BRPI0708363A2 - processo para o tratamento de animais de sangue quente, incluindo seres humanos, sofrendo de uma doença relativa a uma superprodução de citocinas inflamatórias - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA O TRATAMENTO DE ANIMAIS DE SANGUE QUENTE, INCLUINDO SERES HUMANOS, SOFRENDO DE UMA DOENçA RELATIVA A UMA SUPERPRODUçãO DE CITOCINAS INFLAMATóRIAS A invenção se refere ao uso de compostos imunomodulatórios para o tratamento de doenças relacionadas a uma superprodução de citocinas inflamatórias, tais como as doenças selecionadas do grupo consistindo de asma, dermatite atópica, rinite alérgica, prostatite, doença alérgica do intestino, diabete, e artrite reumatóide, os ditos compostos sendo de fórmula geral (1), na qual: m e n, independentemente entre si, são um número inteiro variando de 1 a 4; X e Y representam COOH; -O- P(O)(0H~ 2~); -O-S0~ 2~(OH); -NH~ 2~; -OH; -CO-NH(CH~ 2~)n~ 1~-NH~ 2~-CONH-CH(COOH)-(CH~ 2~)n~ 1~ -COOH; -CO-NH-CH(COOH)(CH~ 2~)n~ 1~ - NH~ 2~; -O-CO-(CH~ 2~)n~ 1~-NH~ 2~ - -O-CO-(CH~ 2~)n~ 1~-OH; -O-CO- (CH~ 2~ )n ~ 1~-COOH; -O-CO-(CH~ 2~)n~ 1~-CHO; -O-CO-(CH~ 2~)n~ 1~-NH-CO (CH~ 2~)n~ 2~-COOH; R^ 1^ e R^ 2^ designam cada um grupo acua derivado de um ácido carboxílico de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado, tendo de 2 a 18 átomos de carbono, que é não substituído ou porta de uma a tres substituintes, selecionados entre hidroxila, diidroxifosforilóxi, alquila de 2 a 18 átomos de carbono, alcóxi de 2 a 18 átomos de carbono, acilóxi de 2 a 18 átomos de carbono na parte acua, amino, e acilamino.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invençãopara "PROCESSO PARA O TRATAMENTO DE ANIMAISDE SANGUE QUENTE, INCLUINDO SERES HUMANOS,SOFRENDO DE UMA DOENÇA RELATIVA A UMASUPERPRODUÇÃO DE CITOCINAS INFLAMATÓRIAS"
A invenção se refere ao uso de compostosimunomodulatórios para o tratamento de doenças relacionadas auma superprodução de citocinas inflamatórias, tais como asdoenças selecionadas do grupo consistindo de asma, dermatiteatópica, rinite alérgica, prostatite, doença alérgica do intestino,diabete, e artrite reumatóide.
Houve, recentemente, grandes avanços noentendimento do mecanismo da ativação do sistema imune inatopor sinais microbianos. Ficou claro que essa ativação do sistemaimune inato é essencial para iniciar as respostas imunesadaptadoras e para determinar o tipo de respostas adaptadoras quesão geradas. Em conjunto, essas observações geraram umatremenda renovação do interesse em abordagens racionais aodesenvolvimento da imunoterapia.
Duas grandes descobertas foram cruciais para omaior entendimento da ativação imune inata:
1) o papel das células dendríticas (DCs) comoas células apresentadoras de antígenos, responsáveis pela induçãode respostas imunes primárias; e
2) a descoberta de receptores similares aos deToll (TLR) e outros receptores de "reconhecimento de modelo",que detectam a presença de estruturas microbianas, provocandoestímulo do sistema imune inato.
Sallusto e Lanzavecchia registraram primeiroque as DCs imaturas podem ser geradas de monócitos humanosem meio suplementado com GM-CSF e IL-4 (Sallusto F,Lanzavecchia A. J Exp Med 1994,179:1109-18). No entanto,ficou rapidamente aparente que, além de GM-CSF e IL-4, umoutro fator de maturação era necessário para obter DCs maduras,que fossem inteiramente funcionais como células apresentadorasde antígenos (APC). As DCs maduras são capazes de iniciar egovernar a resposta imune adaptadora.
Esses sinais de maturação podem serproporcionados por produtos microbianos. Esses produtosmostraram agir por TLRs. Onze TLRs foram identificados,capazes de reconhecerem diferentes produtos microbianos. OTLR4 é o receptor que reconhece especificamentelipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, um dos estimuladores maispotentes do sistema imune inato conhecido.
O pedido de patente internacional WO2005/007699 descreve o uso de elementos de ligação específicos,em particular de moléculas de anticorpos anti-IL-13 humanos, e,especialmente, aqueles que neutralizam a atividade de IL-13 nadiagnose ou tratamento de distúrbios relacionados com IL-13,incluindo asma, dermatite atópica, rinite alérgica, fibrose, doençainflamatória do intestino e linfoma de Hodgkin.No entanto, as investigações são aindanecessárias para conhecer o papel exato da IL-13 naimunomodulação e na interpretação dos resultados relativos aoestudo da rota IL-13 / IL-4, que são ainda de natureza hipotética,como mostrado pelas duas publicações recentes mencionadas aseguir.
A publicação "IL-4/IL-13 pathway geneticsstrongly influence serum IgE leveis and childhood asthma" deMichael Kabesch et al., (J. Allergy Clin. Immunol. Volume 117,Número 2) menciona que a produção de IgE, uma marca de asmae doença atópica, pode ser sob controle genético envolvendogenes da rotas IL-4 / IL-13. Em virtude de que a troca de IgE éfundamental para imunidade e sobrevivência humanas, aregulação de IgE é delicada. Embora a rota IL-4 / IL-13possa influenciar no desenvolvimento de asmabasicamente por seu efeito na regulação de IgE, osresultados apresentados indicam que esse pode não serexclusivamente o caso.
A publicação "Control of allergic airwayinflammation through immunomodulation" de David B Corry, eFarrah Kheradmand, (J. Allergy Clin. Immunol. Volume 117,Número 2) descreve as grandes descobertas relacionadas com osensaios clínicos que mudaram o controle da asma, mas que aindamerecem mais estudo. Registrou-se que a IL-4, uma citocina queé necessária para as respostas de IgE de células B, é crítica para asrespostas de hipersensibilidade do tipo I, e que a IL-4 foi,portanto, uma das primeiras citocinas a serem alvo de ensaiosclínicos de asma, por uso de uma forma solúvel da cadeia α dereceptor de IL-4 (sIL-4Roc), que se liga é, e desativa a, IL-4. AIL-13 é outra citocina que tem, basicamente, os mesmos efeitos que aIL-4, mas não é inibida pela sIL-4a. A conclusão é que estudosfuturos devem, portanto, tentar inibir, simultaneamente, ambas asIL-4 e IL-13 para o tratamento da asma.
A presente invenção se baseia na demonstraçãopelos inventores de que as moléculas, como descrito abaixo, sãoagonistas eficientes de TLR4, com um bom perfil de segurança,que são capazes de induzir a maturação completa de DCsderivadas de monócitos funcionais, bem como ativar outros tiposde células expressando TLR4. As DCs tratadas com oscompostos de acordo com a invenção são capazes de induzirativação de células T primárias e favorecer as respostas imunescelulares Th 1.
Os inventores também demonstraram que oscompostos de acordo com a invenção são capazes de diminuiracentuadamente a secreção de IL-13 por células T CD4+ativadas policlonalmente por anticorpos anti-CD3 e anti-CD28.
Além do mais, quando um dos compostos foiadministrado por rotas i.p ou i.n a um modelo de murino paraasma, os inventores demonstraram uma prevenção das respostasalérgicas produzidas por sensibilização de antígenos esubseqüente exposição do antígeno a aerossol. Os parâmetrosimunológicos sugerem uma diminuição relativa nasrespostas Th2, o que pode explicar o mecanismo pelo qual oscompostos de acordo com a invenção estão agindo nessemodelo de asma. Adicionalmente, os autores demonstramque o composto da invenção é capaz de diminuir aocorrência de diabete em camundongos diabéticos nãoobesos.
para o tratamento de animais de sangue quente, incluindo sereshumanos, sofrendo de uma doença relativa a uma superproduçãode citocinas inflamatórias, compreendendo a administração a umpaciente carente dele de uma quantidade adequada deuma composição farmacêutica, que compreende pelo menosum composto imunomodulador da seguinte fórmula geral
A presente invenção se refere a um processo
(I):
X-(CH2)m-C*1 H-CO-N H-(CH2)n-C*2H-CH2-Y
(D
NHR1
NHR2
na qual:
- m e n, independentemente entre si, são um
número inteiro variando de 1 a 4;
-XeY designam cada um grupo no estadoneutro ou carregado, selecionado dos seguintes:
* carboxila - -COOH; -O-P(O)(OH2); -O-
SO2(OH);* amino - -NH2;
* hidroxila - -OH;
* [amino (Q - Ci0) alquil] aminocarbonila - -CO-NH(CH2)nrNH2, com ni sendo um número inteiro de 1 a 10;
* [dicarbóxi (C1 - C5) alquil] aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-COOH, com n, sendo um númerointeiro de 1 a 5;
* {carbóxi [amino (C1 - C5) alquil]}aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)(CH2)nl-NH2, com n,sendo um número inteiro de 1 a 5;
* [amino (C1-C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com Ii1 sendo um número inteiro de 1 a 15;
* hidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-OH, com ni sendo um número inteiro de 1 a 10;
* carbóxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-COOH, com U1 sendo um número inteiro de 1 a 10;
* oxo (C1 - C5) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHO, com Ii1 sendo um número inteiro de 1 a 5; e
* [carbóxi (C1 - C10) alcanoil] amino (C1 - C15)alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH-CO-(CH2)n2-COOH, com n,sendo um número inteiro de 1 a 10, e n2 sendo um número inteirode 1 a 15;
- R1 e R2 designam cada um grupo aciladerivado de um ácido carboxílico de cadeia linear ou ramificada,saturado ou insaturado, tendo de 2 a 18 átomos decarbono, que é não substituído ou porta de uma a trêssubstituintes, selecionados entre hidroxila, diidroxifosforilóxi,alquila de 2 a 18 átomos de carbono, alcóxi de 2 a 18 átomos decarbono, acilóxi de 2 a 18 átomos de carbono na parte acila,amino, e acilamino; e
- C*1 e C*2, independentemente entre si, sãoátomos de carbono assimétricos na configuração R, S ou na formaracêmica RS,
ou um sal, solvato ou isômerofarmaceuticamente aceitável deles, opcionalmente em conjugaçãoou mistura com um diluente ou transportador farmaceuticamenteaceitável, atóxico, inerte.
A invenção se refere, mais particularmente, aum processo como definido acima, em que:
* X é selecionado dos seguintes grupos:
* carboxila - -COOH;
* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);
* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);
* amino - -NH2;
* [amino (C, - C10) 'alquil] aminocarbonila - -CO-NH(CH2)nl-NH2, com nx sendo um número inteiro de 1 a 10;
* [dicarbóxi (C1 - C5) alquil] aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-COOH, com nj sendo um númerointeiro de 1 a 5;
* {carbóxi [amino (C1 - C5) alquil]}aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)(CH2)nl-NH2, com nisendo um número inteiro de 1 a 5; e* [amino (C1 - C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nI-NH2, com n, sendo um número inteiro de1 a 15;
* e Y é selecionado dos seguintes grupos:
* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);
* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);
* amino - -NH2;
* hidroxila - -OH;
* [amino (Ci-C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com Ii1 sendo um número inteiro de 1 a 15;
* diidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -Q-CQ-
(CH2)nl-CHOH-CH2OH, com Ii1 sendo um número inteiro de 1 a 10;
* hidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-OH, com n, sendo um número inteiro de 1 a 10;
* carbóxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-COOH, com n! sendo um número inteiro de 1 a 10;
* oxo (C1 - C5) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHO, com n} sendo um número inteiro de 1 a 5; e
* [carbóxi (C1 - C10) alcanoil] amino (C1 - C15)alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH-CO-(CH2)n2-COOH, com n,sendo um número inteiro de 1 a 10, e n2 sendo um número inteirode 1 a 15.
A invenção se refere, mais particularmente, aum processo como definido acima, no qual:
* X é selecionado dos seguintes grupos:* carboxila - -COOH;
* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);
* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);
* amino - -NH2;
* [amino (C1 - Ci0) alquil] aminocarbonila - -CO-NH(CH2)nl-NH2, com Ii1 sendo um número inteiro de 1 a 6;
* [dicarbóxi (C1 - C5) alquil] aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-COOH, com n, sendo um númerointeiro de 1 a 5;
* {carbóxi [amino (C1 - C5) alquil]}aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)(CH2)nl-NH2, com msendo um número inteiro de 1 a 5; e
* [amino (C1-C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com nj sendo um número inteiro de 2 a 12;
* e Y é selecionado dos seguintes grupos:
* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);
* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);
* amino - -NH2;
* hidroxila - -OH;
* [amino (C1-C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com U1 sendo um número inteiro de 2 a 12;
* diidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHOH-CH2OH, com ri] sendo um número inteiro de 3 a7;
* hidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-OH, com n, sendo um número inteiro de 2 a 6;* carbóxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-COOH5 com Π] sendo um número inteiro de 3 a 6"
* oxo (C1 - C5) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHO, com nj sendo um número inteiro de 2 a 5; e
* [carbóxi (C1 - C10) alcanoil] amino (C1 - C15)alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nrNH-CO-(CH2)n2-COOH, com n,sendo um número inteiro de 3 a 6, e n2 sendo um número inteirode 2 a 12.
