CN117750973A - 呼吸道病毒组合疫苗 - Google Patents
呼吸道病毒组合疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117750973A CN117750973A CN202280041649.0A CN202280041649A CN117750973A CN 117750973 A CN117750973 A CN 117750973A CN 202280041649 A CN202280041649 A CN 202280041649A CN 117750973 A CN117750973 A CN 117750973A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- mrna
- respiratory
- antigenic polypeptide
- combination vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 520
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 title claims abstract description 347
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 title claims description 190
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 178
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 99
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 384
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 373
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 372
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 369
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 342
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 342
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 341
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 286
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 241
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 241
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 237
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 192
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 170
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 167
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 155
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 134
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 129
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 127
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 100
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 88
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 81
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 77
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 66
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 57
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims description 56
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 claims description 45
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 claims description 37
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 34
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 32
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 29
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims description 28
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 26
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 25
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 24
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 24
- -1 amino lipid Chemical class 0.000 claims description 23
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 21
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 20
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 claims description 20
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 20
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 20
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 20
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 claims description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 20
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 20
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 19
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 claims description 17
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 17
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 claims description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 16
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 claims description 15
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims description 15
- 241000711904 Pneumoviridae Species 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 15
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 claims description 14
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 claims description 12
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 claims description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 12
- 241000893570 Hendra henipavirus Species 0.000 claims description 11
- 241000526636 Nipah henipavirus Species 0.000 claims description 11
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 10
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 claims description 10
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 9
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 6
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 claims description 5
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims description 4
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 claims description 4
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 claims description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims 2
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 abstract description 17
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 abstract description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 131
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 91
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 88
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 88
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 41
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 28
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 22
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 21
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 20
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 20
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 19
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 19
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 18
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 17
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 17
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 17
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 15
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 11
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 11
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 10
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 10
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 10
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 10
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 8
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 8
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 8
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 8
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 8
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 8
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 8
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 8
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 8
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 7
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 6
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 6
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 1-methylpseudouridine Natural products O=C1NC(=O)N(C)C=C1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical class NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 5
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 4
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 102100034235 ELAV-like protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 102100022823 Histone RNA hairpin-binding protein Human genes 0.000 description 4
- 101000825762 Homo sapiens Histone RNA hairpin-binding protein Proteins 0.000 description 4
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 4
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 4
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- UYEUUXMDVNYCAM-UHFFFAOYSA-N lumazine Chemical compound N1=CC=NC2=NC(O)=NC(O)=C21 UYEUUXMDVNYCAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol Chemical compound C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CC(O)CC1(C)CC2 KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800001779 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108020005176 AU Rich Elements Proteins 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 3
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 101000629313 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 2
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 108091093094 Glycol nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 description 2
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101150114197 TOP gene Proteins 0.000 description 2
- 108091046915 Threose nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 101710198378 Uncharacterized 10.8 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 2
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 125000001369 canonical nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000013639 protein trimer Substances 0.000 description 2
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- PDXQSLIBLQMPJS-FDDDBJFASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-(methoxymethyl)pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(COC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PDXQSLIBLQMPJS-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- OZNBTMLHSVZFLR-GWTDSMLYSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OZNBTMLHSVZFLR-GWTDSMLYSA-N 0.000 description 1
- 101710176159 32 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- IZFJAICCKKWWNM-JXOAFFINSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methoxypyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IZFJAICCKKWWNM-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- AMMRPAYSYYGRKP-BGZDPUMWSA-N 5-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1-ethylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)N(CC)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 AMMRPAYSYYGRKP-BGZDPUMWSA-N 0.000 description 1
- ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 5-methoxyuridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 5-methyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102100027573 ATP synthase subunit alpha, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101000787133 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 12.3 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000708563 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 9.0 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000351313 Aquaparamyxovirus Species 0.000 description 1
- 241000180579 Arca Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101000827603 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 10.2 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000765606 Bacillus subtilis (strain 168) FlaA locus uncharacterized protein YlxG Proteins 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 101000861181 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) Uncharacterized protein H16_B0148 Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 101710082494 DNA protection during starvation protein Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000016662 ELAV Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010053101 ELAV Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150029742 HE gene Proteins 0.000 description 1
- 108700004031 HN Proteins 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000035314 Henipavirus Species 0.000 description 1
- 101000936262 Homo sapiens ATP synthase subunit alpha, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 101000926057 Human herpesvirus 2 (strain G) Envelope glycoprotein C Proteins 0.000 description 1
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 101000977786 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 9.7 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 102000004364 Myogenin Human genes 0.000 description 1
- 108010056785 Myogenin Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000982623 Quaranjavirus Species 0.000 description 1
- 108020005073 RNA Cap Analogs Proteins 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241001113283 Respirovirus Species 0.000 description 1
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001113905 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P4 Proteins 0.000 description 1
- 241000711897 Rinderpest morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241001533467 Rubulavirus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 108010055591 SARS coronavirus 3C-like protease Proteins 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101000667983 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101001024647 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710147732 Small envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101800000904 Spike protein S1 Proteins 0.000 description 1
- 101800000905 Spike protein S2 Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 1
