccionado de los siguientes grupos: - carboxilo -OH, - dihidroxifosforiloxi -O-P (O) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(OH), - amino -NH2, [ (amino (C1-C10) alquil] aminocarbonilo -CONH (CH2) nl-NH2, n es un número entero de 1 a 6, - [dicarboxi (C1-C5) alquil] aminocarbonilo -CO-NH- CH (COOH) - (CH2) ni-COOH, n es un número entero de 1 a 5, { carboxi [amino (C1-C5) alquil ]} aminocarbonilo -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni_NH2, n es un número entero de 1 a 5, - amino (C1-C15 ) alcanoiloxi -0-C0- (CH2) ni_NH2, n es un número entero de 1 a 12 e Y es seleccionado de los siguientes grupos: - dihidroxifosforiloxi -0-P (0) (OH) 2, - hidroxisulfoniloxi -0-S02(0H), - amino - NH2, - hidroxilo - OH, - amino (C1-C15) alcanoiloxi -0-C0- (CH2) ni- H2, n es un número entero de 2 a 12, dihidroxi (C1-C10) alcanoiloxi -0-C0- (CH2) ni-CH0H-CH20H, n es un número entero de 3 a 7 , - hidroxi (C1-C10) alcanoiloxi-O-CO- (CH2) ??-??, n es un número entero de 2 a 6, - carboxi (C1-C10) alcanoiloxi -O-CO- (CH2 ) ni-C00H, n es un número entero de 3 a 6, - oxo (C1-C5) alcanoiloxi - -O-CO- (CH2) nl-CHO, n es un número entero de 2 a 5, - [carboxi (C1-C10) alcanoil] amino (Ci-C15) alcanoiloxi -O-CO- (CH2) m-NH-CO- (CH2) n2-COOH, n es un número entero de 2 a 12. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque: - X es seleccionado de los siguientes grupos: -COOH, -0-P(0) (0H)2, -O- SO2 (OH) , -NH2, -CO-NH- (CH2) 3-N H2 , o -CONH- (CH2) 6- H2, -CO-NH-CH (COOH) -CH2-COOH, -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) 4-NH2, -O-CO- (CH2) 5-NH2 e - Y es seleccionado de los siguientes grupos: -O-P(O) (OH)2, -0-S02 (OH) , -NH2, -OH, -O-CO-CH2 -NH2 (2-aminoetanoiloxi) , -O-CO- (CH2) 2-NH2 (3-aminopropanoiloxi ) , -O-CO- ( CH2 ) 5- H2 ( 6-aminohexanoiloxi ) o -0-CO- (CH2) 11- H2 ( 12-aminododecanoiloxi ) , -O-CO- (CH2) 4-CHOH-CH2OH (6, 7-dihidroxiheptanoiloxi) , -O-CO- (CH2) 5-OH ( ß-hidroxihexanoiloxi ) , -O-CO- (CH2) 2-COOH (3-carboxipropanoiloxi ) , -O-CO- (CH2) 4-CHO ( 6-oxohexanoiloxi ) , -O-CO- (CH2) 5-NH-CO- (CH2) 2-COOH ( 3-carboxipropanoil-ami-nohexanoiloxi ) . 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque Ri y R2 son escogidos de entre: -CO-CH2-C*H [0-C0- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3, (3 (Ci20)Ci4) , -CO-CH2-C*HOH- (CH2) 10-CH3, (3 (HO) Ci4) , -CO-CH3, (C2), -CO-CH2-NH-CO-C*H [0-C0- (CH2) 8-CH3] - (CH2) 5-CH3, ( [2 (C10O)C8]NC2) , -CO-C*H [0-C0- (CH2) 4-CH3] - (CH2) 5-CH3, (2 (C60) C8) , -C0- (CH2) 16-CH3, (C18), -CO-CH2-C*H[0-CH2-C6H5] - (CH2) 10-CH3, (3 (BnO)C14) , -CO-CH2-C*H[0-P(0) (OH)2]-(CH2)10-CH3 , (3[(OH)2- P(0)0]Ci4) , C* correspondiente a un átomo de carbono asimétrico en configuración R, S, o en forma racémica RS, en las fórmulas mencionadas anteriormente. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque: - Ri es escogido de entre: -CO-CH2-C* H [0-C0- (CH2) i0-CH3] - (CH2) 10-CH3, (3 (C120) C14) , -CO-CH2-C* HOH- (CH2) 10-CH3 , (3 (HO) Ci4) , -CO- CH3 , (C2), -CO-CH2-NH-CO-C* H [0-C0- (CH2) 8-CH3] - (CH2) 5-CH3 , ( [2 (C10O)C8]NC2) , -CO-C* H [0-C0- (CH2) 4-CH3] - (CH2) 5-CH 3 , (2 (C60) C8) , -C0- (CH2) 16-CH 3 , (C18), - R2 es escogido de entre: -CO-CH2-C* +2H[0-CO- (CH2) 10-CH3] - (CH2) io~CH3, (3 (Ci20)Ci4) , -CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3, (3 (HO) C14) , -CO-CH2-C**2H [0-CH2-C6H5] - (CH2) 10-CH3, (3 (BnO) C14) , -CO-CH2-C**2H [O-P (0) (0?)2]~ (CH2) 10-CH3, (3[(OH)2-P(0)0]Cn). C**1 y C**2 correspondientes con átomos de carbono asimétricos en configuración R o S o en forma racémica RS, en las fórmulas mencionadas anteriormente. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el compuesto administrado tiene la fórmula general (II): X- (CH2>)m-C+1H-CO-NH- (CH2) 3-C+2H-CH2-Y (II) NHRx NHR2 en donde X, Y, Ri, R2, y m son como se definen anteriormente, C*1 está en configuración R, S o es la forma racémica RS y C*2 está en configuración R. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el compuesto administrado es seleccionado de entre aquellos de fórmula (II), en donde: - X = -0-P (O) (OH) 2, Y = -O-P(O) (OH)2, Ri = -CO-CH2- C**XH [0-CO- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3, R2 = -CO-CH2-C*+2HOH- ( CH2 ) 10-CH3 , m = 2 , C*1 está en configuración S, C**2 está en configuración R; C**1 y C**2 están en configuración R, esto es (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxi-tetradecanoilamino] -decan-1 , 10-diol (l,10)-bis-dihidrogenofosfato (OM-294-DP (S,R)), - X = -0-P (0) (OH) 2, Y = -0-CO- (CH2) 4-CHOH-CH2OH, Rx = -C0-CH2-C* H [ 0-CO- ( CH2 ) 10-CH3 ] -(CH2)i0-CH3, R2 = -CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3, m = 2, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, C**1 y C**2 están en configuración R, esto es, (3S, 9R) -3- [ ( R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxi tetradecanoil amino] -decan-1, 10-diol 1-dihidrogenofosfato 10-(6, 7-dihidroxiheptanoato) (OM-197-MP-HD (S,R)), - X = - COOH, Y = - 0-CO- (CH2) 4-CHOH-CH20H, Ri = - CO-CHz-C**^ [0-CO- (CH2) i0-CH3] - (CH2) 10-CH3, R2 = - CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3, m = 1, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, C**1 y C**2 están en configuración R, esto es ácido N-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoil ] -L-aspartico, a-N-{ (4R) -5-hidroxi-4 -[ (R) -3-hidroxitetradecanoilamino] pentil } amida 5-0- (6, 7-dihidroxiheptanoato) (OM-197-MC-HD (S,R)), - X = -0-P (0) (OH) 2, Y = - 0-CO- (CH2) 5-NH2, Ri = - C0-CH2-C**1H[0-C0- (CH2) 10-CH3] -(CH2)i0-CH3, R2 = - CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3, m = 2, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, c**1 y c**2 están en configuración R, esto es (3S, 9R) -3- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino] -4-oxo-5-aza-9- [ (R) -3-hidroxi- tetradecanoilamino] -decan-1 , 10-diol 1-dihidrogeno fosfato 10- (6-aminohexanoato) (OM-197-MP-CA (S,R) ) , - X = - NH2, Y = -O-P(O) (OH)2, Ri = - C0-CH2-C**1H [O-CO- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3, R2 = - CO-CH2-C**2HOH- (CH2) 10-CH3,m = 4, C*1 está en configuración S y C*2 está en configuración R, C**1 y c**2 están en configuración R, es decir ( 5S, 11R) -l-amino-5- [ (R) -3-dodecanoiloxitetradecanoilamino ] -6-oxo-7-aza-ll- [ (R) -3-hidroxi-tetradecanoilamino] -dodecan-12-ol 12-dihidrogeno fosfato (OM-294-BA-MP (S, R) ) . 