A invenção se refere, mais particularmente, aum processo como definido acima, no qual:
* X é selecionado dos seguintes grupos:
* -COOH;
* -O-P(O)(OH)2;
* -O-SO2(OH);
* -NH2;
* -CO-NH-(CH2)3-NH2, ou -CONH-(CH2)6-
NH2;
* -CO-NH-CH(COOH)-CH2-COOH;
* -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH2; e
* -0-C0-(CH2)5-NH2,
* e Y é selecionado dos seguintes grupos:
* -O-P(O)(OH)2;
* -O-SO2(OH);
* -NH2;
* -OH;* -O-CO-CH2-NH2 (2-aminoetanoilóxi), -0-CO-(CH2)2-NH2 (3- aminopropanoilóxi), -O-CO-(CH2)5-NH2 (6-aminiexanoilóxi), ou -O-CO-(CH2)11-NH2 (12-aminododecanoilóxi);
* -0-C0-(CH2)4-CH0H-CH20H (6,7-diidroxieptanoilóxi);
* -O-CO-(CH2)5-OH (6-hidroxiexanoilóxi);
* -O-CO-(CH2)2-COOH (3-carboxipropanoilóxi);
* -O-CO-(CH2)4-CHO (6-oxoexanoilóxi); e
* -0-C0-(CH2)5-NH-C0-(CH2)2-C00H (3-carboxipropanoilamino hexanoilóxi).
A invenção se refere, mais particularmente, aum processo como definido acima, em que R1 e R2 sãoselecionados entre:
CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C120)C14);
-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C]4);-CO-CH3, (C2);
-C0-CH2-NH-C0-C*H[0-C0-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(C10O)C8]NC2);
-C0-C*H[0-C0-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3,
(2(C60)C8);
-CO-(CH2)16-CH3, (Cl8);
-CO-CH2-C * H [O-CH2-C6H5] -(CH2) j O-CH3,
(3(BnO)C14); e-CO-CH2-C*H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)i0-CH3, (3[(OH)2-P(0)0]C14).
C* correspondendo a um átomo de carbonoassimétrico em configuração R, S ou na forma racêmica RS, nasfórmulas mencionadas acima.
A invenção se refere, mais particularmente, aum processo como definido acima, em que:
- Ri é selecionado entre:
C0-CH2-C*H[0-C0-(CH2) ι o-CH3]-(CH2)i o-CH3, (3(C120)C14);
-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14);-CO-CH3, (C2);
-C0-CH2-NH-C0-C*H[0-C0-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(C10O)C8]NC2);
-C0-C*H[0-C0-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3,(2(C60)C8); e
-CO-(CH2)16-CH3, (Cl8),
- R2 é selecionado entre:
CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C120)C14);
-C0-CH2-C*H0H-(CH2)]Q-CH3, (3(HO)C14);
-CO-CH2-C*H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3,(3(BnO)C i4); e
-CO-CH2-C*H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)]0-CH3 ,(3[(0H)2-P(0)0]C14).C** e C** correspondendo a átomos decarbono assimétricos em configuração R, S ou na forma racêmicaRS, nas fórmulas mencionadas acima.
A invenção se refere também a um processocomo definido acima, no qual o composto administrado tem afórmula geral (II):
<formula>formula see original document page 14</formula>
na qual X, Y, R1, R2 e m são como definidosacima, C*1 está em uma configuração R, S ou é a forma racêmicaRS, e C* está na configuração R.
A invenção se refere, mais particularmente, aum processo como definido acima, em que o compostoadministrado é selecionado entre aqueles de fórmula (II), emque:
- X = -O-P(O)(OH)2, Y = -O-P(O)(OH)2, R1 = -CO-CH2-C* *1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, R2 = -CO-CH2-Cssi52HOH-(CH2)1 Q-CH3, m = 2, C*1 está em configuração S,C*2 está em configuração R, C**1 e C**2 estão em configuraçãoR, isto é, (3S, 9R)-3-[(R)-3- dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoil amino]-decan-l, 10-diol(1 ,10)-bis-difosfato (OM-294-DP (S,R));
- X = -O-P(O)(OH)2, Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH, R1 = -CO-CH2-C^H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, R2 = -CO-CH2-C* *2HOH-(CH2)10-CH3, m = 2, C*1está em configuração S, e C*2 está em configuração R, C**1 eC**2 estão em configuração R, isto é, (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)3-hidróxitetradecanoil amino]-decan-l, 10-diol 1-difosfato 10-(6,7-diidroxieptanoato) (OM-197-MP-HD (S,R));
- X = -COOH, Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH, Rl = -CO-CH2-C**1 HfO-CO-(CH2)10-CH3J-(CH2)10-CH3, R2 = -CO-CH2-C* *2HOH-(CH2)10-CH3, m = 1 , C*1 está emconfiguração S, e C*2 está em configuração R, C**1 e C**2 estãoem configuração R, isto é, (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-0X0-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-decan-l , 10-diol 1-bifosfato 10-(6-aminoexanoato)(OM-197-MP-AC (S,R));
- X = -NH2, Y = -O-P(O)(OH)2, R1 = -CO-CH2-C** 1HfO-CO-(CH2)10-CH3J-(CH2)10-CH3, R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3, m = 4, C*1 está em configuração S, eC*2 está em configuração R, C**1 e C**2 estão em configuraçãoR> isto é, (5S,11 R)-1 -Amino- 5 - [(R)-3 -dodecanoiloxitetradecanoilamino]-6-oxo-7-aza-11 -[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-dodecan-12-ol 12-bifosfato (OM-294-BA-MP (S,R)).
A invenção também diz respeito a um processo,como definido acima, para o tratamento de animais de sanguequente, incluindo seres humanos, sofrendo de uma doença oudistúrbio relacionado a uma superprodução de citocinasinflamatórias ou marcadores de doenças inflamatórias porlinfócitos T, monócitos ou células apresentadoras de antígenosativados no organismo, em que as citocinas inflamatórias ou osmarcadores de doenças inflamatórias pertencem ao grupo, queconsiste de IL-I β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IFN-γ,TNF-α, e MCP-1.
A invenção se refere, mais particularmente, aum processo, como definido acima, no qual a doença éselecionada do grupo consistindo de asma, diabete, dermatiteatópica, rinite alérgica, prostatite, doença alérgica do intestino, eartrite reumatóide.
A invenção também se refere, maisparticularmente, a um processo como definido acima, queconsiste na administração de uma quantidade terapeuticamenteefetiva de qualquer composto de fórmula (I), como definidoacima, da invenção em um transportador, excipiente ouformulação farmaceuticamente aceitável, por meio de uma rotamucosa ou parenteral.
A invenção também diz respeito, maisparticularmente, a um processo, como definido acima, queconsiste na administração de uma quantidade terapeuticamenteefetiva de um composto de fórmula (I), como definido acima, dainvenção por rotas peritoneal, subcutânea, oral, intranasal,sublingual ou aerossol.
A invenção se refere, mais particularmente, acomposições farmacêuticas gastrorresistentes compreendendouma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto defórmula (I), como definido acima, em associação com umtransportador gastrorresistente, tais como tensoativos depoloxâmeros hidrofílicos, tal como polaxâmero 407(Lutrol F-127). Os transportadores coloidais, tais comonanopartículas ou micropartículas, são também formulaçõesadequadas para a transferência oral de fórmula (I), quandopolímeros entéricos, tais como polímeros de metacrilatos, sãousados.
Em um modo mais convencional, o uso detabletes ou cápsulas gastrorresistentes, obtidos por uso de umrevestimento entérico, também pode ser uma alternativa para arota oral.
A invenção também se refere, maisparticularmente, a um processo, como definido acima, no qual asdosagens necessárias das moléculas imunomoduladoras defórmula (I), como definidas acima, da invenção variam de 0,01 a50 mg/m em seres humanos.
A invenção também se refere ao uso de pelomenos um composto de fórmula (I), como definido acima, para apreparação de um medicamento para a prevenção ou tratamentode uma doença ou distúrbio, tal como asma, diabete, dermatiteatópica, rinite alérgica, prostatite, doença alérgica do intestino, eartrite reumatóide, relacionada a uma superprodução decitocinas inflamatórias ou marcadores de doençasinflamatórias.A invenção também diz respeito aos compostosde fórmula (I), como definidos acima, e ao produto farmacêuticocontendo os ditos compostos em associação com um veículofarmaceuticamente aceitável.
Os compostos de fórmula (I), como definidosacima, da presente invenção podem ser preparados de acordo como processo descrito no pedido de patente internacional WO00/00462 e no pedido de patente internacional WO01/46127, relativo à preparação e ao uso de compostos defórmula (I) no tratamento de cânceres, ou comoimunoadjuvantes.
A invenção vai ser descrita ainda em detalhes nadescrição apresentada a seguir da síntese dos compostos OM-294-DP (S,R)), OM-197-MP-HD (S,R)), OM-197-MC-HD (S,R)),OM-197-MP-AC (S,R)), e OM-294-BA-MP (S,R)), e das suaspropriedades biológicas.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1:
(3S, 9R)3-[(R)3-dodecanoüoxitetradecanoilamino]4-oxch5-aza-94(R>3-hidroxitetradecanoilamino]-decan-1, 10-diol 1-difosfato10-(6-aminoexanoato) (= OM-197-MP-AC (S,R)) (esquema 1)
1. (2R)-5-(Benziloxicarbonilamino)-2-[(R)-3-benzüoxitetradecanoüaminol-1 -(2-tetraidropiranilóxi)pentano (CA)
A uma solução de (2R)-5-(benziloxicarbonilamino)-2-[(R)-3-benziloxitetra-decanoilamino]pentan-1 -ol (PCT W000146127A1) (2,5 g ; 4,39mmol) em CH2Cl2 (83 mL), à temperatura ambiente e sobargônio, foram adicionados sucessivamente 3,4-diidro-2H-pirano(DHP) (1,4 mL; 15,38 mmol), depois p-toluenossulfonato depiridínio (PPTS) (441 mg, 1,75 mmol). A solução foi agitada por18 h à temperatura ambiente, depois diluída com CH2Cl2 (100mL), lavada com solução aquosa de NaHCO3 a 5%, depois comH2O. A fase orgânica foi seca por MgSO4, filtrada e concentrada.A purificação por cromatografia por cintilação em sílica-gel(AcOEt/pet. éter 4/1) produziu o composto C-I (2,86 g; 100%),como um sólido cristalino branco. (Rf = 0,66 em AcOEt/pet. éter4/1; U.V. e fosfomolibdato).
C39H60N2O6. IS/MS : m/z 653,5 ([M+H]+),675.5 ([M+Na]+). Pf = 84-86°C.
2· (2R)-5-Amino-2-ríR)3-benziloxitetradecanoilaminol-1 -(2-tetraidropiranilóxiVpentano (C-2)
Uma solução do composto C-I (2,5 g; 4,4mmol) em EtOH (150 mL) contendo trietilamina (4 mL) foihidrogenada na presença de 10% PD em C à temperaturaambiente e sob pressão atmosférica de hidrogênio por 3,5 h.O catalisador foi depois removido por filtração, lavadocom etanol e o filtrado foi concentrado e seco sob alto vácuo, paraproduzir amina livre C-2 (2,15 g; 96%) como um sólido brancoamorfo.
C31H54N2O4. IS/MS : m/z 519,5 ([M+H]+).
3. (S)(α)-[(R)-3-Dodecanoiloxitetradecanoüaminol-Y-butirolactonafC-3)A uma solução de ácido (R)-3-dodecanoiloxitetradecanóico [Buli. Chem. Soe. Jpn 60 (1987),2205-2214] (2,16 g; 5,1 mmol) em THF anidro (28 mL) a -15°Ce sob argônio, foram adicionados, sucessivamente, N-metilmorfolina (0,56 mL; 5,1 mmol, 1 eq) e cloroformiato deisobutila (657 μΐ; 5,1 mmol; 1 eq.). Após 1 h sob agitação a -15°C, bromidrato de L-homoserina e lactona (916 mg; 5,1 mmol;1 eq.), como uma solução em solução aquosa de NaHCO3 a0,72 M (14 mL, 2 eq.), foi adicionado. A mistura reacional foiagitada por 20 h á temperatura ambiente. A mistura foidiluída com Et2O (130 mL), a fase orgânica foi separadae lavada com H2O, depois seca com MgSO4, filtrada econcentrada. Uma purificação por cristalização (volumemínimo de CH2Cl2 e excesso de pentano a O0C) produziu ocomposto C-3 (2,17 g; 85%), como um sólido branco.
C30H55NO5. IS/MS : m/z 510,5 ([M+H]4), 532,5 ([M+Na]4). Pf=79-80°C.
4. Í3S, 9RV3-[(RV3-Dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4<>xo-S-aza-9-r(UV3-benzüoxitetradecanoüamino]-10-í2-tetraidropiranilY)xi-decan-l-olíC-4^
A uma solução do composto C-2 (638, mg, 1,23mmol, 1,3 eq) em CH2Cl2 anidro (1,5 mL) a 20 - 21°C, adicionou-se o composto C-3 (483 mg, 0,95 mmol). A solução foi agitadapor 3 dias a 20 - 21°C; o solvente foi evaporado sob pressãoreduzida. Uma purificação por cromatografía por cintilação emsílica-gel (CH2Cl2 / acetona 5/1 a 1/1) produziu o álcool C-4 (829mg, 85%) como um sólido branco.
C61H1O9N3C^JSZMS: m/z 1.029,OQM+Hf), 1.051.0([M+Na]4). Pf= 81 -82°C.