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108010007780 U7 Small Nuclear Ribonucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091026823 U7 small nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000024716 acute asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N beta-D-ribose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940017687 beta-d-ribose Drugs 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000008773 effect on children Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 150000002211 flavins Chemical class 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 238000002873 global sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000007479 persistent immune response Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000011506 response to oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000013175 transesophageal echocardiography Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000008478 viral entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本公开提供了针对呼吸道病毒的组合mRNA疫苗，以及使用所述疫苗的方法。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2021年4月13日提交的美国临时申请号63/174,463、2021年4月14日提交的美国临时申请号63/175,011、2021年9月8日提交的美国临时申请号63/241,959和2022年3月21日提交的美国临时申请号63/322,121的权益，所述临时申请各自以引用的方式整体并入本文。
对作为文本文件提交的序列表的引用
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2022年4月12日，名称为M137870177WO00-SEQ-JXV且大小为2,186字节。
背景技术
呼吸道疾病是涵盖影响使高等生物体能进行气体交换的器官和组织的病理状况的医学术语，并且包括上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜和胸膜腔以及呼吸神经和肌肉的状况。呼吸道疾病的范围为从轻微的自限性实体(诸如普通感冒)到危及生命的实体(诸如细菌性肺炎、肺栓塞、急性哮喘和肺癌)。呼吸道疾病是世界各地常见且重要的疾病和死亡原因。在美国，每年大约有10亿例“普通感冒”发生。呼吸道疾病是儿童住院最常见的原因之一。
季节性流感是一种由流感病毒(甲型流感病毒和乙型流感病毒，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员)引起的急性呼吸道感染，在世界各地流行。季节性流感的特征是突然发烧、咳嗽(通常是干咳)、头痛、肌肉和关节疼痛、严重不适(感觉不舒服)、喉咙痛和流鼻涕。在工业化国家，大多数与流感相关的死亡发生在65岁或以上的群体中。流行病可能导致工人/学校缺勤率高和生产力损失。在疾病高峰期，诊所和医院可能会不堪重负。季节性流感流行对发展中国家的影响尚不完全清楚，但研究估计，流感相关下呼吸道感染导致的5岁以下儿童死亡中有99％发生在发展中国家。
人冠状病毒是冠状病毒科(Coronaviridae)的具有高度传染性的包膜正义单链RNA病毒。已知冠状病毒科的两个亚科会引起人类疾病。影响最大的是乙型冠状病毒(β-coronaviruses，betacoronaviruses)。乙型冠状病毒是轻度至中度上呼吸道感染的常见病原体。然而，新型冠状病毒感染的爆发已与高死亡率死亡人数相关。这种最近发现的冠状病毒，称为严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)(以前称为“2019新型冠状病毒”或“2019-nCoV”)，已迅速感染数百万人。SARS-CoV-2病毒所引起的大流行疾病已被世界卫生组织(WHO)命名为COVID-19(2019冠状病毒病)。中国疾病预防控制中心的研究人员于2020年1月10日在英国论坛Virological上发布了SARS-CoV-2分离株(USA-WA1/2020分离株)的第一个基因组序列用于分析和解释病毒分子进化和流行病学。该序列随后于2020年1月12日存入GenBank，Genbank登录号为MN908947.1。随后，鉴定出了多种SARS-CoV-2毒株变体，其中一些比SARS-CoV-2分离株更具传染性。
呼吸道合胞病毒(RSV)是一种负义单链RNA病毒。成人的症状通常类似于鼻窦感染或普通感冒，尽管感染可能无症状。在老年人(例如，>60岁)中，RSV感染可能进展为细支气管炎或肺炎。儿童的症状通常更严重，包括细支气管炎和肺炎。据估计，在美国，大多数儿童在三岁时感染RSV。RSV病毒体由包含与核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)结合的病毒RNA的内部核衣壳组成。核衣壳被基质蛋白(M)包围并且由脂质双层囊封，脂质双层中合并有病毒融合(F)蛋白和附着(G)蛋白以及小疏水蛋白(SH)。病毒基因组还编码两种非结构蛋白(NS1和NS2)，它们抑制I型干扰素活性以及M-2蛋白。
与诸如流感、冠状病毒和RSV等呼吸道病毒相关的持续性健康问题受到国际社会的关注，加强了开发针对这些病毒的有效且安全的疫苗候选物的重要性。
发明内容
在一些方面，本公开提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；以及脂质纳米颗粒。
本公开的另一方面提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；以及脂质纳米颗粒。
本公开的再一方面提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；以及脂质纳米颗粒。
在一些方面，本公开在一些方面提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；包含编码来自第六病毒的第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第六mRNA多核苷酸；以及脂质纳米颗粒。
本公开的另一方面提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；包含编码来自第六病毒的第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第六mRNA多核苷酸；包含编码来自第七病毒的第七呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第七mRNA多核苷酸；以及脂质纳米颗粒。
本公开的再一方面提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；包含编码来自第六病毒的第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第六mRNA多核苷酸；包含编码来自第七病毒的第七呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第七mRNA多核苷酸；包含编码来自第八病毒的第八呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第八mRNA多核苷酸；以及脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒来自流感病毒科正粘病毒科。在一些实施方案中，所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒选自甲型流感病毒和乙型流感病毒。
在一些实施方案中，所述第五病毒和所述第六病毒来自病毒科冠状病毒科。在一些实施方案中，所述第五病毒和所述第六病毒来自正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)。在一些实施方案中，所述第五病毒和所述第六病毒是冠状病毒。
在一些实施方案中，所述第七病毒和所述第八病毒是非流感非冠状病毒呼吸道病毒。在一些实施方案中，所述第七病毒和所述第八病毒来自病毒科副粘病毒科(Paramyxoviridae)。在一些实施方案中，所述第七病毒和所述第八病毒来自病毒亚科肺病毒亚科(Pneumovirinae)。在一些实施方案中，所述第七病毒和所述第八病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)并且/或者其中所述第七病毒和所述第八病毒来自人偏肺病毒(hMPV)。
在一些实施方案中，所述第七病毒和所述第八病毒来自副粘病毒(Paramyxovirus)属或亚科。在一些实施方案中，所述第七病毒和所述第八病毒是副流感病毒。在一些实施方案中，所述第七病毒和所述第八病毒来自麻疹病毒(Morbillivirus)属或亚科。
在一些实施方案中，所述第二病毒和所述第三病毒彼此不同并且与所述流感病毒不同。
在一些实施方案中，所述第二病毒是选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
在一些实施方案中，所述第三病毒选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1病毒组成的组。
在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型流感病毒。在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒。
在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是细胞表面糖蛋白。在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是血凝素抗原(HA)或神经氨酸酶抗原(NA)。
在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型冠状病毒。在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自SARS-CoV。在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自HCoV。
在一些实施方案中，所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中，所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自人偏肺病毒(hMPV)。在一些实施方案中，所述第三呼吸道病毒抗原性多肽选自副流感病毒、鼻病毒、亨德拉病毒或尼帕病毒。
在一些实施方案中，所述疫苗包含至少2个包含编码流感病毒抗原的ORF的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含2-4个包含编码流感病毒抗原的ORF的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述疫苗包含至少2个包含编码来自第二病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述疫苗包含至少2个包含编码来自第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述疫苗包含少于15个mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含3-10个mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含4-10个mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含5-10个mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含8-9个mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含至少三个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述疫苗包含至少四个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含至少八个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述疫苗包含至少两个编码冠状病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸和至少两个编码副粘病毒科抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸以1:1:1的比例存在于所述组合疫苗中。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为4:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为3:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为5:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为4:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为1:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为1:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为8:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述第一病毒的所述呼吸道病毒抗原性多肽包含比例为4:4的HA和NA。
在一些实施方案中，所述组合疫苗中的所述mRNA多核苷酸中的每一者与所述组合疫苗中的每个其他mRNA多核苷酸互补且不对其进行干扰。
在一些实施方案中，所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者源自天然存在的抗原。在一些实施方案中，所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者是天然存在的抗原的稳定型式。在一些实施方案中，所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者是非天然存在的抗原。
在一些实施方案中，所述疫苗还包含编码结构改变的变体呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸，其中所述结构改变的变体是所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中的任一者的结构改变的变体。
在一些实施方案中，所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸中的至少一者是多顺反子性的。在一些实施方案中，所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸中的每一者是多顺反子性的。
在一些方面，本公开提供了一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含：包含编码来自第一病毒的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；其中所述多价RNA组合物包含大于40％的多聚A加尾的RNA，并且/或者所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和/或所述第三mRNA多核苷酸各自的长度彼此相差至少100个核苷酸。
在一些实施方案中，所述组合物通过包括以下的方法产生：(a)将编码所述第一mRNA多核苷酸的线性化第一DNA分子、编码所述第二mRNA多核苷酸的线性化第二DNA分子和编码所述第三mRNA多核苷酸的线性化第三DNA分子合并到单个反应器皿中，其中所述第一DNA分子、所述第二DNA分子和所述第三DNA分子获自不同来源；以及(b)同时体外转录所述线性化第一DNA分子、所述线性化第二DNA分子和所述线性化第三DNA分子，以获得多价RNA组合物。
在一些实施方案中，不同来源是第一、第二和第三细菌细胞培养物，并且其中第一、第二和第三细菌细胞培养物不是共同培养的。
在一些实施方案中，在所述IVT开始之前在反应混合物中存在的所述第一DNA分子、所述第二DNA分子和所述第三DNA分子的量已经归一化。
在一些实施方案中，所述第一病毒来自病毒科正粘病毒科流感病毒。在一些实施方案中，所述第一病毒是流感病毒。在一些实施方案中，所述第二病毒来自病毒科冠状病毒科。
在一些实施方案中，所述第二病毒来自正冠状病毒亚科。在一些实施方案中，所述第二病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，所述第二病毒是选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
在一些实施方案中，所述第三病毒来自病毒科副粘病毒科。在一些实施方案中，所述第三病毒来自病毒亚科肺病毒亚科。在一些实施方案中，所述第三病毒来自副粘病毒属或亚科。在一些实施方案中，所述第三病毒来自麻疹病毒属或亚科。在一些实施方案中，所述第三病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)和/或副流感病毒。在一些实施方案中，所述第三病毒选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1病毒组成的组。
在一些方面，本公开提供了一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含2-15个mRNA多核苷酸，所述mRNA多核苷酸各自包含编码呼吸道病毒抗原性多肽的不同开放阅读框(ORF)，其中每个mRNA多核苷酸在非翻译区(UTR)，任选地5’UTR或3’UTR中包含一个或多个非编码序列。
在一些实施方案中，所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的上游。在一些实施方案中，所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的下游。在一些实施方案中，所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的ORF的最后一个密码子与所述mRNA的多聚A尾的第一个“A”之间。在一些实施方案中，所述非编码序列包含1至10个核苷酸。在一些实施方案中，所述非编码序列包含一个或多个RNA酶裂解位点。在一些实施方案中，所述RNA酶裂解位点是RNA酶H裂解位点。
在一些实施方案中，至少一种呼吸道病毒抗原性多肽来自病毒科正粘病毒科流感病毒。在一些实施方案中，所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种呼吸道病毒抗原性多肽来自病毒科冠状病毒科，任选地是正冠状病毒亚科。在一些实施方案中，所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是冠状病毒抗原。在一些实施方案中，所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是选自由以下组成的组的冠状病毒抗原：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
在一些实施方案中，至少一种呼吸道病毒抗原性多肽来自病毒科副粘病毒科，任选地来自病毒亚科肺病毒亚科、副粘病毒或麻疹病毒。
在一些实施方案中，所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)和/或副流感病毒。在一些实施方案中，所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1组成的组。
在一些方面，本公开提供了一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含：包含编码来自第一病毒的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者源自天然存在的抗原或天然存在的抗原的稳定型式，并且所述多价RNA组合物还包含编码结构改变的变体呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸，其中所述结构改变的变体是所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中任一者的结构改变的变体。
在一些实施方案中，所述第二病毒和所述第三病毒彼此不同并且与所述流感病毒不同。在一些实施方案中，所述第一病毒是流感病毒。
在一些实施方案中，所述第二病毒是选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
在一些实施方案中，所述第三病毒选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV组成的组。
在一些实施方案中，所述结构改变的变体是所述第一呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体。在一些实施方案中，所述结构改变的变体是所述第二呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体。在一些实施方案中，所述结构改变的变体是所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体。
在一些方面，本公开提供了一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含5至15个信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸各自包含编码不同呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽源自三个不同的病毒科；以及脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述三个病毒科包括流感病毒、冠状病毒和副粘病毒科。
在一些实施方案中，所述组合物具有3-6个包含编码流感抗原的ORF的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物具有1-5个包含编码冠状病毒抗原的ORF的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物具有1-4个包含编码源自hMPV、PIV3、RSV和/或MEV的抗原的ORF的mRNA多核苷酸。
本公开的另一方面提供了一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含一组至少6个信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸各自包含编码来自第一病毒、第二病毒或第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)；其中所述组合物包含比例为4:1:1、4:2:2、4:2:1、4:3:2、4:3:3、4:3:2或4:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸以1:1:1的比例存在于所述组合疫苗中。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为4:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为3:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为5:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为4:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为1:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为1:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为8:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述抗原性多肽包括融合(F)蛋白、刺突(S)蛋白和血凝素抗原(HA)。
在一些实施方案中，所述多价组合物还包含至少一个脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，所述LNP包含摩尔比为20％-60％的可电离氨基脂质、5％-25％的非阳离子脂质、25％-55％的甾醇和0.5％-15％的PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，所述可电离氨基脂质包含化合物1的结构：
在一些实施方案中，所述抗原性多肽包括细胞表面糖蛋白。
在一些方面，本公开提供了一种用于对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括：向所述受试者施用组合疫苗，其中所述组合疫苗包含有包含编码来自第一病毒的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；其中第一病毒科、第二病毒科和第三病毒科各自彼此不同。
在一些实施方案中，所述受试者年龄为65岁或以上。在一些实施方案中，所述受试者未满18岁。在一些实施方案中，所述方法预防所述受试者的呼吸道感染。在一些实施方案中，所述方法减轻所述受试者的呼吸道感染的严重程度。
在一些实施方案中，所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阴性的。在一些实施方案中，所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阴性的。在一些实施方案中，所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阳性的。在一些实施方案中，所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阳性的。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用加强疫苗。在一些实施方案中，所述加强疫苗在所述组合疫苗后3周至1年之间施用。
在一些实施方案中，所述加强疫苗包含至少一个包含编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述加强疫苗包含至少一个包含编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽和所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中每一者的ORF的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述加强疫苗包含至少一个包含编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体的ORF的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，所述组合疫苗是季节性加强疫苗。
在一些实施方案中，所述组合疫苗是本文所述的任何疫苗。
在进一步的方面，本公开提供了一种预防呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度的方法，所述方法是通过基于单剂量或单剂量加上加强剂向受试者施用有效量的本文所述的疫苗以预防所述受试者的呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度来实现的。
在一些实施方案中，将所述组合疫苗以50μg的剂量施用于所述受试者。
本公开的另一方面提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是来自流感病毒科正粘病毒科的流感病毒抗原；和包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽是来自病毒科副粘病毒科的抗原；以及脂质纳米颗粒。