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para el tratamiento de animales de sangre caliente, en los que se incluyen humanos, que sufren de una enfermedad o alteración relacionada con la sobreproducción de citoquinas inflamatorias mediante linfocitos T activados, monolitos o células que presentan antigeno en el organismo, caracterizado porque las citoquinas inflamatorias o marcadores inflamatorios pertenecen al grupo que consiste de IL-?ß, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IFN-?, TNF-a y CP-1. 10. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la enfermedad es seleccionada del grupo que consiste de asma, diabetes, dermatitis atópica, rinitis alérgica, prostatitis, enfermedad de intestino inflamatorio y artritis reumatoide. 11. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque consiste de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquier compuesto como se define en las reivindicaciones 1 a 8 en un portador, excipiente o formulación aceptable farmacéuticamente via una ruta mucosal o parenteral. 12. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque consiste de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto como se define en las reivindicaciones 1 a 8, preferiblemente via rutas peritoneal, subcutánea, oral, intranasal, sublingual o en aerosol. 13. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque las dosificaciones necesarias de las moléculas inmunomoduladoras como se definen en las reivindicaciones 1 a 8 fluctúan de 0.01 a 50 rag/m2 en humanos. RESUMEN DE LA INVENCION La invención es concerniente con el uso de compuestos inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobreproducción de citoquinas inflamatorias, tales como enfermedades seleccionadas del grupo que consiste de asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, prostatitis, enfermedad de intestino inflamatorio, diabetes y artritis reumatoide, dichos compuestos son de fórmula general (I) : X- (CH2)m-C H-CO-NH- (CH2) n-C*2H-CH2-Y (I) HRx NHR2 en donde : - m y n, independientemente entre si, son un número entero que fluctúa de 1 a 4 , - X e Y representan -COOH, -O-P (O) (OH) 2, -0-S02(OH), -NH2, -OH, -CONH (CH2) ni-NH2, -CO-NH-CH ( COOH ) - ( CH2 ) ni~COOH , -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ni~NH2, -O-CO- ( CH2 ) nl-NH¿ , -O-CO- ( CH2 ) m-CHOH-CH2OH, -O-CO- (CH2) m-OH, -O-CO- ( CH2 ) nl-COOH , -O-CO- (CH2) ni~CHO, -O-CO- (CH2) ni-NH-CO- ( CH2 ) n2-COOH , - Ri y R2 cada uno designan un grupo acilo derivado de de un ácido carboxilico saturado o insaturado de cadena recta o ramificada, que tiene de 2 a 18 átomos de carbono, que está sin sustituir o lleva uno a tres substituyentes seleccionados de entre hidroxilo, dihidroxifosforiloxi , alquilo de 2 a 18 átomos carbono, alcoxi de 2 a 18 átomos del carbono, aciloxi de 2 a átomos del carbono en la porción acilo, amino, acilamino.
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