5. (3S, 9R)-3-í(RV3-Dodecanoiloxitetradecanoilaminol-4-oxo-5-aza-9- IYRV 3 -benziloxitetradecanoilamino 1 -10-Γ2-tetraidropiraniPoxi-decan-l-ol dibenzila fosfato ÍC-5)
A uma solução de álcool C-4 (120 mg; 0,12mmol) e 1-H-tetrazol (25 mg; 0,35 mmol; 3 eq.) em THF anidro(5 mL) à temperatura ambiente e sob argônio, adicionou-se N,N-dibenzildiethilfosforamidita (85%, 95 μΐ,; 0,27 mmol; 2,3 eq.).Após 45 min sob agitação, a mistura reacional foi resfriada a -40°C, depois uma solução de mCPBA (57 - 86%, 75 mg; 0,43mmol; 3,7 eq) em CH2Cl2 (3 mL) foi adicionada. Após 45 min a -40°C, a mistura foi aquecida e uma solução saturada de Na2S2O3(3 mm) foi adicionada e a mistura foi agitada por 10 min. Asolução foi diluída com éter, a fase orgânica foi separada e lavadacom solução saturada de Na2S2O3 (5x), depois com soluçãosaturada de NaHCO3 (2x). A fase orgânica foi seca com MgSO4,filtrada e concentrada. A purificação por cromatografia porcintilação em sílica-gel (CH2Cl2 / acetona 4/1 depois 2/1)produziu fosfato de dibenzila C-5 (126 mg; 84%) como um sólidoamorfo.
6. (3S,_9RV3-r(RV3-Dodecanoiloxitetradecanoilamino 14-oxo-5-aza-9-ÍÍRV3-benzüoxitetradecanoüaminol-decan-1.10-diol Kdibenzilafosfato^ ÍC-6)A uma solução a 1% de HCl em metanol (25mL) a 0°C, adicionou-se uma solução de composto C-5 (700 mg,0,54 mmol) em CH2Cl2 (2,5 mL). Após 45 min sobagitação a 0°C, a mistura reacional foi neutralizada comsolução aquosa de NaHCO3 a 5%, diluída com CH2Cl2, depoisa fase orgânica sendo separada. A fase aquosa foi extraída comCH2Cl2 (3 x), depois as fases orgânicas foram combinadas, secaspor MgSO4, filtradas e concentradas para produzir álcool C-6(640 mg; 98%).
7. (3S, 9RV3-[fRV3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4<>xo-5-aza-9-r(RV3-benziloxitetradecanoüaminol-decan-1.10-diol 1 -dibenzila fosfato 10-(6-benziloxicarbonilaminoexanoato (C-7)
A uma solução do composto preparado acima C-6 (640 mg, 0,53 mmol) e ácido 6-(benziloxicarbonilamino)hexanóico (423 mg, 1,60 mmol) em CH2Cl2 seco (25 mL) a O0C esob um fluxo de argônio, adicionou-se, sucessivamente,cloridrato de 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (306 mg, 1,60 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (20 mg, 160 μηιοί). A misturareacional é depois agitada por 30 minutos a 0°C e depoisde um dia para o outro à temperatura ambiente. Amistura reacional é depois lavada com água e umasolução de HCl 1 N, seguida por separação. A camadaorgânica é seca por MgSO4, filtrada e evaporada.Conduzindo-se uma purificação por cromatografia porcintilação em sílica-gel (4/1 depois 2/1 de eluente de CH2Cl2 /acetona), recuperou-se o produto da reação de acoplamentoC-I (537 mg; 71%). 13C-NMR (62,89 MHz, CDCl3), γ inppm: 173,18, 171,16, 170,38, 169,60, 156,30, 138,23,136,50, 135,38, 135,28, 128,42, 128,26, 128,17, 127,79,127,74, 127,44, 76,48, 71,15, 70,84, 69,47, 69,39, 69,31,66,25, 65,62, 64,37, 49,78, 47,76, 41,41, 41,34, 40,57,38,97, 34,22, 34,16, 33,96, 33,57, 32,95, 31,70, 29,15,28,95, 28,32, 25,87, 25,46, 25,02, 28,80, 24,18, 22,49,13,94.
8. (3S, 9RV3-[(RV3-dodecanoüoxitetradecanoüamino]-4-oxo-5-aza-9-r(RV3-Mdroxitetradecanoüammol-decan-L 10-diol 1-difosfatolO-fó-aminoexanoalo) ÍC-8) (= OM-197-MP-AC (SR))
Uma solução do composto C-7 (500 mg, 0,35mmol) em uma mistura 5/2 de CH2Cl2 / etanol (70 mL)contendo ácido acético (10 mL) é hidrogenada napresença de Pd em carbono contendo 10% de Pd àtemperatura ambiente e sob hidrogênio a pressãoatmosférica por 12 a 24 horas. O catalisador é filtrado. Ofiltrado é evaporado à secura e o resíduo é então seco porsucção de uma bomba de vácuo, para obter C-8 (368 mg,rendimento quantitativo). ES/MS: razão m/z 1.047,9 [M+H]+;1.069,8
Esquema 1<formula>formula see original document page 24</formula>EXEMPLO 2
(3S, 9R>34(^>3Klodecanoüoxiteti^ecanoüamino]4-oxc>5-aza-94(U>3-M(±-oxitetradecanoüamino]-decan-1,10-diol 1-difosfalo10-(6,7- düdroxieptanoato) (= OM-197-MP-HD (SJl)) (esquema 2)
1. Benzil_6-heptenoato_(C-9)
A uma solução de ácido 6-heptenóico (4,71 g,36,75 mmol( em AcOEt (80 mL) a O0C, foram sucessivamenteadicionados trietilamina (15,3 mL, 110,24 mmol), brometo debenzila (13,1 mL, 110,24 mmol) e Bu4Nl (6,79, 18,37 mmol). Amistura reacional foi agitada a O0C por 2 h e concentrada a vácuo.O resíduo é retomado em AcOEt, a fase orgânica é lavada comuma solução aquosa saturada de NaHCO3 e H2O. A fase orgânicafoi seca por MgSO4, e o solvente removido a vácuo. Acromatografia por cintilação do resíduo em sílica-gel (n-heptano /EtOAc, 9:1) proporcionou o composto C-9 (6,00 g; 75%) comoum óleo incolor. 13C-NMR (62,89 MHz, CDCl3): 24,42, 28,34,33,37, 34,13, 66,08, 114,73, 128,19, 128,55, 136,16, 138,37,173,43.
2. Benzil 6,7-epoxieptanoato (C-IO)
A uma solução de m-CPBA (2,76 g, 12,29mmol) em CH2Cl2 (50 mL) a O0C, adicionou-se lentamente umasolução de C-9 (1,79 g, 8,19 mmol) em CH2Cl2 (20 mL). Asolução foi agitada a O0C por 2 h, depois à temperatura ambientepor 18 h. A solução foi diluída com CH2Cl2 e a fase orgânica foilavada com uma solução aquosa saturada de Na2S2O3 (5 χ). Afase orgânica foi seca por MgSO4, e o solvente removido a vácuo.A cromatografia por cintilação do resíduo em sílica-gel (n-heptano / EtOAc, 5:1) proporcionou o composto C-IO (1,54 g;80%) como um óleo incolor. 13C-NMR (62,89 MHz, CDCl3):24,60, 25,39, 32,00, 34,02, 46,86, 51,91, 66,04, 128,11 , 128,46,136,01, 173,17.
3. Benzila 6.7-isopropilidenoeptanoato (C-Il)
A uma solução de C-10 (1,54 g, 6,59 mmol) emacetona (50 mL) à temperatura ambiente, adicionou-se ácidosulfurico (0,42 mL, 7,9 mmol). A solução foi agitada por 3 h,diluída com éter dietílico e a fase orgânica lavada com umasolução aquosa saturada de NaHCO3. A fase orgânica foi seca porMgSO4, e o solvente removido a vácuo para produzir C-11 (1,73g), como um óleo amarelo claro, que foi usado na etapa seguinte,sem purificação adicional.
4. Acido 6.7-isopropilidenoeptanóico ÍC-12)
Uma solução do composto C-Il (1,53 g) emEtOAc (20 mL) contendo Et3N (3,65 mL, 26,16 mL) foihidrogenada na presença de Pd em carbono contendo 10% de Pd àtemperatura ambiente e sob hidrogênio à pressão atmosférica por3h. O catalisador foi filtrado e o filtrado evaporado à secura. Acromatografia por cintilação do resíduo em sílica-gel (CH2Cl2 /MeOH, 5:1) proporcionou o composto C-12 (0,63 g; 54% emduas etapas), como um óleo incolor.
5. (3S, 9RV3-|"(RV3-dodecanoiloxitetradecanoilamino1-4<>xo-5-aza-9-r(RV3-benzüoxitetradecanoüaminol-decan-L 10-diol 1-dibenzila fosfato 10-6.7-isopropilidenoeptanoato (C-W)A uma solução do composto preparado acimaC-6 (248 mg, 0,21 mmol) e o composto ácido 6,7-isopropilidenoeptanóico (C-12) (92 mg, 0,45 mmol) em CH2Cl2seco (5 mL) e sob um fluxo de argônio, adicionou-se, emsucessão, cloridrato de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (91 mg, 0,47 mmol.) e 4-dimetilaminopiridina(catalítica) disponíveis comercialmente. A mistura reacional éentão agitada por 30 minutos a 0°C, e depois de um dia para ooutro à temperatura ambiente. A mistura reacional é então lavadacom água e uma solução de HCl 1 N, seguida por separação emcamadas. A camada orgânica é seca por MgSO4, filtrada eevaporada. Conduzindo-se uma purificação por cromatografia porcintilação em sílica-gel (CH2Cl2 / MeOH 99:1), recuperou-se oproduto da reação de acoplamento C-13 (240 mg; 83%). ES/MS:m/z 1.390 [M+H]+; 1.411 [M+Na]+.
6. (3S, 9RV3-[(RV3-dodecanoüoxitetradecanoilamino]-decan-1, 10-diol 14-oxo-5-aza-9-r(R>3- hidroxitetradecanoilaminol-decan-1. 10-diol 1 -difosfato 10-(6,7-diidroxieptanoato) ÍC-14) (= OM-197-MP-HD (SICi)Uma solução do composto C-13 (180 mg, 0,13mmol) em uma mistura 5/2 de CH2Cl2 / etanol (21 mL) contendoácido acético (3 mL) é hidrogenada na presença de Pd em carbonocontendo 10% de Pd à temperatura ambiente e sob hidrogênio apressão atmosférica por 12 a 36 horas. O catalisador é filtrado. Ofiltrado é evaporado à secura e o resíduo é então seco por sucçãode uma bomba de vácuo, para obter C-14 (368 mg, rendimentoquantitativo). ES/MS: razão m/z 1.079; 1.101 [M+H]+Esquema 2
<formula>formula see original document page 28</formula>
EXEMPLO 3
(3S,9R>34(R)-3Hlodecanoüoxitetr^ecanoüamino]4-oxo-5aza-9-[(R>3- M(±oxitetradecanoüamino]-decan-1,10-diol 1, 10-bis-difosfato) (OM-294-DP(S,R)) (esquema 3)1. (3S, 9R)-V34(TlV3-Dode(^oüoxitetradecanoüamjno1-oxo-5-aza-9-r(RV3-benzüoxitetradecanoüarnMo1-decan-1. 10-diol (C-15)
A uma solução de (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benziloxitetradecanoilamino]pentan-1 -ol (PCT W000146127A1)(8 g, 18,4 mmol) em CH2Cl2 anidro (60 mL) a 25°C, adicionou-seo composto C3 (9g, 17,5 mmol) em CH2Cl2 anidro (28 mL). Asolução foi agitada por 3 dias a 20 - 210C. A suspensão foi diluídacom CH2Cl2 (66 mL) e aquecida a 30°C, para obter uma soluçãoclara. Acetonitrila (320 mL) foi lentamente adicionada à solução.A solução foi resfriada a 20°C e agitada por 2 h. O precipitado foifiltrado, lavado com acetonitrila e seco sob vácuo, para obter C-(13,7 g, 83%), como um sólido branco, pf = 103°C.
2. (3S, 9RV3-[(RV3-Dodecanoiloxitetradecanoilamino]-oxo-5-aza-9-r(RV3-benziloxitetradecanoilamino1-decan-L 10-diol 1. 10-bis-(fosfato de dibenzila) fC-16
A uma solução de C-15 (1,02 g; 1,08 mmol) e 1 H-tetrazol (454 mg; 6,48 mmol; e eq) em THF anidro (46 mL) à temperaturaambiente e sob argônio, adicionou-se Ν,Ν-dibenzil dietilfosforamidita (85%,1,50 mL; 4,97 mmol; 4,6 eq). Após 30 min sob agitação, a mistura reacionalfoi resfriada a -20°C, depois uma solução de mCPBA (57 - 86%; 1,32 g; 7,67mmol; 7,4 eq) em CH2Cl2 (30 mL) foi adicionada Após 45 min a -20°C,a solução foi aquecida a 0°C e uma solução saturada de Na2S2O3(25 mL) foi adicionada e a mistura foi agitada por 10 min. Asolução foi diluída com éter, a fase orgânica foi separada e lavada com umasolução saturada de Na2S2O3 (5 x), depois com uma solução saturada deNaHCO3 (2 χ). A fase orgânica foi seca por MgSO4, filtrada e concentradaA purificação por cromatografia por cintilação em sílica-gel (CH2Cl2 / acetona4/1 depois3/1) produziu C-16 (1,38 g; 87%) como um óleo incolor.
3. (3S. 9RV3-[(RV3-Dodecanoüoxitetmdecanoüamino]-oxo-5-aza-9-r(RV3-benzüoxitetradecanoüamino1-decan-1. 10-diol 1. 10-bis-(difosfato) fC-17) (= OM-294-DP ÍS.RY)
Uma solução do composto C-16 (2,7 g, 1,84mmol) em isopropanol (150 mL) foi hidrogenada com 10% de Pdem C (320 mg à temperatura ambiente e sob pressão atmosféricade hidrogênio por 3 h. O catalisador foi removido por fíltraçãopor uma membrana Millipore. O filtrado foi concentrado e secosob alto vácuo para produzir C-17 (1,8 g; 98%) como um sólidoamorfo.
