CN101511379A - 免疫调节化合物和治疗与炎性细胞因子过度产生相关的疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫调节化合物在治疗与炎性细胞因子过度产生相关的疾病中的用途，所述的疾病诸如选自哮喘，特应性皮炎，过敏性鼻炎，前列腺炎，炎症性肠病，糖尿病和类风湿关节炎的疾病，所述的化合物具有通式(I)，其中：m和n彼此独立为1－4的整数，X和Y表示－COOH，－O－P(O)(OH)2，－O－SO2(OH)，－NH2，－OH，－CONH(CH2)n1－NH2，－CO－NH－CH(COOH)－(CH2)n1－COOH，－CO－NH－CH(COOH)－(CH2) n1－NH2，－O－CO－(CH2)n1－NH2，－O－CO－(CH2)n1－CHOH－CH2OH，－O－CO－(CH2)n1－OH，－O－CO－(CH2)n1－COOH，－O－CO－(CH2) n1－CHO，－O－CO－(CH2)n1－NH－CO－(CH2)n2－COOH，R1和R2各自表示衍生自具有2－18个碳原子的饱和或不饱和直链或支链的羧酸的酰基，其未被取代或带有1－3个取代基，所述的取代基选自羟基，二羟基磷酰氧基，2－18个碳原子的烷基，2－18个碳原子的烷氧基，在酰基部分上的2－18个碳原子的酰氧基，氨基，酰氨基。

Description

免疫调节化合物和治疗与炎性细胞因子过度产生相关的疾病的方法
本发明涉及免疫调节化合物用于治疗与炎性细胞因子过度产生相关的疾病的用途，诸如选自下组的疾病：哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、前列腺炎、炎症性肠病、糖尿病和类风湿性关节炎。
近来我们已经在理解微生物信号先天免疫系统的机制方面取得了重大进展。另外显而易见的是这类先天免疫系统的活化是引起适应性免疫应答和确定产生的适应反应类型所必需的。这些观察结果对研发免疫疗法的合理手段重新产生了巨大的关注。
两个主要发现对先天免疫活化的理解增加是关键：
1)树突细胞(DC)作为诱导初次免疫应答所必需的抗原呈递细胞的作用；
2)检测微生物结构的存在，从而导致刺激先天免疫系统的Toll-样受体(TLR)和其它“模式识别”受体的发现。
Sallusto和Lanzavecchia首次报导未成熟DC可以由人单核细胞在补充了GM-CSF和IL-4的培养基中产生(Sallusto F，LanzavecchiaA.J Exp Med 1994，179：1109-18)。然而，迅速变得显而易见的是除GM-CSF和IL-4外，额外的成熟因子是获得完全作为抗原呈递细胞(APC)起作用的成熟DC所需的。成熟DC能够引起和操纵适应性免疫应答。
这类成熟信号由微生物产物提供。已经证实这些产物通过TLRs起作用。已经鉴定了有能力的或识别不同微生物产物的11种TLRs。TLR4为特异性识别细菌脂多糖(LPS)的受体，即已知先天免疫系统最有效刺激剂之一。
国际申请W0 2005 007699中描述了特异性结合成员，特别是人抗-IL-13抗体分子且尤其是中和IL-13活性的那些在诊断或治疗IL-13相关病症，包括哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、炎症性肠病和何杰金淋巴瘤中的用途。
然而，研究仍然是了解IL-13在免疫调节中的确切作用所必需的，且解释与研究IL-13/IL-4途经相关的结果仍然具有推定性质，正如通过下列2篇近期公开文献中所示的。
Michael Kabesch等(J.Allergy Clin.Immunol.Volume 117，Number 2)的公开文献“IL-4/IL-13 pathway genetics stronglyinfluence serum IgE levels and childhood asthma”中描述了IgE产生，即哮喘和特应性疾病的标志可以在涉及IL-4和IL-13途经的基因的遗传控制下。因为IgE转换是人免疫性和存活的基础，所以IgE的调节是微妙的。尽管IL-4/IL-13途经可以主要通过其对IgE调节的作用影响哮喘发生，但是得到的结果表明这并非为唯一的情况。
David B Corry和Farrah Kheradmand的公开文献“Control ofallergic airway inflammation through immunomodulation”(J.Allergy Clin.Immunol.Volume 117，Number 2)中描述了与临床试验相关的主要发现，这些临床试验改变了对哮喘的管理和没有改变并且值得进一步研究。据报导B-细胞IgE反应所需的细胞因子IL-4是I型超敏反应所必需的并且IL-4由此为哮喘临床试验中通过使用结合和失活IL-4的IL-4受体α链的可溶性形式(sIL-4Rα)靶向的首要细胞因子之一。IL-13为具有许多与IL-4相同作用，但不受sIL-4α抑制的另一种细胞因子。结论在于未来研究由此可以尝试同时抑制IL-4和IL-13以便治疗哮喘。
本发明依赖于本发明者证实如下文所述的分子为具有良好安全特性的TLR4有效激动剂，它们能够诱导功能性单核细胞-衍生的DC完全成熟并且活化其它表达TLR4的细胞类型。使用本发明化合物处理的DC’s能够诱导初级T-细胞活化并且有利于Th1细胞免疫应答。
本发明者还证实本发明的化合物能够显著减少由抗-CD3和抗-CD28抗体以多克隆方式活化的CD4+T细胞分泌IL-13。
此外，当通过腹膜内或鼻内途经对哮喘鼠模型给予化合物之一时，本发明者证实可预防由抗原致敏和随后气溶胶接触抗原产生的过敏反应。测定的免疫参数提示Th2反应相对减少，这可以解释本发明化合物在这种哮喘模型中起作用的机理。另外，作者证实本发明的化合物能够减少非肥胖型糖尿病小鼠的糖尿病发生。
本发明涉及治疗患有与炎性细胞因子过度产生相关的疾病或病症的温血动物，包括人的方法，包括对有此需要的患者给予适量的药物组合物，该药物组合物包含：
至少一种下列通式(I)的免疫调节化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或异构体：
Figure A200780007571D00121
其中：
- m和n彼此独立为1-4的整数，
- X和Y各自表示中性或带电荷状态的基团，其选自下组：
* 羧基-COOH，
* 二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
* 羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
* 氨基-NH2，
* 羟基-OH，
* [氨基(C1-C10)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)n1-NH2，其中n1为1-10的整数，
* [二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-5的整数，
* {羧基[氨基(C1-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-5的整数，
* 氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-15的整数，
* 二羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH，其中n1为1-10的整数，
* 羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-OH，其中n1为1-10的整数，
* 羧基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-10的整数，
* 氧代(C1-C5)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHO，其中n1为1-5的整数，
* [羧基(C1-C10)烷酰基]氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n1为1-10的整数且n2为1-15的整数，
- R1和R2各自表示衍生自具有2-18个碳原子的饱和或不饱和直链或支链的羧酸的酰基，其未被取代或带有1-3个取代基，所述的取代基选自羟基，二羟基磷酰氧基，2-18个碳原子的烷基，2-18个碳原子的烷氧基，在酰基部分上的2-18个碳原子的酰氧基，氨基，酰氨基，
- C*1和C*2彼此独立为构型R、S或外消旋形式RS中的不对称碳；
任选与惰性无毒性药学上可接受的稀释剂或载体结合或混合。
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其中：
* X选自下组：
* 羧基-COOH，
* 二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
* 羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
* 氨基-NH2，
* [氨基(C1-C10)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)n1-NH2，其中n1为1-10的整数，
* [二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-5的整数，
* {羧基[氨基(C1-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-5的整数，
* 氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-15的整数，
* 且Y选自下组：
* 二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
* 羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
* 氨基-NH2，
* 羟基-OH，
* 氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-15的整数，
* 二羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH，其中n1为1-10的整数，
* 羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-OH，其中n1为1-10的整数，
* 羧基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-10的整数，
* 氧代(C1-C5)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHO，其中n1为1-5的整数，
* [羧基(C1-C10)烷酰基]氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n1为1-10的整数且n2为1-15的整数n
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其中：
* X选自下组：
* 羧基-COOH，
* 二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
* 羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
* 氨基-NH2，
* [氨基(C1-C6)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)n1-NH2，其中n1为1-6的整数，
* [二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-5的整数，
* {羧基[氨基(C1-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-5的整数，
* 氨基(C2-C12)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为2-12的整数，
* 且Y选自下组：
* 二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
* 羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
* 氨基-NH2，
* 羟基-OH，
* 氨基(C2-C12)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为2-12的整数，