在另一方面，本公开提供了一种组合疫苗，所述组合疫苗包含：包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是来自病毒科冠状病毒科的冠状病毒抗原；和包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽是来自病毒科副粘病毒科的抗原；以及脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述组合疫苗还包含有包含编码第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三、第四、第五和第六病毒mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒和乙型流感病毒。在一些实施方案中，所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒科。在一些实施方案中，所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自正冠状病毒亚科。在一些实施方案中，所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒。在一些实施方案中，所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自非流感非冠状病毒呼吸道病毒。在一些实施方案中，所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒科。在一些实施方案中，所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自肺病毒亚科。
在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒和乙型流感病毒。在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒科。在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自正冠状病毒亚科。在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒。
在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒科。在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自肺病毒亚科。在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自呼吸道合胞病毒(RSV)和/或来自人偏肺病毒(hMPV)。在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒属或亚科。在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自副流感病毒。在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自麻疹病毒属或亚科。
在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
在一些实施方案中，所述第二呼吸道病毒抗原性多肽选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1病毒组成的组。
在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型流感病毒。在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒。在一些实施方案中，所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是血凝素抗原(HA)或神经氨酸酶抗原(NA)。
在一些实施方案中，所述疫苗包含大于40％的多聚A加尾的RNA，并且/或者所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和/或所述第三mRNA多核苷酸各自的长度彼此相差至少100个核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的组合物通过包括以下的方法产生：(a)将编码所述第一mRNA多核苷酸的线性化第一DNA分子和编码所述第二mRNA多核苷酸的线性化第二DNA分子合并到单个反应器皿中，其中所述第一DNA分子和所述第二DNA分子获自不同来源；以及(b)同时体外转录所述线性化第一DNA分子和所述线性化第二DNA分子，以获得多价RNA组合物。
在一些实施方案中，在所述IVT开始之前在反应混合物中存在的所述第一DNA分子和所述第二DNA分子的量已经归一化。
在一些实施方案中，所述mRNA多核苷酸各自在非翻译区(UTR)，任选地5’UTR或3’UTR中包含一个或多个非编码序列。在一些实施方案中，所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的上游。在一些实施方案中，所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的下游。在一些实施方案中，所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的ORF的最后一个密码子与所述mRNA的多聚A尾的第一个“A”之间。
在一些实施方案中，所述非编码序列包含1至10个核苷酸。
在一些实施方案中，所述非编码序列包含一个或多个RNA酶裂解位点。在一些实施方案中，所述RNA酶裂解位点是RNA酶H裂解位点。
在一些实施方案中，所述LNP包含摩尔比为20％-60％的可电离氨基脂质、5％-25％的非阳离子脂质、25％-55％的甾醇和0.5％-15％的PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，所述可电离氨基脂质包含化合物1的结构：
在一些实施方案中，所述抗原性多肽包括细胞表面糖蛋白。
在另一方面，本公开提供了一种用于对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的任何组合疫苗。
在一些实施方案中，所述受试者年龄为65岁或以上。在一些实施方案中，所述受试者未满18岁。
在一些实施方案中，所述方法预防所述受试者的呼吸道感染。在一些实施方案中，所述方法减轻所述受试者的呼吸道感染的严重程度。
在一些实施方案中，所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阴性的。在一些实施方案中，所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阴性的。在一些实施方案中，所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阳性的。在一些实施方案中，所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阳性的。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括施用加强疫苗。在一些实施方案中，所述加强疫苗在所述组合疫苗后3周至1年之间施用。
在一些实施方案中，本公开提供了一种预防呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度的方法，所述方法是通过基于单剂量或单剂量加上加强剂向受试者施用有效量的本文所述的组合疫苗以预防所述受试者的呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度来实现的。
在一些实施方案中，将所述组合疫苗以50μg的剂量施用于所述受试者。
在一些实施方案中，所述疫苗的各RNA多核苷酸配制在单独的LNP中。在一些实施方案中，所述疫苗的所述RNA多核苷酸共同配制在LNP中。
附图说明
图1是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种HA抗原中的每一者的血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度。
图2是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种NA抗原中的每一者的NA反应性IgG抗体滴度。
图3是显示了在指示制剂的一次剂量后21天SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表。
图4是显示了在指示制剂的一次剂量后21天RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表。
图5是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(高剂量)。
图6是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图7是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图8A至图8B是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(图8A)和在指示制剂的一次剂量后21天针对四种NA抗原中的每一者的归一化神经氨酸酶(NA)反应性IgG抗体滴度(图8B)(高剂量)。
图9是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图10是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图11是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(低剂量)。
图12是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图13是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图14A至图14B是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(图14A)和在指示制剂的一次剂量后21天针对四种NA抗原中的每一者的归一化神经氨酸酶(NA)反应性IgG抗体滴度(图14B)(低剂量)。
图15是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图16是显示了在指示制剂的一次剂量后21天归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图17是一系列图表，显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(高剂量)。
图18是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图19是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图20A至图20B是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(图20A)和指示制剂在第36天(第2次剂量后)的针对四种NA抗原中的每一者的归一化神经氨酸酶(NA)反应性IgG抗体滴度(图20B)(高剂量)。
图21是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图22是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(高剂量)。
图23是一系列图表，显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(低剂量)。
图24是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图25是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图26A至图26B是一系列图表，显示了在指示制剂的一次剂量后21天针对四种HA抗原中的每一者的归一化血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度(图26A)和指示制剂在第36天(第2次剂量后)的针对四种NA抗原中的每一者的归一化神经氨酸酶(NA)反应性IgG抗体滴度(图26B)(低剂量)。
图27是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图28是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的归一化SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表(低剂量)。
图29是一系列图表，显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的针对四种HA抗原中的每一者的血凝素(HA)反应性IgG抗体滴度。
图30是一系列图表，显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的针对四种NA抗原中的每一者的NA反应性IgG抗体滴度。
图31是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表。
图32是显示了指示制剂在第36天(第2次剂量后)的RSV前融合F特异性IgG抗体滴度的图表。
图33A至图33B是一系列图表，显示了指示试剂在第28天(第1次剂量后)和第56天(第2次剂量后)的RSV前融合F特异性IgG抗体滴度(图33A)和RSV后融合F特异性IgG抗体滴度(图33B)。
图34是显示了指示制剂在第28天(第1次剂量后)和第56天(第2次剂量后)的针对四种HA抗原中的每一者的血凝素(HA)特异性IgG抗体滴度的图表。
图35是显示了与PBS相比组合疫苗在第28天(第1次剂量后)和第56天(第2次剂量后)的SARS-CoV-2S2P特异性IgG抗体滴度的图表。
图36是显示了接种指示制剂疫苗后第56天产生的RSV中和抗体滴度水平的图表。
图37A至图37B是显示了接种指示制剂后第61天产生的肺病毒滴度(图37A，代表下呼吸道)和鼻病毒滴度(图37B，代表上呼吸道)的图表。
具体实施方式
呼吸道病毒是人类最常见的疾病病原体，对全世界的发病率和死亡率有重大影响。来自几个病毒科的某些呼吸道病原体非常适合有效的人际传播，从而导致全球流行。以社区为基础的研究证实，这些病毒是急性呼吸道感染最普遍的病原体。对于大多数这些病毒，目前还没有有效的疫苗和抗病毒药物。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了组合疫苗，所述组合疫苗包含编码来自至少三种不同呼吸道病毒的至少三种呼吸道抗原性多肽的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，这三种不同的病毒来自正粘病毒科、冠状病毒科(任选地，正冠状病毒亚科)和副粘病毒科(任选地，肺病毒亚科)。在一些实施方案中，呼吸道抗原性多肽来自甲型流感病毒属、乙型流感病毒属、乙型冠状病毒属、副粘病毒属、麻疹病毒属、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)和/或副流感病毒。
由于合成、配制和递送的限制，组合RNA疫苗的制造一直具有挑战性。本文公开了在脂质纳米颗粒载体中的编码呼吸道抗原的两种或更多种RNA多核苷酸的组合。本文公开了用于成功地产生编码抗原的RNA多核苷酸的功能性组合以产生高效组合疫苗的方法。组合疫苗的一个局限性涉及抗原之间的干扰，以致不能针对疫苗中的所有抗原产生完整且强有力的免疫应答。已经证明，可以产生编码多种抗原(即，8-10种抗原)的组合疫苗，并且这些组合疫苗仍然产生完整的免疫应答。在一些实施方案中，所述组合疫苗中的所述mRNA多核苷酸中的每一者与所述组合疫苗中的每个其他mRNA多核苷酸互补且不对其进行干扰。因此，施用组合疫苗产生的抗原不会干扰彼此的免疫应答。如实施例中描述的数据所示，令人惊奇的是，施用包含编码来自正粘病毒科(例如，流感抗原)、副粘病毒科(例如，RSV)和冠状病毒科(例如，SARS-CoV-2)的抗原的mRNA多核苷酸的组合疫苗与单独施用编码各单一抗原的mRNA相比并没有抑制或降低各对应抗原的中和抗体滴度。
本文还提供了施用疫苗的方法、生产疫苗的方法、包含疫苗的组合物和编码疫苗的核酸。如本文所述，本文所述的疫苗可用于诱导平衡的免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫，而没有与DNA疫苗接种相关的许多风险。这样的疫苗，在本文中任选地称为多价疫苗或组合疫苗，可施用于血清阳性或血清阴性受试者。例如，受试者可能是原初的并且不具有与疫苗的至少一种呼吸道病毒抗原性多肽反应的抗体，或者因为先前曾感染过呼吸道病毒或先前可能已施用过一定剂量的诱导针对呼吸道病毒的抗体的疫苗(例如，mRNA疫苗)而可能具有针对疫苗的至少一种呼吸道病毒抗原的预先存在的抗体。在一些实施方案中，受试者可能具有针对疫苗的所有呼吸道病毒抗原的预先存在的抗体。
抗原
如本文所用，抗原是能够诱导免疫应答(例如，导致免疫系统产生针对抗原的抗体)的蛋白质。本公开的疫苗提供优于传统的基于蛋白质的疫苗接种方法的独特优势，在传统的基于蛋白质的疫苗接种方法中蛋白质抗原是在体外纯化或生产的，例如重组蛋白质生产技术。本公开的疫苗的特征在于编码所需抗原的mRNA，当将其引入体内时，即在体内施用于哺乳动物受试者(例如人)时，导致身体的细胞表达所需抗原。本公开的疫苗的特征在于编码所需病毒表面抗原(例如糖蛋白抗原)的mRNA，当将其引入体内时，即在体内施用于哺乳动物受试者(例如人)时，导致身体的细胞以天然折叠方式表达所需的肽，任选地以人糖基化模式表达所需的肽。因此，编码来自一系列病原性病毒的病毒表面抗原的组合疫苗均以与实际感染期间产生的相同方式呈递正确折叠的和任选糖基化的病毒抗原。因此，mRNA疫苗由此提供了制造呼吸道病毒疫苗的最佳媒介物，无需使用减毒病毒即可生产，但没有相关风险。为了促进本公开的mRNA递送至身体细胞，将mRNA封装在脂质纳米颗粒(LNP)中。在递送和被身体细胞摄取后，mRNA在胞质溶胶中被翻译，并且蛋白质或糖蛋白抗原被宿主细胞机器折叠和加工。蛋白质和/或糖蛋白抗原被呈递并引发适应性体液和细胞免疫应答。中和抗体针对表达的病毒受体结合蛋白和糖蛋白抗原，因此这些病毒蛋白抗原被认为是疫苗开发中最相关的靶抗原。简而来说，中和抗体通常针对病毒表面蛋白，例如糖蛋白，其负责与细胞结合，并且当被特异性抗体阻断时，病毒被中和。在本文中，除非另有说明，否则术语“抗原”的使用涵盖免疫原性病毒表面蛋白(例如糖蛋白)和免疫原性片段(诱导(或能够诱导)针对(至少一种)呼吸道病毒的免疫应答的免疫原性片段)。在一些实施方案中，抗原是天然存在的抗原(例如，呼吸道病毒抗原性多肽编码天然存在的抗原)。在一些实施方案中，至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是用于组合疫苗中的蛋白质或糖蛋白抗原的工程化型式或非天然存在的抗原。在一些实施方案中，至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是天然存在的抗原的稳定型式(例如，通过一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，例如两个脯氨酸取代而稳定的冠状病毒刺突蛋白)。在另一个实施方案中，将其他修饰工程化到病毒表面蛋白例如糖蛋白中，诸如突变或胞质尾部缺失以促进蛋白质加工或构象稳定性。
应当理解，术语“蛋白质”涵盖糖蛋白、蛋白质、肽及其片段，并且术语“抗原”涵盖此类分子的激发免疫应答的抗原性部分。对于本文包括的病毒疫苗，术语“抗原”包括病毒表面蛋白(例如，糖蛋白)、病毒蛋白(例如，糖蛋白)片段以及源自呼吸道病毒的病毒蛋白(例如，糖蛋白)的设计和/或突变型式。
正粘病毒科
正粘病毒科是负义RNA病毒科，包括甲型流感病毒属、乙型流感病毒属、丁型流感病毒属、丙型流感病毒属、鲑鱼贫血病毒属(Isavirus)、托高土病毒属(Thogotovirus)和夸兰杰贾病毒属(Quaranjavirus)。本文所述的疫苗可以包含来自甲型流感病毒或乙型流感病毒的病毒抗原性多肽。这两者都与人流感相关。
所有流感病毒都是具有区段化基因组的负链RNA病毒。甲型和乙型流感病毒有8个基因，这些基因编码10种蛋白质，包括表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。就甲型流感病毒而言，根据这两种表面蛋白的差异，可以进一步细分为不同的亚型。迄今为止，已鉴定出16种HA亚型和9种NA亚型。然而，在20世纪，在人类中广泛流行的甲型流感亚型只有A(H1N1)；A(H1N2)；A(H2N2)和A(H3N2)。所有已知的甲型流感病毒亚型均已从鸟类中分离出来，并且可影响一系列哺乳动物物种。与人类一样，从其他哺乳动物物种中分离出的甲型流感亚型数量有限。几乎所有甲型流感大流行都是由1918年病毒的后代引起的，包括“漂移的”H1N1病毒以及重配的H2N2和H3N2病毒。甲型流感病毒在其病毒包膜表面上包含HA和NA蛋白质。HA允许病毒识别并结合靶细胞，并用病毒RNA感染细胞。NA对于随后在受感染细胞内产生的子病毒颗粒的释放至关重要，这样它们就可以传播到其他细胞。
乙型流感病毒几乎只感染人类。乙型流感病毒不分为亚型，但可以细分为谱系。目前流行的乙型流感病毒属于B/Yamagata(B/Yamagata/16/88样)或B/Victoria(B/Victoria/2/87样)谱系。乙型流感病毒的突变速度比甲型流感病毒慢2至3倍；然而，它每年会对儿童和年轻人产生重大影响。乙型流感病毒衣壳有包膜，其病毒体由包膜、基质蛋白、核蛋白复合物、核衣壳和聚合酶复合物组成。它可以是球形的或丝状的。其500个左右的表面投影由HA和NA组成。乙型流感病毒基因组长14,548个核苷酸，由八段线性负义单链RNA组成。多部分基因组被包裹，每个区段在一个单独的核衣壳中，核衣壳被一个包膜包围。
本发明的mRNA疫苗包含编码在设计疫苗时流行的流感病毒的HA和任选的NA抗原的mRNA。本发明的示例性疫苗包含编码流行的H1N1病毒和H3N2病毒的HA抗原和任选的NA抗原的mRNA。本发明的疫苗可以包含编码每种流行的甲型流感亚型或每种主要的甲型流感亚型的HA抗原的mRNA与编码每种流行的乙型流感谱系(或每种主要的流感谱系)的HA抗原的mRNA的组合。在示例性实施方案中，疫苗还包含编码对应于选定HA抗原的NA抗原的mRNA。主要病毒，或在流行中占主导地位的病毒，是在人群中以地方流行频率或以高于本领域技术人员理解的某一阈值的频率检测到的病毒，这对于证明这些毒株在人群中(例如，在代表北半球或南半球的人群中)流行是必要的。
本发明的mRNA疫苗适合于包含多种mRNA，并且因此可包含编码例如最流行的A/H1N1毒株、A/H3N2毒株、B/Victoria谱系和B/Yamagata谱系的HA抗原以及任选的相应的NA抗原的mRNA，但还可以包括编码第二流行的A/H1N1毒株、A/H3N2毒株、B/Victoria谱系和/或B/Yamagata谱系的HA抗原以及任选的相应的NA抗原的mRNA。在示例性实施方案中，本发明的mRNA疫苗包含编码A(H1N1)亚型的甲型流感病毒株的HA抗原的mRNA、编码A(H3N2)亚型的甲型流感病毒株的HA抗原的mRNA、编码B/Victoria谱系的乙型流感病毒株的HA抗原的mRNA和编码B/Yamagata谱系的乙型流感病毒株的HA抗原的mRNA。
在一些实施方案中，抗原是流感抗原。流感抗原是血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)。在一些实施方案中，流感抗原是HA或NA的片段、衍生物或修饰物。例如，在一些实施方案中，NA是野生型NA(例如，具有酶活性)。在一些实施方案中，NA是修饰的NA，诸如无酶活性的NA。如本文所用，“无酶活性的NA”是指已突变以致其不具有或具有最小催化活性的NA(参见例如Richard等人,JClinVirol.,2008,41(1):20-24；Yen等人,JVirol.,2006,80(17):8787-8795)。例如，在一些实施方案中，无酶活性的NA具有小于野生型NA的催化活性的30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的活性(例如，在酶活性测定中，如本领域已知的)。在一些实施方案中，Arg118、Asp151、Arg152、Arg224、Glu276、Arg292、Arg371和Tyr406中的至少一者是突变的。在一些实施方案中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部8个氨基酸是突变的。在一些实施方案中，突变是R118K、D151G、E227D。
在一些实施方案中，本公开的mRNA疫苗可以包含编码HA的mRNA的组合，任选地是与编码NA抗原或其片段、衍生物或修饰型式的mRNA的组合。在一些实施方案中，mRNA疫苗可以包含编码HA的mRNA和编码NA抗原或其片段、衍生物或修饰型式的mRNA的组合。在一些实施方案中，疫苗包含编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种HA抗原的mRNA和/或编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种NA抗原或它们的任何组合(例如，4种HA抗原，或4种HA抗原和4种NA抗原)的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码一种HA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码两种HA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码三种HA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码四种HA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码五种HA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包括编码六种HA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码一种HA抗原的mRNA和编码一种NA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码两种HA抗原的mRNA和编码两种NA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码三种HA抗原的mRNA和编码三种NA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码四种HA抗原的mRNA和编码四种NA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码五种HA抗原的mRNA和编码五种NA抗原的mRNA。在一些实施方案中，疫苗包含编码六种HA抗原的mRNA和编码六种NA抗原的mRNA。
凭借多重mRNA型式，本发明的疫苗可编码代表多个不同的流感进化枝和亚进化枝的流行毒株/谱系的HA抗原以及任选的相应的NA抗原，从而产生更有效地对抗即将来临或即将到来的流感季节的疫苗。
冠状病毒科
冠状病毒科包括有包膜的正链RNA病毒，可感染哺乳动物、两栖动物和鸟类。冠状病毒科正冠状病毒亚科包括引起哺乳动物和鸟类疾病的RNA病毒，可导致从普通感冒到更致命的疾病(例如，SARS、MERS、COVID-19)等呼吸道感染。在一些实施方案中，呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型冠状病毒属，例如：MERS-CoV、SARS-CoV(SARS-CoV-1)、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的基因组是单链正义RNA(+ssRNA)，大小为29.8-30kb，编码约9860个氨基酸(Chan等人2000，同上；Kim等人,2020Cell,5月14日；181(4):914-921.e10.)。SARS-CoV-2是一种具有5'帽和3'多聚A尾的多顺反子性mRNA。SARS-CoV-2基因组被组织成编码结构蛋白和非结构蛋白(Nsp)的特定基因。基因组中结构蛋白的顺序为5′-复制酶(开放阅读框(ORF)1/ab)-结构蛋白[刺突(S)-包膜(E)-膜(M)-核衣壳(N)]-3′。冠状病毒的基因组包括数量可变的开放阅读框，这些开放阅读框编码辅助蛋白、非结构蛋白和结构蛋白(Song等人2019Viruses；11(1):p.59)。大多数抗原性肽位于结构蛋白中(Cui等人2019Nat.Rev.Microbiol.；17(3):181–192)。刺突表面糖蛋白(S)、小包膜蛋白(E)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)是四种主要的结构蛋白。由于S蛋白有助于细胞嗜性和病毒进入，并且还能够诱导中和抗体(NAb)和保护性免疫，因此它可以被认为是冠状病毒疫苗开发中所有其他结构蛋白中最重要的靶标之一。
如本文所用，术语“刺突蛋白”是指形成从包括乙型冠状病毒在内的病毒的包膜(病毒表面)突出的同源三聚体的糖蛋白。三聚化刺突蛋白通过与宿主细胞表面的受体结合，随后将病毒与宿主细胞膜融合，从而促进病毒体进入宿主细胞。S蛋白是一种高度糖基化的大型I型跨膜融合蛋白，由1,160至1,400个氨基酸组成，具体取决于病毒类型。乙型冠状病毒刺突蛋白包含约1100至1500个氨基酸。