Esquema 3
<formula>formula see original document page 30</formula>EXEMPLO 4
Acido N-[(R)3-dodecanoüoxitetradecanoüamino]-L-aspártico,a-N-{(4R)-5-Mdróxi4-5-hidróxi-4-[(R)-3-Wdroxitetradecanoüamino]-pentil} amida 5-0-(6,7-diidroxieptanoato)(=OM-197-MC-HD (SJR)) (esquema 4)
1. Aeido N4(RV3Hdodecanoüoxitetradecanoüamino1-L-aspártico,_a-N-{(4R)5-hidróxi-4-[(R)-3-benziloxitetradecanoilamino]pentil}amida-B-benzil éster. 5-0-(6.7-isopropilidenoeptanoaío) (C-18)
A uma solução de composto aeido N-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-L-aspártico, α-N- {(4R)-5-hidróxi-4-[(R)-3-benziloxitetradeeanoilamino]pentil}amida-p-benzil éster (PCT W000146127A1) (1,14 g, 1,09 mmol) e docomposto ácido 6,7-isopropilidenoeptanóico (C-12) (487 mg, 2,48mmol) em CH2Cl2 seco (30 mL) a 0°C e sob fluxo de argônio, adicionou-seem sucessão cloridrato de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida(485 mg, 2,53 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (43 mg, 0,35mmol). A mistura reacional é então agitada por 30 minutos a 0°Ce depois de um dia para o outro à temperatura ambiente. Amistura reacional é então lavada com água e uma solução de HCl1N, seguida por separação em camadas. A camada oigânica é secapor MgSO4, filtrada e evaporada. Conduzindo-se uma purificação porcromatografia por cintilação em sílica-gel (CH2Cl2 / acetona 9:1),recuperou-se o produto da reação de acoplamento C-18 (1,20 g;76%) como um sólido branco. ES/MS: m/z 1.255 [M+Na]+.2. Acido N-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-L-aspártico, αt-N-{(4R)-5-hidróxi-4-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]pentil}amida, 5-O-(6,7-diidroxieptanoato) (C-19)(= OM-197-MC-HD (S, R)
Uma solução do composto C-18 (1,20 g,0,97 mmol) em uma mistura 2/1 de CH2Cl2 / etanol (50 mL)contendo ácido acético (5 mL) é hidrogenada na presença de Pdem carbono contendo 10% de Pd, à temperatura ambiente e sobhidrogênio à pressão atmosférica, por 12 a 36 horas. O catalisadoré filtrado. O filtrado é evaporado à secura e o resíduo é então secopor sucção de uma bomba de vácuo, para obter C-19 (1 g,rendimento quantitativo). ES/MS: m/z 1.012 [M+H]+; 1.034[M+Na]+.
Esquema 4
<formula>formula see original document page 32</formula>
EXEMPLO 5(5S, 11R)-1 - Amino-5 - [(R)-3 -dodecanoiloxitetradecanoilamino]-6-oxo-7-aza-l 1 -[(R)~3-hidroxitetradecanoilamino]-dodecan-12-ol 12-difosfato (= OM-294-BA-MP (S,R)) (esquema 5)
1. Na-[(R)-3-Dodecanoiloxitetradecanoil] Ns-benziloxicarbonil-L-lisina (C-20)
A uma solução de ácido (R)-3-dodecanoiloxitetradecanóico P-109 [Buli. Chem. Soe. Jpn 60(1987), 2205-2214] (153 mg ; 0,36 mmol) em THF anidra (4 mL)a -15°C e sob argônio, foram adicionadas sucessivamente N-metilmorfolina(40 |uL; 0,36 mmol; 1 eq) e cloroformiato de isobutila (47 jiL; 0,36 mmol; 1eq). Após 30 min sob agitação a -15°C, uma solução comercialmentedisponível de H-L-Lisina(Z)-OH (100 mg; 0,36 mmol; 1 eq) emCH3CN / H2O (3,5/1) (4,5 mL) contendo Et3N (0,16 mL) foiadicionada A mistura reacional foi agitada por 20 h à temperatura ambiente.O solvente orgânico foi então evaporado e a camada aquosa foi resinada aO°C, acidificada com uma solução a 10% de ácido cítrico a um pH = 3, eextraída com AcOEt (3 χ). A camada orgânica é seca por MgSO4,filtrada e evaporada Conduzindo-se uma purificação por cromatografia porcintilação em süica-gel (1/1 de eluente de éter de petróleo / AcOEt contendo0,25% de ácido acético), seguida por co-evaporação de tolueno, produziu C-20(172mg; 70%), como um sólido cristalino branco. MS: (IS+) m/z690,0 [M+H]4,707,0 [MfNH4]+, 712,0 [MfNa]+, 727,5 [M+K]+, 13C-NMR(62,89 MHz, CDCl3), δ in ppm: 174,90, 173,73, 170,66, 156,98, 136,53,128,57,128,17,128,05,71,27,66,79,52,24,41,32,40,47,34,59,34,24,31,99,31,45,29,72,29,43,29,25,25,29,25,07, 22,76, 22,27, 14,19.2· (5S, 11RV1 -Benziloxicarbonilamino-5-|YR)-3-dodecanoiloxitetradecanoilaminol-6-oxo-7-aza-11 -|YR V3-benziloxitetradecanoilamino 1 -dodecan-12-ol (C-21
A uma solução de C-20 (150 mg; 0,22 mmol) e(2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzüoxiteti^ecanoüammo]penían-1 -ol WZ-IOb(PCT W000146127A1) (95 mg; 0,22 mmol; 1,0 eq) em CH2Cl2 anidro (3mL) a O0C, adicionou-se HOAt comercialmente disponível (l-hidróxi-7-azabenzotriazol) (36 mg, 0,26 mmol, 1,2 eq) e N,N'-diisopropilcarbodiimida comercialmente disponível (41 μΐ, 0,22mmol, 1,2 eq). A mistura reacional foi agitada por 1 h a O0C edepois de um dia para o outro à temperatura ambiente. A misturareacional foi subseqüentemente lavada com água, uma solução 1N de HCl e uma solução saturada de NaHCO3, seguida por separação emcamadas. Conduzhdose uma cromatografia por cintilação em sílica-gel(eluente de CH2Cl2 / acetona), recuperou-se C-21 (165 mg; 68%),como um sólido cristalino branco. MS: (IS+) m/z 1.105,8 [M+H]+,1.128,0 (M+Na]+, 13C-NMR (62,89 MHz, CDCl3), δ in ppm: 173,56,172,20,171,87,170,23,156,82,138,32,136,69, 128,53, 128,47, 128,09,128,00, 127,91 , 127,82, 76,77, 71,48, 71,15, 66,59, 64,77, 53,1 ,51,39,41,71,41,63,40,46,39,45,34,57,34,51,34,12,31,97,29,70,29,51,29,41 , 29,25, 28,69, 25,38, 25,29, 25,19, 25,09, 22,74, 22,50, 14,18.
3· (5S.11 RVl-Benziloxicarbonilarri ino-5-|YR V3-dodecanoiloxitetradecanoilamino1-6-oxo-7-aza-l 1 -[(R) -3-benziloxitetradecanoilaminol-dodecan-12-ol 12-dibenzila fosfato (C-22)
A uma solução de C-21 (150 mg; 0,14 mmol) eIH-tetrazol (29 mg; 0,41 mmol; 3 eq) em THF anidra (8 mL), àtemperatura ambiente e sob argônio, adicionou-se N,N-dibenzildietilfosforamidita (85%; 110 μL; 0,31 mrnol; 23, eq). Após 30min sob agitação, a mistura reacional foi resfriada a -20°C, entãouma solução de mCPBA (57 - 86%; 87 g; 0,50 mmol; 3,7 eq) emCH2Cl2 (6 mL) foi adicionada. Após 45 min a -20°C, a solução foiaquecida a 0°C e uma solução saturada de Na2S2O3 (5 mL) foi adicionada e amistura foi agitada por 10 min. A solução foi diluída com éter, a fase orgânicafoi separada e lavada com Na2S2O3 (5 x), depois com soluçãosaturada de NaHCO3 (2 χ). A fase orgânica foi seca por MgSO4,filtrada e concentrada. A purificação por cromatografia porcintilação em sílica-gel (CH2Cl2 / acetona 4/1 depois 2/1)produziu C-22 (149 mg; 81%), como um sólido amorfo. MS:(IS+) m/z 1.366,0 [M+H]+, 1.383,5 [M + NH4]+, 1.388,5 [MfNa]+,1.088,0 \M - BnO^OPOH)+Hf, 13C-NMR (62,89 MHz, CDCl3), δ in ppm:173,51,171,77,171,27,169,95,156,67,138,32,136,69,135,66 (d), 135,55(d), 128,69, 128,51 , 128,43, 128,03, 127,77, 127,69, 76,49, 71,28, 71,20,69,66 (d), 69,58 (d), 68,72 (d), 66,51 , 52Λ82, 48,62 (d), 41,76, 41,46,40,46, 39,01 , 34,54, 34,06, 31,96, 29,68, 29,49, 29,39, 29,22,27,95, 25,29, 25,18, 25,05, 22,73, 22,45, 14,17.
4. (SS. 11 RVI -Amino-5-|YR)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino1-6-oxo-7-aza-l 1-IYRV3-hidroxitetradecanoilaminol-dodecan-12-ol 12-difosfato (C-21) (=OM-294-BA-MP (S,R))
Uma solução do composto C-22 (130 mg, 0,095mmol) em uma mistura 3/1 de CH2Cl2 / etanol (20 mL) contendoácido acético (3 mL) é hidrogenada na presença de Pd em carbonocontendo 10% de Pd, à temperatura ambiente e sob hidrogênio àpressão atmosférica, por 36 horas. O catalisador é filtrado. Ofiltrado é evaporado à secura e o resíduo é então seco por sucçãode uma bomba de vácuo, para obter C-23 (84 mg, 91%). MS:(IS+) m/z 962,0 [M+H]+, 984,0 [M+Na]+.
Esquema 5
<formula>formula see original document page 36</formula>
Atividades biológicas dos compostos de acordo com a invençãoEXEMPLO 6
Efeito regulador in vitro de OM-197-MP-AC eOM-294-DP em citocinas inflamatórias induzidas por LPS ÍIL-12e TNF-oc) e antiinflamatórias QL-IOn) em células DC de murino
Protocolo:
Células de medula óssea foram isoladas ecultivadas como descrito abaixo.
Fêmures e tíbias de dois machos C57BL/7, de 6semanas de idade (Charles River Laboratories França) foramremovidos, com retirada de músculos e tendões, e desinfetadoscom etanol a 70%. Ambas as extremidades de cada osso foramcortadas e a medula foi lavada com HBSS (Gibco BRL), usandouma seringa com uma agulha de calibre 26. A suspensão celularresultante foi centrifugada por 5 min a 500 g e lavada em HBSS.A células foram ressuspensas a 3 χ IO5 células / mL em RPMI-1640 (Gibco BRL), suplementado com 2 mM de L-glutamina(Sigma), 100 U/mL de penicilina (Sigma), 100 μg/mL deestreptomicina (Sigma), 50 μΜ de β-mercaptoetanol (Sigma),10% de FCS desativado termicamente (Sigma) e 14 ng/mL derGM-CSF de murino (R&D).
Para gerar células dendríticas (DCs) derivadasde medula óssea (BM), os leucócitos BM foram cultivados emcápsulas Petri bacteriológicas de 100 mm (Falcon 1029), por 8dias a 37°C em 5% de CO2. No dia 0, 10 mL de uma suspensão decélulas foi cultivada por cápsula. No dia 3, outros 10 mL de meiorecém-preparado foram adicionados a cada lâmina, e no dia 6, 9mL de meio de topo foram removidos cuidadosamente de cadalâmina e substituídos por 10 mL de meio fresco.
As células não aderentes do 8o dia de culturas decélulas BM foram coletadas, centrifugadas por 5 min a 500 g eressuspensa a 1,25 χ IO6 células/mL em RPMI suplementadocontendo 10 ng/mL de GM-CSF. As células foram depoiscultivadas em lâminas de cultura de tecido de 24 reservatórios (1χ IO6 células / reservatório) e incubadas por 1 h 30 a 37°C em 5%de CO2, na ausência ou presença de OM-294-DP ou OM-197-MP-AC (0,01 - 100 μβ / mL / 200 μΐ. / reservatório). LPS (E. coli026: B6, Sigma) foi depois adicionado a 1 μg/mL, e as lâminasforam incubadas ainda mais. Após 20 h de incubação, ossobrenadantes foram coletados para análise de citocinas. Asconcentrações de IL-12p70, IL-IO e TNF-α em sobrenadantes deculturas de DCs foram medidas por ELISA, usando pares ABcomparados com OptEIA da BD Pharmingen. O substrato deperoxidase quimioluminescente Supersignal ELISA Pico (BDPharmingen) foi usado para a detecção por luminometria(contador de multimarcação Wallac 1420 Victor-2). Os ensaiosforam conduzidos de acordo com as instruções do fabricante.
Resultados:
a) Efeito de OM-197-MP-AC e ΟΜ-294-ΠΡ naprodução de IL-12 e IL-10 induzida por LPS
Os resultados na produção de IL-12 e IL-IOinduzida por LPS são apresentados na Figura 1.b) Efeito de OM-197-MP-AC e OM-294-DP naprodução de TNF-α induzida por LPS
Os resultados na produção de TNF-α induzidapor LPS são apresentados na Figura 2.