* 二羟基(C3-C7)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH，其中n1为3-7的整数，
* 羟基(C2-C6)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-OH，其中n1为2-6的整数，
* 羧基(C3-C6)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-COOH，其中n1为3-6的整数，
* 氧代(C2-C5)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHO，其中n1为2-5的整数，
* [羧基(C3-C6)烷酰基]氨基(C2-C12)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n1为3-6的整数和n2为2-12的整数。
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其中：
* X选自下组：
* -COOH，
* -O-P(O)(OH)2，
* -O-SO2(OH)，
* -NH2，
* -CO-NH-(CH2)3-NH2或-CONH-(CH2)6-NH2，
* -CO-NH-CH(COOH)-CH2-COOH，
* -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH2，
* -O-CO-(CH2)5-NH2，
* 且Y选自下组：
* -O-P(O)(OH)2，
* -O-SO2(OH)，
* -NH2，
* -OH，
* -O-CO-CH2-NH2(2-氨基乙酰氧基)，-O-CO-(CH2)2-NH2(3-氨基丙酰氧基)，-O-CO-(CH2)5-NH2(6-氨基己酰氧基)或-O-CO-(CH2)11-NH2(12-氨基十二烷酰氧基)，
* -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH(6，7-二羟基庚酰氧基)，
* -O-CO-(CH2)5-OH(6-羟基己酰氧基)，
* -O-CO-(CH2)2-COOH(3-羧基丙酰氧基)
* -O-CO-(CH2)4-CHO(6-氧代己酰氧基)，
* -O-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-COOH(3-羧基丙酰基氨基己酰氧基)。
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其中R1和R2选自：
-CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，(3(C12O)C14)，
-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3，(3(HO)C14)，
-CO-CH3，(C2)，
-CO-CH2-NH-CO-C*H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3，([2(C10O)C8]NC2)，
-CO-C*H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3，(2(C6O)C8)，
-CO-(CH2)16-CH3，(C18)，
-CO-CH2-C*H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3，(3(BnO)C14)，
-CO-CH2-C*H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3，(3[(OH)2-P(O)O]C14)，
C*相当于上述式中构型R、S或外消旋形式RS中的不对称碳。
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其中：
-R1选自：
-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，(3(C12O)C14)，
-CO-CH2-C**1HOH-(CH2)10-CH3，(3(HO)C14)，
-CO-CH3，(C2)，
-CO-CH2-NH-CO-C**1H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3，([2(C10O)C8]NC2)，
-CO-C**1H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3，(2(C6O)C8)，
-CO-(CH2)16-CH3，(C18)，
-R2选自：
-CO-CH2-C**2H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，(3(C12O)C14)，
-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，(3(HO)C14)，
-CO-CH2-C**2H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3，(3(BnO)C14)，
-CO-CH2-C**2H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3，(3[(OH)2-P(O)O]C14)，
C**1和C**2相当于上述式中构型R、S或外消旋形式RS中的不对称碳。
本发明还涉及如上所述的方法，其中给予的化合物具有通式(II)：
其中X，Y，R1，R2和m如上述所定义，C*1在构型R、S中或为外消旋RS且C*2在构型R中。
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其中给予的化合物选自式(II)的那些，其中：
-X＝-O-P(O)(OH)2，Y＝-O-P(O)(OH)2，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝2，C*1在构型S中，C*2在构型R中，C**1和C**2在构型R中，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-癸-1，10-二醇(1，10)-双-二氢磷酸酯(OM-294-DP(S，R))，
-X＝-O-P(O)(OH)2，Y＝-O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝2，C*1在构型S中且C*2在构型R中，C**1和C**2在构型R中，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6，7-二羟基庚酸酯)(OM-197-MP-HD(S，R))，
-X＝-COOH，Y＝-O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝1，C*1在构型S中且C*2在构型R中，C**1和C**2在构型R中，即N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰基]-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]戊基}酰胺5-O-(6，7-二羟基庚酸酯)(OM-197-MC-HD(S，R))，
-X＝-O-P(O)(OH)2，Y＝-O-CO-(CH2)5-NH2，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝2，C*1在构型S中且C*2在构型R中，C**1和C**2在构型R中，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(OM-197-MP-AC(S，R))，
-X＝-NH2，Y＝-O-P(O)(OH)2，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝4，C*1在构型S中且C*2在构型R中，C**1和C**2在构型R中，即(5S，11R)-1-氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-6-氧代-7-氮杂-11-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-十二烷-12-醇12-二氢磷酸酯(OM-294-BA-MP(S，R))。
本发明还涉及如上所述用于治疗温血动物，包括人的方法，所述的温血动物，包括人患有与生物体中T淋巴细胞，单核细胞或抗原呈递细胞活化的炎性细胞因子或炎性疾病标记过度产生相关的疾病或病症，其中所述的炎性细胞因子或炎性疾病标记属于IL-1β，IL-4，IL-5IL-6，IL-8，IL-9，IL-13，IFN-γ，TNF-α和MCP-1的组。
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其中所述的疾病选自哮喘，糖尿病，特应性皮炎，过敏性鼻炎，前列腺炎，炎症性肠病和类风湿关节炎。
更具体地说，本发明涉及如上所述的方法，其在于通过粘膜或非肠道途经给予治疗有效量的如上述定义的在药学上可接受的载体，赋形剂或制剂中的本发明式(I)的任意化合物。
更具体地说，本发明还涉及如上所述的方法，其在于通过腹膜，皮下，口服，鼻内，舌下或气溶胶途经给予治疗有效量的如上述定义的本发明式(I)的化合物。
更具体地说，本发明涉及耐胃液的药物组合物，其包含治疗有效量的如上述定义的式(I)的化合物与耐胃液的载体，诸如亲水性伯洛沙姆表面活性剂，诸如伯洛沙姆407(Lutrol F-127)。当使用肠溶聚合物，诸如甲基丙烯酸酯聚合物时，胶态载体，诸如聚合纳米粒或微粒也为用于式(I)口服递送的适当制品。
在一种更常规的方式中，通过使用肠溶衣获得的耐胃液的片剂或胶囊的应用也可以为口服途经的可替代选择。
更具体地说，本发明还涉及如上所述的方法，其中如上述定义的本发明式(I)的免疫调节分子在人体中的所需剂量在0.01-50mg/m2。
本发明还涉及如上述定义的式(I)的至少一种化合物在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的应用，所述的疾病或病症与炎性细胞因子或炎性疾病标记的过度产生相关，诸如哮喘，糖尿病，特应性皮炎，过敏性鼻炎，前列腺炎，炎症性肠病和类风湿关节炎。
本发明还涉及如上述定义的式(I)的化合物和包含所述化合物与生理学可接受载体的药物。
有关式(I)化合物的制备和在治疗癌症或作为免疫佐剂中的应用可以按照WO 00/00462和WO 01/46127中所述的方法制备如上述定义的本发明式(I)的化合物。
本发明进一步详细描述在下列化合物OM-294-DP(S，R)，OM-197-MP-HD(S，R)，OM-197-MC-HD(S，R)，OM-197-MP-AC(S，R)和OM-294-BA-MP(S，R)合成及其生物特性的描述中。
实施例
实施例1：
(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC(S，R))(方案1)
1.(2R)-5-(苄氧基羰基氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨 基]-1-(2-四氢吡喃氧基)戊烷(C-1)
向在室温下和氩气环境中的(2R)-5-(苄氧基羰基氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]戊-1-醇(PCTWO00146127A1)(2.5g；4.39mmol)在无水CH2Cl2(83ml)中的溶液中连续加入3，4-二氢-2H-吡喃(DHP)(1.4ml，15.38mmol)，然后是吡啶鎓对-甲苯磺酸盐(PPTS)(441mg，1.75mmol)。将该溶液在室温下搅拌18小时，然后用CH2Cl2(100ml)稀释，用5％NaHCO3水溶液，随后用H2O洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤并且浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化(AcOEt/石油醚4/1)而得到化合物C-1(2.86g；100％)，为白色结晶固体(在AcOEt/石油醚4/1中Rf＝0.66；U.V.和磷钼酸盐)。
C39H60N2O6.IS/MS：m/z 653.5([M+H]+)，675.5([M+Na]+)。Mp＝84-86℃。