本发明的mRNA被设计为产生SARS-CoV-2刺突蛋白(即，编码刺突蛋白，使得当mRNA被递送至细胞或组织(例如受试者中的细胞或组织)时表达刺突蛋白)，及其结构改变的抗原性变体。技术人员将理解，虽然对于病毒(例如，乙型冠状病毒)而言基本上全长或完整的刺突蛋白是执行其促进病毒进入宿主细胞的预期功能所必需的，但当主要寻求引发针对刺突蛋白的免疫应答时，刺突蛋白结构和/或序列中一定数量的变异是可容忍的。例如，在不改变蛋白质的抗原特性的情况下可以容忍从编码的刺突蛋白(例如，编码的刺突蛋白抗原)的N末端或C末端进行例如一个至几个、可能多达5个或多达10个氨基酸的少量截短。同样，在不改变蛋白质的抗原特性的情况下可以容忍编码的刺突蛋白(例如，编码的刺突蛋白抗原)的一个至几个、可能多达5个或多达10个氨基酸(或更多)的变异(例如，保守取代)。在一些实施方案中，刺突蛋白不是稳定的刺突蛋白，例如，刺突蛋白通过两个脯氨酸取代(2P突变)而稳定。
在一些实施方案中，刺突蛋白来自不同的病毒株。毒株是微生物(例如，病毒)的基因变体。当两种或更多种病毒在自然界中例如通过抗原性漂移或抗原性转变感染同一细胞时，由于基因组分的突变或交换，可以产生新的病毒株。
抗原性漂移是病毒的一种基因变异，是由编码宿主抗体识别的病毒表面蛋白的病毒基因的突变积累引起的。这导致产生一种新的病毒颗粒株，该病毒颗粒株不能被防止先前毒株感染的抗体有效抑制。这使得改变的病毒更容易在部分免疫的人群中传播。
抗原性转变是病毒的两种或更多种不同毒株、或两种或更多种不同病毒的毒株结合形成具有所述两种或更多种原始毒株的表面抗原的混合物的新亚型的过程。这一术语通常专门用于流感，因为这是最著名的例子，但已知这一过程也发生在其他病毒上。抗原性转变是导致表型变化的重配或病毒转变的特殊情况。抗原性转变与抗原性漂移形成对比，抗原性漂移是已知病毒株随着时间的推移发生的自然突变，可能导致免疫力丧失或疫苗错配。抗原性转变通常与病毒表面抗原的重大改组有关，引起的重配极大地改变了病毒的表型。
如本文所用的病毒株是病毒的基因变体，其特征在于病毒的一种或多种表面蛋白或其他蛋白发生突变。例如，就SARS-CoV-2而言，SARS-CoV-2刺突蛋白中的氨基酸序列不同，其中个体对新毒株的免疫应答不如对用于免疫或首次感染个体的毒株的免疫应答的有效。由于免疫或先前感染的个体中的持续的免疫应答，因自然突变或自然突变与免疫选择的组合可能产生新的病毒株。新病毒株的不同之处在于，在刺突蛋白的负责病毒功能(诸如受体结合或病毒与靶细胞融合)的区域中有一个、两个、三个或更多个氨基酸突变。来自新毒株的刺突蛋白在氨基酸水平上可能与亲本毒株存在高达80％、85％、90％、95％、98％、99％的差异性。
天然病毒株是给定病毒的变体，其因为具有一些在自然条件下保持稳定的“独特表型特征”(例如，稳定且可遗传的生物学、血清学和/或分子特征)而可被识别。这种“独特表型特征”是指与所比较的参考病毒不同的生物学特性，诸如独特抗原特性、宿主范围(例如，感染不同种类的宿主)、毒株引起的疾病症状、毒株引起的不同类型的疾病(例如，通过不同的方式传播)等。“独特表型特征”可以在临床上检测到(例如，在感染该毒株的宿主中检测到的临床表现)，或者在比较动物实验中检测到，在比较动物实验中病毒学领域的技术人员可以在不知道哪只动物感染了哪种病毒，也没有任何关于两种病毒之间差异的信息的情况下区分感染参考对照病毒的动物和感染所谓新毒株的动物。重要的是，如果没有可识别的独特病毒表型，则具有简单基因组序列差异的病毒变体就不是单独的毒株。基因组序列变异的程度与将变体分类为菌毒株无关，因为有时少数突变会产生不同的表型。
例如，在一些实施方案中，mRNA编码来自至少一种病毒株变体的抗原或包含来自至少一种非野生型SARS-CoV-2的病毒株的突变。在一些实施方案中，疫苗包含编码与B.1.1.7谱系(UK)变体(20B/501Y.V1 VOC202012/01)相关的刺突蛋白的mRNA。B.1.1.7谱系变体在刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)中在位置501处具有突变，其中氨基酸天冬酰胺(N)已被酪氨酸(Y)置换；即N501Y突变。此外，该变体具有69/70缺失，其多次自发发生，导致刺突蛋白发生构象变化；S1/S2弗林蛋白酶裂解位点附近的P681H突变；以及ORF8中的突变，产生ORF8停止密码子(Q27停止子)。501.V2(SouthAfrica,SA)变体在刺突蛋白中包含多个突变，包括N501Y和E484K，但在69/70处没有缺失。E484K突变被认为是相对于至少一种形式的抗SARS-CoV-2单克隆抗体的“逃逸”突变，因此它可能会改变病毒的抗原性。已发现的其他突变包括D614G突变(被认为会增加病毒的传播率)和N543Y突变(出现于荷兰和丹麦的水貂养殖场)。在一些实施方案中，刺突蛋白包含来自超过一种变体的突变(例如，B.1.1.7和502Y.V2变体中发现的突变的组合)并且是具有多个突变的结构改变的变体。
冠状病毒的S蛋白可分为两个重要的功能亚单位，其中包括N末端S1亚单位，其形成S蛋白的球状头部；和C末端S2区域，其形成蛋白的茎部，直接嵌入病毒包膜中。在与潜在的宿主细胞相互作用时，S1亚单位将识别并结合宿主细胞上的受体，特别是血管紧张素转换酶2(ACE2)受体，而S2亚单位是S蛋白中最保守的组分，将负责将病毒的包膜与宿主细胞膜融合。(参见例如，Shang等人,PLoSPathog.2020Mar；16(3):e1008392.)。三聚体S蛋白三聚体的每个单体都含有两个亚单位S1和S2，分别介导附着和膜融合。作为体内感染过程的一部分，这两个亚单位通过酶裂解过程彼此分离。S蛋白首先在受感染细胞的S1/S2位点处被弗林蛋白酶介导的裂解所裂解，在体内，随后的丝氨酸蛋白酶介导的裂解事件发生在S1内的S2′位点处。在SARS-CoV2中，S1/S2裂解位点位于氨基酸676–TQTNSPRRAR/SVA–688(参考SEQ ID NO:1)处。S2’裂解位点位于氨基酸811–KPSKR/SFI–818(SEQ ID NO:2)处。
如本文所用，例如在设计由本发明的核酸(例如，mRNA)编码的SARS-CoV-2S蛋白抗原的情形中，术语“S1亚单位”(例如，S1亚单位抗原)是指刺突蛋白的N末端亚单位，以S蛋白N末端开始并以S1/S2裂解位点结束，而术语“S2亚单位”(例如，S2亚单位抗原)是指刺突蛋白的C末端亚单位，以刺突蛋白的S1/S2裂解位点开始并以C末端结束。如上所述，技术人员将理解，虽然基本上全长或完整的刺突蛋白S1或S2亚单位可能分别是受体结合或膜融合所必需的，但当主要寻求引发针对刺突蛋白亚单位的免疫应答时，S1或S2结构和/或序列中一定数量的变异是可容忍的。例如，在不改变蛋白质的抗原特性的情况下可以容忍从编码的亚单位(例如，编码的S1或S2蛋白抗原)的N末端或C末端进行例如一个至几个、可能多达4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸的少量截短。同样，在不改变蛋白质的抗原特性的情况下可以容忍编码的刺突蛋白亚单位(例如，编码的S1或S2蛋白抗原)的一个至几个、可能多达4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸(或更多)的变异(例如，保守取代)。
SARS-CoV-2刺突蛋白的S1和S2亚单位还包括易于通过结构和功能辨别的结构域，这些结构域又可用于设计由核酸疫苗(特别是本发明的mRNA疫苗)编码的抗原。在S1亚单位内，结构域包括N末端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，所述RBD结构域还包括受体结合基序(RBM)。在S2亚单位内，结构域包括融合肽(FP)、七肽重复序列1(HR1)、七肽重复序列2(HR2)、跨膜结构域(TM)和细胞质结构域(也称为胞质尾部(CT))(Lu R.等人,同上；Wan等人,J.Virol.2020年3月,94(7)e00127-20)。HR1和HR2结构域可称为SARS-CoV-2的“融合核心区”(Xia等人,2020Cell Mol Immunol.一月；17(1):1-12.)。S1亚单位包括N末端结构域(NTD)、接头区域、受体结合结构域(RBD)、第一亚结构域(SD1)和第二亚结构域(SD2)。S2亚单位除其他外包括第一七肽重复序列(HR1)、第二七肽重复序列(HR2)、跨膜结构域(TM)和胞质尾部。S1的NTD和RBD是用于本发明的疫苗设计方法的良好抗原，因为这些结构域已被证明是乙型冠状病毒感染个体内中和抗体的靶标。
本文提供的组合物包含可编码任何一个或多个全长或部分(截短的或其他序列缺失的)S蛋白亚单位(例如，S1或S2亚单位)、S蛋白亚单位的一个或多个结构域或结构域组合(例如，NTD、RBD或NTD-RBD融合体，有或没有SD1和/或SD2)，或全长或部分和S2蛋白亚单位的嵌合体的mRNA。本文考虑了其他S蛋白亚单位和/或结构域构型。
SARS-CoV(例如，SARS-CoV-1)的基因组还包括大约29,700个核苷酸长的单一正链RNA。SARS-CoV的整体基因组组织与其他冠状病毒的整体基因组组织相似。参考基因组包括13个基因，其编码至少14种蛋白质。两个大的重叠阅读框(ORF)涵盖了基因组的71％。其余部分有12个潜在的ORF，包括结构蛋白S(刺突)、E(小包膜)、M(膜)和N(核衣壳)的基因。其他潜在的ORF编码缺乏与已知蛋白质的明显序列相似性的独特推定SARS-CoV特异性多肽。对SARS-CoV基因组的详细分析已在J Mol Biol 2003；331:991-1004中公开。
在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码SARS-CoV S蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码SARS-CoV S蛋白的S1亚单位的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码SARS-CoV S蛋白的S2亚单位的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码SARS-CoV E蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码SARS-CoV N蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码SARS-CoV M蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下SARS-CoV蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：S蛋白(S、S1和/或S2)、E蛋白、N蛋白和M蛋白。
MERS-CoV是乙型冠状病毒属的一种正义单链RNA病毒。基因组在系统发育上分为两个进化枝，进化枝A和进化枝B。MERS-CoV的基因组编码至少四种独特的辅助蛋白，诸如3、4a、4b和5；两种复制酶蛋白(开放阅读框1a和1b)；以及四种主要结构蛋白，包括刺突(S)、包膜(E)、核衣壳(N)和膜(M)蛋白(Almazan F等人MBio 2013；4(5):e00650-13)。S蛋白在通过S1亚单位中的受体结合结构域(RBD)介导病毒与表达受体二肽基肽酶4(DPP4)的细胞结合方面尤为重要，而S2亚单位随后通过病毒与靶细胞膜的融合介导病毒进入(Li F.J Virol2015；89(4):1954-64；Raj VS等人Nature 2013；495(7440):251-4)。
在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MERS-CoV S蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MERS-CoV S蛋白的S1亚单位的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MERS-CoV S蛋白的S2亚单位的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MERS-CoV E蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MERS-CoV N蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MERS-CoV M蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下MERS-CoV蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：S蛋白(S、S1和/或S2)、E蛋白、N蛋白和M蛋白。
人冠状病毒OC43是包膜的正义单链RNA病毒，属于乙型冠状病毒1物种(乙型冠状病毒属，冠状病毒亚科，冠状病毒科，网巢病毒目(Nidovirales))。已鉴定出四种HCoV-OC43基因型(A至D)，其中基因型D最有可能由重组产生。连同HCoV-229E(甲型冠状病毒属中的一种物种)，HCoV-OC43也是导致普通感冒的已知病毒。这两种病毒均可引起严重的下呼吸道感染，包括婴儿、老年人和免疫功能低下的个体(诸如经历化疗的个体和患有HIV-AIDS的个体)的肺炎。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码HCoV-OC43蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。
人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)是一种具有HE基因的正义单链RNA病毒，将其区分为2组或乙型冠状病毒。基因组组织与其他II组冠状病毒的基因组组织相同，其特征性基因顺序为1a、1b、HE、S、E、M和N。此外，在S与E之间存在辅助蛋白基因(ORF4)且在N基因的位置处存在辅助蛋白基因(ORF8)。TRS可能位于AAUCUAAAC序列内，该序列位于除E之外的每个ORF之前。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码HKU1 HE蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码HKU1 S蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码HKU1 E蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码HKU1 M蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码HKU1 N蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下HKU1蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：HE蛋白、S蛋白、E蛋白、N蛋白和M蛋白。
在一些实施方案中，乙型冠状病毒是人冠状病毒NL63(HCoV-NL63或HCoV-NL)。人纽黑文冠状病毒(Human New Havencoronavirus，HCoV-NH)是人冠状病毒NL63的一个毒株。在HCoV-NL63基因组的3′部分中发现预测编码S、E、M和N蛋白的基因。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码NL63 S蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码NL63 S蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码H NL63 KU1 E蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码NL63 M蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码NL63 N蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下NL63蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：S蛋白、E蛋白、N蛋白和M蛋白。
人冠状病毒229E(HCoV-229E)是巢病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科甲型冠状病毒属中的一种单链正义RNA病毒物种。连同人冠状病毒OC43一起，其致使发生普通感冒。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码HCoV-229E抗原性蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。
副粘病毒科
在一些实施方案中，疫苗包含编码至少一种来自副粘病毒科的呼吸道病毒抗原性多肽的RNA(例如，mRNA)。最近，副粘病毒科的病毒被部分重新分类并重新命名。如本文所用的术语“副粘病毒科”是指属于Virus Taxonomy:2014Release；EC 46,Kingston andMontreal,Canada,2014年7月,Email ratification 2015(MSL#29)(https://talk.ictvonline.org/taxonomy)中确定的分类中列出的病毒组内的任何病毒。在该分类中，副粘病毒科包括以下亚科内的所有病毒：副粘病毒亚科(即，属：水生副粘病毒属(Aquaparamyxovirus)、禽副粘病毒属(Avulavirus)、猫副粘病毒属(Ferlavirus)、亨尼巴病毒属(Henipavirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、呼吸道病毒属(Respirovirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus))和肺病毒亚科(即，偏肺病毒属(Metapneumovirus)、肺病毒属(Pneumovirus))。这些包括被分类为副粘病毒科以及肺病毒科或肺病毒亚科的病毒。副粘病毒科成员是负链RNA病毒，长度为15-19千碱基。在一些实施方案中，呼吸道病毒抗原性多肽来自肺病毒亚科(例如，呼吸道合胞病毒或人偏肺病毒)。在一些实施方案中，呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒属(例如，副流感病毒)。在一些实施方案中，呼吸道病毒抗原性多肽来自麻疹病毒属(例如，麻疹病毒)。
RSV(也称为人正肺病毒)存在于至少两个抗原性亚组中，称为A组和B组，主要源于表面G糖蛋白的差异。两种RSV表面糖蛋白–G和F–介导与呼吸道上皮细胞附着和附着至呼吸道上皮细胞。F表面糖蛋白介导相邻细胞的聚结。这导致形成合胞细胞。RSV的基因组编码至少三种表面糖蛋白(包括F、G和SH)、四种核衣壳蛋白(包括L、P、N和M2)和一种基质蛋白M。糖蛋白F通过病毒体与宿主膜之间的融合引导病毒穿透。糖蛋白G是II型跨膜糖蛋白并且是主要的附着蛋白。SH是短的膜内在蛋白。基质蛋白M存在于脂质双层的内层中并且辅助病毒体形成。核衣壳蛋白L、P、N和M2调节RSV基因组的复制和转录。
在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码RSV F蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码RSVG蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码RSV L蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码RSV P蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码RSV N蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码RSV M2蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码RSV M蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下RSV蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：F蛋白、G蛋白、L蛋白、P蛋白、N蛋白、M2蛋白和M蛋白。
人偏肺病毒(hMPV)与RSV在其表面糖蛋白方面共享显著的同源性。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码hMPV融合蛋白(F)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码hMPV F蛋白的F1或F2亚单位的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码hMPV糖蛋白(G)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码hMPV基质蛋白(M)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码hMPV磷蛋白(P)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码hMPV核蛋白(N)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码hMPV SH蛋白(SH)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下hMPV蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白和SH蛋白。
副流感病毒是具有负义单链RNA基因组的包膜病毒。副流感病毒属于副粘病毒科亚科，其再分为三个属：呼吸道病毒属(PIV-1、PIV-3(现称为人呼吸道病毒1和3)和仙台病毒(SeV))、腮腺炎病毒属(PIV-2、PIV-4和流行性腮腺炎病毒)和麻疹病毒属(麻疹病毒、牛瘟病毒和犬瘟热病毒(CDV))。其基因组(一种约15500个核苷酸长的负义RNA分子)编码两种包膜糖蛋白、血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白(F或F0)(其裂解为F1和F2亚单位)、基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和包括病毒复制酶(L)的若干种非结构蛋白。除PIV-1之外，所有副流感病毒均表达在受感染的细胞中阻断IFN信号传导并由此用作毒力因子的非结构V蛋白(参见，例如，Nishio M等人J Virol.2008；82(13):6130-38)。在一些实施方案中，副流感病毒是副流感病毒3(PIV3)。
在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码PIV3融合蛋白(F)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码PIV3 F蛋白的F1或F2亚单位的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码PIV3血凝素-神经氨酸酶(HN)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸(参见，例如，van WykeCoelingh KL等人J Virol.1987；61(5):1473-77，以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码PIV3基质蛋白(M)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码PIV3磷蛋白(P)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码PIV3核蛋白(N)的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下PIV3蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：F蛋白、HN蛋白、M蛋白、P蛋白和N蛋白。
麻疹病毒(MeV)是一种单链、负义、包膜的RNA病毒。
病毒的糖蛋白复合物介导受体结合和膜融合。特别地，MeV融合(F)蛋白在与血凝素(HA)蛋白结合受体后执行膜融合(Muhlebach MD等人Journal of Virology 2008；82(22):11437-45)。MeV P基因编码三种蛋白质：P，一种必需的聚合酶辅因子，以及V和C，它们具有多种功能，但并不是病毒在培养细胞中繁殖所必需的。V与P共享氨基末端结构域，但具有锌结合羧基末端结构域，而C则是由重叠阅读框翻译而来。MeV C蛋白为感染因子。在复制期间，P蛋白以其氨基末端结构域结合进入的单体核衣壳(N)蛋白，并使其定位以组装到新生核糖核衣壳中。P蛋白氨基末端结构域是天然未折叠的(DeveauxP等人Journal ofVirology 2004；78(21):11632-40)。
在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MeV HA蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MeV F蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MeV P蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MeV V蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码MeV C蛋白的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的疫苗包含编码以下MeV蛋白中的至少一者的RNA(例如，mRNA)多核苷酸：HA蛋白、F蛋白、P蛋白、V蛋白和C蛋白。
亨尼巴病毒是副粘病毒科的另一种负链RNA病毒，包括尼帕病毒和亨德拉病毒。这些病毒具有脂质膜，其中嵌入有F(融合)蛋白三聚体和G(附着)蛋白四聚体的刺突。脂质下方是病毒基质蛋白外壳，由与N(核衣壳)蛋白紧密结合并与L(大)和P(磷蛋白)蛋白缔合的基因组RNA单螺旋链组成。
鼻病毒是小核糖核酸病毒科病毒的另一成员。鼻病毒是人类最常见的病毒感染原，也是普通感冒的病原体。鼻病毒具有长度在7200与8500nt之间的单链正义RNA基因组。基因组的5'端是病毒编码的蛋白质，并且与哺乳动物mRNA一样，有3'多聚A尾。病毒颗粒没有包膜，结构呈二十面体。人鼻病毒的衣壳含有四种病毒蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。较小的VP4蛋白位于衣壳和RNA基因组之间的界面处。VP1-VP3通常是鼻病毒的表位靶标，因为它们位于病毒的外部。人鼻病毒在上呼吸道的主要受体是ICAM-1(细胞间粘附分子1)，也称为CD54(分化簇54)。
本领域技术人员应当理解，病毒分类会随着另外的病毒被鉴定和测序而演变。虽然本文阐述并举例说明了牵涉人疾病的呼吸道病毒的具体实例，但本发明的mRNA疫苗可包括其他人呼吸道病毒，例如未具体阐述的这些科中的病毒或相关的人呼吸道病毒。就病毒在本文中被明确地鉴定为属于特定科或亚科而言，即使这些病毒后来被重新分类或在其他出版物或来源中被不同地或不一致地鉴定，这些病毒也被明确地指出属于这些科/亚科。应当理解，如果病毒在过去、现在或将来被分类在本文描述或要求保护的科、亚科或属之一下，则认为其属于本文所定义和使用的这些术语的该病毒科、亚科或属的范围内。
组合疫苗
本公开的实施方案提供了组合疫苗(例如，组合mRNA疫苗)。本公开的“组合疫苗”是指包含至少3个多核苷酸的疫苗，每个多核苷酸包含编码至少一种呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框。在另一个实施方案中，抗原性多肽源自病毒表面受体结合糖蛋白或所含病毒的蛋白质，因为这些导致诱导最佳中和抗体应答。在一些实施方案中，组合疫苗包含3-15个mRNA多核苷酸，例如3-4个、3-5个、3-6个、3-7个、3-8个、3-9个、3-10个、3-11个、3-12个、3-13个、3-14个、3-15个、4-5个、4-6个、4-7个、4-8个、4-9个、4-10个、4-11个、4-12个、4-13个、4-14个、4-15个、5-6个、5-7个、5-8个、5-9个、5-10个、5-11个、5-12个、5-13个、5-14个、5-15个、6-7个、6-8个、6-9个、6-10个、6-11个、6-12个、6-13个、6-14个、6-15个、7-8个、7-9个、7-10个、7-11个、7-12个、7-13个、7-14个、7-15个、8-9个、8-10个、8-11个、8-12个、8-13个、8-14个、8-15个、9-10个、9-11个、9-12个、9-13个、9-14个、9-15个、10-11个、10-12个、10-13个、10-14个、10-15个、11-12个、11-13个、11-14个、11-15个、12-13个、12-14个、12-15个、13-14个、13-15个或14-15个mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，组合疫苗包含3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个mRNA多核苷酸。在特定实施方案中，所有RNA都编码参与受体结合以促进病毒进入宿主细胞的病毒表面蛋白，例如糖蛋白。