Conclusão:
Os resultados apresentados acima mostramclaramente que ambas as OM-197-MP-AC e OM-294-DPdiminuem a produção induzida por LPS das citocinasinflamatórias (IL-12 e TNF-α), e em um contraste surpreendenteaumentam a produção de citocina inflamatória IL-10, sugerindoque os compostos da invenção podem agir como agentesantiinflamatórios terapêuticos.
EXEMPLO 7
Efeitos diretos de uma série de quatro derivadostriacilados em células T CD4+ humanas
Protocolo:
Uma série de quatro compostos da presenteinvenção (OM-197-MP-AC, OM-197-MC-HD, OM-294-BA-MP,OM-197-MP-HD) foi testada diretamente como resumido abaixo.As células T CD4+ nativas foram classificadas magneticamente dedoador de sangue saudável (revestimento de pele humana). Ascélulas foram estimuladas na presença ou não de doses graduadasde derivados de triacila (0,02; 0,2; 2 e 20 μ^/mL) usando anti-CD3 ligado à lâmina (5 μg/mL) e anti-CD28 solúvel (1 μ^πιΐ,).Após 6 dias, os níveis de citocina (IFN-γ e IL-13) foram testadosnos sobrenadantes das culturas usando ELISA.
Resultados:
Os resultados para a produção de citocinas sãoapresentados na Figura 3. A proliferação de células T foi tambémtestada, mas não foi modificada pelos compostos da invenção.
Conclusão:
A produção de IL-13 (histogramas brancos) porcélulas T CD4+ é reduzida na presença de OM-197-MP-AC, OM-197-MC-HD, OM-294-BA-MP5 OM-197-MP-HD, enquanto aprodução de IFN-γ (histogramas escuros) e a proliferação decélulas T se manteve não afetada. Isso representa umdeslocamento no sentido de uma resposta Thl5 na presença dasquatro moléculas triaciladas testadas.
EXEMPLO 8
Efeito de OM-197-MP-AC em um modelo deasma
Uma vez que no exemplo anterior mostrou-seque as moléculas triaciladas testadas diminuíram a produção deuma citocina, provavelmente envolvida na patologia de asma (istoé, IL-3), os inventores procuraram na presente invenção investigarin vivo os efeitos de um elemento da série (OM-197-MP-AC) namodulação da diferenciação de células auxiliadoras T nativas e nodesenvolvimento subseqüente de asma alérgica.
No presente estudo, os inventores investigaramprimeiro (parte a) o efeito da OM-197-MP-AC administradadurante a fase de sensibilização de asma alérgica induzida porLACK5 e depois o efeito da molécula testada terapeuticamente(parte b).
Parte a) Tratamento "profilático" de asma
Protocolo:
Camundonsos e indução de asma alérgica:
Camundongos fêmeas Balb/c de 6 semanas devida foram comprados do "Centre d'Elevage Janvier" (CERJ, LeGenest-StJsle, França). Todos os camundongos foramsensibilizados por 2 injeções i.p. de 10 g de proteína LACKprecipitada em 2 mg de Alum (PerBio Science França SAS,Brebières, França) nos dias 0 e 7.
Os animais foram divididos em grupos, como sesegue:
- os camundongos confrontados com soluçãosalina e sensibilizados com LACK (4 camundongos);
- os camundongos confrontados e sensibilizadoscom LACK (8 camundongos); e
- os camundongos confrontados e sensibilizadoscom LACK, tratados com OM-197-MP-AC (8 camundongos).
Os camundongos do terceiro grupo foramtratados intraperitonealmente com 1 mg/kg (20 μg porcamundongo) de OM-197-MP-AC. Os camundongos foramtratados nos dias: -1, 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 e 11.
Do dia 16 ao dia 21, os camundongos dosgrupos BeC foram expostos a uma confrontação com aerossoldiária de 20 min de uma solução de LACK (0,15%), enquanto queos camundongos do grupo da solução salina receberam umasolução salina, como um controle.
Hiperresposta das vias aéreas TAHR):
A AHR para todos os camundongos, um diadepois do último confronto com antígenos por pletismografia decorpo inteiro (Emka), em resposta a concentrações crescentes (6 -mg/mL) de metacolina (acetilmetilcolina, Sigma) inalada. AAHR é expressa com uma pausa acentuada (Penh, consultar aFigura 4), um parâmetro adimensional perfeitamentecorrelacionado o valor calculado de resistência e submissão dasvias aéreas, que se correlaciona com a medida da resistência dasvias aéreas, impedância e pressão interpleural.
Reagentes:
- a proteína recombinante LACK foi produzidaem E. coli e purificada como descrito por Mougneau et al., 1995;
- OM-197-MP-AC, batelada DL040906 naconcentração de 0,98 mg/mL, foi da OM PHARMA;
- Anti-IgE EM-95 mAbs foi um presente daDNAX (Paio Alto, CA, EUA);
- Metacolina (acetilmetilcolina) foi comprada daSigma (Saint Quentin, Fallavier, França); e
- contas de disposição CBA (Flex set) foramcompradas da BD Biosciences.
Títulos de anticorpos:Todos os camundongos foram sangrados porperfuração no coração um dia depois do último aerossol. A IgEtotal foi quantificada por ELISA, usando EM-95 anti-IgE mAbsde rato, como anticorpo de revestimento, anti-IgE mAbs de ratoacoplados a biotina, como o segundo anticorpo, como descrito(Julia et al., 2002).
Análise de células de lavagens broncoalveolares(BAL) (percentual de eosinófilos):
Os camundongos individuais foram sangrados euma cânula foi inserida nas suas traquéias. Os pulmões foramlavados 3 vezes com 1 mL de PBS aquecida. As células foramlavadas com PBS, ressuspensas em 300 μΐ, e contadas usandouma câmara Burker-Türk. Para contagens de células BALdiferenciais, preparações de citospina foram feitas e manchadascom coloração de Wright V Giemsa. Os respectivos números deneutrófilos, eosinófilos e outras células mononucleares foramdeterminados por exame microscópico. Apenas o percentual deeosinófilos (Figura 5) é indicado aqui.
Análise de conteúdo de citocina no pulmão:
Para investigar o conteúdo de citocina nopulmão de animais tratados e não tratados, extratos e proteínaforam preparados de pulmões de camundongos wt confrontadoscom PBS e sensibilizados com LACK (grupo "Controle"),camundongos wt confrontados e sensibilizados com LACK(grupo "Asma"), camundongos wt tratados com OM-197-MP-AC(grupo "OM-197"). Os teores de IL-4, IL-5, IL-13 foramanalisados por análise multiplex usando ensaio FACS.
Resultados:
Medida de hiperresposta das vias aéreas ÍAHR^:
Os camundongos sensibilizados com LACKtratados ou não (consultar acima) foram a seguir confrontadoscom aerossol diário de LACK por cinco dias consecutivos. Umdia depois do último aerossol, a AHR foi medida porpletismografia de corpo inteiro em resposta, para aumentar asconcentrações de metacolina em forma de aerossol.
Como esperado, os camundongos confrontadoscom solução salina e sensibilizados por LACK nãodesenvolveram AHR, quando expostos a metacolina, enquantoque os camundongos confrontados e sensibilizados com LACKdesenvolveram uma forte AHR, como refletido por altos valoresde Penh (Figura 4). Em um grande contraste, os camundongosconfrontados e sensibilizados com LACK, que foram tratadoscom OM-197-MP-AC, não apresentaram AHR.
Conclusão:
A hiperresposta das vias aéreas por exposiçãode camundongos a antígenos em aerossol, medida na presença demetacolina, foi reduzida de volta para os níveis de controle(solução salina) por tratamento com OM-197-MP-AC.
Caracterização do percentual de eosinófílos emlavagens broncoalveolares TBALn):
Os resultados são indicados na Figura 5.Os camundongos sensibilizados com LACK,que receberam aerossóis de solução salina, não apresentarameosinófilos nas BAL, enquanto que aqueles que receberam osconfrontos com aerossol LACK não. Além disso, oscamundongos tratados com OM-197-MP-AC apresentaram 3vezes menos eosinófilos do que os camundongos de controle nãotratados (Figura 5).
Conclusão:
Os tratamentos com OM-197-MP-ACdiminuíram bastante a eosinofilia das BAL.
Medida de imunoglobulinas (Io) em soros:
Os resultados para IgE são apresentados na
Figura 6.
Os títulos de IgE total (Figura 6) foramsignificativamente diminuídos, quando os camundongos foramtratados com composto de OM-197-MP-AC.
Conclusão:
Desse modo, os soros de camundongos tratadoscom OM-197-MP-AC continham 2 vezes menos IgE total,comparados com os soros de camundongos confrontados,sensibilizados, tratados (isto é, "animais asmáticos").
Medida de citocinas no pulmão:
Para investigar ainda mais os efeitos de OM-197-MP-AC profilático em inflamação alérgica das vias aéreas, asproteínas foram extraídas dos pulmões de ambos os camundongosWT tratados e não tratados, e as citocinas conhecidas pordesempenhar um papel importante na asma (IL-4, IL-5 e IL-13)foram quantificadas por análise multiplex usando contras dedisposição CBA e ensaio FACS. Os dados foram normalizados naquantidade total de proteínas e considerados como pg de citocinapor mg e proteínas de pulmão.
Ainda que as proporções de IL-4, IL-13 e IL-5estivessem abaixo do limite de detecção nos pulmões decamundongos confrontados com PBS e sensibilizados com LACK(consultar "Controle" na Figura 7), as proporções dessas citocinasaumentou bastante em relação aos confrontos com LACK(consultar "Asma" na Figura 7). Em contraste, os pulmões decamundongos confrontados e sensibilizados com LACK, queforam tratados com OM-197-MP-AC, continham 5 vezes menosIL-4 (p = 0,0003), 5 vezes menos IL-5 (p = 0,0003), e 3,5 vezesmenos IL-13 (p = 0,0003) do que os camundongos não tratados(consultar "OM-197" na Figura 7).
Além das IL-4, IL-5 e IL-13, outras citocinasforam quantificadas por análise multiplex usando contas dedisposição CBA e ensaio FACS. Os resultados principais estãoindicados abaixo.
A IFN-γ foi verificada como estando supra-regulada nos pulmões de camundongos confrontados esensibilizados com LACK, comparados com os camundongosconfrontados com PBS e sensibilizados com LACK. Os pulmõesde camundongos tratados com OM-197-MP-AC continham 2vezes menos IFN-γ do que aqueles de camundongos não tratados.KC é a quimiocina homóloga funcional de IL-8 ou CXCL8humana, e se liga à CXCR2 expressa por ambos os neutrófilos eeosinófilos. De fato, KC pode permitir o recrutamento degranulócitos em tecidos inflamados. Ainda que KC estejapresente em uma quantidade muito baixa nos pulmões decamundongos confrontados com PBS e sensibilizados comLACK, a sua expressão aumentou bastante em relação aosconfrontos com os aerossóis LACK. A quantidade de KCproduzida nos pulmões foi reduzida à metade por tratamento comOM-197-MP-AC.
A citocina pró-inflamatória, IL-6 foi encontradaem pulmões daqueles confrontados com PBS e sensibilizadoscom LACK e aumentou ligeiramente em relação aos aerossóis deLACK. Os pulmões de camundongos tratados com OM-197-MP-AC apresentaram 1,5 vez menos IL-6 do que aqueles decamundongos não tratados. A quimiocina MCP-I foi verificadacomo sendo expressa em pulmões de camundongos confrontadoscom PBS e sensibilizados, e foi ligeiramente supra-regulada porconfronto. Os pulmões de camundongos, que foram tratados comOM-197-MP-AC, continham 1,8 vez menos do que aqueles deanimais não tratados.
As quantidades de TFN-cc em pulmões decamundongos tratados e não tratados não produziram diferençassignificativas.
IL-9 não foi detectada em quaisquer dasamostras.Esses dados considerados conjuntamenteindicam que o OM-197-MP-AC profilática induz não apenas umaforte diminuição das citocinas Th2, que são cruciais para aindução de inflamações alérgicas das vias aéreas, e AHR, mastambém uma diminuição de outras citocinas e quimiocinas, quecontribuem para a inflamação do pulmão e para o recrutamento decélulas efetoras inflamatórias, tais como eosinófilos.
Conclusão geral para o Exemplo 8a:
Esse estudo demonstrou claramente um papelprotetor de uma das moléculas da invenção, a de OM-197-MP-AC, no desenvolvimento de asma alérgica. Os tratamentos comOM-197-MP-AC, começando um pouco antes da fase desensibilização, inibiram o desenvolvimento de AHR, e diminuiubastante a eosinofilia das BAL. Além disso, as quantidades totaisde IgE foram diminuídas no soro de camundongos, que tinhamsido tratados com OM-197-MP-AC.
Os dados mostram que os tratamentos com OM-197-MP-AC prejudicaram principalmente o desenvolvimento dascitocinas envolvidas na asma, e a secreção de outras citocinasinflamatórias. Um possível mecanismo seria aquele no qual oOM-197-MP-AC pode induzir uma resposta imunossupressoraque controlaria o desenvolvimento de Th2 e a inflamação das viasaéreas subseqüentes.
Parte b) Tratamento "terapêutico" de asma
Protocolo:As diferenças principais comparadas com oprotocolo prévio Tparte a) são:
- camundongos tratados com OM-197-MP-ACi.p. apenas nos dias 15, 17 e 19 (isto é, pelo menos 1 semana apósa segunda sensibilização) na dose de 1 mg/kg (20 μg porcamundongo); e
- as citocinas no pulmão medidas por análisemultiplex usando ensaio FACS foram as IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γe IL-10.