2.(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-1-(2-四氢 吡喃氧基)-戊烷(C-2)
在室温下和氢气环境压力下和有10％Pd/C存在下将化合物C-1(2.5g；4.4mmol)在含有三乙胺(4ml)的EtOH(150ml)中的溶液氢化3.5小时。然后通过过滤除去催化剂，用乙醇洗涤并且浓缩滤液且在高度真空中干燥而得到游离胺C-2(2.15g；96％)，为非晶形白色固体。C31H54N2O4.IS/MS：m/z 519.5([M+H]+)。
3.(S)-(α)-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-γ-丁内酯 (C-3)
向在-15℃下和氩气环境中的(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酸[Bull.Chem.Soc.Jpn 60(1987)，2205-2214](2.16g；5.1mmol)在无水THF(28ml)中的溶液中连续加入N-甲基吗啉(0.56ml；5.1mmol；1eq)和氯甲酸异丁酯(657μl；5.1mmol；1eq)。在-15℃和搅拌下1小时后，加入作为在0.72M NaHCO3水溶液(14ml，2eq)的L-高丝氨酸内酯氢溴酸盐(916mg；5.1mmol；1eq)。将该反应混合物在室温下搅拌20小时。用Et2O(130mL)稀释该混合物，分离有机相并且用H2O洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并且浓缩。通过结晶纯化(最小体积的CH2Cl2和过量的戊烷，在0℃下)而得到化合物C-3(2.17g；85％)，为白色固体。C30H55NO5。IS/MS：m/z 510.5([M+H]+)，532.5([M+Na]+)。mp＝79-80℃。
4.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-10-(2-四氢吡喃基)氧基- 癸-1-醇(C-4)
向在20-21℃下化合物C-2(638mg，1.23mmol，1.3eq)在无水CH2Cl2(1.5mL)中的溶液中加入化合物C-3(483mg，0.95mmol)。将该溶液在20-21℃下搅拌3天；在减压下蒸发溶剂。通过硅胶快速色谱法纯化(CH2Cl2/丙酮5/1-1/1)而得到醇C-4(829mg，85％)，为白色固体。C61H109N3O9。IS/MS：m/z 1029.0([M+H]+)，1051.0([M+Na]+)。mp＝81-82℃。
5.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-10-(2-四氢吡喃基)氧基- 癸-1-醇二苄基磷酸酯(C-5)
向在室温下和氩气环境中醇C-4(120mg；0.12mmol)和1H-四唑(25mg；0.35mmol；3eq)在无水THF(5ml)中的溶液中加入N，N-二苄基二乙基亚磷酰胺(85％，95μl；0.27mmol；2.3eq)。在搅拌下45分钟后，将该反应混合物冷却至-40℃，然后加入mCPBA(57-86％；75mg；0.43mmol；3，7eq)在CH2Cl2(3ml)中的溶液。在-40℃下45分钟后，使该混合物升温并且加入饱和Na2S2O3溶液(3ml)并且将该混合物搅拌10分钟。用乙醚稀释该溶液，分离有机相并且用饱和Na2S2O3(5x)，然后用饱和NaHCO3(2x)洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤并且浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化(CH2Cl2/丙酮4/1，然后2/1)而得到二苄基磷酸酯C-5(126mg；84％)，为非晶形固体。
6.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-(二苄基 磷酸酯)(C-6)
向在0℃下1％HCl在甲醇中的溶液(25ml)中加入化合物C-5(700mg，0.54mmol)在CH2Cl2(2.5ml)中的溶液。在0℃和搅拌下45分钟后，用5％NaHCO3水溶液中和该反应混合物，用CH2Cl2稀释，然后分离有机相。用CH2Cl2(3x)萃取水相，然后合并有机相，用MgSO4干燥，过滤并且浓缩至得到醇C-6(640mg；98％)。
7.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二苄基磷 酸酯10-(6-苄氧基羰基氨基己酸酯(C-7)
向在0℃下和氩气流中的上述制备的化合物C-6(640mg，0.53mmol.)和6-(苄氧基羰基氨基)己酸(423mg，1.60mmol.)在无水CH2Cl2(25ml)中的溶液中依次加入商购1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(306mg，1.60mmol.)和4-二甲氨基吡啶(20mg，160μmol.)。然后将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟且此后在室温下搅拌过夜。然后用水和1N HCl溶液洗涤反应介质，随后进行层分离。用MgSO4干燥有机层，过滤并且蒸发。通过进行硅胶快速色谱纯化(4/1，然后2/1CH2Cl2/丙酮洗脱剂)回收偶联反应产物C-7(537mg；71％)。13C-NMR(62，89MHz，CDCl3)，以ppm计的δ：173.18，171.16，170.38，169.60，156.30，138.23，136.50，135.38，135.28，128.42，128.26，128.17，127.79，127.74，127.44，76.48，71.15，70.84，69.47，69.39，69.31，66.25，65.62，64.37，49.78，47.76，41.41，41.34，40.57，38.97，34.22，34.16，33.96，33.57，32.95，31.70，29.15，28.95，28.32，25.87，25.46，25.02，28.80，24.18，22.49，13.94。
8.(3S.9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯 10-(6-氨基己酸酯)(C-8)(＝OM-197-MP-AC(S，R))
将化合物C-7(500mg，0.35mmol.)在含有乙酸(10ml)的5/2CH2Cl2/乙醇混合物(70ml)中的溶液在室温下和氢气环境压力下和有含10％Pd的Pd/碳存在下氢化12-24小时。过滤出催化剂。蒸发滤液至干且然后通过从真空泵中抽吸干燥残余物而得到C-8(368mg，定量产率)。ES/MS：m/z比为1047.9[M+H]+；1069.8
方案1
Figure A200780007571D00241
实施例2
(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6，7-二羟基庚酸酯)(＝OM-197-MP-HD(S，R))(方案2)
1.6-庚烯酸苄酯(C-9)
向在0℃下6-庚烯酸(4.71g，36.75mmol)在AcOEt(80mL)中的溶液中一次加入三乙胺(15.3mL，110.24mmol)，苄基溴(13.1mL，110.24mmol)和Bu4NI(6.79g，18.37mmol)。将该反应混合物在0℃下搅拌2小时并且在真空中浓缩。将残余物溶于AcOEt，用饱和NaHCO3和H2O洗涤有机相。用MgSO4干燥有机相并且在真空中除去溶剂。对残余物进行硅胶快速色谱(正-庚烷/EtOAc，9：1)而得到化合物C-9(6.00g；75％)，为无色油状物。13C-NMR(62.89MHz，CDCl3)：24.42，28.34，33.37，34.13，66.08，114.73，128.19，128.55，136.16，138.37，173.43。
2.6，7-环氧庚酸苄酯(C-10)
向在0℃下m-CPBA(2.76g，12.29mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液中缓慢加入C-9(1.79g，8.19mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。将该溶液在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌18小时。用CH2Cl2稀释该溶液并且用饱和Na2S2O3水溶液(5x)洗涤有机相。用MgSO4干燥有机相并且在真空中除去溶剂。对残余物进行硅胶快速色谱(正-庚烷/EtOAc，5:1)而得到化合物C-10(1.54g；80％)，为无色油状物。13C-NMR(62.89MHz，CDCl3)：24.60，25.39，32.00，34.02，46.86，51.91，66.04，128.11，128.46，136.01，173.17。
3.67-异亚丙基庚酸苄酯(C-11)
向在室温下C-10(1.54g，6.59mmol)在丙酮(50mL)中的溶液中加入硫酸(0.42mL，7.9mmol)。将该溶液搅拌3小时，用乙醚稀释并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤有机相。用MgSO4干燥有机相并且在真空中除去溶剂而得到C-11(1.73g)，为淡黄色油状物，将其不经进一步纯化用于下一步。
4.6，7-亚异丙基庚酸(C-12)
将化合物C-11(1.53g)在含有Bt3N(3.65mL，26.16mmol)的EtOAc(20ml)中的溶液在室温下和氢气环境压力中在有含10％Pd的Pd/碳存在下氢化3小时。过滤出催化剂并且将滤液蒸发至干。对残余物进行硅胶快速色谱(CH2Cl2/MeOH，5:1)而得到化合物C-12(0.63g；2步内54％)，为无色油状物。
5.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二苄基磷 酸酯10-(6，7-异亚丙基庚酸酯(C-13)
向在0℃下和氩气流中上述制备的化合物C-6(248mg，0.21mmol.)和化合物6，7-异亚丙基庚酸(C-12)(92mg，0.45mmol.)在无水CH2Cl2(5ml)中的溶液中依次加入商购1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(91mg，0.47mmol.)和4-二甲氨基吡啶(催化剂)。然后将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟且此后在室温搅拌过夜。然后用水和1N HCl溶液洗涤反应介质，随后进行层分离。用MgSO4干燥有机层，过滤并且蒸发。通过进行硅胶快速色谱纯化(CH2Cl2/MeOH，99：1)回收偶联反应产物C-13(240mg；83％)。ES/MS：m/z 1390[M+H]+；1411[M+Na]+。
6.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯 10-(6，7-二羟基庚酸酯)(C-14)(＝OM-197-MP-HD(S，R))
将化合物C-13(180mg，0.13mmol.)在含有乙酸(3ml)的5/2CH2Cl2/乙醇混合物(21ml)中的溶液在室温下和氢气环境压力下和有含10％Pd的Pd/碳存在下氢化12-36小时。过滤出催化剂。蒸发滤液至干且然后通过从真空泵中抽吸干燥残余物而得到C-14(139mg，定量产率)。ES/MS：m/z 1079[M+H]+；1101[M+Na]+。
方案2
Figure A200780007571D00271
实施例3
(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1，10-双-二氢磷酸酯)(＝OM-294-DP(S，R))(方案3)
1.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇(C-15)
向在25℃下(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]戊-1-醇(PCT WO00146127A1)(8g，18.4mmol)在无水CH2Cl2(60mL)中的溶液中加入在无水CH2Cl2(28mL)中的化合物C-3(9g，17.5mmol)。将该溶液在20-21℃下搅拌3天。用CH2Cl2(66mL)稀释该混悬液并且温至30℃而得到澄清溶液。向该溶液中缓慢加入乙腈(320mL)。将该溶液冷却至20℃并且搅拌2小时。过滤沉淀，用乙腈洗涤并且在真空中干燥而得到C-15(13.7g，83％)，为白色固体。mp＝103℃。