在一些实施方案中，疫苗包含至少两个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含至少三个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述疫苗包含至少四个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，疫苗包含至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少两个编码冠状病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，疫苗包含至少3个、4个、5个或6个编码冠状病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，疫苗包含至少两个编码副粘病毒科抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，疫苗包含至少3个、4个、5个或6个编码副粘病毒科抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，编码流感抗原的mRNA以等量(例如，1:1比例)存在于制剂中，例如，编码不同HA抗原的mRNA以1:1比例存在，或编码不同HA和NA抗原的mRNA以1:1比例存在。在包含编码四种不同HA抗原的mRNA的示例性疫苗中，“1:1比例”的mRNA将包括1:1:1:1比例的第一、第二、第三和第四mRNA的mRNA。在包含编码四种不同HA抗原和四种不同NA抗原的mRNA的示例性疫苗中，“1:1比例”的mRNA将包括1:1:1:1比例的第一、第二、第三和第四mRNA的编码不同HA抗原的mRNA，并将包括1:1:1:1比例的第一、第二、第三和第四mRNA的编码不同NA抗原的mRNA。
在一些实施方案中，编码不同HA抗原的mRNA的比例彼此等同(例如，1:1:1:1)，并且编码不同NA抗原的mRNA的比例彼此等同(例如，1:1:1:1)；然而，编码HA抗原的mRNA与编码NA抗原的mRNA的比例不是1:1。在包含编码四种不同HA抗原和四种不同NA抗原的mRNA的示例性疫苗中，“3:1比例”的mRNA将包括3:3:3:3比例的第一、第二、第三和第四mRNA的编码不同HA抗原的mRNA，并将包括1:1:1:1比例的第一、第二、第三和第四mRNA的编码不同NA抗原的mRNA。在一些实施方案中，HA:NA比例为1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1。
在一些实施方案中，第一、第二和第三mRNA多核苷酸以1:1:1的比例存在于组合疫苗中。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为4:1:1的编码来自第一病毒(例如，流感):第二病毒:第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为3:1:1的编码来自第一病毒(例如，流感):第二病毒:第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为5:1:1的编码来自第一病毒(例如，流感):第二病毒:第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为4:2:1的编码来自第一病毒(例如，流感):第二病毒:第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为1:2:1的编码来自第一病毒(例如，流感):第二病毒:第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗包含比例为1:2:2的编码来自第一病毒(例如，流感):第二病毒:第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合疫苗(例如，多价RNA组合物)包含比例为8:2:2、4:1:1、4:2:2、4:2:1、4:3:2、4:3:3、4:3:2或4:2:2的编码来自第一病毒:第二病毒:第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，组合疫苗中的mRNA多核苷酸中的每一者与组合疫苗中的每个其他mRNA多核苷酸互补且不对其进行干扰。也就是说，施用组合疫苗产生的抗原不会显著干扰响应于疫苗产生的对任何其他抗原的免疫应答，从而削弱抗原在受试者中激发保护性免疫应答的能力。在一些实施方案中，组合疫苗相对于疫苗中各单种抗原的中和抗体是附加的。如图1至图4所示，相对于分别施用编码每种单一抗原的mRNA，施用包含编码流感抗原、RSV和SARS-CoV-2的mRNA多核苷酸的组合疫苗与单独施用编码各单一抗原的mRNA相比并没有抑制或降低各对应抗原的中和抗体滴度。
在本发明的每个实施方案或方面，应当理解，特征疫苗包括封装在LNP内的mRNA。虽然可以将每个独特的mRNA封装在其自己的LNP中，但mRNA疫苗技术具有能够将多个mRNA封装在单一LNP产品中的显著技术优势。
核酸
本公开的组合物包含(至少一个)具有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，mRNA还包含5′UTR、3′UTR、多聚(A)尾和/或5′帽类似物。
在一些实施方案中，所述组合物中的第一、第二和/或第三mRNA多核苷酸在长度上彼此相差至少100个核苷酸(例如，100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或更多个核苷酸)。
还应当理解，本公开的呼吸道病毒疫苗可以包含任何5′非翻译区(UTR)和/或任何3′UTR。示例性UTR序列包括SEQ ID NO:3-6；然而，可以使用其他UTR序列或用其他UTR序列替换本文所述的任何UTR序列。在一些实施方案中，本公开的5'UTR包含选自SEQ ID NO:3(GGGAAAUA AGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)和SEQ ID NO:4(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACC)的序列。在一些实施方案中，本公开的3'UTR包含选自SEQ ID NO:5(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUU CUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)和SEQID NO:6(UGAUAA UAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)的序列。UTR也可以从本文提供的RNA多核苷酸中省略。
核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物。因此，核酸也称为多核苷酸。核酸可以是或可以包括例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)和/或它们的嵌合体和/或组合。
信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(天然存在的、非天然存在的或修饰的氨基酸聚合物)的任何RNA，并且可以被翻译以在体外、体内、原位或离体产生所编码的蛋白质。技术人员将理解，除非另有说明，否则本申请中提出的核酸序列可以在代表性DNA序列中引用“T”，但是当该序列代表mRNA时，“T”将被替换为“U”。因此，本文中由特定序列识别号公开和鉴定的任何DNA也公开了与该DNA互补的相应mRNA序列，其中DNA序列的每个“T”被“U”取代。
开放阅读框(ORF)是连续的DNA或RNA链段，以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束。ORF通常编码蛋白质。应当理解，本文公开的序列还可包含另外的元件，例如5′UTR和3′UTR，但是那些元件，与ORF不同，不一定存在于本公开的RNA多核苷酸中。
变体
在一些实施方案中，本公开的组合物包含编码呼吸道病毒抗原和代表多种病毒抗原的结构改变的变体的RNA。抗原性变体或结构改变的变体是指其氨基酸序列不同于野生型(天然存在的)、天然或参考蛋白质序列的分子。与天然或参考序列相比，抗原/结构改变的变体可以在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与野生型、天然或参考序列具有至少50％同一性。在一些实施方案中，变体与野生型、天然或参考序列具有至少80％或至少90％同一性。
由本公开的核酸编码的变体抗原/多肽可以含有氨基酸变化，这些氨基酸变化赋予许多期望特性中的任一种，例如，增强其免疫原性，改变其免疫原性的广度(即，相对于产生的免疫应答的广度)，增强其表达和/或改善其在受试者中的稳定性或PK/PD特性。可以使用常规诱变技术来制备变体抗原/多肽，并酌情进行测定以确定它们是否具有所需特性。确定表达水平和免疫原性的测定在本领域中是众所周知的，示例性的此类测定在实施例部分中阐述。类似地，蛋白质变体的PK/PD特性可以使用本领域公认的技术来测量，例如通过确定接种疫苗的受试者中抗原随时间的表达和/或通过观察诱导的免疫应答的持久性。由变体核酸编码的蛋白质的稳定性可以通过测定热稳定性或尿素变性时的稳定性来测量，或者可以使用计算机预测来测量。用于此类实验和计算机测定的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，组合物包含RNA或RNA ORF，所述RNA或RNAORF包含本文提供的任一序列的核苷酸序列，或包含与野生型(天然存在的)或变体抗原的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽(例如，抗原)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。同一性还是指序列之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串之间的匹配数量所确定的。同一性测量由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)处理的具有缺口比对(如果有的话)的两个或更多个序列中较小序列之间的同一性匹配的百分比。相关抗原或核酸的同一性可以通过已知方法容易地计算。当应用于多肽或多核苷酸序列时，“百分比(％)同一性”被定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比同一性之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的残基(氨基酸残基或核酸残基)百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的。应当理解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的缺口和罚分，值可能不同。通常，如通过本文所述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的，特定多核苷酸或多肽(例如，抗原)的变体与该特定参考多核苷酸或多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。此类用于比对的工具包括BLAST套件的那些工具(StephenF.Altschul等人(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of proteindatabase search programs",Nucleic AcidsRes.25:3389-3402)。另一种流行的局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“Identificationof common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)。基于动态编程的通用全局比对技术是Needleman-wunsch算法(Needleman,S.B.&Wunsch,C.D.(1970)“Ageneralmethod applicable to the search for similarities in theamino acid sequencesof two proteins.”J.Mol.Biol.48:443-453)。最近，已开发了一种快速最佳全局序列比对算法(FOGSAA)，据称该算法比其他最佳全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。
因此，编码相对于参考序列(特别是本文公开的多肽(例如，抗原)序列)含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的蛋白或糖蛋白的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，可将序列标签或氨基酸，诸如一个或多个赖氨酸，添加到肽序列中(例如，在N末端或C末端)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基可任选地缺失以提供截短的序列。取决于序列的用途，例如，当作为可溶或与固相支持物连接的较大序列的一部分的序列表达时，某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可另选地缺失。在一些实施方案中，用于(或编码)信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如像折叠区)等的序列可用实现相同或相似功能的另选序列取代。在一些实施方案中，可以填充蛋白质核心中的空腔以提高稳定性，例如通过引入更大的氨基酸。在其他实施方案中，掩埋氢键网络可以用疏水性残基置换以提高稳定性。在又其他实施方案中，糖基化位点可被去除并用适当的残基置换。此类序列对于本领域技术人员而言是容易识别的。还应当理解，本文提供的一些序列含有例如在用于制备mRNA疫苗之前可以被删除的序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端处)。
如本领域技术人员所认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在目标呼吸道病毒抗原的范围内。例如，本文提供了参考蛋白的任何蛋白片段(意指比参考抗原序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面相同的多肽序列)，条件是所述片段是免疫原性的并且赋予针对呼吸道病毒的保护性免疫应答。
除了与参考蛋白相同但被截短的结构改变的变体以外，在一些实施方案中，结构改变的变体包括相对于参考抗原具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个突变的抗原。结构改变的变体的一些实例显示在本文提供或引用的序列中。抗原/抗原性多肽的长度范围可以从约4、6或8个氨基酸到全长蛋白质。
稳定元件
天然存在的真核mRNA分子可以含有稳定元件，包括但不限于在其5′端(5′UTR)和/或在其3′端(3′UTR)的非翻译区(UTR)，以及其他结构特征，诸如5′帽结构或3′多聚(A)尾。5′UTR和3′UTR通常都是从基因组DNA转录，并且是成熟mRNA的元件。成熟mRNA的特征性结构特征，诸如5′帽和3′多聚(A)尾，通常在mRNA加工期间添加到转录的(未成熟)mRNA中。
在一些实施方案中，组合物包含具有编码至少一种抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，所述抗原性多肽具有至少一种修饰、至少一个5′末端帽，并且组合物被配制在脂质纳米颗粒内。多核苷酸的5′加帽可以在体外转录反应期间根据制造商方案，使用以下化学RNA帽类似物产生5′-鸟苷帽结构来同时完成：3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)。修饰的RNA的5′加帽可以在转录后使用痘苗病毒加帽酶产生“帽0”结构来完成：m7G(5')ppp(5')G(NewEngland BioLabs,Ipswich,MA)。帽1结构可以使用痘苗病毒加帽酶和2'-O甲基转移酶产生以下结构来产生：m7G(5')ppp(5')G-2′-O-甲基。帽2结构可以从帽1结构产生，然后使用2'-O甲基转移酶对5'-倒数第三个核苷酸进行2'-O-甲基化。帽3结构可以从帽2结构产生，然后使用2'-O甲基转移酶对5'-倒数第四个核苷酸进行2'-O-甲基化。酶可以源自重组来源。
3'多聚(A)尾通常是添加到转录的mRNA的3'端的腺嘌呤核苷酸链段。在一些情况下，它可以包含多达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3'多聚(A)尾的长度对于单个mRNA的稳定性可能是必需的要素。在一些实施方案中，组合疫苗(例如，多价RNA组合物)包含大于20％、30％、40％、50％或60％的多聚A加尾的RNA。
在一些实施方案中，组合物包含稳定元件。稳定元件可以包括例如组蛋白茎环。已鉴定出茎环结合蛋白(SLBP)，这是一种32kDa的蛋白质。它与细胞核和细胞质中组蛋白信息的3'端的组蛋白茎环缔合。其表达水平受细胞周期调节；它在S期达到峰值，此时组蛋白mRNA水平也升高。所述蛋白质已被证明对于U7 snRNP对组蛋白前体mRNA进行有效3'端加工至关重要。SLBP在加工后继续与茎环缔合，然后刺激成熟组蛋白mRNA在细胞质中翻译成组蛋白。SLBP的RNA结合结构域在后生动物和原生动物中都是保守的；它与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。相对于茎环，最小结合位点包括至少三个核苷酸5’和两个核苷酸3′。
在一些实施方案中，mRNA包含编码区、至少一个组蛋白茎环和任选的多聚(A)序列或多聚腺苷酸化信号。多聚(A)序列或多聚腺苷酸化信号通常应增强所编码蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所编码的蛋白质不是组蛋白、报告蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、β半乳糖苷酶、EGFP)或标志物或选择蛋白(例如α珠蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤:鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，mRNA包含多聚(A)序列或多聚腺苷酸化信号和至少一个组蛋白茎环的组合，尽管两者都代表自然界中的替代机制，但协同起作用以增加蛋白质表达超过用任一单独元件观察到的水平。多聚(A)和至少一个组蛋白茎环的组合的协同效应不依赖于元件的顺序或多聚(A)序列的长度。
在一些实施方案中，mRNA不包含组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括天然存在的茎环3'处约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸链段，代表U7 snRNA的结合位点，其参与将组蛋白前体mRNA加工成成熟的组蛋白mRNA。在一些实施方案中，核酸不包含内含子。
mRNA可以含有或不含有增强子和/或启动子序列，其可以是修饰的或未修饰的或者可以是激活的或失活的。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常源自组蛋白基因并且包括由间隔子隔开的两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，所述间隔子由形成结构的环的短序列组成。未配对的环区域通常不能与任一茎环元件碱基配对。它更常见于RNA，是许多RNA二级结构的关键组件，但也可能存在于单链DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于配对区域的长度、错配或凸起的数量以及碱基组成。在一些实施方案中，可能导致摆动碱基配对(非Watson-Crick碱基配对)。在一些实施方案中，至少一个组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，mRNA去除了一个或多个富含AU的序列。这些序列(有时称为AURES)是3’UTR中发现的不稳定序列。AURES可以从RNA疫苗中去除。或者，AURES可以保留在RNA疫苗中。
信号肽
在一些实施方案中，组合物包含具有编码与呼吸道病毒抗原融合的信号肽的ORF的mRNA。信号肽包含蛋白质N末端15-60个氨基酸，通常是在分泌途径上跨膜易位所需要的，因此普遍控制真核生物和原核生物中的大多数蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗面内质网(ER)膜，并启动生长的肽链穿过该膜进行加工。ER加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的ER驻留信号肽酶从前体蛋白质中裂解，或者它们保持未裂解并充当膜锚定物。信号肽还可以促进蛋白质靶向细胞膜。
信号肽可以具有15-60个氨基酸的长度。例如，信号肽可以具有15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个或60个氨基酸的长度。在一些实施方案中，信号肽具有20-60个、25-60个、30-60个、35-60个、40-60个、45-60个、50-60个、55-60个、15-55个、20-55个、25-55个、30-55个、35-55个、40-55个、45-55个、50-55个、15-50个、20-50个、25-50个、30-50个、35-50个、40-50个、45-50个、15-45个、20-45个、25-45个、30-45个、35-45个、40-45个、15-40个、20-40个、25-40个、30-40个、35-40个、15-35个、20-35个、25-35个、30-35个、15-30个、20-30个、25-30个、15-25个、20-25个或15-20个氨基酸的长度。
来自异源基因的信号肽(其调节自然界中除呼吸道病毒抗原之外的基因的表达)是本领域已知的，并且可以测试所需特性，然后并入本公开的核酸中。
融合蛋白
在一些实施方案中，本公开的组合物包含编码抗原性融合蛋白的mRNA。因此，一个或多个所编码的抗原可以包含连接在一起的两个或更多个蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。或者，与蛋白质抗原融合的蛋白质并不促进对其自身的强烈免疫应答，而是促进对呼吸道病毒抗原的强烈免疫应答。在一些实施方案中，抗原性融合蛋白保留了每种原始蛋白的功能特性。
支架部分
在一些实施方案中，如本文提供的mRNA疫苗编码包含与支架部分连接的呼吸道病毒抗原的融合蛋白。在一些实施方案中，此类支架部分赋予由本公开的核酸编码的抗原所需的特性。例如，支架蛋白可以例如通过改变抗原的结构、改变抗原的摄取和加工和/或使抗原与结合配偶体结合来改进抗原的免疫原性。
在一些实施方案中，支架部分是可以自组装成高度对称的、稳定的且结构有序的蛋白质纳米颗粒的蛋白质，其直径为10-150nm，这是与免疫系统的各种细胞最佳相互作用的非常合适的尺寸范围。在一些实施方案中，病毒蛋白或病毒样颗粒可用于形成稳定的纳米颗粒结构。此类病毒蛋白的实例是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，支架部分是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg形成平均直径为约22nm的球形颗粒，其缺乏核酸，因此不具有感染性(Lopez-Sagaseta,J.等人Computational and Structural BiotechnologyJournal 14(2016)58–68)。在一些实施方案中，支架部分是乙型肝炎核心抗原(HBcAg)，其自组装成24-31nm直径的颗粒，类似于从HBV感染的人肝脏中获得的病毒核心。HBcAg自组装成两类不同尺寸的纳米颗粒，其直径为和/>对应于180或240个原聚体。在一些实施方案中，呼吸道病毒抗原与HBsAG或HBcAG融合以促进展示呼吸道病毒抗原的纳米颗粒的自组装。
在一些实施方案中，可以使用细菌蛋白质平台。这些自组装蛋白的非限制性实例包括铁蛋白、2,4-二羟基蝶啶(lumazine)和封装蛋白(encapsulin)。
铁蛋白是一种蛋白质，其主要功能是细胞内铁储存。铁蛋白由24个亚单位组成，每个亚单位由一个四α螺旋束组成，以八面体对称的四级结构自组装(Cho K.J.等人J MolBiol.2009；390:83–98)。铁蛋白的几种高分辨率结构已得到确定，证实幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白由24个相同的原聚体组成，而在动物体内，铁蛋白轻链和重链可以单独组装或以不同比例组合成24个亚单位的颗粒(Granier T.等人J Biol InorgChem.2003；8:105–111；Lawson D.M.等人Nature.1991；349:541–544)。铁蛋白自组装成具有强大热稳定性和化学稳定性的纳米颗粒。因此，铁蛋白纳米颗粒非常适合携带和暴露抗原。
2,4-二羟基蝶啶合酶(LS)也非常适合作为抗原展示的纳米颗粒平台。LS负责核黄素生物合成的倒数第二个催化步骤，是一种存在于多种生物体中的酶，所述生物体包括古细菌、细菌、真菌、植物和真细菌(Weber S.E.Flavins and Flavoproteins.MethodsandProtocols,Series:Methods in Molecular Biology.2014)。LS单体长150个氨基酸，由β折叠以及其两侧侧接的串联α螺旋组成。已报道了LS的许多不同的四级结构，说明了其形态多样性：从同五聚体到形成直径为的衣壳的12个五聚体的对称组装体。甚至已描述了超过100个亚单位的LS笼(Zhang X.等人J Mol Biol.2006；362:753–770)。
封装蛋白是一种从嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中分离的新型蛋白笼纳米颗粒，也可用作在自组装纳米颗粒表面呈递抗原的平台。封装蛋白由60个拷贝的相同31kDa单体组装而成，所述单体具有薄的二十面体T＝1对称笼结构，内径和外径分别为20nm和24nm(Sutter M.等人Nat Struct Mol Biol.2008,15:939-947)。尽管目前尚未清楚地了解海栖热袍菌中封装蛋白的确切功能，但其晶体结构最近已得到解析，并且其功能被假定为封装参与氧化应激应答的蛋白质诸如DyP(染料脱色过氧化物酶)和Flp(铁蛋白样蛋白)的细胞室(Rahmanpour R.等人FEBS J.2013,280:2097-2104)。
在一些实施方案中，本公开的RNA编码与折叠结构域融合的呼吸道病毒抗原。折叠结构域可以例如获自噬菌体T4纤维蛋白(参见，例如，Tao Y等人Structure.1997Jun 15；5(6):789-98)。
接头和可裂解肽
在一些实施方案中，本公开的mRNA编码超过一种多肽，在本文中称为融合蛋白。在一些实施方案中，mRNA还编码位于融合蛋白的至少一个结构域或每个结构域之间的接头。接头可以是例如可裂解接头或蛋白酶敏感性接头。在一些实施方案中，接头选自由F2A接头、P2A接头、T2A接头、E2A接头以及它们的组合组成的组。称为2A肽的此自裂解肽接头家族已在本领域中进行了描述(参见例如Kim,J.H.等人(2011)PLoS ONE6:e18556)。在一些实施方案中，接头是F2A接头。在一些实施方案中，接头是GGGS(SEQ ID NO:7)接头。在一些实施方案中，融合蛋白含有三个具有间插接头的结构域，具有以下结构：结构域-接头-结构域-接头-结构域。
本领域已知的可裂解接头可以与本公开结合使用。示例性的此类接头包括：F2A接头、T2A接头、P2A接头、E2A接头(参见，例如，WO2017127750)。技术人员将理解，其他本领域认可的接头可适用于本公开的构建体(例如，由本公开的核酸编码)。技术人员同样会理解，其他多顺反子性构建体(在同一分子内分别编码超过一种抗原/多肽的mRNA)可适用于如本文所提供的用途。
序列优化