Resultados:
Número total de células e eosinófílos nas BAT,:
Dois dias depois do último aerossol, oscamundongos foram sacrificados e as células das BAL colhidas.Como esperado, os camundongos sensibilizados com LACK nãotratados apresentaram um influxo massivo de células nas BALpor confrontos com LACK (20 vezes mais células, se comparadascom os camundongos confrontados com PBS) (Figura 8). Muitointeressantemente, o recrutamento de células BAL foi prejudicadopor 90%, mediante administrações terapêuticas com OM-197-MP-AC (p < 0,01) (Figura 9), com 40 - 45 vezes menoseosinófílos, comparados com os camundongos não tratados.
Conclusão:
O OM-197-MP-AC, proporcionado três vezesterapeuticamente, foi capaz de diminuir bastante a extravasãocelular e a eosinofilia em BAL.
Medidas de citocinas do pulmão:Uma vez que a eosonifilia das vias aéreas foiassim bastante reduzida por tratamento terapêutico com OM-197-MP-AC, buscou-se analisar os teores no pulmão de IL-4, IL-5,IL-13, IL-IO e IFN-γ (Figura 10). De fato, quando comparadoscom os pulmões de camundongos não tratados, as quantidades dascitocinas Th2: IL-4, IL-5 e IL-13, foram reduzidassignificativamente nos pulmões de camundongos tratados. Osníveis de IL-4 foram reduzidos por 90%, as quantidades de IL-13por 85% e as quantidades de IL-5 por 70% por tratamento comOM-197-MP-AC (de ρ < 0,00005 a 0,005).
Conclusão:
Claramente, OM-197-MP-AC, quandoproporcionado terapeuticamente apenas três vezes, foi capaz dediminuir o nível das citocinas Th2. Isso não foi devido a umdeslocamento no sentido da citocina Th 1, uma que os níveis deIFN-γ se mantiveram baixos (1,5 a 3 pg / mL) para todos oscamundongos e foi reduzido nos camundongos tratados. Asquantidades de IL-10, que é tanto um Th2 e um citocinaimunossupresora, foram baixas, e não aumentaramsignificativamente por tratamento.
Medida dos níveis de IgE:
Para caracterizar ainda mais o estado de imunede camundongos, após tratamento com OM-197-MP-AC,analisou-se IgE específico de LACK em soros de camundongostratados e naqueles de camundongos não tratados por ELISA.Enquanto que os níveis de IgE específico de LACK aumentaram7 vezes, por exposição aos aerossóis LACK, soros decamundongos tratados com OM-197-MP-AC continham 2 vezesmenos (p < 0,05) IgE específico de LACK, comparados com oscamundongos confrontados com LACK não tratados.
Conclusão:
Claramente, o OM-197-MP-AC, quandoproporcionado terapeuticamente, diminuiu os níveis de IgEespecífico de LACK.
Conclusão geral para o Exemplo 8b:
Demonstrou-se na presente invenção que oproduto da invenção, OM-197-MP-AC, quando proporcionadoterapeuticamente, diminuiu, claramente, a eosinofilia, bem comoo nível de citocinas Th2, tais como de IL-4, IL-5 e IL-13, etambém o nível do IgE específico de alérgeno.
Conclusão geral para o Exemplo 8:
Claramente, o OM-197-MP-AC foi ativo, tantopreventivamente quanto terapeuticamente, in vivo em um modelode asma, como julgado por seus efeitos em muitas leiturasrelevantes de asma.
EXEMPLO 9
Efeito de OM-197-MP-AC por outras rotas deadministração no modelo de murino de asma
Os resultados apresentados no Exemplo 8mostram que o OM-197-MP-AC é efetivo na prevenção derespostas alérgicas no modelo de asma de LACK de murino,quando administrado pela rota i.p. Outros modos deadministração, mais compatíveis com uso humano, foram,portanto, investigados nesse modelo (intranasal, intragástrico,subcutâneo).
Protocolo:
43 camundongos BALB/C ByJ de 6 semanas devida foram comprados do "Centre d'Elevage Janvier" (CERJ, LeGenest-St.Isle, França). Todos os camundongos foramsensibilizados por 2 injeções i.p. de 10 g de proteína LACKprecipitada em 2 mg de Alum (PerBio Science França SAS,Brebières, França) nos dias 1 e 8 (Julia et al., 2002).
O OM-197-MP-AC foi administrado do dia 0 aodia 12, como descrito abaixo. Todos os camundongos foramconfrontados do dia 16 ao dia 20, com uma solução de LACK(0,15%) ou com PBS, como indicado abaixo.
Os grupos experimentais foram os seguintes:
- Grupo A: camundongos confrontados comPBS e sensibilizados com LACK, não tratados (3 camundongos);
- Grupo B: camundongos confrontados esensibilizados com LACK, não tratados (7 camundongos);
- Grupo C: camundongos confrontados esensibilizados com LACK, tratados com OM-197-MP-AC i.p. (5camundongos);
- Grupo D: camundongos confrontados esensibilizados com LACK, tratados com OM-197-MP-AC i.g. (7camundongos);- Grupo Ε: camundongos confrontados esensibilizados com LACK, tratados com OM-197-MP-AC s.c. (7camundongos);
- Grupo F: camundongos confrontados esensibilizados com LACK, tratados com OM-197-MP-AC i.n. (7camundongos); e
- Grupo g: camundongos confrontados esensibilizados com LACK, tratados com OM-197-MP-AC emaerossóis (7 camundongos).
Os camundongos dos grupos C, D, E e G foramtratados nos dias: O, 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11, enquanto que oscamundongos do grupo F (rota intranasal) foram apenas tratadosnos dias 0, 4, 7 e 11.
Os camundongos dos grupos CeE foramtratados i.p. e s.c., respectivamente, com 1 mg/kg (20 μg porcamundongo) de OM-197-MP-AC.
Os camundongos do grupo D foram tratadosintragastricamente com 50 mg/kg (1 mg por camundongo) deOM-197-MP-AC.
Os camundongos do grupo F foram tratados i.n.com 20 μg de OM-197-MP-AC em um volume de 20 μΐ (OM-197-MP-AC a 2 mg/mL, 10 ^/narina).
Os camundongos do grupo G receberamaerossóis de uma solução de OM-197-MP-AC a 0,2% (2 mg/mL)por 10 minutos.
Reagentes:- A proteína recombinante LACK foi produzidaem E. coli e purificada como descrito (Mougneau et al., 1995).
- OM-197-MP-AC, batelada #050323, naconcentração de 2,2 mg/mL, e batelada #050322, na concentraçãode 2,17 mg/mL foram proporcionados pela OM PHARMA eusados para administração oral e todas as outras administrações,respectivamente.
- Anti-IgE (R35 - 118) acoplada a biotina foicomprada da BD Biosciences (Le Pont de Claix, França). Anti-IgE EM-95 mAbs foram um presente da DNAX (Paio Alto, CA, EUA).
- O tratamento intranasal foi conduzido apósleve anestesia dos camundongos usando isoflurano (Aerrane,Baxter).
Títulos de anticorpos:
Todos os camundongos foram sangrados porperfuração no coração, 2 dias depois do último aerossol. Os IgEtotais foram quantificados por ELISA usando EM-95 anti-IgEmAbs de rato, como anticorpo de revestimento, e anti-IgE mAbsde rato acoplado a biotina, como descrito em outro lugar (Julia etal., 2002).
Análise de células de lavagem broncoalveolar(BAL):
Os camundongos individuais foram sangrados euma cânula foi inserida nas suas traquéias. Os pulmões foramlavados 3 vezes com 1 mL de PBS aquecido. As células foramlavadas com PBS, ressuspensas em 300 \xL, e contadas usandouma câmara Burker-Türk. Para contagens de células BALdiferenciais, preparações de citospina foram feitas e manchadascom Wright / Glemsa.
Resultados:
a) Os respectivos números de neutrófilos,eosinófilos, linfócitos e outras células mononucleares foramdeterminados por exame microscópico e são indicados na Figura11 para cada rota de administração testada.
Como os inventores tinham indicadopreviamente no Exemplo 8, os camundongos tratados i.p. comOM-197-MP-AC apresentaram tanto percentual reduzido quantonúmeros reduzidos de eosinófilos em BAL. No entanto, oconteúdo das células BAL de camundongos tratados s.c e i.g. comOM-197-MP-AC não produziu diferenças com relação aoscamundongos não tratados. Em contraste, ambas as freqüências(não mostradas) e os números (Figura 11) de eosinófilos foramreduzidos à metade nas BAL dos camundongos, que tinhamrecebido i.n. OM-197-MP-AC. Além disso, os camundongostratados com aerossóis de OM-197-MP-AC apresentaram amesma tendência como nos animais tratados i.n..
Conclusão:
Pelo menos o OM-197-MP-AC foisignificativamente eficiente em ambas as rotas i.n. e intranasais,para diminuir significativamente nesse modelo o número deeosinófilos nas lavagens broncoalveolares de camundongossensibilizados a um alérgeno.
b) Depois, os níveis de IgE plasmático forammedidos como descrito na seção do processo. De acordo com osdados prévios da presente invenção (Exemplo 8), verificou-se queos camundongos, que tinham sido tratados i.p. com OM-197-MP-AC, apresentaram quantidades reduzidas de IgE (Figura 12).Além disso, os camundongos. que tinham recebido i.n. injeçõesde OM-197-MP-AC, também apresentaram títulos reduzidos deIgE no soro total. Em contraste, os camundongos tratados i.g., s.c.ou com aerossóis apresentaram quantidades similares de IgE nosoro total, comparados com os camundongos não tratados.
Conclusão:
OM-197-MP-AC administrado por rota i.p. ouintranasal diminuíram significativamente os níveis totais de IgEnesse modelo de asma.
EXEMPLO IQ
Maior efeito de OM-197-MP-AC formuladopela rota de administração oral em modelo de asma de murino
Os resultados apresentados no Exemplo 9mostram que o OM-197-MP-AC é ineficiente na prevenção derespostas alérgicas no modelo de asma LACK de murino, quandoadministrado não formulado por rota oral. Um ensaio deformulação para aumentar a atividade de OM-197-MP-AC porrota oral foi, portanto, investigado nesse modelo. Portanto, nesseestudo, investigou-se se o composto OM PHARMA triacilado,OM-197-MP-AC, vai proteger camundongos contra inflamaçãoalérgica nas vias aéreas, quando proporcionado como umaformulação resistente gastrointestinal (OM-197-MP-AC comLutrol® F 127, também conhecido como poloxâmero 407).
Protocolo:
A formulação de OM-197-MP-AC / Lutrol® F127 foi preparada por mistura de 12,875 mL de uma solução deOM-197-MP-AC a 4,35 mg/mL e 5,6 mL de Lutrol F 127 a 50mg/mL. O volume administrado foi de 330 μL.
Reagentes de equipamento:
- Solução salina administrada como aerossóis decontrole.
- Proteína LACK recombinante foi produzidaem E. coli e purificada em uma coluna de afinidade Ni-NTA.
- A citocentrífuga usada foi uma Cytospin 4(Thermo-Shandon, Checshire, Reino Unido), as citoslidas foramcompradas da Thermo-Shandon e as cepas Wright and Giemsa daSigma.
- Os aerossóis foram administrados por uso deum nebulizador de ultra-som Ultramed (Medicalia, Florença,Itália).
- IL-4 dispostas em contas CBA foramcompradas da BD Biosciences.
- O citômetro de fluxo FACSarray foi compradoda BD Biosciences.
Animais:- Os camundongos BALB/c ByJ de seissemanas de idade foram comprados da The Centre d'ElevageJanvier, França, e foram mantidos sob condições livres depatógenos específicas na instalação dos animais. Foramalimentados com uma dieta usual proporcionada pela Safe (Augy,França).
Protocolo:
15 camundongos BAL/c (incluindo oscamundongos para os grupos de controle AeB, tambémapresentados nos Exemplos 8 e 9) foram usados para esseexperimento.
A: camundongos confrontados com soluçãosalina e sensibilizados por LACK (3 camundongos)
B: camundongos confrontados e sensibilizadospor LACK (6 camundongos)
Tratamento profilático
F: camundongos confrontados e sensibilizadospor LACK, tratados (via oral) com OM-197-MP-AC (6camundongos)
Os camundongos do grupo F foram tratadosoralmente nos dias, O, 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11 com 1 mg de OM-197-MP-AC formulado.
Nos dias 1 e 8, os meio de distribuição foramsensibilizados i.p. com LACK / Alum. Do dia 16 ao dia 20, todosos grupos exceto o grupo de camundongos A foram confrontadoscom aerossóis de uma solução de LACK (0,15%). O grupo Arecebeu, em vez disso, uma solução salina (NaCl 0,9%) por 40minutos.
No dia 22, todos os camundongos foramsacrificados. Para todos os animais, BAL, e pulmões sem nóslinfáticos peribrônquicos foram colhidos.
As células BAL vão ser contadas e o conteúdodas células vai ser analisado após exame microscópico decitospinas, seguinte ao manchamento com Wright / Giemsa. Alémdisso, os pulmões de cada grupo foram colhidos e congelados emnitrogênio líquido para análise posterior de teor de citosinas. Parainvestigar o teor de citocinas, os extratos de proteínas forampreparados de pulmões de camundongos confrontados com PBS esensibilizados por LACK (grupo A), os camundongosconfrontados e sensibilizados por LACK (grupo B), e oscamundongos wt tratados com OM-197-MP-AC formulados(grupo F). A quantidade de IL-4 foi analisada por análisemultiplex usando ensaio FACS.
Resultados:
Os respectivos números de neutrófilos,eosinófilos, linfócitos e outras células mononucleares foramdeterminados por exame microscópico e estão indicados naFigura 13.