2.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1，10-双 -(二苄基磷酸酯)(C-16)
向在室温下和氩气环境中的C-15(1.02g；1.08mmol)和1H-四唑(454mg；6.48mmol；6eq)在无水THF(46mL)中的溶液中加入N，N-二苄基二乙基亚磷酰胺(85％，1.50mL；4.97mmol；4.6eq)。在搅拌下30分钟后，将该反应混合物冷却至-20℃，然后加入mCPBA(57-86％；1.32g；7.67mmol；7.4eq)在CH2Cl2(30mL)中的溶液。在-20℃下45分钟后，将该溶液温至0℃并且加入饱和Na2S2O3溶液(25mL)并且将该混合物搅拌10分钟。用乙醚稀释该溶液，分离有机相且用饱和Na2S2O3(5x)，然后用饱和NaHCO3(2x)洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤并且浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化(CH2Cl2/丙酮4/1，然后3/1)而得到C-16(1.38g；87％)，为无色油状物。
3.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1，10-双-二氢 磷酸酯)(C-17)(＝OM-294-DP(S，R))
将化合物C-16(2.7g，1.84mmol)在异丙醇(150mL)中的溶液在室温下和氢气环境压力中用10％Pd/C(320mg)氢化3小时。通过经微孔滤膜过滤除去催化剂。浓缩滤液并且在高度真空中干燥而得到C-17(1.8g；98％)，为非晶形固体。
方案3
Figure A200780007571D00291
实施例4
N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-戊基}酰胺5-0-(6，7-二羟基庚酸酯)(＝OM-197-MC-HD(S，R))(方案4)
1.N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-L-天冬氨 酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]戊基}酰胺 -B-苄酯，5-O-(6，7-异亚丙基庚酸酯)(C-18)
向在0℃下和氩气流中的化合物N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]戊基}酰胺-β-苄酯(PCT WO00146127A1)(1.14g，1.09mmol.)和化合物6，7-异亚丙基庚酸(C-12)(487mg，2.48mmol.)在无水CH2Cl2(30mL)中的溶液中依次加入商购1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(485mg，2.53mmol.)和4-二甲氨基吡啶(43mg，0.35mmol)。然后将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟且此后在室温下搅拌过夜。然后用水和1N HCl溶液洗涤反应介质，此后进行层分离。用MgSO4干燥有机层，过滤并且蒸发。通过进行硅胶快速色谱纯化(CH2Cl2/丙酮，9:1)回收偶联反应产物C-18(1.20g；76％)，为白色固体。ES/MS：m/z 1255[M+Na]+。
2.N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-L-天冬氨 酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-戊基}酰胺 5-0-(6，7-二羟基庚酸酯)(C-19)(＝OM-197-MC-HD(S，R))
将化合物C-18(1.20g，0.97mmol.)在含有乙酸(5ml)的2/1CH2Cl2/乙醇混合物(50ml)中的溶液在室温下和氢气环境压力下和有含10％Pd的Pd/碳存在下氢化12-36小时。过滤出催化剂。蒸发滤液至干且然后通过从真空泵中抽吸干燥残余物而得到C-19(1g，定量产率)。ES/MS：m/z 1012[M+H]+；1034[M+Na]+。
方案4
实施例5
(5S，11R)-1-氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-6-氧代-7-氮杂-11-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-十二烷-12-醇12-二氢磷酸酯(＝OM-294-BA-MP(S，R))(方案5)
1.N α -[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰基]Nε-苄氧基羰基-L-赖 氨酸(C-20)
向在-15℃下和氩气环境中的(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酸P-109[Bull.Chem.Soc.Jpn 60(1987)，2205-2214](153mg；0.36mmol)在无水THF(4ml)中的溶液中依次加入N-甲基吗啉(40μl；0.36mmol；1eq)和氯甲酸异丁酯(47μl；0.36mmol；1eq)。在-15℃下搅拌30分钟后，加入商购H-L-赖氨酸(Z)-OH(100mg；0.36mmol；1eq)在含Et3N(0.16mL)的CH3CN/H2O(3.5/1(4.5mL)中的溶液。将该反应混合物在室温下搅拌20小时。然后蒸发有机溶剂并且将水层冷却至0℃，用10％柠檬酸水溶液酸化至pH＝3并且用AcOEt(3x)萃取。用MgSO4干燥有机层，过滤并且蒸发。通过进行硅胶快速色谱纯化(含0.25％乙酸的1/1石油醚/AcOEt洗脱液)，随后共蒸发甲苯得到C-20(172mg；70％)，为白色结晶固体。MS：(IS+)m/z 690.0[M+H]+，707.0[M+NH4]+，712.0[M+Na]+，727.5[M+K]+.13C-NMR(62.89MHz，CDCl3)，以ppm计的δ：174.90，173.73，170.66，156.98，136.53，128.57，128.]17，128.05，71.27，66.79，52.24，41.32，40.47，34.59，34.24，31.99，31.45，29.72，29.43，29.25，25.29，25.07，22.76，22.27，14.19。
2.(5S，11R)-1-苄氧基羰基氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四 烷酰基-氨基]-6-氧代-7-氮杂-11-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-十 二烷-12-醇(C-21)。
向在0℃下C-20(150mg；0.22mmol.)和(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基-十四烷酰氨基]戊-1-醇WZ-10b(PCT WO00146127A1)(95mg；0.22mmol.；1.0eq)在无水CH2Cl2(3ml)中的溶液中加入商购HOAt(1-二羟基-7-氮杂苯并三唑)(36mg，0.26mmol.，1.2eq.)和商购N，N′-二异丙基碳二亚胺(41μl，0.22mmol.，1.2eq.)。将该反应混合物在0℃下搅拌1小时且此后在室温下搅拌过夜。随后用水，1N HCl溶液和饱和NaHCO3溶液洗涤该反应混合物，随后进行层分离。用MgSO4干燥有机层，过滤并且蒸发。通过进行硅胶快速色谱纯化(3/1CH2Cl2/丙酮洗脱液)回收C-21(165mg；68％)，为白色结晶固体。MS：(IS+)m/z 1105.8[M+H]+，1128.0[M+Na]+，13C-NMR(62.89MHz，CDCl3)，以ppm计的δ：173.56，172.20，171.87，170.23，156.82，138.32，136.69，128.53，]128.47，128.09，128.00，127.91，127.82，76.77，71.48，71.15，66.59，64.77，53.1，51.39，41.71，41.63，40.46，39.45，34.57，34.51，34.12，31.97，29.70，29.51，29.41，29.25，28.69，25.38，25.29，25.19，25.09，22.74，22.50，14.18。
3.(5S，11R)-1-苄氧基羰基氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四 烷酰氨基]-6-氧代-7-氮杂-11-[(R)-3-苄氧基十四烷酰氨基]-十二烷 -12-醇12-二苄基磷酸酯(C-22)。
向在室温下和氩气环境中的C-21(150mg；0.14mmol)和1H-四唑(29mg；0.41mmol；3eq)在无水THF(8mL)中的溶液中加入N，N-二苄基二乙基亚磷酰胺(85％，110μL；0.31mmol；2.3eq)。在搅拌下30分钟后，将该反应混合物冷却至-20℃，然后加入mCPBA(57-86％；87g；0.50mmol；3.7eq)在CH2Cl2(6mL)中的溶液。在-20℃下45分钟后，将该溶液温至0℃并且加入饱和Na2S2O3溶液(5mL)并且将该化合物搅拌10分钟。用乙醚稀释该溶液，分离有机相并且用饱和Na2S2O3(5x)，然后用饱和NaHCO3(2x)洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤并且浓缩。通过快速硅胶色谱法纯化(CH2Cl2/丙酮4/1，然后2/1)得到C-22(149mg；81％)，为非晶形固体。MS：(IS+)m/z 1366.0[M+H]+，1383.5[M+NH4]+，1388.5[M+Na]+，1088.0[M-(BnO)2OPOH]+H]+，13C-NMR(62.89MHz，CDCl3)，以ppm计的δ：173.51，171.77，171.27，169.95，156.67，138.32，136.69，135.66(d)，135.55(d)，128.69，128.51，128.43，128.03，127.77，127.69，76.49，71.28，71.20，69.66(d)，69.58(d)，68.72(d)，66.51，52.82，48.62(d)，41.76，41.46，40.46，39.01，34.54，34.06，31.96，29.68，29.49，29.39，29.22，27.95，25.29，25.18，25.05，22.73，22.45，14.17。
4.(5S，11R)-1-氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨 基]-6-氧代-7-氮杂-11-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-十二烷-12-醇 12-二氢磷酸酯(C-23)(＝OM-294-BA-MP(S，R))
将化合物C-22(130mg，0.095mmol.)在含有乙酸(3ml)的3/1CH2Cl2/乙醇混合物(20ml)中的溶液在室温下和氢气环境压力下和有含10％Pd的Pd/碳存在下氢化36小时。过滤出催化剂。蒸发滤液至干且然后通过从真空泵中抽吸干燥残余物而得到C-23(84mg，91％)。MS：(IS+)m/z 962.0[M+H]+，984.0[M+Na]+。
方案5
本发明化合物的生物活性
实施例6
OM-197-MP-AC和OM-294-DP对鼠DC细胞上LPS诱导的炎性(IL-12 和TNF-α)和抗炎(IL-10)细胞因子的体外调节作用
方案：
分离骨髓细胞并且如下所述培养：
从2只6周龄雄性C57BL/7的(Charles River LaboratoriesFrance)中取出股骨和胫骨，剥离肌肉和腱并且用70％乙醇消毒。切下各骨的两端并且使用带有26号针头的注射器用HBSS(Gibco BRL)冲洗骨髓。以500g离心所得细胞混悬液5min并且用HBSS洗涤。将细胞以3 x 105个细胞/ml重新悬浮于补充了2mM L-谷氨酰胺(Sigma)，100U/ml青霉素(Sigma)，100μg/ml链霉素(Sigma)，50μMβ-巯基乙醇(Sigma)，10％热灭活的FCS(Sigma)和15ng/ml鼠rGM-CSF(R&D)的RPMI-1640(Gibco BRL)中。