在一些实施方案中，编码本公开的抗原的ORF是密码子优化的。密码子优化方法是本领域已知的。例如，本文提供的任何一个或多个序列的ORF可以是密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配目标生物体和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏向GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行最小化；定制转录和翻译控制区域；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加编码蛋白质中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白质结构域；插入或删除限制位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译速率以允许蛋白质的各个结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的有问题的二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的，非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专有方法。在一些实施方案中，使用优化算法来优化开放阅读框(ORF)序列。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列ORF或野生型序列ORF(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在的mRNA序列或野生型mRNA序列)共享小于95％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在的mRNA序列或野生型mRNA序列)共享小于90％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在的mRNA序列或野生型mRNA序列)共享小于85％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在的mRNA序列或野生型mRNA序列)共享小于80％序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在的mRNA序列或野生型mRNA序列)共享小于75％序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在的mRNA序列或野生型mRNA序列)共享65％与85％之间(例如，约67％与约85％之间或约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的序列或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在的mRNA序列或野生型mRNA序列)共享65％与75％之间或约80％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的抗原的免疫原性与由非密码子优化的序列编码的呼吸道病毒抗原相同或更高(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。
当转染至哺乳动物宿主细胞中时，修饰的mRNA具有12-18小时之间或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA可以是其中G/C水平增强的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA在功能上比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。作为实例，WO02/098443公开了含有通过翻译区中的序列修饰而稳定的mRNA的药物组合物。由于遗传密码的简并性，修饰通过用现有密码子取代那些促进更大的RNA稳定性而不改变所得氨基酸的密码子来起作用。该方法限于RNA的编码区。
未经化学修饰的核苷酸
在一些实施方案中，mRNA是未经化学修饰的并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，诸如存在于转录的RNA中的那些(例如A、G、C或U)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，诸如存在于DNA中的那些(例如dA、dG、dC或dT)。
化学修饰
在一些实施方案中，本公开的组合物包含具有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框的RNA，其中该核酸包含可以是标准的(未修饰的)或如本领域已知那样修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包括修饰的核苷酸或核苷。此类修饰的核苷酸和核苷可以是天然存在的修饰的核苷酸和核苷或非天然存在的修饰的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域所公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分的那些修饰。
在一些实施方案中，本公开的天然存在的修饰的核苷酸或核苷是如本领域通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类天然存在的修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于广泛认可的MODOMICS数据库中。
在一些实施方案中，本公开的非天然存在的修饰的核苷酸或核苷是本领域通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类非天然存在的修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于公布的美国申请号PCT/US2012/058519、PCT/US2013/075177、PCT/US2014/058897、PCT/US2014/058891、PCT/US2014/070413、PCT/US2015/036773、PCT/US2015/036759、PCT/US2015/036771或PCT/IB2017/051367中，所述申请全部以引用的方式并入本文。
因此，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，诸如mRNA核酸)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，诸如mRNA核酸)包含各种(超过一种)不同类型的标准和/或修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区域含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或修饰的核苷酸和核苷。
在一些实施方案中，引入细胞或生物体的修饰的RNA核酸(例如，修饰的mRNA核酸)相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸分别在细胞或生物体中表现出降低的降解。
在一些实施方案中，引入细胞或生物体的修饰的RNA核酸(例如，修饰的mRNA核酸)相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸分别在细胞或生物体中表现出降低的免疫原性(例如，降低的先天应答)。
在一些实施方案中，核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)包含在核酸的合成期间或合成后引入以实现所需功能或特性的非天然的修饰的核苷酸。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可以通过化学合成或用聚合酶引入到链末端或链中的任何其他位置处。可对核酸的任何区域进行化学修饰。
本公开提供了核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)的修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称作“核碱基”)组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。“核苷酸”是指核苷，包括磷酸基团。修饰的核苷酸可以通过例如像化学、酶促或重组的任何有用方法合成，以包括一个或多个修饰的或非天然的核苷。核酸可以包含连接的核苷的一个或多个区域。此类区域可能具有可变的主链键联。键联可以是标准的磷酸二酯键联，在这种情况下，核酸将包含核苷酸区域。
修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准的腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖核苷酸和/或包含非标准或修饰碱基的修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键接受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间的氢键结，例如，在具有至少一个化学修饰的那些核酸中。此种非标准碱基配对的一个实例是修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可以并入本公开的核酸中。
在一些实施方案中，核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)中的修饰的核碱基包括1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)中的修饰的核碱基包括5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种(例如，2种、3种、4种或更多种)任何上述修饰(包括但不限于化学修饰)的核碱基的组合。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的尿苷。
在一些实施方案中，针对特定修饰，一致地修饰(例如，完全修饰、在整个序列中修饰)mRNA。例如，核酸可以用1-甲基-假尿苷一致地修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基都被1-甲基-假尿苷置换。类似地，核酸可以通过用修饰的残基(诸如上文所阐述的那些残基)置换而针对存在于序列中的任何类型的核苷残基进行统一修饰。
本公开的核酸可以沿着分子的整个长度被部分或完全修饰。例如，一种或多种或全部或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任一者或多者或全部)可以在本公开的核酸中或其预定序列区域中(例如，在包括或不包括多聚(A)尾的mRNA中)一致地修饰。在一些实施方案中，本公开的核酸(或其序列区域)中的所有核苷酸X都是修饰的核苷酸，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
核酸可以含有约1％至约100％的修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即，A、G、U或C中的任一者或多者)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％及95％至100％)。应当理解，任何剩余的百分比都是由未修饰的A、G、U或C的存在所占的。
mRNA可含有最少1％且最多100％的修饰的核苷酸，或任何中间百分比，诸如至少5％的修饰的核苷酸、至少10％的修饰的核苷酸、至少25％的修饰的核苷酸、至少50％的修饰的核苷酸、至少80％的修饰的核苷酸或至少90％的修饰的核苷酸。例如，核酸可含有修饰的嘧啶，诸如修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被修饰的尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)置换。修饰的尿嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物置换，或者可以被具有不同结构(例如2、3、4或更多个独特结构)的多个化合物置换。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被修饰的胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)置换。修饰的胞嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物置换，或者可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多个化合物置换。
非翻译区(UTR)
本公开的mRNA可包含用作或充当非翻译区的一个或多个区域或部分。当mRNA被设计为编码至少一种目标抗原时，核酸可以包含这些非翻译区(UTR)中的一个或多个。核酸的野生型非翻译区被转录但不被翻译。在mRNA中，5'UTR从转录起始位点开始，一直延伸到起始密码子，但不包含起始密码子；而3'UTR紧接着终止密码子开始，一直持续到转录终止信号出现。越来越多的证据表明UTR在核酸分子和翻译的稳定性方面发挥着调节作用。UTR的调节特征可以并入本公开的多核苷酸中，以尤其增强分子的稳定性等。也可并入特定特征以确保在转录物被错误导向不期望的器官位点的情况下转录物的受控下调。多种5'UTR和3'UTR序列是本领域已知和可获得的。
5'UTR是mRNA的直接在起始密码子(核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)上游(5')的区域。5'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们具有如同通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列一样的特征。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO:8)，其中R是起始密码子上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)(AUG)，后面跟着另一个“G”。5'UTR也已知可形成参与延伸因子结合的二级结构。
在本公开的一些实施方案中，5'UTR是异源UTR，即是在自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在另一个实施方案中，5'UTR是合成UTR，即在自然界中不存在。合成的UTR包括已被突变以改善其特性的UTR，例如增加基因表达的UTR以及完全合成的UTR。示例性5'UTR包括非洲爪蟾(Xenopus)或人来源的a珠蛋白或b珠蛋白(8278063；9012219)、人细胞色素b-245a多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶、以及烟草蚀刻病毒(US8278063，9012219)。还可使用CMV立即早期1(IE1)基因(US20140206753、WO2013/185069)、序列GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:97)(WO2014144196)。在另一个实施方案中，TOP基因的5’UTR是缺少5'TOP基序(寡嘧啶束)的TOP基因的5'UTR(例如，WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738、WO2015024667、WO2015024667)；可以使用源自核糖体蛋白大32(L32)基因的5’UTR元件(WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738)、源自羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5’UTR的5’UTR元件(WO2015024667)或源自ATP5A1的5’UTR的5’UTR元件(WO2015024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5'UTR。
在一些实施方案中，本公开的5'UTR包含选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列。
3'UTR是mRNA中在终止密码子(mRNA转录物的传导翻译终止信号的密码子)直接下游(3')的区域。3'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3'UTR中嵌入有腺苷和尿苷链段。这些富含AU的特征在高周转率的基因中尤其普遍。根据其序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可分为三类(Chen等人,1995)：I类ARE在富含U区域内含有多个分散的AUUUA基序拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有这种类型ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III级ARES的定义不太明确。这些富含U区域不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是此类中两个经过充分研究的实例。已知大多数与ARE结合的蛋白质都会破坏信使的稳定性，而ELAV家族的成员，最值得注意的是HuR，已被证明可以增加mRNA的稳定性。HuR与所有三个类别的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，并因此导致体内信息的稳定。
3'UTR AU富集元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节本公开的核酸(例如，RNA)的稳定性。当工程化特定的核酸时，可引入ARE的一个或多个拷贝以使得本公开的核酸不那么稳定，并且由此缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，ARE可以被识别、去除或突变，以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。转染实验可在相关细胞系中使用本公开的核酸进行，并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同的ARE工程化分子转染细胞，并通过使用ELISA试剂盒检测相关蛋白质，并测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。
本领域普通技术人员将理解，异源或合成的5'UTR可与任何期望的3'UTR序列一起使用。例如，异源5'UTR可与具有异源3”UTR的合成3'UTR一起使用。
非UTR序列也可用作核酸内的区域或亚区域。例如，内含子或内含子序列的部分可以并入本公开的核酸的区域中。内含子序列的并入可以增加蛋白质产量以及核酸水平。
特征的组合可包含在侧翼区中并且可包含在其他特征内。例如，ORF的侧翼可以是5'UTR，其可含有强Kozak翻译起始信号，和/或3'UTR，其可包括用于以模板添加多聚A尾的寡(dT)序列。5′UTR可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，诸如美国专利申请公开号20100293625和PCT/US2014/069155中所述的5′UTR，以引用的方式整体并入本文。
应当理解，来自任何基因的任何UTR可并入核酸的区域。此外，可以利用任何已知基因的多个野生型UTR。在本公开的范围内也提供不是野生型区域的变体的人工UTR。这些UTR或其部分可以以与从中选择它们的转录物相同的取向放置，或者可以改变取向或位置。因此，5'UTR或3'UTR可以被倒置、缩短、延长、用一个或多个其他5'UTR或3'UTR制成。如本文所用，术语“改变”在涉及UTR序列时意味着UTR相对于参考序列已经以某种方式发生变化。例如，相对于野生型或天然UTR，3'UTR或5'UTR可通过改变如上文教导的取向或位置而改变，或者可通过包含另外的核苷酸、删除核苷酸、交换或转座核苷酸而改变。产生“改变的”UTR(无论是3'或5')的任何这些变化都包含变体UTR。
在一些实施方案中，可以使用双重、三重或四重UTR，诸如5'UTR或3'UTR。如本文所用，“双重”UTR是其中同一UTR的两个拷贝串联或基本上串联编码的UTR。例如，可以如美国专利公布20100129877中所述使用双重β珠蛋白3'UTR，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在本公开的范围内也具有模式化UTR。如本文所用，“模式化UTR”是反映重复或交替模式的那些UTR，诸如ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其重复一次、两次或超过3次的变体。在这些模式中，每个字母A、B或C代表核苷酸水平上的不同UTR。
在一些实施方案中，侧翼区选自转录物家族，其蛋白质共享共同的功能、结构、特征或特性。例如，目标多肽可以属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自任何这些基因的UTR可以被交换为相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR以产生新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白质家族”在最广泛的意义上使用，是指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的一组两种或更多种目标多肽。
非翻译区还可以包含翻译增强子元件(TEE)。作为非限制性实例，TEE可以包括在美国申请号20090226470中描述的那些(其以引用的方式整体并入本文)以及本领域已知的那些。
RNA的体外转录
本公开的方面提供了产生(例如，合成)RNA转录物(例如，mRNA转录物)的方法，所述方法包括在导致RNA转录物产生的条件下使DNA模板(例如，第一输入DNA和第二输入DNA)与RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶变体等)接触。这个过程被称为“体外转录”或“IVT”。IVT条件通常需要纯化的线性DNA模板，所述模板含有启动子、三磷酸核苷、包含二硫苏糖醇(DTT)和镁离子的缓冲系统以及RNA聚合酶。转录反应中使用的确切条件取决于特定应用所需的RNA量。典型的IVT反应通过在转录缓冲液中孵育DNA模板与RNA聚合酶和三磷酸核苷来进行，所述三磷酸核苷包括GTP、ATP、CTP和UTP(或核苷酸类似物)。由这种反应产生具有5'末端三磷酸鸟苷的RNA转录物。
在一些实施方案中，在IVT反应中使用野生型T7聚合酶。在一些实施方案中，在IVT反应中使用修饰的或突变的T7聚合酶。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含与野生型T7(WT T7)聚合酶具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7聚合酶变体是国际申请公布号WO2019/036682或WO2020/172239描述的T7聚合酶变体，所述申请各自的全部内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体)以0.01mg/ml至1mg/ml的浓度存在于反应(例如，IVT反应)中。例如，RNA聚合酶可能以0.01mg/mL、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1.0mg/ml的浓度存在于反应中。
输入的脱氧核糖核酸(DNA)用作RNA聚合酶的核酸模板。DNA模板可以包括编码目标多肽(例如，抗原性多肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，DNA模板包括RNA聚合酶启动子(例如，T7 RNA聚合酶启动子)，所述启动子位于编码目标多肽的多核苷酸的5'并且可操作地连接至所述多核苷酸。DNA模板还可以包括编码位于目标基因的3'端的多聚腺苷酸化(多聚A)尾的核苷酸序列。在一些实施方案中，输入的DNA包含质粒DNA(pDNA)。如本文所用，“质粒DNA”或“pDNA”是指在细胞中与染色体DNA物理分离并且可以独立复制的染色体外DNA分子。在一些实施方案中，从细胞中分离质粒DNA(例如，作为质粒DNA制备物)。在一些实施方案中，质粒DNA包含复制起点，其可含有一种或多种异源核酸，例如编码可用作RNA聚合酶模板的治疗性蛋白的核酸。质粒DNA可以是环化的或线性的(例如，已通过限制酶消化而线性化的质粒DNA)。
多价mRNA构建体通常通过以下方式产生：一次转录一种mRNA产物，纯化每种mRNA产物，将纯化的mRNA产物混合在一起，之后配制。这种类型的工艺需要大量的时间和金钱投资，尤其是在药品生产质量管理规范(GMP)规模下。
本公开的方面涉及用于生产包含多价不同RNA(例如，2种或更多种不同RNA)的组合物的方法。在一些方面，本文公开的多价转录方法涉及选择用于IVT反应的输入DNA的量，从而产生比使用先前方法产生的RNA组合物具有更高纯度的多价RNA组合物。观察到共同转录(例如，体外同时转录)的DNA分子的某些特征或特性，诸如DNA分子之间的长度差异、DNA分子的多聚A加尾效率等，和/或共同IVT反应混合物中存在的其他试剂(例如，RNA聚合酶、三磷酸核苷酸(NTP)等)可能会将组成偏差引入所得多价RNA组合物中。令人惊讶的是，发现了减少这种组成偏差的方法。在一些实施方案中，修改输入DNA量导致相对于通过先前方法产生的RNA组合物具有增加的纯度(例如，如通过包含多聚A尾的RNA的百分比所测量)的多价RNA组合物的产生。还令人惊奇地发现，即使当IVT反应中使用的输入DNA的长度存在很大差异(例如，>100个核苷酸)时，本文所述的共同IVT方法也产生高纯度的多价RNA组合物。
因此，在一些方面，本公开提供了一种用于产生多价RNA组合物的方法，所述方法包括在反应混合物中同时体外转录至少两个DNA分子，所述反应混合物包含：编码第一RNA的第一DNA分子群体；编码与第一RNA不同的第二RNA的第二DNA分子群体；以及获得具有由IVT产生的第一RNA与第二RNA的预定比例的多价RNA组合物。
如本文所用，术语“多价RNA组合物”是指包含超过两种不同mRNA的组合物。多价RNA组合物可包含2个或更多个不同的RNA，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个不同的RNA。在一些实施方案中，多价RNA组合物包含超过10种不同的RNA。术语“不同RNA”是指与多价RNA组合物中的另一RNA不同的任何RNA。例如，如果两个RNA具有i)不同的长度(无论RNA在两个长度中较短者的整个长度上是否相同)，ii)不同的核苷酸序列，iii)不同的化学修饰模式，或iv)前述任何组合，则它们是不同的。
在一些实施方案中，共同IVT反应中的每个输入DNA(例如，输入DNA分子群体)获自不同来源(例如，例如在不同细胞或细胞群体中单独合成)。在一些实施方案中，各输入DNA(例如，输入DNA群体)获自不同的细菌细胞或细菌细胞群体。例如，在具有三个输入DNA群体的共同IVT反应中，第一输入DNA在细菌细胞群体A中产生，第二输入DNA在细菌细胞群体B中产生，并且第三输入DNA在细菌群体C中产生，其中A、B和C各自不是相同的细菌培养物(例如，在同一容器或板中共同培养)。获得输入DNA群体(例如，质粒DNA)的方法是已知的，例如Sambrook,Joseph.Molecular Cloning:a LaboratoryManual.Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001所描述的。
一些方面包括将多价共同IVT反应中使用的DNA的量归一化。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA的摩尔质量。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA的降解率。在一些实施方案中，归一化是基于所得mRNA的降解率(例如，基于反应混合物中存在的多聚A变体，或T7聚合酶无效转录物或截短的转录物来测量)。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA的核苷酸含量(例如，A、G、C、U或它们的任何组合的量)。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA的纯度。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA的多聚A加尾效率。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA的长度。
在一些实施方案中，mRNA具有预定义的mRNA比例，其可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同RNA之间的比例(例如，取决于组合物中不同RNA的数量)。在一些实施方案中，预定义的比例包括超过10个RNA之间的比例。如本文所用，“预定义的mRNA比例”是指多价RNA组合物中RNA分子的所需最终比例。RNA组合物的所需最终比例将取决于由RNA编码的最终肽或多肽产物。例如，多价RNA混合物可包含两个RNA(例如，编码第一抗原的RNA和编码第二抗原的RNA)；在这种情况下，RNA分子的所需最终比例可以是1个第一抗原RNA:1个第二抗原RNA。在另一个实例中，多价RNA组合物可以包含编码不同抗原性肽(例如，用作疫苗)的几个(例如，3、4、5、6、7、8或更多个)RNA；在这种情况下，所需比例可包含3至10个RNA(例如，a:b:c、a:b:c:d、a:b:c:d:e、a:b:c:d:e:f、a:b:c:d:e:f:g、a:b:c:d:e:f:g:h、a:b:c:d:e:f:g:h:i、a:b:c:d:e:f:g:h:i:j等，其中a-j各自是1与10之间的数字)。
在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA中存在的最低水平(例如，最低摩尔质量、降解率(例如，输入DNA和/或输出RNA的降解率)、核苷酸含量、纯度和/或多聚A加尾效率)。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA中存在的最高水平(例如，最高摩尔质量、降解率(例如，输入DNA和/或输出RNA的降解率)、核苷酸含量、纯度和/或多聚A加尾效率)。在一些实施方案中，归一化是基于输入DNA的RNA产生速率(例如，反应混合物中输入DNA的最高RNA产生速率或输入DNA的最低RNA产生速率)。
在一些方面，本公开涉及IVT方法，其中对输入DNA(例如，第一DNA或第二DNA)的量进行调整或归一化，以便改进具有预定义的mRNA组分比例的多价RNA组合物的产生。