Em oposição aos resultados indicados noExemplo 8 (e na Figura 11), em que o conteúdo das células BALde camundongos foi tratado i.g. com OM-197-MP-AC (nãoformulado), quando o OM-197-MP-AC foi formulado comLutrol, o número de neutrófilos, eosinófilos (p < 0,05) e outrascélulas mononucleares foi reduzido à metade em BAL decamundongos, que tinham recebido OM-197-MP-AC (consultar aFigura 15).
Além do mais, as quantidades de IL-4 foramanalisadas nos pulmões de camundongos tratados e não tratados.
Enquanto isso, o conteúdo no pulmão de IL-4 foi muito baixopara ser detectado em animais confrontados com PB S, asquantidades de IL-4 aumentaram 20 vezes em camundongos decontrole não tratados confrontados com LACK. Mediantetratamento oral com OM-197-MP-AC formulado (consultar aFigura 14), as quantidades de IL-4 nos pulmões diminuiu por75% (p< 0,01).
Conclusão:
Quando formulado adequadamente, o OM-197-MP-AC oral foi capaz de diminuir significativamente nessemodelo o número de eosinófilos nas lavagens broncoalveolares demeio de distribuição sensibilizados a um alérgeno. Essadiminuição foi correlacionada com uma diminuição em IL-4.
EXEMPLO 11
Efeito de OM-197-MP-AC em camundongodiabético não obeso (TSTODn)
Até aqui, foram proporcionados exemplos daeficiência in vivo de OM-197-MP-AC apenas em um modelo deasma de murino. Nesse exemplo, vai-se proporcionar algumaevidência de que o OM-197-MP-AC é também ativo em outrapatologia inflamatória: diabete.
Protocolo:
Mostrou-se acima que o OM-197-MP-AC eoutras moléculas triaciladas diminuem a inflamação nas viasaéreas em animais asmáticos.
Nesse estudo, investigou-se se o OM-197-MP-AC vai ser capaz de induzir proteção em outro modelo de doençainflamatória de murino: o modelo de diabete NOD (DiabéticoNão Obeso).
Um grupo de 10 camundongos NOD de seissemanas de vida, fêmeas foi tratado durante 10 semanas com0,01, 0,1 e 1 mg/kg de OM-197-MP-AC. Um grupo de 6camundongos MOD fêmeas recebendo 200 μΐ, de PBS i.p. 3vezes por semana foi usado como controle.
Nessa série de experimentos, o tratamento foicontinuado até que os camundongos tivessem atingido 16semanas de idade. Esse é o ponto no tempo, quando os animais decontrole começam a desenvolver diabete aberta.
Os resultados em termos de incidência dediabete foram comparados àqueles obtidos no controle deanimais. A diabete foi checada uma vez por semana por teste deglicosúria, usando-se tiras de teste (Glukotest®, Roche, França),duas vezes por semana, quando do aparecimento da diabete. Adiabete foi confirmada por avaliação de glicemia (> 3 mg/mL)com tiras de teste (Glucotrende®).A ocorrência de diabete nos diferentes gruposexperimentais é plotada (consultar a Figura 15), por uso doprocesso de Kaplan - Meier, isto é, uma plotagem desobrevivência cumulativa não paramétrica. A comparaçãoestatística entre as curvas é feita por uso do teste logrank (Mantel-Cox), que proporciona os valores χ2 correspondentes. O OM-197-MP-AC, na dose de 1 mg/kg, foi significativamente ativo (p= 0,0321), e na dose de 0,1 mg/kg, o composto da invençãoapresentou uma tendência positiva (p = 0,0543).
Em outro experimento usando uma dose deOM-197-MP-AC de 0,3 mg/kg, os resultados obtidos na semana27 mostraram um valor ρ significativo de 0,0362. Na semana 27,82% dos animais foram verificados como sendo diabéticos nogrupo de controle e apenas 27% no grupo tratado com OM-197-MP-AC (0,3 mg/kg) apresentaram a doença.
EXEMPLO 13
Toxicologia: endotoxicidade LAL
A endotoxicidade foi determinada primeiro parapeptídio e para OM-294-DP pelo teste cromogênico de Lisado deAmoebócito Limulos (Cromogênico - LAL da Bio-Whitaker, kitn° 50-650U).
Protocolo:
Esse teste é baseado na ativação porlipopolissacarídeo (LPS) ou produtos de estrutura comparável,por uma cascata enzimática presente na LAL. Essa ativaçãoenzimática é demonstrada pela clivagem de um cromogênioligado a um peptídio por uma protease. A reação enzimática éconduzida a 37°Ce a formação do cromogênio com o tempo émedida a 405 nm. O tempo necessário para atingir 0,2 unidade deD.O. é registrado e a atividade endotóxica calculada em relação aum padrão LPS (curva padrão). Os resultados são expressos emEU (Unidade de Endotoxina) em relação a uma preparaçãopadronizada de E. coli LPS (1 EU corresponde a 0,08 ng de LPSequivalente).
Resultados:
Ambos o OM-197-MP-AC e o OM-294-DPmostraram muito pouca ou nenhuma atividade Limulus na ensaioLAL cromogênico.
Conclusão:
OM-197-MP-AC e OM-294-DP são muitofracamente endotóxicos (pelo menos IO6 menos), quandocomparados com LPS.
EXEMPLO 14
Toxicologia: pirogenicidade no coelho
Finalmente, OM-197-MP-AC e OM-294-DPforam testados para as suas pirogenicidades potenciais no coelho.
Protocolo:
3 coelhos brancos da Nova Zelândia / grupoforam injetados i.v. com OM-197-MP-AC ou OM-294-DP, emdiferentes doses (de acordo com a Farmacopéia Européia 2001,processo 2.6.8).Produtos: OM-197-MP-AC a 0,0009, 0,09, 0,9mg/kg e OM-294-DP a 0,001, 0,01, 0,1 e 1 mg/kg.
Animais: Leitura: aumento de temperatura
Resultados:
Ambos os compostos foram considerados nãopirogênicos in vivo, uma vez que o limiar pirogênico de OM-197-MP-AC não foi atingido na maior dose testada (0,9 mg/kg), e apirogenicidade de OM-294-DP foi apenas atingida entre 0,01 e0,1 mg/kg.
REFERÊNCIAS
ByI, B., Libin, M., Bauer, J., Martin, O. R., DeWit, D., Davies, G., Goldman, M., e Willems, F. (2003). OMl 97-MP-AC induces the maturation of human dendritic cells andpromotes a primary T cell response, Int Immunopharmacol 3,417-425. Julia, V., Hessel, E. M., Malherbe, L., Glaichenhaus, N,0'Garra, A., e Coffman, R. L. (2002). A restricted subset ofdendritic cells captures airborne antigens and remains able toactivate specific T cells Iong after antigen exposure. Immunity 16,271-283.
Mougneau, E., Altare, F., Wakil, A. E., Zheng,S., Copolla, T., Wang, Z.-E., Waldmann, R., Locksley, R., eGlaichenhaus, N. (1995). Expression cloning of a Leishmaniamajor protective T cell antigen. Science 268, 563-566.Veran, J., Mohty, M., Gaugler, B., Chiavaroli, Cl e Olive, D.(2004). OM-197-MP- AC adjuvant properties: the in vitromaturation of normal and leukemic dendritic cells in a serum-freeculture model, lmmunobiology 209, 67-77.
LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1: secreção de IL-12 (painéis esquerdos)e IL-IO (painéis direitos) por DC de murino estimulada por LPS(1 μg/mL) apenas, ou primeiro durante 90 minutos com asconcentrações indicadas (em μg/mL) de OM-197-MP-AC (A) ou294-DP (B), e depois por LPS (1 μg/mL) por mais 20 horas. Ossobrenadantes foram coletados das culturas de DC e analisadospor ELISA para a presença de IL-12 e IL-10.
Figura 2: Secreção de TNF-α por DC de murinoestimulada por LPS (1 μ^πΛ), ou primeiro durante 90 minutoscom as concentrações indicadas (em μg/mL) de 294-DP (294) oude OM-197-MP-AC (197), e depois por LPS (1 pg/mL) por mais20 horas. Os sobrenadantes foram coletados das culturas de DC eanalisados por ELISA para a presença de TNFoc.
Figura 3: Efeito de doses crescentes dos quatrocompostos testados (OM-197-MP-AC, η = 5, OM-197-MP-HD, η= 5, OM-197-BA-MP, η = 7, OM-197-MP-HD, η = 3) naprodução de IFN-γ e IL-13 de células T CD4+, seguinte a umaativação policlonal. Os resultados são expressos como a média (±p25 / p75) de η experimentos independentes, e mostram opercentual (%) de proliferação ou produção de citocina de célulastratadas versus células não tratadas (consideradas como 100%,consultar linha pontilhada). A análise estatística foi conduzida porum uso de um test t Mann - Whitney não emparelhado, nãoparamétrico (2 caudas).
Figura 4: AHR por pletismografia de corpointeiro (Emka) em resposta a concentrações crescentes (6 - 25mg/mL) de metacolina inalada, um dia depois do últimoconfronto com antígeno. Os animais foram tratados como descritona seção de protocolo. Os resultados ("valor de pausa acentuado"médio ± SEM) são mostrados para animais confrontados comsolução salina (como o grupo de controle negativo, η = 4),animais confrontados com LACK não tratados (como o grupo decontrole positivo, η = 8), e camundongos confrontados comLACK tratados com OM-197-MP-AC (n = 8).
Figura 5: Percentual de eosinófílos em lavagensbroncoalveolares analisadas por exame microscópico depreparações de citospina com coloração de Wright / Giemsa. Osgrupos estudados são os mesmos daqueles usados na Figura 4. Alinha pontilhada indica ao longo do gráfico o valor obtido emanimais asmáticos não tratados.
Figura 6: Todos os camundongos foram tratadoscomo descrito na seção de protocolo, e foram sangrados porperfuração no coração, um dia depois do último aerossol. IgEtotal foi quantificado por ELISA, usando EM-95 anti-IgE mAbscomo o anticorpo de revestimento e anti-IgE mAbs de ratoacoplados a biotina, como o segundo anticorpo, como descrito(Julia et al., 2002). Cada ponto corresponde a um único animalOs grupos estudados foram os mesmos que aqueles usados nasFiguras 4 e 5.
Figura 7: Extratos de proteína (400 μΐ.) forampreparados de pulmões esquerdos de camundongos wtconfrontados com PBS e sensibilizados por LACK (Controle),camundongos wt confrontados e sensibilizados por LACK(Asma), e camundongos wt tratados com OM-197-MP-AC (OM-197). Os teores de IL-4, IL-5 e IL-13 foram analisados por análisemultiplex usando ensaio FACS. Os resultados são apresentadosem pg / mL. As linhas pontilhadas indicam ao longo dos gráficosos valores obtidos em animais asmáticos não tratados.
Figura 8: Os camundongos foram tratadosterapeuticamente três vezes como descrito na seção do processo,as lavagens foram conduzidas em camundongos individuaissangrados com uma cânula inserida nas suas traquéias. Ospulmões foram lavados 3 vezes com 1 mL de PBS aquecido. Ascélulas foram lavadas com PBS, ressuspensas material granular300 μί, e contadas usando uma câmara Burker - Türk. Paracontagens de células BAL diferenciais, as preparações decitospina foram feitas e manchadas com coloração Wright /Giemsa. Os grupos testados foram: camundongos wt confrontadoscom PBS e sensibilizados por LACK (Controle), camundongoswt confrontados e sensibilizados por LACK (Asma), ecamundongos wt tratados com OM-197-MP-AC (OM-197). Onúmero total de células na BAL foi determinado por examemicroscópico de preparações de citospina manchadas comcoloração Wright / Giemsa. A linha pontilhada indica ao longo dográfico o valor obtido em animais asmáticos não tratados.
Figura 9: O percentual de eosinófilos em BALanalisadas por exame microscópico de preparações de citospinamanchadas com coloração Wright / Giemsa. Os camundongosforam tratados terapeuticamente três vezes como descrito naseção do processo, as células da BAL foram colhidas, comoexplicado na Figura 8. Os grupos (terapêuticos) estudados são osmesmos que aqueles usados na Figura 8. A linha pontilhada
indica ao longo do gráfico o valor obtido em animais asmáticosnão tratados.
Figura 10: Para analisar os teores de citocina nopulmão, os pulmões foram colhidos e os pulmões esquerdosforam usados para preparar os extratos de proteínas. 400 μΐforam recuperados para cada pulmão esquerdo. As citocinasforam medidas por análise multiplex usando ensaio FACS, e osresultados são apresentados em pg / mL. Os grupos (terapêuticos)estudados são os mesmos que aqueles usados nas Figuras 8 e 9. Alinha pontilhada indica ao longo do gráfico o valor obtido emanimais asmáticos não tratados.
Figura 11: Número de eosinófilos, neutrófilos elinfócitos em BAL de murino. As células foram obtidas e lavadascomo descrito na seção de protocolo. Para as contagens de célulasde BAL diferencial, as preparações de citospina foram feitas emanchadas com Wright / Giemsa. Pelo menos 400 células foramclassificadas para cada lâmina, e os números de eosinófilos,neutrófilos e linfócitos foram determinados por examemicroscópico. A linha pontilhada indica ao longo do gráfico ovalor obtido em animais asmáticos não tratados.
Figura 12: Medida de IgE específico dealérgeno em soros de murinos, que foram sangrados porperfuração no coração, dois dias depois do último aerossol, e ossoros foram preparados. A IgE específica de LACK foi medidapor ELISA. Os resultados (ng/mL) dos camundongos individuaissão registrados, o valor médio em cada grupo é representado poruma barra. * = P < 0,05. A linha pontilhada indica ao longo dográfico o valor obtido em animais asmáticos não tratados.