为了产生骨髓(BM)衍生的树突细胞(DC)，在第0天时在100-mm细菌培养皿(Falcon 1029)中将BM白细胞在37℃下和5％CO2中培养8天。在第0天，每个培养皿中接种10ml细胞混悬液。在第3天时，向各平板中再加入10ml新鲜制备的培养基并且在第6天时从每个平板中谨慎取出9ml上部培养基并且用10ml新鲜培养基替代。
收集8日龄BM细胞培养物的非贴壁细胞，以500g离心5分钟并且以1.25 x 106个细胞/ml重新悬浮于含有10ng/ml GM-CSF的补充的RPMI中。然后将细胞接种在24-孔组织培养板(1 x 106个细胞/孔)中并且在37℃下和5％CO2中，在没有或有OM-294-DP或OM-197-MP-AC(0.01-100μg/ml/200μl/孔)存在下孵育1小时30分钟。然后以1μg/ml加入LPS(大肠杆菌(E.coli)026：B6，Sigma)并且进一步孵育该平板。在孵育20小时后，采集上清液用于细胞因子分析。
通过ELISA，使用来自BD Pharmingen的OptEIA配对的Ab对测定DC培养物上清液中的IL-12p70，IL-10和TNF-α浓度。SupersignalELISA Pico化学发光过氧化物酶底物(BD Pharmingen)用于通过发光测定法(luminometry)检测(Wallac 1420多标记计数器Victor-2)。按照制造商的说明进行测定。
结果：
a)OM-197-MP-AC和OM-294-DP对LPS-诱导的IL-12和IL-10 产生的作用
对LPS-诱导的IL-12和IL-10产生的作用如图1中所示。
b)OM-197-MP-AC和OM-294-DP对LPS-诱导的TNF-α产生的作 用
对LPS-诱导的TNF-α产生的作用如图2中所示。
结论：
上述结果清楚地表明OM-197-MP-AC和OM-294-DP均减少了LPS-诱导的炎性细胞因子(IL-12和TNF-α)产生，而明显相反的是增加了抗炎细胞因子IL-10的产量，从而提示本发明的化合物可以作为治疗性抗炎药起作用。
实施例7
一系列4种三酰化衍生物对人CD4 + T细胞的直接作用
方案：
如下概括地直接测试本发明的一系列4种化合物(OM-197-MP-AC，OM-197-MC-HD，OM-294-BA-MP，OM-197-MP-HD)：
从健康血液供体(血沉棕黄层)中以磁方式分选首次用于实验的CD4+T细胞。在有或没有分级剂量的三酰基衍生物(0，02；0，2；2和20μg/ml)存在下使用平板结合的抗-CD3(5μg/ml)和可溶性抗-CD28(1μg/ml)刺激细胞。6天后，使用ELISA在培养物上清液中测试细胞因子水平(IFN-γ和IL-13)。
结果：
细胞因子产生结果如图3中所示。还测试了T细胞增殖，但并未被本发明化合物改变。
结论：
CD4+T细胞在有OM-197-MP-AC，OM-197-MC-HD，OM-294-BA-MP，OM-197-MP-HD存在下产生IL-13减少(白色直方图)，而IFN-γ产生(深色直方图)和T细胞增殖保持不受影响。这表明在有测试的4种三酰化分子存在下向Th1反应转移。
实施例8
OM-197-MP-AC在哮喘模型中的作用
由于在上述实施例中已经证实测试的三酰化分子减少了哮喘病理学中可能涉及的细胞因子产生(即IL-13)，所以本发明者在本文中的目的在于研究所述系列中的成员(OM-197-MP-AC)在体内调节首次用于实验的T辅助细胞Th2分化和随后过敏性哮喘发生中的作用。
在本研究中，本发明者已经首次研究了(部分a)给出的OM-197-MP-AC在致敏期过程中对LACK-诱导的过敏性哮喘发生的作用和随后治疗测试分子的作用(部分b)。
部分a)哮喘的“预防性”治疗
方案：
过敏性哮喘小鼠和诱导：
6周龄雌性Balb/c ByJ小鼠购自Centre d’ElevageJanvier(CERJ，Le Genest-St-Isle，France)。在第0天和第7天时通过腹膜内2次注射沉淀在2mg白矾(PerBio Science France SAS，Brebières，France)中的10μgLACK蛋白使所有小鼠致敏。
如下将动物分组：
-LACK-致敏和盐水-攻击的小鼠(4只小鼠)
-LACK-致敏和攻击小鼠(8只小鼠)
-OM-197-MP-AC-治疗，LACK-致敏和攻击的小鼠(8只小鼠)
使用1mg/Kg(20μg/小鼠)OM-197-MP-AC通过腹膜内治疗第3组小鼠。在如下天时治疗小鼠：-1，1，2，3，6，8，9，10和11。
从第16-第21天，使B和C组小鼠每天接触20分钟LACK溶液(0.15％)气溶胶攻击，而盐水组小鼠接受盐水溶液作为对照组。
气道高反应性(AHR)：
在最后抗原攻击后1天通过全身体积描记术(Emka)测定所有小鼠对增加浓度(6-25mg/ml)的吸入乙酰甲胆碱(乙酰基甲基胆碱，Sigma)的反应的AHR。将AHR表示为增加的暂停(Penh，参见图4)，即完全与气道顺应性和抗性计算值有关的无量纲参数，它与气道阻力，阻抗和胸膜内压测量相关。
试剂：
-在大肠杆菌中产生并且如Mougneau等，1995所述纯化的LACK重组蛋白。
-OM-197-MP-AC，0.98mg/ml浓度的批号DL040906来自OMPHARMA。
-抗-IgE EM-95 mAbs为来自DNAX(Palo Alto，CA，USA)的赠品。
-乙酰甲胆碱(乙酰基甲基胆碱)购自Sigma(Saint QuentinFallavier，France)。
-CBA阵列珠(Flexset)购自BD Biosciences。
抗体滴度：
在最后的气溶胶后1天通过心脏穿刺对所有小鼠取血。通过ELISA，使用大鼠EM-95抗-IgEmAbs作为包被抗体和如所述的与生物素偶联的大鼠抗-IgE mAbs作为二次抗体对总IgE定量(Julia等，2002)。
支气管肺泡灌洗(BAL)细胞分析(嗜酸细胞百分比)：
对各小鼠放血并且将导管插入其气管。用1ml温热PBS将肺洗涤3次。用PBS洗涤细胞，重新悬浮于300μl中并且使用Burker-Türk室计数。为了进行差别BAL细胞计数，制备细胞离心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色进行染色。通过显微镜检查测定中性白细胞，嗜酸细胞和其它单核细胞的相应数量。此处仅报导了嗜酸细胞百分比(图5)。
肺细胞因子含量分析：
为了研究治疗和未治疗动物的肺细胞因子含量，由LACK-致敏和PBS-攻击的wt小鼠(“对照组”)，LACK-致敏和攻击的wt小鼠(哮喘”组)，OM-197-MP-AC-治疗的wt小鼠(“OM-197”组)的肺制备蛋白质提取物。通过多路分析，使用FACSArray分析IL-4，IL-5，IL-13含量。
结果：
气道高反应性(AHR)测定：
接下来每日用LACK气溶胶将治疗或未治疗LACK-致敏小鼠(参见上文)连续攻击5天。在最后的气溶胶后1天通过全身体积描记术测定对增加浓度的气溶胶化乙酰甲胆碱的反应的AHR。
正如预计的，LACK-致敏和盐水-攻击的小鼠在接触乙酰甲胆碱时不会发生AHR，而未治疗的LACK-致敏和攻击的小鼠发生显著的AHR，正如通过高Penh值反映出的(图4)。明显相反的是，用OM-197-MP-AC治疗的LACK-致敏和攻击的小鼠未表现出AHR。
结论：
通过使用OM-197-MP-AC治疗使在有乙酰甲胆碱存在下测定的小鼠接触气溶胶抗原时的气道高反应性下降至对照组水平(盐水)。
嗜酸细胞在支气管-肺泡灌洗液(BAL)中的百分比表征：
将结果报导在图5中。
接受盐水气溶胶的LACK-致敏小鼠在BAL中未显示出嗜酸细胞，而接受LACK气溶胶攻击的LACK-致敏小鼠会在BAL中显示出嗜酸细胞。此外，OM-197-MP-AC-治疗的小鼠表现出低于未治疗对照组小鼠3-倍的嗜酸细胞(图5)。
结论：
用OM-197-MP-AC治疗显著减轻了BAL嗜酸性细胞增多症。
血清中免疫球蛋白(Ig)的测定：
IgE结果如图6中所示：
在使用OM-197-MP-AC化合物治疗时总IgE滴度(图6)显著降低。
结论：
因此，使用OM-197-MP-AC治疗的小鼠血清包含的总IgE低于未治疗致敏攻击小鼠(即“哮喘型小鼠”)2-倍。
肺细胞因子的测定：
为了进一步研究预防性OM-197-MP-AC对过敏性气道炎症的作用，从治疗和未治疗WT小鼠的肺中提取蛋白质并且通过多路分析，使用CBA阵列珠和FACSarray定量已知在哮喘中起重要作用的细胞因子(IL-4，IL-5和IL-13)。将数据对蛋白质的总量校准并且定为pg细胞因子/mg肺蛋白质。
尽管IL-4，IL-13和IL-5的量在LACK-致敏和PBS-攻击小鼠肺中的检测限内(参见图7中的“对照组”)，但是这些细胞因子的量在LACK攻击时显著增加(参见图7中的“哮喘”)。相反，用OM-197-MP-AC治疗的LACK-致敏和攻击小鼠肺包含低于未治疗小鼠5倍的IL-4(p＝0.0003，)，5倍的IL-5(p＝0.0003)和3.5倍的IL-13(p＝0.003)(参见图7中的“OM-197”)。
除IL-4，IL-5和IL-13外，通过多路分析，使用CBA阵列珠和FACSarray定量其它细胞因子。将主要结果报导在下文中。还发现IFN-γ在LACK-致敏和攻击的小鼠肺中比LACK-致敏和PBS-攻击的小鼠得到增量调节。OM-197-MP-AC-治疗小鼠的肺包含低于那些未治疗小鼠2-倍的IFN-γ。
KC为人IL-8或CXCL8的功能同源性趋化因子并且结合中性白细胞和嗜酸细胞表达的CXCR2。实际上，KC能够使粒细胞补充至发炎组织。尽管KC以极低量存在于LACK-致敏和PBS-攻击小鼠肺中，其表达在LACK气溶胶攻击时显著增加。在肺中产生的KC的量在使用OM-197-MP-AC治疗时减少一半。
在LACK-致敏和PBS-攻击的肺中发现促炎细胞因子IL-6并且在使用LACK气溶胶时适度增加。OM-197-MP-AC-治疗的小鼠肺表现出低于那些未治疗小鼠1.5-倍的IL-6。发现趋化因子MCP-1在致敏和PBS-攻击小鼠肺中表达并且在攻击时适度得到增量调节。使用OM-197-MP-AC治疗的小鼠肺包含低于那些未治疗动物1.8倍的MCP-1。
TNF-α在治疗和未治疗小鼠肺中的量未产生显著性差异。
在任何样品中未检测到IL-9。
这些数据共同表明预防性OM-197-MP-AC不仅诱导对诱发过敏性气道炎症和AHR关键的Th2细胞因子显著减少，而且诱导其它细胞因子和趋化因子减少，而这些细胞因子和趋化因子促成肺炎症和炎性效应细胞，诸如嗜酸细胞募集。
实施例8a的一般性结论：
本研究清楚地证实本发明的一种分子OM-197-MP-AC在发生过敏性哮喘中的防护作用。恰在致敏期前开始使用OM-197-MP-AC治疗抑制了AHR发生并且显著减轻了BAL嗜酸性细胞增多症。此外，总IgE量在使用OM-197-MP-AC治疗的小鼠血清中减少。
数据还证实OM-197-MP-AC治疗主要影响涉及哮喘的细胞因子发展和其它炎性细胞因子分泌。一种可能的机制在于OM-197-MP-AC可以诱导控制Th2发展和随后气道炎症的特异性免疫抑制应答。
部分b)哮喘的“治疗性”治疗
方案：
与上述(部分a)方案相比的主要差别：
·仅在第15，17和19天时(即在第二次致敏后至少1周)通过腹膜内使用OM-197-MP-AC以1mg/Kg(20μg/小鼠)的剂量治疗小鼠。
·通过多路分析，使用FACSArray测定的肺细胞因子为IL-4，IL-5，IL-13，I FN-γ和IL-10。
结果：
BAL中的总细胞数和嗜酸细胞：
在最后使用气溶胶后2天，处死小鼠并且收集BAL细胞。正如预计的，在LACK攻击时未治疗的LACK-致敏小鼠在BAL中表现出大量细胞流入(比PBS-攻击小鼠多20-倍)(图8)。极为有意义的是，在使用OM-197-MP-AC治疗性给药时，BAL细胞募集被影响了90％(p<0.01)(图9)，其中嗜酸细胞低于未治疗的小鼠40-45-倍。
结论：
提供三次治疗的OM-197-MP-AC能够显著减少肺细胞外渗和BAL中的嗜酸性细胞增多症。
肺细胞因子测定
由于气道嗜酸性细胞增多症在使用OM-197-MP-AC进行治疗性治疗时如此彻底地减少，所以我们寻求分析IL-4，IL-5，IL-13，IL-10和IFN-γ肺含量(图10)。实际上，当与未治疗的小鼠肺比较时，Th2-细胞因子：IL-4，IL-5和IL-13的量在治疗小鼠肺中显著下降。在使用OM-197-MP-AC治疗时IL-4水平下降了90％，IL-13的量下降了85％且IL-5的量下降了70％(p<0.00005-0.005)。
结论：