如本文所述，影响多价RNA组合物纯度的某些因素，诸如在IVT期间输入DNA之间大小的巨大差异(例如，长度差异超过100、200、500、1000或更多个核苷酸)和/或给定DNA的多聚A加尾效率可以通过基于这些因素中的一个或多个将输入DNA的量归一化在IVT之前得到解决。
IVT反应中使用的输入DNA(例如，输入DNA分子群体)的数量可以变化，取决于多价RNA组合物中期望包含的不同RNA分子的数量。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含2种或更多种不同的输入DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种不同的输入DNA。在一些实施方案中，IVT反应包含超过15种不同的输入DNA。术语“不同的输入DNA”涵盖编码例如具有以下的不同RNA的输入DNA：i)不同的长度(无论RNA在两个长度中较短者的整个长度上是否相同)，ii)不同的核苷酸序列，iii)不同的化学修饰模式，或iv)前述任何组合。
在一些实施方案中，IVT反应中使用的两个或更多个输入DNA分子编码具有不同长度(例如，包含不同数量的核苷酸)的mRNA分子。在一些实施方案中，IVT反应混合物中由不同输入DNA分子编码的两个或更多个mRNA分子之间的长度差异大于70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸或100个核苷酸(例如，组合物中的两个输入DNA编码彼此长度不在70个、80个、90个或100个核苷酸以内的mRNA分子)。在一些实施方案中，由不同输入DNA分子编码的两个或更多个mRNA分子之间的长度差异超过100个核苷酸，例如500个核苷酸、1000个核苷酸、1500个核苷酸、2000个核苷酸、3000个核苷酸、4000个核苷酸或更多。
在具体实施方案中，通过将编码第一mRNA多核苷酸的线性化第一DNA分子、编码第二mRNA多核苷酸的线性化第二DNA分子和编码第三mRNA多核苷酸的线性化第三DNA分子合并到单个反应器皿中来产生组合疫苗(例如，多价RNA组合物)，其中第一DNA分子、第二DNA分子和第三DNA分子获自不同来源。在一些实施方案中，不同来源是第一、第二和第三细菌细胞培养物，并且其中第一、第二和第三细菌细胞培养物不是共同培养的。在一些实施方案中，不同来源是第一、第二和第三细菌细胞培养物，并且其中第一、第二和第三细菌细胞培养物是共同培养的。在一些实施方案中，在体外转录开始之前在反应混合物中存在的第一、第二和第三DNA分子的量已经归一化。
在一些实施方案中，同时体外转录线性化第一DNA分子、线性化第二DNA分子和线性化第三DNA分子以获得多价RNA组合物。
在一些实施方案中，体外转录模板编码5'非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并编码3'UTR和多聚(A)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板所编码的mRNA。
“5'非翻译区”(UTR)是指mRNA中不编码多肽的在起始密码子(即，核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)直接上游(即5')的区域。当生成RNA转录物时，5'UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域已知的。应当理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。
“3′非翻译区(UTR)”是指mRNA中不编码多肽的在终止密码子(即，传导翻译终止信号的mRNA转录物的密码子)直接下游(即，3′)的区域。
“开放阅读框”是以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束的连续DNA链段，并且编码多肽。
“多聚(A)尾”是mRNA中在3′UTR下游，例如直接下游(即，3′)的区域，其含有多个连续的单磷酸腺苷。多聚(A)尾可以含有10至300个单磷酸腺苷。例如，多聚(A)尾可以含有10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，多聚(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物环境中(例如，在细胞中，在体内)，多聚(A)尾起到保护mRNA免受酶促降解的作用，例如，在细胞质中，并且有助于转录终止和/或mRNA从细胞核中的输出，以及翻译。
在一些实施方案中，核酸包含200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包含200至500个、200至1000个、200至1500个、200至3000个、500至1000个、500至1500个、500至2000个、500至3000个、1000至1500个、1000至2000个、1000至3000个、1500至3000个或2000至3000个核苷酸)。
体外转录系统通常包含转录缓冲液、三磷酸核苷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。
NTP可内部制造，可从供应商处选择，或可如本文所述合成。NTP可选自但不限于本文所述的那些，包括天然和非天然(修饰的)NTP。
任何数量的RNA聚合酶或变体可以用于本公开的方法中。聚合酶可选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和/或突变体聚合酶，例如但不限于能够并入修饰的核酸和/或修饰的核苷酸(包括化学修饰的核酸和/或核苷酸)中的聚合酶。一些实施方案排除了DNA酶的使用。
在一些实施方案中，RNA转录物经由酶促加帽来加帽。在一些实施方案中，RNA包含5'末端帽，例如7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp。
非编码序列
本公开的方面涉及包含mRNA(例如，2-15个mRNA多核苷酸)的多价RNA组合物，每个mRNA多核苷酸包含编码呼吸道病毒抗原性多肽的不同开放阅读框(ORF)，其中每个mRNA多核苷酸在具有独特标识符序列的非翻译区(UTR)中包含一个或多个非编码序列。如本文所用，“非编码序列”是指生物分子(例如，核酸、蛋白质等)中的当与另一生物分子的序列组合时用于识别该另一生物分子的序列。通常，非编码序列是并入靶生物分子序列内或附加至靶生物分子序列并用作参考以识别目标靶分子的异源序列。在一些实施方案中，非编码序列是并入靶核酸内或附加至靶核酸并用作参考以识别靶核酸的核酸(例如，异源或合成核酸)的序列。在一些实施方案中，非编码序列为式(N)n。在一些实施方案中，n是5至20、5至10、10至20、7至20或7至30范围内的整数。在一些实施方案中，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更大。在一些实施方案中，N是各自独立地选自A、G、T、U和C或其类似物的核苷酸。因此，一些实施方案包含核酸(例如，mRNA)，其(i)具有目标靶序列(例如，编码序列(例如，编码治疗性肽或治疗性蛋白的序列))；并且(ii)包含独特非编码序列。
在一些实施方案中，一个或多个体外转录的mRNA在非翻译区(UTR)诸如5’UTR或3’UTR中包含一个或多个非编码序列。在mRNA的UTR中包含非编码序列可防止非编码序列被翻译成肽。在一些实施方案中，非编码序列位于mRNA的3’UTR中。在一些实施方案中，非编码序列位于mRNA的多聚A尾的上游。在一些实施方案中，非编码序列位于mRNA的多聚A尾的下游(例如，之后)。在一些实施方案中，非编码序列位于mRNA的ORF的最后一个密码子和mRNA的多聚A尾的第一个“A”之间。在一些实施方案中，位于UTR中的多核苷酸非编码包含1至10个核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸)。在一些实施方案中，包含多核苷酸非编码序列的UTR还包含一个或多个(例如，1个、2个、3个或更多个)RNA酶裂解位点，诸如RNA酶H裂解位点。在一些实施方案中，多价RNA组合物的各不同RNA包含不同的(例如，独特的)非编码序列。在一些实施方案中，根据RNA的多核苷酸非编码序列检测和/或纯化多价RNA组合物的RNA。在一些实施方案中，mRNA非编码序列用于鉴定样品(例如，反应产物或药物产品)中mRNA的存在或确定不同mRNA的相对比例。在一些实施方案中，使用深度测序、PCR和Sanger测序中的一者或多者来检测mRNA非编码序列。示例性非编码序列包括：AACGUGAU、AAACAUCG、ATGCCUAA、AGUGGUCA、ACCACUGU、ACAUUGGC、CAGAUCUG、CAUCAAGU、CGCUGAUC、ACAAGCUA、CUGUAGCC、AGUACAAG、AACAACCA、AACCGAGA、AACGCUUA、AAGACGGA、AAGGUACA、ACACAGAA、ACAGCAGA、ACCUCCAA、ACGCUCGA、ACGUAUCA、ACUAUGCA、AGAGUCAA、AGAUCGCA、AGCAGGAA、AGUCACUA、AUCCUGUA、AUUGAGGA、CAACCACA、GACUAGUA、CAAUGGAA、CACUUCGA、CAGCGUUA、CAUACCAA、CCAGUUCA、CCGAAGUA、ACAGUG、CGAUGU、UUAGGC、AUCACG和UGACCA。
在一些实施方案中，多价RNA组合物通过包括以下的方法产生：
(a)将编码第一mRNA多核苷酸的线性化第一DNA分子、编码第二mRNA多核苷酸的线性化第二DNA分子和编码第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十mRNA多核苷酸的线性化第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十DNA分子合并到单个反应器皿中，其中第一DNA分子、第二DNA分子以及第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十DNA分子获自不同来源；以及
(b)同时体外转录线性化第一DNA分子、线性化第二DNA分子和线性化第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十DNA分子以获得多价RNA组合物。不同来源可以是可能不是共同培养的细菌细胞培养物。在一些实施方案中，在IVT开始之前在反应混合物中存在的第一、第二以及第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十DNA分子的量已经归一化。
化学合成
固相化学合成.本公开的核酸可以全部或部分使用固相技术制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子固定在固相支持物上并在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于在核酸序列中位点特异性引入化学修饰。
液相化学合成.通过连续添加单体结构单元来合成本公开的核酸可以在液相中进行。
合成方法的组合.上文讨论的合成方法各有其优点和局限性。已尝试将这些方法结合起来以克服这些局限性。此类方法的组合是在本公开的范围内。使用固相或液相化学合成与酶连接的组合提供了一种有效的方式来生成仅通过化学合成无法获得的长链核酸。
核酸区域或亚区域的连接
也可使用通过连接酶组装核酸。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键促进多核苷酸链的5'和3'端的分子间连接。核酸诸如嵌合多核苷酸和/或环状核酸可通过连接一个或多个区域或亚区域来制备。DNA片段可通过连接酶催化的反应接合以产生具有不同功能的重组DNA。两个寡脱氧核苷酸，一个具有5'磷酰基基团，另一个具有游离的3'羟基基团，用作DNA连接酶的底物。
纯化
本文所述的核酸的纯化可包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。可通过本领域已知的方法进行净化，诸如但不限于珠(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、聚-T珠、LNATM寡聚-T捕获探针(/>Inc,Vedbaek,Denmark)或基于HPLC的纯化方法，诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化的”当与核酸诸如“纯化的核酸”相关使用时，是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是指使另一种物质变得不合格、不纯净或劣等的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以与其在自然界中发现的形式或背景不同的形式或背景存在，或者以与在对其进行处理或纯化方法之前就已存在的形式或背景不同的形式或背景存在。
质量保证和/或质量控制检查可以使用诸如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析型HPLC的方法进行。
在一些实施方案中，可以通过包括但不限于逆转录酶-PCR的方法对核酸进行测序。
定量
在一些实施方案中，本公开的核酸可以在外泌体中或当源自一种或多种体液时进行定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper's fluid)或射精前液、汗液、粪便、头发、眼泪、囊液、胸水和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺吸出物、囊胚腔液和脐带血。或者，外泌体可从选自由肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳腺、前列腺、脑、食道、肝和胎盘组成的组的器官回收。
可使用构建体特异性探针、细胞计量术、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱或它们的组合进行测定，而可使用免疫组织化学方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分离外泌体。外泌体还可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来分离。
这些方法为研究者提供了实时监测剩余或递送的核酸水平的能力。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。
在一些实施方案中，可以使用诸如但不限于紫外可见光谱(UV/Vis)的方法来定量核酸。UV/Vis光谱仪的非限制性实例是光谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)。可以分析定量的核酸以确定核酸是否具有适当的大小，检查核酸是否没有发生降解。核酸的降解可以通过诸如但不限于以下的方法来检查：琼脂糖凝胶电泳；基于HPLC的纯化方法，诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)、疏水作用高效液相色谱(HIC-HPLC)；液相色谱-质谱联用(LCMS)；毛细管电泳(CE)；和毛细管凝胶电泳(CGE)。/>
脂质纳米颗粒(LNP)
在一些实施方案中，本公开的mRNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。脂质纳米颗粒通常包含可电离氨基脂质、非阳离子脂质、甾醇和PEG脂质组分以及目标核酸货物。本公开的脂质纳米颗粒可以使用本领域通常已知的组分、组合物和方法来产生，参见例如PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016/000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/052117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575和PCT/US2016/069491，其全部以引用的方式整体并入本文。
本公开的疫苗通常配制在脂质纳米颗粒中。例如，可以使用混合工艺诸如微流体和两种流体流的T形连接混合来制备疫苗，所述两种流体流中一种流体流含有mRNA并且另一种流体流含有脂质组分。在一些实施方案中，通过将可电离氨基脂质、磷脂(诸如DOPE或DSPC)、PEG脂质(诸如1,2-二肉豆蔻酰基-OT-甘油甲氧基聚乙二醇，也称为PEG-DMG)和结构脂质(诸如胆固醇)在醇(例如，乙醇)中组合来制备疫苗。例如，可将脂质组合以产生所需摩尔比并用水和醇(例如乙醇)稀释至最终脂质浓度在约5.5mM与约25mM之间。
包含mRNA和脂质组分的疫苗可以例如通过将脂质溶液与mRNA溶液以脂质组分与mRNA重量:重量比为约5:1至约50:1组合来制备。可以使用基于微流体的系统(例如，NanoAssemblr)以约10ml/min与约18ml/min之间的流速将脂质溶液快速注射到例如mRNA溶液中以产生悬浮液(例如，用水与酒精的比例在约1:1与约4:1之间)。
疫苗可以通过透析进行加工，以去除醇(例如乙醇)并实现缓冲液交换。制剂可用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)进行透析，所述盐水例如体积大于初级产品的体积(例如，使用Slide-A-Lyzer盒(ThermoFisher Scientific Inc.,Rockford,IL))，例如截留分子量为10kD。前述示例性方法诱导纳米沉淀和颗粒形成。替代性方法包括但不限于T形连接和直接注射，可用于实现相同的纳米沉淀。
本公开的疫苗通常配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含至少一种可电离氨基脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种甾醇和/或至少一种聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离氨基脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含20-50mol％、20-40mol％、20-30mol％、30-60mol％、30-50mol％、30-40mol％、40-60mol％、40-50mol％或50-60mol％可电离氨基脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含20mol％、30mol％、40mol％、50mol％或60mol％可电离氨基脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含5-25mol％非阳离子脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含5-20mol％、5-15mol％、5-10mol％、10-25mol％、10-20mol％、10-25mol％、15-25mol％、15-20mol％或20-25mol％非阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或25mol％非阳离子脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含25-55mol％甾醇。例如，脂质纳米颗粒可包含25-50mol％、25-45mol％、25-40mol％、25-35mol％、25-30mol％、30-55mol％、30-50mol％、30-45mol％、30-40mol％、30-35mol％、35-55mol％、35-50mol％、35-45mol％、35-40mol％、40-55mol％、40-50mol％、40-45mol％、45-55mol％、45-50mol％或50-55mol％甾醇。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％或55mol％甾醇。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％PEG修饰的脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含0.5-10mol％、0.5-5mol％、1-15mol％、1-10mol％、1-5mol％、2-15mol％、2-10mol％、2-5mol％、5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离氨基脂质、5-25mol％非阳离子脂质、25-55mol％甾醇和0.5-15mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含40-50mol％可电离氨基脂质、5-15mol％中性脂质、20-40mol％胆固醇和0.5-3mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含45-50mol％可电离氨基脂质、9-13mol％中性脂质、35-45mol％胆固醇和2-3mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含48mol％可电离氨基脂质、11mol％中性脂质、68.5mol％胆固醇和2.5mol％PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含式(I)的化合物：
或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和–C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括以下那些，其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、–CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不为5、6或7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5元至14元杂环烷基，其被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和C1-3烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2,-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q为5元至14元杂环且(i)R4为-(CH2)nQ，其中n为1或2，或(ii)R4为-(CH2)nCHQR，其中n为1，或(iii)R4为-CHQR和-CQ(R)2时，则Q为5元至14元杂芳基或8元至14元杂环烷基；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q为-N(R)2，并且n选自3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C1-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2组成的组，其中Q为-N(R)2，并且n选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C1-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(IA)的那些：
或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；R4为未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(II)的那些：
或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M’；R4为未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基、杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)的那些：
或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的一个子集包括式(IId)的那些：
或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R’、R”和R2至R6如本文所述。例如，R2和R3各自可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方案中，本公开的非阳离子脂质包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、l,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-十一酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰-2胆固醇半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂以及它们的混合物。
在一些实施方案中，本公开的PEG修饰的脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DMG-PEG、PEG-c-DOMG(也称为PEG-DOMG)、PEG-DSG和/或PEG-DPG。
在一些实施方案中，本公开的甾醇包括胆固醇、粪生甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚以及它们的混合物。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含化合物1的可电离氨基脂质，其中非阳离子脂质是DSPC，结构脂质是胆固醇，并且PEG脂质是DMG-PEG(例如，PEG2000-DMG)。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含45-55摩尔％(mol％)的可电离氨基脂质(例如，化合物1)。例如，脂质纳米颗粒可包含45-47、45-48、45-49、45-50、45-52、46-48、46-49、46-50、46-52、46-55、47-48、47-49、47-50、47-52、47-55、48-50、48-52、48-55、49-50、49-52、49-55或50-55mol％可电离氨基脂质(例如，化合物1)。例如，脂质纳米颗粒可包含45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55摩尔％可电离氨基脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含5-15mol％非阳离子(中性)脂质(例如，DSPC)。例如，脂质纳米颗粒可包含5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-14、5-15、6-7、6-8、6-9、6-10、6-11、6-12、6-13、6-14、6-15、7-8、7-9、7-10、7-11、7-12、7-13、7-14、7-15、8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-14、8-15、9-10、9-11、9-12、9-13、9-14、9-15、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、11-12、11-13、11-14、11-15、12-13、12-14、13-14、13-15或14-15mol％非阳离子(中性)脂质(例如，DSPC)。例如，脂质纳米颗粒可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mol％DSPC。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含35-40mol％甾醇(例如，胆固醇)。例如，脂质纳米颗粒可包含35-36、35-37、35-38、35-39、35-40、36-37、36-38、36-39、36-40、37-38、37-39、37-40、38-39、38-40或39-40mol％胆固醇。例如，脂质纳米颗粒可包含35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5或40mol％胆固醇。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含1-3mol％DMG-PEG。例如，脂质纳米颗粒可包含1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、2-2.5、2-3或2.5-3mol％DMG-PEG。例如，脂质纳米颗粒可包含1、1.5、2、2.5或3mol％DMG-PEG。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含50mol％可电离氨基脂质、10mol％DSPC、38.5mol％胆固醇和1.5mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含48mol％可电离氨基脂质、11mol％DSPC、38.5mol％胆固醇和2.5mol％PEG2000-DMG。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约2:1至约30:1的N:P比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约6:1的N:P比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约3:1的N:P比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10:1至约100:1的可电离氨基脂质组分与RNA的wt/wt比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约20:1的可电离氨基脂质组分与RNA的wt/wt比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10:1的可电离氨基脂质组分与RNA的wt/wt比。