Figura 13: Número de eosinófilos, neutrófilos elinfócitos em BAL de murino. As células foram obtidas e lavadascomo descrito na seção do protocolo. Para as contagens de célulasde BAL diferencial, as preparações de citospina foram feitas emanchadas com Wright / Giemsa. Pelo menos 400 células foramclassificadas para cada lâmina, e os números de eosinófilos,neutrófilos, linfócitos e outras células (macrófagos, célulasdendríticas e pneumócitos) foram determinados por examemicroscópico. A linha pontilhada indica ao longo do gráfico ovalor obtido em animais asmáticos não tratados.
Figura 14: Para analisar os teores de citocinasno pulmão, os pulmões foram colhidos e os pulmões esquerdosforam usados para preparar os extratos de proteínas. 400 μΐforam recuperados para cada pulmão esquerdo. A IL-4 foi medidapor análise multiplex usando ensaio FACS, e os resultados sãoapresentados em pg / mL. Os 3 grupos testados foram descritos naseção do protocolo do Exemplo 10. A linha pontilhada indica aolongo do gráfico o valor obtido em animais asmáticos nãotratados.
Figura 15: Ocorrência de diabete emcamundongos NOD. Os camundongos foram tratados i.p. comPBS (6 animais) ou as 3 doses indicadas de OM-197-MP-AC (3grupos de 10 animais). A diabete foi checada uma vez por semanapor teste de glicosúria (Glucotest), e duas vezes por semana,quando a diabete apareceu. A diabete foi confirmada poravaliação de glicemia (> 3 mg/mL) com tiras de teste(Glucotrend®). A ocorrência de diabete nos diferentes gruposexperimentais é plotada (consultar a Figura 15) usando o processode Kaplan - Meier, isto é, a plotagem de sobrevivência cumulativanão paramétrica. A comparação estatística entre as curvas é feitausando o teste logrank (Mantel-Cox), que proporcionou osvalores χ2 correspondentes. OM-197-MP-AC 1 mg/kg, ρ = 0,321;0,1 mg/kg = 0,0543.
Claims (13)
1. Processo para o tratamento de animais desangue quente, incluindo seres humanos, sofrendo de uma doençarelativa a uma superprodução de citocinas inflamatórias,caracterizado pelo fato de que compreende a administração a umpaciente carente dele de uma quantidade adequada de umacomposição farmacêutica, que compreende pelo menos umcomposto imunomodulador da seguinte fórmula geral (I):<formula>formula see original document page 71</formula>na qual:- m e n, independentemente entre si, são umnúmero inteiro variando de 1 a 4;-X e Y designam cada um grupo no estadoneutro ou carregado, selecionado dos seguintes:* carboxila - -COOH;* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);* amino - -NH2;* hidroxila - -OH;* [amino (Ci - C10) alquil] aminocarbonila - -CO-NH(CH2)nl-NH2, com nx sendo um número inteiro de 1 a 10;* [dicarbóxi (C1 - C5) alquil] aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-COOH, com n, sendo um númerointeiro de 1 a 5;* {carbóxi[amino (C1 - C5) alquil]}aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)(CH2)nl-NH2, com Ii1sendo um número inteiro de 1 a 5;* [amino (C1 - C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com n1 sendo um número inteiro de 1 a 15;* hidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-OH, com nj sendo um número inteiro de 1 a 10;* carbóxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-COOH, com nj sendo um número inteiro de 1 a 10'* oxo (C1 - C5) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHO, com nj sendo um número inteiro de 1 a 5; e* [carbóxi (C1 - C10) alcanoil] amino (C1 - C15)alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH-CO-(CH2)n2-COOH, com n,sendo um número inteiro de 1 a 10, e n2 sendo um número inteirode Ia 15;- R1 e R2 designam cada um grupo aciladerivado de um ácido carboxílico de cadeia linear ou ramificada,saturado ou insaturado, tendo de 2 a 18 átomos de carbono, que énão substituído ou porta de uma a três substituintes, selecionadosentre hidroxila, diidroxifosforilóxi, alquila de 2 a 18 átomos decarbono, alcóxi de 2 a 18 átomos de carbono, acilóxi de 2 a 18átomos de carbono na parte acila, amino, e acilamino; e-C1C C*2, independentemente entre si, sãoátomos de carbono assimétricos na configuração R, S ou na formaracêmica RS,ou um sal, solvato ou isômerofarmaceuticamente aceitável deles, opcionalmente em conjugaçãoou mistura com um diluente ou transportador farmaceuticamenteaceitável, atóxico, inerte.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que:* X é selecionado dos seguintes grupos:* carboxila - -COOH;* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);* amino - -NH2;* [amino (C1-C10) alquil] aminocarbonila - -CO-NH(CH2)nl-NH2, com n, sendo um número inteiro de 1 a 10;* [dicarbóxi (C1 - C5) alquil] aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-COOH, com n, sendo um númerointeiro de 1 a 5;* {carbóxi [amino (C1 - C5) alquil]}aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)(CH2)nl-NH2, com Ji1sendo um número inteiro de 1 a 5; e* [amino (C1-C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com nj sendo um número inteiro de 1 a 15;* e Y é selecionado dos seguintes grupos:* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);* amino - -NH2;* hidroxila - -OH;* [amino (C1 - Ci5) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nI-NH2, com Π] sendo um número inteiro de 1 a 15;* diidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHOH-CH2OH, com sendo um número inteiro de 1 a 10;* hidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-OH, com nj sendo um número inteiro de 1 a 10;* carbóxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-COOH, com n1 sendo um número inteiro de 1 a 10;* oxo (C1 - C5) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHO, com nj sendo um número inteiro de 1 a 5; e* [carbóxi (C1 - C10) alcanoil] amino (C1 - C15)alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH-CO-(CH2)n2-COOH, com n,sendo um número inteiro de 1 a 10, e n2 sendo um número inteirode Ia 15.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou-2, caracterizado pelo fato de que:* X é selecionado dos seguintes grupos:* carboxila - -COOH;* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);* amino - -NH2;* [amino (C1 - C10) alquil] aminocarbonila - -CO-NH(CH2)nl-NH2, com U1 sendo um número inteiro de 1 a 6;* [dicarbóxi (C1 - C5) alquil] aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-COOH, com Ii1 sendo um númerointeiro de 1 a 5;* {carbóxi[amino (C1 - C5) alquil]}aminocarbonila - -CO-NH-CH(COOH)(CH2)nl-NH2, com Ii1sendo um número inteiro de 1 a 5; e* [amino (C1-C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com n1 sendo um número inteiro de 2 a 12;* e Y é selecionado dos seguintes grupos:* diidroxifosforilóxi - -O-P(O)(OH2);* hidroxissulfonilóxi - -O-SO2(OH);* amino - -NH2;* hídroxila - -OH;* [amino (C1-C15) alquil] alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH2, com n1 sendo um número inteiro de 2 a 12;* diidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHOH-CH2OH, com n1 sendo um número inteiro de 3 a7;* hidróxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-OH, com nj sendo um número inteiro de 2 a 6;* carbóxi (C1 - C10) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-COOH, com n\ sendo um número inteiro de 3 a 6;* oxo (C1 - C5) alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-CHO, com n, sendo um número inteiro de 2 a 5; e* [carbóxi (C1 - C10) alcanoil] amino (C1 - C15)alcanoilóxi - -O-CO-(CH2)nl-NH-CO-(CH2)n2-COOH, com n,sendo um número inteiro de 3 a 6, e n2 sendo um número inteirode 2 a 12.
4. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que:* X é selecionado dos seguintes grupos:* -COOH;* -O-P(O)(OH)2;* -O-SO2(OH);* -NH2;* -CO-NH-(CH2)3-NH2, ou -CONH-(CH2)6-NH2;* -CO-NH-CH(COOH)-CH2-COOH;* -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH2; e* -0-C0-(CH2)5-NH2,* e Y é selecionado dos seguintes grupos:* -O-P(O)(OH)2;* -O-SO2(OH);* -NH2;* -OH;* -O-CO-CH2-NH2 (2-aminoetanoilóxi), -O-CO-(CH2)2-NH2 (3- aminopropanoilóxi), -O-CO-(CH2)5-NH2 (6-aminiexanoilóxi), ou -O-CO-(CH2)11-NH2 (12-aminododecanoilóxi);-0-C0-(CH2)4-CH0H-CH20H (6,7 -diidroxieptanoilóxi);* -O-CO-(CH2)5-OH (6-hidroxiexanoilóxi);* -O-CO-(CH2)2-COOH (3-carboxipropanoilóxi);* -O-CO-(CH2)4-CHO (6-oxoexanoilóxi); e* -0-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-COOH (3-carboxipropanoilamino hexanoilóxi).
5. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que R1 e R2são selecionados entre:CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C120)C14);-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14);-CO-CH3, (C2);-C0-CH2-NH-C0-C*H[0-C0-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(C10O)C8]NC2);-C0-C*H[0-C0-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3,(2(C60)C8);-CO-(CH2)16-CH3, (Cl8);-CO-CH2-C *H[0-CH2-C6H5] -(CH2)10-CH3,(3 (BnO)C14); e-CO-CH2-C*H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3 ,(3 [(OH)2-P(O)OJC14).C* correspondendo a um átomo de carbonoassimétrico em configuração R, S ou na forma racêmica RS, nasfórmulas mencionadas acima.
6. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que:- R1 é selecionado entre:C0-CH2-C*H[0-C0-(CH2),o-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C120)C14);-CO-CH2-C*HOH-(CH2)ιO-CH3, (3(HO)C14);-CO-CH3, (C2);-C0-CH2-NH-C0-C*H[0-C0-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(CιOO)C8]NC2);-C0-C*H[0-C0-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3,(2(C60)C8); e-CO-(CH2)16-CH3, (Cl8),- R2 é selecionado entre:CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C120)C14);-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14);-C0-CH2-C*H[0-CH2-C6H5]-(CH2)1 Q-CH3,(3 (BnO)C14); e-CO-CH2-C *H[0-P(0)(0H)2]-(CH2) ] O-CH3 ,(3 [(OH)2-P(O)O] C14).C**i e c**2 correspondendo a átomos decarbono assimétricos em configuração R, S ou na forma racêmicaRS, nas fórmulas mencionadas acima.
7. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que ocomposto administrado tem a fórmula geral (II):<formula>formula see original document page 79</formula>na qual Χ, Y, R1, R2 e m são como definidosacima, C*1 está em uma configuração R, S ou é a forma racêmicaRS, e C* está na configuração R.
8. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que ocomposto administrado é entre aqueles de fórmula (II), em que:- X = -0-P(O)(OH)2, Y = -0-P(O)(OH)2, R1 = -CΟ-CΗ2,-C?**Η[Ο-CΟ-(CΗ2)10-^Ι-ίΟΗ^,ο-^, R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3, m = 2, C*1 está em configuração S,C*2 está em configuração R, C**1 e C**2 estão em configuraçãoR, isto é, (3S, 9R)-3-[(R)-3- dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoil amino]-decan-l, 10-diol(1 ,10)-bis-difosfato (OM-294-DP (S,R));- X = -O-P(O)(OH)2, Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH, R1 = -CO-CH2-C^1HtO-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3, m = 2, C*1está em configuração S, e C*2 está em configuração R, C**1 eC**2 estão em configuração R, isto é, (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-0X0-5-aza-9-[(R)3-hidróxitetradecanoil amino]-decan-l, 10-diol 1-difosfato 10-(6,7-diidroxieptanoato) (OM-197-MP-HD (S,R));-X = -COOH, Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH, Rl = -CO-CH2-C**1 H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, R2 = -CO-CH2-C* *2HOH-(CH2)ιO-CH3, m = 1 , C*1 está emconfiguração S, e C*2 está em configuração R, C**1 e C**2 estãoem configuração R, isto é, (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-decan-l , 10-diol 1-bifosfato 10-(6-aminoexanoato)(OM-197-MP-AC (S,R));- X = -NH2, Y = -O-P(O)(OH)2, R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3J-(CH2)10-CH3, R2 = -CO-CH2-C* *2HOH-(CH2)ιO-CH3, m = 4, C*1 está em configuração S, eC*2 está em configuração R, C**1 e C**2 estão em configuraçãoR, isto é, (5S,11 R)-1 - Amino-5 - [(R)-3 -dodecanoiloxitetradecanoilamino]-6-oxo-7-aza-11-[(R)-3-hidroxitetradecanoilaminoj-dodecan-12-ol 12-bifosfato (OM-294-BA-MP (S,R)).
9. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para otratamento de animais de sangue quente, incluindo sereshumanos, sofrendo de uma doença ou distúrbio relacionado a umasuperprodução de citocinas inflamatórias ou marcadores dedoenças inflamatórias por linfócitos T, monócitos ou célulasapresentadoras de antígenos ativados no organismo, em que ascitocinas inflamatórias ou os marcadores de doenças inflamatóriaspertencem ao grupo, que consiste de IL-Iβ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8,IL-9, IL-13, IFN-γ, TNF-cc, e MCP-I.
10. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a doençaé selecionada do grupo consistindo de asma, diabete, dermatiteatópica, rinite alérgica, prostatite, doença alérgica do intestino, eartrite reumatóide.
11. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que consistena administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva dequalquer composto de fórmula (I), como definido nasreivindicações de 1 a 8, em um transportador, excipiente ouformulação farmaceuticamente aceitável, por meio de uma rotamucosa ou parenteral.
12. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que consistena administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva deum composto de fórmula (I), como definido nas reivindicações de-1 a 8, por rotas peritoneal, subcutânea, oral, intranasal, sublingualou aerossol.
13. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que asdosagens necessárias das moléculas imunomoduladoras defórmula (I), como definidas nas reivindicações de 1 a 8, variam de-0,01 a 50 mg/m2 em seres humanos.
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