显然，OM-197-MP-AC在仅提供三次治疗时能够降低Th2细胞因子水平。这不是因向Th1细胞因子移动所致，因为IFN-γ水平对所有小鼠而言保持较低(1.5-3pg/ml)并且在治疗小鼠中减少。为Th2和免疫抑制因子的IL-10的量低并且在治疗时未显著增加。
IgE水平的测定：
为了进一步表征使用OM-197-MP-AC治疗性治疗后小鼠的免疫状态，我们通过ELISA分析了治疗后和那些未治疗小鼠血清中的LACK-特异性IgE。而LACK-特异性IgE水平在接触LACK气溶胶时增加7-倍，OM-197-MP-AC-治疗小鼠的血清包含低于未治疗LACK攻击小鼠2-倍(p<0.05)的LACK-特异性IgE。
结论：
显然，OM-197-MP-AC在提供治疗时降低了血清LACK-特异性IgE水平。
实施例8b的一般性结论
我们在本文中证实本发明的产品OM-197-MP-AC在提供治疗时明显减轻了嗜酸性细胞增多症和降低了诸如IL-4，IL-5和IL-13这类Th2细胞因子水平并且还降低了过敏原-特异性IgE水平。
实施例8的一般性结论
显然，OM-197-MP-AC在体内哮喘模型中在预防和治疗上均具有活性，诸如根据其对许多哮喘-相关读出值的影响所判定的。
实施例9
OM-197-MP-AC在鼠哮喘模型通过其它给药途径给予的作用
实施例8中提供的结果表明，在通过腹膜内途径给药时，OM-197-MP-AC有效预防哮喘鼠LACK模型中的过敏反应。由此在该模型中研究了与人体应用更相容的其它给药途径(鼻内，灌胃，皮下)。
方案：
43只6-周龄雌性BALB/c ByJ小鼠购自Centre d’ElevageJanvier(CERJ，Le Genest-St-Isle，France)。在第1和8天时通过腹膜内注射2次沉淀在2mg白矾中的10μgLACK蛋白(PerBio ScienceFrance SAS，Brebi è res，France)使所有小鼠致敏(Julia等，2002)。
如下所述在第0-12天给予OM-197-MP-AC。在第16-第20天时如下所述使用LACK溶液(0.15％)或PBS攻击所有小鼠。
实验组如下：
-A组：未治疗的LACK-致敏和PBS-攻击的小鼠(3小鼠)
-B组：未治疗的LACK-致敏和-攻击的小鼠(7小鼠)
-C组：腹膜内OM-197-MP-AC-治疗的LACK-致敏和-攻击的小鼠(5小鼠)
-D组：灌胃OM-197-MP-AC-治疗的LACK-致敏和-攻击的小鼠(7小鼠)
-E组：皮下OM-197-MP-AC-治疗的LACK-致敏和-攻击的小鼠(7小鼠)。
-F组：鼻内OM-197-MP-AC-治疗的LACK-致敏和-攻击的小鼠(7小鼠)
-G组：气溶胶OM-197-MP-AC-治疗的LACK-致敏和-攻击的小鼠(7小鼠)
在第0，2，3，4，7，9，10，11天时治疗C，D，E和G组小鼠；而仅在第0，4，7和11时治疗F组小鼠(鼻内途径)。
分别通过腹膜内和皮下使用1mg/Kg(20μg/小鼠)OM-197-MP-AC治疗C和E组小鼠。
通过灌胃法使用50mg/Kg(1mg/小鼠)OM-197-MP-AC治疗D组小鼠。
通过鼻内使用在20μl体积中的20μgOM-197-MP-AC治疗F组小鼠(OM-197-MP-AC，2mg/ml，10μl/鼻孔)。
G组小鼠接受0.2％(2mg/ml)OM-197-MP-AC溶液气溶胶10分钟。
试剂：
-在大肠杆菌中产生并且如所述纯化的LACK重组蛋白(Mougneau等，1995)。
-批号#050323，浓度为2.2mg/ml和批号#050322，浓度为2.17mg/ml的OM-197-MP-AC由OM PHARMA提供并且分别用于口服和所有其它给药。
-与生物素偶联的抗-IgE(R35-118)购自BD Biosciences(LePontde Claix，France)。抗-IgE EM-95mAbs为来自DNAX(Palo Alto，CA，USA)的赠品。
-在使用异氟烷(Aerrane，Baxter)轻度麻醉小鼠后进行鼻内治疗。
抗体滴度：
在最后使用气溶胶后2天通过心脏穿刺给所有小鼠取血。通过ELISA，使用大鼠EM-95抗-IgE mAbs作为包被抗体和与生物素偶联的大鼠抗-IgE mAbs作为二次抗体如本文其它处所述对总IgE定量(Julia等，2002)。
支气管肺泡灌洗液(BAL)细胞分析：
对各小鼠放血并且将导管插入其气管。用1ml温热PBS将肺洗涤3次。用PBS洗涤细胞，重新悬浮于300μl中并且使用Burker-Türk室计数。为了进行差别BAL细胞计数，制备细胞离心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色。
结果：
a)通过显微镜检查测定中性白细胞，嗜酸细胞和其它单核细胞的相应数量并且对测试的每一给药途径报导在图11中。
正如本发明者预先在实施例8中报导的，通过腹膜内使用OM-197-MP-AC治疗的小鼠表现出BAL中嗜酸细胞百分比和数量均下降。然而使用OM-197-MP-AC皮下和灌胃治疗的小鼠的BAL细胞含量未产生与那些未治疗的小鼠的差别。相反，在鼻内接受OM-197-MP-AC的小鼠BAL中嗜酸细胞频率(未显示)和数量(图11)减少一半。此外，使用OM-197-MP-AC气溶胶治疗的小鼠表现出与鼻内治疗动物相同的趋向。
结论：
至少OM-197-MP-AC在该模型中减少对过敏原敏感的小鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸细胞数量的腹膜内和鼻内途径中明显有效。
b)然后如方法部分中所述测定血浆IgE水平。
与我们上述数据一致(实施例8)，我们发现使用OM-197-MP-AC腹膜内治疗的小鼠表现出总IgE数量减少(图12)。此外，接受鼻内注射OM-197-MP-AC的小鼠表现出总血清IgE滴度下降。相反，灌胃，皮下和使用气溶胶治疗的小鼠提供了与未治疗小鼠相比类似量的总血清IgE。
结论：
通过腹膜内或通过鼻内途径给予的OM-197-MP-AC显著减少了该哮喘模型中的总IgE水平。
实施例10
配制的OM-197-MP-AC通过鼠哮喘模型中的口服给药途径的作用 增加
实施例9中提供的结果表明OM-197-MP-AC在通过口服途径未配方给药时预防鼠哮喘LACK模型的过敏反应无效。由此在这种模型中研究了为了通过口服途径增加OM-197-MP-AC活性的制剂方法。因此，在本研究中，我们研究了三酰化OM PHARMA化合物OM-197-MP-AC在作为耐胃肠制剂(OM-197-MP-AC与LutrolF 127，也称作伯洛沙姆407)提供时是否可以防止小鼠发生过敏性气道炎症。
方案：
通过将12.875ml OM-197-MP-AC4.35mg/ml溶液和5.6mL50mg/ml Lutrol F127混合制备OM-197-MP-AC/
Figure A200780007571D00461
 F 127制剂。给药体积为330μl。
试剂和仪器
-将盐水溶液指定为对照组气溶胶。
-重组LACK蛋白在大肠杆菌中产生并且在Ni-NTA亲和柱上纯化
-氢氧化铝(白矾)购自Pierce。
-所用的血细胞分离器为Cytospin4(Thermo-Shandon，Cheschire，U.K.)，细胞载玻片购自Thermo-Shandon且Wright和Giemsa染料购自Sigma。
-气溶胶使用超声喷雾器Ultramed(Medicalia，Forenze，Italy)得到。
-CBA珠阵列IL-4购自BD Biosciences。
-流式细胞仪FACSarray购自BD Biosciences。
动物：
-6周龄雌性BALB/c ByJ小鼠购自The Centre d’ElevageJanvier，France并且将它们保持在动物设施中的无特异性病原体条件下。给它们饲喂Safe(Augy，France)提供的标准膳食。
方案：
15只BAL/c小鼠(包括如实施例8和9中所示的对照组A和B的小鼠)用于本实验。
A：未治疗的LACK-致敏和盐水-攻击的小鼠(3小鼠)
B：未治疗的LACK-致敏和攻击的小鼠(6小鼠)
预防性治疗
F：OM-197-MP-AC(口服)-治疗的LACK-致敏和攻击的小鼠(6小鼠)
在第0，2，3，4，7，9，10，11和12天使用1mg配制的OM 197MP AC对F组小鼠口服治疗。
在第1天和第8天时，通过腹膜内使用LACK/白矾使小鼠致敏。从第16天-第20天，使用LACK溶液气溶胶(0.15％)攻击除A组小鼠外的所有组。而A组接受盐水溶液(NaCl 0.9％)40分钟。
在第22天时，处死所有小鼠。对所有动物而言，采集BAL和无支气管周淋巴结的肺。
对BAL细胞进行计数并且在使用wright/giemsa染色后对细胞离心涂片器进行显微镜检查后分析细胞含量。此外，采集每组的肺并且冷冻在液氮中以便进行进一步细胞因子含量分析。为了研究细胞因子含量，由LACK-致敏和PBS-攻击的小鼠(A组)，LACK-致敏和攻击的小鼠(B组)和配制的OM-197-MP-AC-治疗的wt小鼠(F组)的肺制备蛋白质提取物。通过多路分析，使用FACSArray分析IL-4的量。
结果：
通过显微镜检查测定中性白细胞，嗜酸细胞，淋巴细胞和其它单核细胞的相对量并且报导在图13中。
与实施例8(和图11)中报导的结果使用OM-197-MP-AC(未配制的)通过灌胃治疗小鼠的BAL细胞含量相反，在使用Lutrol配制OM-197-MP-AC时，中性白细胞，嗜酸细胞(p<0.05)，淋巴细胞和其它单核细胞的数量在接受配制的OM-197-MP-AC的小鼠BAL中减少一半(参见图13)。
此外，分析治疗和未治疗小鼠肺中IL-4的量。而IL-4肺含量极低至在PBS-攻击动物中无法检测到，IL-4的量在LACK-攻击的未治疗的对照组小鼠中增加了20-倍。在使用配制的OM-197-MP-AC口服治疗(参见图14)时，IL-4在肺中的量减少了75％(p<0.01)。
结论：
当适当配制时，口服OM-197-MP-AC能够显著减少这种模型中对过敏原敏感小鼠支气管肺泡灌洗液中的嗜酸细胞数量。这种减少与IL-4减少相关。
实施例11
OM-197-MP-AC对非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的作用
到目前为止，我们提供了OM-197-MP-AC仅在哮喘鼠模型中的体内功效的实施例。在本实施例中，我们将提供OM-197-MP-AC还对另一种炎症病理学情况：糖尿病具有活性的一定证据。
方案：
我们预先证实OM-197-MP-AC和其它三酰化分子减轻了哮喘型动物的气道炎症。
在本研究中，我们研究了OM-197-MP-AC是否能够在另一种鼠炎性疾病模型，即NOD糖尿病模型(非肥胖型糖尿病)中诱导防护作用。
在10周过程中使用0.01，0.1和1mg/kg OM-197-MP-AC治疗10只雌性6-周龄NOD小鼠的组。将6只腹膜内接受每周3次200μl PBS的雌性MOD小鼠组用作对照组。
在该系列实验中，持续治疗至小鼠达到16周龄。这是对照组动物开始发生明显糖尿病的时间点。
将糖尿病发病率的结果与在对照组动物中获得的那些结果比较。每周使用测试条(Roche，France)，通过糖尿测试检查一次糖尿病，当糖尿病出现时，每周进行2次。通过使用测试条
Figure A200780007571D00492
评价糖血(>3mg/ml)证实糖尿病。
使用Kaplan-Meier法绘制不同实验组中糖尿病的发生率(参见图15)，即非参数累积存活图。使用提供相应x2值的时序(Mantel-Cox)检验进行曲线之间的统计学比较。1mg/kg剂量的OM-197-MP-AC具有显著活性(p＝0.0321)并且0.1mg/kg的本发明化合物表现出阳性趋势(p＝0.0543)。
在使用0.3mg/kg剂量OM-197-MP-AC的另一种实验中，在第27周时获得的结果表现出0.0362的显著性p值。在第27周时，在对照组动物中发现82％的动物为糖尿病，而在OM-197-MP-AC治疗组(0.3mg/kg)中仅有27％表现出该病。
实施例13
毒理学：LAL内毒性
首先通过鲎属(Limulus)阿米巴细胞溶解产物产色试验测定OM-197-MP-AC和OM-294-DP的内毒性(Bio-Whittaker的Chromogenic-LAL，试剂盒n°50-650U)。
方案：
本试验基于脂多糖(LPS)或相差无几结构产物通过存在于LAL中的酶级联的活化。通过用蛋白酶裂解与肽连接的色原证实这种酶活化。这种酶反应在37℃下进行并且在405nm处测定随时间的色原形成。记录达到0.2个单位D.0.所必需的时间并且与LPS标准品(标准曲线)相比计算内毒素活性。与标准化大肠杆菌LPS制品相比用EU(内毒素单位)表示结果(1EU相当于0.08ng当量的LPS)。
结果：
OM-197-MP-AC和OM-294-DP在色原LAL测定中几乎未表现出或无鲎属活性。
结论：
OM-197-MP-AC和OM-294-DP在与LPS相比时内毒素性极弱(至少降低106倍)。
实施例14
毒理学：家兔中的致热原性
最终，测试OM-197-MP-AC和OM-294-DP在家兔中可能的致热原性。
方案：
给3只新西兰白色家兔/组通过腹膜内注不同剂量的OM-197-MP-AC或OM-294-DP(按照欧洲药典2001，方法2.6.8)。
产品：0.0009，0.009，0.09，0.9mg/kg的OM-197-MP-AC和0.001，0.01，0.1和1mg/kg的OM-294-DP。
动物：读出值：温度增加
结果：
将两种化合物视为在体内无致热原性，因为在最高测试剂量(0.9mg/kg)下未达到OM-197-MP-AC的致热阈且OM-294-DP仅在0.01-0.1mg/kg下达到致热原性。
参考文献
Byl，B.，Libin，M.，Bauer，J.，Martin，O.R.，De Wit，D.，Davies，G.，Goldman，M.和Willems，F.(2003)。OM197-MP-AC inducesthe maturation of human dendritic cells and promotes a primaryT cell response.Int Immunopharmacol 3，417-425.
Julia，V.，Hessel，E.M.，Malherbe，L.，Glaichenhaus，N.，O′Garra，A.和Coffman，R.L.(2002)。A restricted subset ofdendritic cells captures airborne antigens和remains able toactivate specific Tcells long after antigen exposure.Immunity16，271-283.
Mougneau，E.，Altare，F.，Wakil，A.E.，Zheng，S.，Copolla，T.，Wang，Z.-E.，Waldmann，R.，Locksley，R.和Glaichenhaus，N.(1995)。Expression cloning of a Leishmania major protectiveT cell antigen.Science 268，563-566.
Veran，J.，Mohty，M.，Gaugler，B.，Chiavaroli，C.和Olive，D.(2004)。OM-197-MP-AC adjuvant properties：the in vitromaturation of normal and leukemic dendritic cells in aserum-free culture model.Immunobiology 209，67-77.
图示
图1：单独的LPS(1μg/ml)或在前90分钟过程中用所示浓度(以μg/ml计)的OM-197-MP-AC(A)或294-DP(B)且然后用LPS(1μg/ml)再进行20小时刺激的鼠DC的IL-12(左组)和IL-10(右组)分泌。从DC培养物中收集上清液并且通过ELISA分析存在的IL-12和IL-10。
图2：单独的LPS(1μg/ml)或在前90分钟过程中用所示浓度(以μg/ml计)的294-DP(294)或OM-197-MP-AC(197)且然后用LPS(1μg/ml)再进行20小时刺激的鼠DC的TNF-α分泌。从DC培养物中收集上清液并且通过ELISA分析存在的TNF-α。
图3：增加剂量的4种测试化合物(OM-197-MP-AC，n＝5；OM-197-MC-HD，n＝5；OM-294-BA-MP，n＝7；OM-197-MP-HD，n＝3)对多克隆活化后人D4+T细胞的IFN-γ和IL-13产生的作用。将结果表示为n次独立实验的平均值(±p25/p75)并且显示处理细胞与未处理细胞(视为100％，参见虚线)相比的百分比(％)增殖或细胞因子产生。使用非参数未配对Mann-Whitneyt检验(2-尾)进行统计学分析。
图4：通过全身体积描记术(Emka)的对最后抗原攻击后1天增加浓度(6-25mg/ml)的吸入乙酰甲胆碱的反应的AHR。如方案部分中所述治疗动物。显示了盐水-攻击的动物(作为阴性对照组，n＝4)，未治疗的LACK-攻击的动物(作为阳性对照组，n＝8)和OM-197-MP-AC-治疗的LACK攻击的小鼠(n＝8)的结果(意味着“增强的中止值”+/-SEM)。
图5：通过对用Wright/Giemsa染色进行染色的细胞离心涂片器制品进行显微镜检查分析的支气管肺泡灌洗液中的嗜酸细胞百分比。研究组与图4所用的那些相同。虚线表示整个图中在未治疗的哮喘动物中获得的值。
图6：如方案部分中所述治疗小鼠并且在最后使用气溶胶后1天通过心脏穿刺放血。通过ELISA，如所述的使用大鼠EM-95抗-IgE mAbs作为包被抗体和与生物素偶联的大鼠抗-IgE mAbs作为二次抗体定量总IgE(Julia等，2002)。每点相当于单一动物。研究组与图4和5中所用的那些相同。
图7：由LACK-致敏和PBS-攻击的wt小鼠(Control)，LACK-致敏和攻击的wt小鼠(哮喘)，OM-197-MP-AC-治疗的wt小鼠(OM-197)的左肺制备蛋白质提取物(400μl)。通过多路分析，使用FACSArray分析IL-4，IL-5和IL-13含量。以pg/ml给出结果。虚线表示整个图中在未治疗的哮喘动物中获得的值。
图8：如方法部分中所述通过治疗方式将小鼠治疗3次，在使用插入气管的套管放血的各小鼠中进行灌洗。用1ml温PBS将肺洗涤3次。用PBS洗涤细胞，重新悬浮于300μl并且使用Burker-Türk室计数。为了进行差别BAL细胞计数，制备细胞离心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色进行染色。测试组为：LACK-致敏和PBS-攻击的wt小鼠(Control)，LACK-致敏和攻击的wt小鼠(哮喘)和OM-197-MP-AC-治疗的wt小鼠(OM-197)。通过对使用Wright/Giemsa染色进行染色的细胞离心涂片器制品显微镜检查测定BAL中的总细胞数量。虚线表示整个图中在未治疗的哮喘动物中获得的值。
图9：通过对使用Wright/Giemsa染色进行染色的细胞离心涂片器制品显微镜检查分析的BAL中的嗜酸细胞的百分比。如方法部分中所述以治疗方式将小鼠治疗3次，如图8中例证的采集来自BAL的细胞。研究的(治疗)组与图8中所用的那些相同。虚线表示整个图中未治疗的哮喘动物中获得的值。
图10：为了分析肺细胞因子含量，采集肺并且将左肺用于制备蛋白质提取物。每个左肺回收400μl。通过多路分析，使用FACSArray测定细胞因子并且以pg/ml给出结果。研究的(治疗)组与图8和9中所用的那些相同。虚线表示整个图中未治疗的哮喘动物中获得的值。
图11：鼠BAL中的嗜酸细胞，中性白细胞和淋巴细胞数量。如方法部分中所述获得并且洗涤细胞。为了进行差别BAL细胞计数，制备细胞离心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色。对每个载玻片数至少400个细胞并且通过显微镜检查测定嗜酸细胞，中性白细胞和淋巴细胞数量。虚线表示整个图中在未治疗的哮喘动物中获得的值。
图12：鼠血清中过敏原-特异性IgE的测定，在最后使用气溶胶后2天通过心脏穿刺放血并且制备血清。通过ELISA测定LACK-特异性IgE。报导来自各小鼠的结果(ng/ml)，将每组中的平均值表示为棒形图。*＝P<0，05。虚线表示整个图中在未治疗的哮喘动物中获得的值。
图13：鼠BAL中嗜酸细胞，中性白细胞和淋巴细胞数量。如方案部分中所述获得并且洗涤细胞。为了进行差别BAL细胞计数，制备细胞离心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色。对每个载玻片数至少400个细胞并且通过显微镜检查测定嗜酸细胞，中性白细胞，淋巴细胞和其它细胞(巨噬细胞，树突细胞和肺单核细胞)数量。实施例10中方案部分中描述了测试的3个组。虚线表示整个图中在未治疗的哮喘动物中获得的值。
图14：为了分析肺细胞因子含量，收集肺并且将左肺用于制备蛋白质提取物。对每个左肺收集400μl。通过FACSArray测定IL-4并且以pg/ml表示结果。实施例10中方案部分中描述了测试的3个组。虚线表示整个图中在未治疗的哮喘动物中获得的值。
图15：NOD小鼠中糖尿病的发生。使用PBS(6只动物)或3种所示剂量的OM-197-MP-AC(10只动物的3个组)通过腹膜内治疗小鼠。每周1次通过糖尿测试(Glukotest)检查糖尿病并且在糖尿病出现时每周2次。通过使用测试条评价糖血(>3mg/ml)证实糖尿病。使用Kaplan-Meier法绘制不同实验组中的糖尿病发生率(参见图15)，即非参数累积存活图。使用提供相应x2值的时序(Mantel-Cox)检验进行曲线之间的统计学比较：OM-197-MP-AC1mg/kg p＝0.321；0.1mg/kg＝0.0543。

Claims (13)

1.治疗患有与炎性细胞因子过度产生相关的疾病或病症的温血动物，包括人的方法，包括对有此需要的患者给予适量的药物组合物，该药物组合物包含：
至少一种下列通式(I)的免疫调节化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或异构体：
Figure A200780007571C00021
其中：
-m和n彼此独立为1-4的整数，
-X和Y各自表示中性或带电荷状态的基团，其选自下组：
*羧基-COOH，
*二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
*羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
*氨基-NH2，
*羟基-OH，
*[氨基(C1-C10)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)n1-NH2，其中n1为1-10的整数，
*[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-5的整数，
*{羧基[氨基(C1-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-5的整数，
*氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-15的整数，
*二羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH，其中n1为1-10的整数，
*羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-OH，其中n1为1-10的整数，
*羧基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-10的整数，
*氧代(C1-C5)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHO，其中n1为1-5的整数，
*[羧基(C1-C10)烷酰基]氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n1为1-10的整数且n2为1-15的整数，
-R1和R2各自表示衍生自具有2-18个碳原子的饱和或不饱和直链或支链的羧酸的酰基，其未被取代或带有1-3个取代基取代，所述的取代基选自羟基，二羟基磷酰氧基，2-18个碳原子的烷基，2-18个碳原子的烷氧基，在酰基部分上2-18个碳原子的酰氧基，氨基，酰氨基，
-C*1和C*2彼此独立为构型为R、S或外消旋形式RS中的不对称碳；
任选与惰性无毒性药学上可接受的稀释剂或载体结合或混合。
2.权利要求1的方法，其中：
*X选自下组：
*羧基-COOH，
*二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
*羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
*氨基-NH2，
*[氨基(C1-C10)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)n1-NH2，其中n1为1-10的整数，
*[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-5的整数，
*{羧基[氨基(C1-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-5的整数，
*氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-15的整数，
*且Y选自下组：
*二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
*羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
*氨基-NH2，
*羟基-OH，
*氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-15的整数，
*二羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH，其中n1为1-10的整数，
*羟基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-OH，其中n1为1-10的整数，
*羧基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-10的整数，
*氧代(C1-C5)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHO，其中n1为1-5的整数，
*[羧基(C1-C10)烷酰基]氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n1为1-10的整数和n2为1-15的整数。
3.权利要求1或2的方法，其中：
*X选自下组：
*羧基-COOH，
*二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
*羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
*氨基-NH2，
*[氨基(C1-C6)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)n1-NH2，其中n1为1-6的整数，
*[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH，其中n1为1-5的整数，
*{羧基[氨基(C1-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2，其中n1为1-5的整数，
*氨基(C2-C12)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为2-12的整数，
*且Y选自下组：
*二羟基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，
*羟基磺酰氧基-O-SO2(OH)，
*氨基-NH2，
*羟基-OH，
*氨基(C2-C12)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1为2-12的整数，
*二羟基(C3-C7)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH，其中n1为3-7的整数，
*羟基(C2-C6)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-OH，其中n1为2-6的整数，
*羧基(C3-C6)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-COOH，其中n1为3-6的整数，
*氧代(C2-C5)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHO，其中n1为2-5的整数，
*[羧基(C3-C6)烷酰基]氨基(C2-C12)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n1为3-6的整数且n2为2-12的整数。
4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中：
*X选自下组：
*-COOH，
*-O-P(O)(OH)2，
*-O-SO2(OH)，
*-NH2，
*-CO-NH-(CH2)3-NH2或-CONH-(CH2)6-NH2，
*-CO-NH-CH(COOH)-CH2-COOH，
*-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH2，
*-O-CO-(CH2)5-NH2，
*且Y选自下组：
*-O-P(O)(OH)2，
*-O-SO2(OH)，
*-NH2，
*-OH，
*-O-CO-CH2-NH2(2-氨基乙酰氧基)，-O-CO-(CH2)2-NH2(3-氨基丙酰氧基)，-O-CO-(CH2)5-NH2(6-氨基己酰氧基)或-O-CO-(CH2)11-NH2(12-氨基十二烷酰氧基)，
*-O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH(6，7-二羟基庚酰氧基)，
*-O-CO-(CH2)5-OH(6-羟基己酰氧基)，
*-O-CO-(CH2)2-COOH(3-羧基丙酰氧基)
*-O-CO-(CH2)4-CHO(6-氧代己酰氧基)，
*-O-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-COOH(3-羧基丙酰基氨基己酰氧基)。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中R1和R2选自：
-CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，(3(C12O)C14)，
-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3，(3(HO)C14)，
-CO-CH3，(C2)，
-CO-CH2-NH-CO-C*H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3，([2(C10O)C8]NC2)，
-CO-C*H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3，(2(C6O)C8)，
-CO-(CH2)16-CH3，(C18)，
-CO-CH2-C*H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3，(3(BnO)C14)，
-CO-CH2-C*H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3，(3[(OH)2-P(O)O]C14)，
C*相当于上述式中构型为R、S或外消旋形式RS中的不对称碳。
6.权利要求1-5中任意一项的方法，其中：
-R1选自：
-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，(3(C12O)C14)，
-CO-CH2-C**1HOH-(CH2)10-CH3，(3(HO)C14)，
-CO-CH3，(C2)，
-CO-CH2-NH-CO-C**1H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3，([2(C10O)C8]NC2)，
-CO-C**1H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3，(2(C6O)C8)，
-CO-(CH2)16-CH3，(C18)，
-R2选自：
-CO-CH2-C**2H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，(3(C12O)C14)，
-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，(3(HO)C14)，
-CO-CH2-C**2H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3，(3(BnO)C14)，
-CO-CH2-C**2H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3，(3[(OH)2-P(O)O]C14)。
C**1和C**2相当于上述式中构型为R、S或外消旋形式RS中的不对称碳。
7.权利要求1-6中任意一项的方法，其中给予的化合物具有通式(II)：
Figure A200780007571C00071
其中X，Y，R1，R2和m如权利要求1-6中任一项所定义，C*1为构型R、S或为外消旋RS且C*2为构型R。
8.权利要求1-7中任意一项的方法，其中给予的化合物选自式(II)的那些，其中：
-X＝-O-P(O)(OH)2，Y＝-O-P(O)(OH)2，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝2，C*1为构型S，C*2为构型R，C**1和C**2为构型R，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-癸-1，10-二醇(1，10)-双-二氢磷酸酯(OM-294-DP(S，R))，
-X＝-O-P(O)(OH)2，Y＝-O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝2，C*1为构型S且C*2为构型R，C**1和C**2为构型R，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6，7-二羟基庚酸酯)(OM-197-MP-HD(S，R))，
-X＝-COOH，Y＝-O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝1，C*1为构型S且C*2为构型R，C***1和C**2为构型R，即N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰基]-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]戊基}酰胺5-O-(6，7-二羟基庚酸酯)(OM-197-MC-HD(S，R))，
-X＝-O-P(O)(OH)2，Y＝-O-CO-(CH2)5-NH2，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝2，C*1为构型S且C*2为构型R，C**1和C**2为构型R，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(OM-197-MP-AC(S，R))，
-X＝-NH2，Y＝-O-P(O)(OH)2，R1＝-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3，R2＝-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3，m＝4，C*1为构型S且C*2为构型R，C**1和C**2为构型R，即(5S，11R)-1-氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-6-氧代-7-氮杂-11-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-十二烷-12-醇12-二氢磷酸酯(OM-294-BA-MP(S，R))。
9.权利要求1-8中任意一项的方法，用于治疗温血动物，包括人，他们患有与生物体中T淋巴细胞、单核细胞或抗原呈递细胞活化的炎性细胞因子过度产生相关的疾病或病症，其中所述的炎性细胞因子或炎症标记属于IL-1β，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-9，IL-13，IFN-γ，TNF-α和MCP-1。
10.权利要求1-9的方法，其中所述的疾病选自哮喘，糖尿病，特应性皮炎，过敏性鼻炎，前列腺炎，炎症性肠病和类风湿关节炎。
11.权利要求1-10的方法，其在于通过粘膜或非肠道途经给予在药学上可接受的载体，赋形剂或制剂中的治疗有效量的如权利要求1-8中定义的任意化合物。
12.权利要求1-11的方法，其在于通过腹膜，皮下，口服，鼻内，舌下或气溶胶途经给予治疗有效量的如权利要求1-8中定义的化合物。
13.权利要求1-12的方法，其中所需的如权利要求1-8中定义的免疫调节分子在人体中的剂量为0.01-50mg/m2。
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