在一些实施方案中，本公开的LNP具有约50nm至约150nm的平均直径。
在一些实施方案中，本公开的LNP具有约70nm至约120nm的平均直径。
多价疫苗
如本文提供的组合物可以包含编码相同或不同物种的两种或更多种抗原的一个RNA或多个RNA；也就是说，组合物可以是多价组合物(例如，疫苗)。在一些实施方案中，组合物包含编码两种或更多种呼吸道病毒抗原的一个RNA或多个RNA。在一些实施方案中，RNA可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多种呼吸道病毒抗原。
在一些实施方案中，两种或更多种不同的编码抗原的mRNA可以配制在相同的脂质纳米颗粒中(例如，四种NA抗原和四种HA抗原配制在单个脂质纳米颗粒中，或者流感抗原和冠状病毒抗原配制在单个脂质纳米颗粒中)。在其他实施方案中，两种或更多种不同的编码抗原的RNA可以配制在单独的脂质纳米颗粒中(每种mRNA配制在单个脂质纳米颗粒中)。然后可以将脂质纳米颗粒组合并作为单一疫苗组合物(例如，包含编码多种抗原的多种RNA)施用，或者可以单独施用。
药物制剂
本文提供了用于预防或治疗例如人和其他哺乳动物的呼吸道病毒的组合物(例如，药物组合物)、方法、药盒和试剂。本文提供的组合物可用作治疗剂或预防剂。它们可在医学上用于预防和/或治疗呼吸道病毒感染。
在一些实施方案中，如本文所述的含有RNA的呼吸道病毒疫苗可施用于受试者(例如，哺乳动物受试者，诸如人受试者)，并且RNA多核苷酸在体内被翻译以产生抗原性多肽(抗原)。
组合物(例如，包含RNA)的有效量至少部分基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA的物理特征(例如，长度、核苷酸组成和/或修饰核苷的程度)、疫苗的其他组分以及其他决定因素，诸如受试者的年龄、体重、身高、性别和总体健康状况。通常，有效量的组合物提供作为受试者细胞中抗原产生的函数的诱导或增强的免疫应答。在一些实施方案中，有效量是基于单剂量的组合疫苗或单剂量的组合疫苗加上加强剂量在受试者中预防感染或减轻呼吸道感染的严重程度所必需的量。在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一种化学修饰的RNA多核苷酸的组合物比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未修饰多核苷酸的组合物更有效。抗原产生增加可以通过细胞转染(用RNA疫苗转染的细胞的百分比)增加、多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达增加、核酸降解减少(如例如通过由修饰的多核苷酸翻译蛋白质的持续时间增加来证明)或宿主细胞的抗原特异性免疫应答发生改变来证明。
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，从而使该组合物特别适于体内或离体的诊断或治疗用途。“药学上可接受的载体”在施用于受试者或受试者身上后，不会引起不期望的生理效应。药物组合物中的载体也必须是“可接受的”，即它与活性成分相容并且能够稳定活性成分。一种或多种增溶剂可以用作用于递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以获得可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和十二烷基硫酸钠。其他合适的药物载体和稀释剂以及其使用的药物必需品在Remington'sPharmaceutical Sciences中有描述。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物(包含多核苷酸及其编码的多肽)可用于治疗或预防呼吸道病毒感染。组合物可以作为主动免疫方案的一部分向健康个体预防性或治疗性地施用，或者在感染早期在潜伏期或在症状出现后的主动感染期间施用。在一些实施方案中，向细胞、组织或受试者提供的RNA的量可以是有效用于免疫预防的量。
本文公开的疫苗可以作为组合疫苗(即，其中编码抗原的两种mRNA包含在同一制剂中)或作为单独的疫苗(即，编码第一抗原的mRNA和编码第二抗原的mRNA分开施用)施用于受试者以诱导抗原特异性免疫应答。当疫苗作为单独的疫苗施用时，两种mRNA可以同时(即，彼此相隔一小时内)或在不同时间(即，相隔超过一小时、12小时、24小时、2天、7天、2周)施用于受试者。当疫苗作为单独的疫苗施用时，两种mRNA可以施用于受试者的相同部位或不同部位(即，作为在单独的臂中的注射剂)。在一些实施方案中，组合疫苗可以是受试者接受的包含编码第一抗原(例如，流感抗原)或第二抗原(例如，PIV3抗原)的核酸的唯一疫苗。或者，疫苗可以作为初免剂量和/或加强剂量以各种组合施用。
疫苗可以施用于血清阳性或血清阴性受试者。例如，受试者可能是原初的并且不具有与具有抗原的病毒反应的抗体，其中所述抗原是由疫苗的mRNA编码的病毒抗原或其片段。这样的受试者被认为对该疫苗是血清阴性的。或者，受试者可能具有预先存在的针对由疫苗的mRNA编码的病毒抗原的抗体，因为他们先前曾感染过携带该抗原的病毒，或者可能先前已施用过一定剂量的诱导针对该抗原的抗体的疫苗(例如，mRNA疫苗)。这样的受试者被认为对该疫苗是血清阳性的。在一些情况下，受试者可能先前已暴露于病毒，但未暴露于病毒的特定变体或毒株或与该变体或毒株相关的特定疫苗。这样的受试者被认为对特定变体或毒株是血清阴性的。
因此，本公开提供了在受试者中引发针对第一抗原(例如，流感抗原)和第二抗原(例如，PIV3抗原)的强效中和抗体的组合物(例如，mRNA疫苗)。在一些实施方案中，这样的组合物可以施用于血清阳性或血清阴性受试者。血清阴性受试者可能是原初的并且不具有与受试者所免疫的特定病毒反应的抗体。血清阳性受试者可能具有预先存在的针对该特定病毒的抗体，因为他们先前曾染过该病毒、变体或毒株，或者可能先前已施用过一定剂量的诱导针对该病毒、变体或毒株的抗体的疫苗(例如，mRNA疫苗)。
在一些实施方案中，组合物包含编码至少一种(例如，一种、两种或更多种)冠状病毒抗原，诸如来自不同SARS-CoV-2突变株(在本文中也称为变体)的SARS-CoV-2抗原的mRNA。在一些实施方案中，mRNA疫苗包含在单个脂质纳米颗粒中的编码来自不同变体的SARS-CoV-2抗原的多个mRNA。
组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可以是佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物诸如疫苗时，术语“加强剂”或“加强疫苗”是指预防性组合(疫苗)组合物的额外施用。在一些实施方案中，加强疫苗包含至少一个具有编码第一、第二或第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，加强疫苗包含至少一个具有编码第一、第二和第三呼吸道病毒抗原性多肽中的每一者的ORF的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，加强疫苗包含至少一个具有编码第一、第二或第三呼吸道病毒抗原性多肽的变体的ORF的mRNA多核苷酸。
加强剂(或加强疫苗)可在预防性组合物的较早施用之后给予。在一些实施方案中，组合疫苗是季节性加强疫苗(例如，组合疫苗每年施用一次，例如每年秋季或冬季)。预防性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。在示例性实施方案中，在预防性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或6个月。在一个实施方案中，加强疫苗在组合疫苗后的三周至一年之间施用。
在一些实施方案中，组合物可以肌内、鼻内或皮内施用，类似于本领域已知的灭活疫苗的施用。
组合物可用于各种环境中，这取决于感染的流行率或未满足的医学需要的程度或水平。作为非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防多种感染性疾病。RNA疫苗具有优越的特性，因为它们与市售疫苗相比产生更大的抗体滴度、更好的中和免疫力、产生更持久的免疫应答和/或更早产生应答。
本文提供了药物组合物，其包含任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的RNA和/或复合物。
RNA可以单独或与一种或多种其他组分联合配制或施用。例如，免疫组合物可以包含其他组分，包括但不限于佐剂。
在一些实施方案中，免疫组合物不包含佐剂(它们不含佐剂)。
RNA可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种另外的活性物质，例如像治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。疫苗组合物可以是无菌的、无热原的或既无菌又无热原的。在配制和/或制造药剂诸如疫苗组合物方面的一般考虑因素可见于例如Remington:The Scienceand Practiceof Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，将免疫组合物施用于人、人患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指RNA疫苗或其中包含的多核苷酸，例如编码抗原的RNA多核苷酸(例如，mRNA多核苷酸)。
本文所述的疫苗组合物的制剂可以通过药理学领域已知或以后开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如，mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后，如果必要和/或需要，将产物分割、成型和/或包装成期望的单剂量单位或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、体型和/或状况并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％与100％之间，例如0.5％与50％之间、1％-30％之间、5％-80％之间、至少80％(w/w)之间的活性成分。
在一些实施方案中，使用一种或多种赋形剂配制RNA以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，从储库制剂中)；(4)改变生物分布(例如，针对特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变所编码蛋白质(抗原)的体内释放曲线。除了传统的赋形剂诸如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂以外，赋形剂可包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用RNA转染的细胞(例如，用于移植到受试者体内)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物以及它们的组合。
给药/施用
本文提供了用于预防和/或治疗人和其他哺乳动物的至少一种呼吸道病毒感染的免疫组合物(例如，RNA疫苗)、方法、药盒和试剂。免疫组合物可用作治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，免疫组合物用于提供针对呼吸道病毒感染的预防性保护。在一些实施方案中，免疫组合物用于治疗呼吸道病毒感染。在一些实施方案中，免疫组合物用于减轻受试者呼吸道病毒感染的严重程度。在一些实施方案中，免疫组合物用于引发免疫效应细胞，例如，以离体激活外周血单核细胞(PBMC)，然后将其输注(重新输注)至受试者体内。
受试者可以是任何哺乳动物，包括非人灵长类动物和人受试者。通常，受试者是人受试者。在一些实施方案中，受试者年龄为60岁或以上(例如，61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99岁或以上)。在一些实施方案中，受试者未满18岁(例如，未满17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁)。
在一些实施方案中，免疫组合物(例如，RNA疫苗)以有效诱导抗原特异性免疫应答的量施用于受试者(例如，哺乳动物受试者，诸如人受试者)。编码呼吸道病毒抗原的RNA在体内表达并翻译以产生抗原，然后刺激受试者的免疫应答。
在施用本公开的免疫组合物(例如，RNA疫苗)后，可实现针对呼吸道病毒的预防性保护。免疫疫苗可以施用一次、两次、三次、四次或更多次，但可能施用一次疫苗就足够了(任选地随后施用单次加强剂)。尽管不太理想，但可以向受感染个体施用免疫组合物以实现治疗应答。可能需要相应地调整剂量。
在本公开的方面中提供了一种在受试者中引发针对呼吸道病毒抗原(或多种抗原)的免疫应答的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者施用包含具有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框的mRNA的免疫组合物，从而在受试者中诱导针对呼吸道病毒抗原的特异性免疫应答，其中相对于用预防有效剂量的针对抗原的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度，在疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体滴度有所增加。“抗抗原抗体”是特异性结合至抗原的血清抗体。
预防有效剂量是在临床上可接受的水平上防止病毒感染的有效剂量。在一些实施方案中，有效剂量是疫苗包装说明书中列出的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本公开的mRNA疫苗之外的疫苗。例如，传统疫苗包括但不限于活微生物疫苗、灭活微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已获得监管部门批准和/或由国家药物监管机构(例如美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA))注册的疫苗。
在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的针对呼吸道病毒的传统疫苗进行疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，在接种疫苗后受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log至10log。在一些实施方案中，相对于用预防性有效剂量的针对呼吸道病毒的传统疫苗进行疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，在接种疫苗后受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log、2log、3log、4log、5log或10log。
在本公开的其他方面中提供了一者在受试者中引发针对呼吸道病毒的免疫应答的方法。所述方法涉及向受试者施用包含有包含编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框的RNA多核苷酸的免疫组合物(例如，RNA疫苗)，由此在受试者中诱导对呼吸道病毒具特异性的免疫应答；其中受试者中的免疫应答等同于接种有相对于所述免疫组合物2倍至100倍剂量水平的针对呼吸道病毒的传统疫苗的受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于接种有相对于本公开的免疫组合物两倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于接种有相对于本公开的免疫组合物三倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于接种有相对于本公开的免疫组合物4倍、5倍、10倍、50倍或100倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于接种有相对于本公开的免疫组合物10倍至1000倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于接种有相对于本公开的免疫组合物100倍至1000倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫应答。
在其他实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白质]抗体滴度来评估免疫应答。在其他实施方案中，使用本领域公认的技术来测量促进稳健T细胞应答的能力。
本公开的其他方面提供了在受试者中引发针对呼吸道病毒的免疫应答的方法，所述方法通过以下方式进行：向受试者施用包含具有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框的RNA的免疫组合物(例如，RNA疫苗)，由此在受试者中诱导对呼吸道病毒抗原具特异性的免疫应答，其中受试者中的免疫应答相对于接种有预防有效剂量的针对呼吸道病毒的传统疫苗的受试者中诱导的免疫应答早2天至10周诱导。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答在接种有相对于本公开的免疫组合物2倍至100倍剂量水平的预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫应答相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫应答早2天、3天、1周、2周、3周、5周或10周诱导。
本文还提供了通过向受试者施用具有编码第一抗原的开放阅读框的RNA在受试者中引发针对呼吸道病毒的免疫应答的方法，其中所述RNA不包括稳定元件，并且其中佐剂未与疫苗共同配制或共同施用。
免疫组合物(例如，RNA疫苗)可以通过产生治疗有效结果的任何途径施用。这些途径包括但不限于皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用RNA疫苗的方法。所需的确切量将根据受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等而在受试者之间变化。RNA通常被配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量均匀。然而，应当理解，RNA的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所用特定化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。
如本文提供的RNA的有效量可以低至50μg(总mRNA)，例如作为单剂量或作为两个25μg剂量施用。如本文所用，“剂量”代表组合物中RNA的总和(例如，包括制剂中的所有NA抗原和/或HA抗原)。在一些实施方案中，有效量为50μg-300μg、100μg-300μg、150μg-300μg、200μg-300μg、250μg-300μg、150μg-200μg、150μg-250μg、150μg-300μg、200μg-250μg或250μg-300μg的总剂量。例如，有效量可以为50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg或300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为66μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为67μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为68μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为132μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为133μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为134μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为266μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为267μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为268μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为200μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为300μg的总剂量。
本文所述的RNA可配制成本文所述的剂型，诸如鼻内、气管内或可注射的(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、皮内、心脏内、腹膜内和皮下)。
疫苗功效
本公开的一些方面提供了免疫组合物(例如，RNA疫苗)的制剂，其中RNA以有效量配制以在受试者中产生抗原特异性免疫应答(例如，产生呼吸道病毒抗原特异性抗体)。“有效量”是有效产生抗原特异性免疫应答的RNA剂量。本文还提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法。
如本文所用，对本公开的疫苗或LNP的免疫应答是在受试者中产生针对存在于疫苗中的(一种或多种)呼吸道病毒蛋白的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。出于本公开的目的，“体液”免疫应答是指由抗体分子(包括例如分泌性(IgA)或IgG分子)介导的免疫应答，而“细胞”免疫应答是指由T淋巴细胞(例如，CD4+辅助细胞和/或CD8+T细胞(例如，CTL)和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面包括溶细胞性T细胞(CTL)的抗原特异性应答。CTL对肽抗原具有特异性，肽抗原与由主要组织相容性复合物(MHC)编码并在细胞表面上表达的蛋白质缔合来呈递。CTL有助于诱导和促进细胞内微生物的破坏或被此类微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面包括辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞用于帮助刺激非特异性效应细胞的功能，并将其活性集中于展示与其表面MHC分子缔合的肽抗原的细胞。细胞免疫应答还导致产生细胞因子、趋化因子和由活化的T细胞和/或其他白细胞(包括源自CD4+和CD8+T细胞的白细胞)产生的其他此类分子。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答通过测量施用如本文提供的免疫组合物的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度来表征。抗体滴度是受试者体内抗体例如对特定抗原或抗原表位具有特异性的抗体的量的测量值。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。
在一些实施方案中，抗体滴度用于评估受试者是否已患有感染或确定是否需要免疫接种。在一些实施方案中，抗体滴度用于确定自身免疫应答的强度，确定是否需要加强免疫，确定先前的疫苗是否有效，以及鉴定任何最近或先前的感染。根据本公开，抗体滴度可用于确定由免疫组合物(例如，RNA疫苗)在受试者中诱导的免疫应答的强度。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可以增加至少1.5log、至少2log、至少2.5log或至少3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1log、1.5log、2log、2.5log或3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1-3log。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可以增加1-1.5log、1-2log、1-2.5log、1-3log、1.5-2log、1.5-2.5log、1.5-3log、2-2.5log、2-3log或2.5-3log。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可以增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2-10倍。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可以增加2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10倍。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答被测量为针对呼吸道病毒的血清中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)的比率，称为几何平均比率(GMR)。几何平均滴度(GMT)是通过将所有值相乘并取数字的n次方根来计算的一组受试者的平均抗体滴度，其中n是具有可用数据的受试者数量。
在一些实施方案中，对照是在尚未施用免疫组合物(例如，RNA疫苗)的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照是在施用重组或纯化蛋白疫苗的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如，细菌或酵母)中产生的或从大量病原生物体中纯化的蛋白质抗原。
在一些实施方案中，在鼠模型中测量免疫组合物(例如，RNA疫苗)有效的能力。例如，可以将免疫组合物施用于鼠模型并测定鼠模型的中和抗体滴度的诱导。病毒攻击研究也可用于评估本公开的疫苗的功效。例如，可以将免疫组合物施用于鼠模型，用病毒攻击鼠模型，并测定鼠模型的存活和/或免疫应答(例如，中和抗体应答、T细胞应答(例如，细胞因子应答))。
如本文提供的“护理标准”是指医学或心理治疗指南，并且可以是一般的或特定的。“护理标准”基于科学证据以及参与治疗给定病状的医疗专业人员之间的合作来指定适当的治疗。这是医生/临床医生针对某种类型的患者、疾病或临床情况应遵循的诊断和治疗过程。如本文提供的“标准护理剂量”是指医生/临床医生或其他医疗专业人员将在遵循治疗或预防呼吸道病毒感染或相关病状的护理标准指南时向受试者施用以治疗或预防呼吸道病毒感染或相关病状的重组或纯化蛋白疫苗、或减毒活疫苗或灭活疫苗、或VLP疫苗的剂量。
在一些实施方案中，施用有效量的免疫组合物的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度等同于施用标准护理剂量的重组或纯化蛋白疫苗、或减毒活疫苗或灭活疫苗、或VLP疫苗的对照受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度。
可以使用标准分析来评估疫苗功效(参见，例如，Weinberg等人,J InfectDis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。例如，疫苗功效可以通过双盲、随机化、临床对照试验来测量。疫苗功效可以表示为未接种疫苗(ARU)和已接种疫苗(ARV)研究群组之间疾病发作率(AR)的成比例降低，并且可以使用以下公式根据疫苗接种组中疾病的相对风险(RR)进行计算：
功效＝(ARU–ARV)/ARU x 100；并且
功效＝(1-RR)x 100。
同样，可以使用标准分析来评估疫苗有效性(参见例如Weinberg等人,J InfectDis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。疫苗有效性是对疫苗(可能已经被证明具有高疫苗功效)如何减少人群疾病的评估。此量度可以评估自然场地条件下而不是在受控临床试验中的疫苗接种程序(而不仅仅是疫苗本身)的益处和不利影响的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成正比，但也受到群体中目标组的受免疫程度以及影响住院、门诊就诊或成本的“现实世界”结果的其他非疫苗相关因素的影响。例如，可以使用回顾性病例对照分析，其中比较了一组感染病例和适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可表示为比率差异，使用尽管接种疫苗但仍发生感染的优势比(OR)：
有效性＝(1–OR)x 100。
在一些实施方案中，相对于未接种疫苗的对照受试者，免疫组合物(例如，RNA疫苗)的功效为至少60％。例如，相对于未接种疫苗的对照受试者，免疫组合物的功效可以为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％或100％。
消除性免疫。消除性免疫是指防止有效病原体感染宿主的独特免疫状态。在一些实施方案中，本公开的免疫组合物的有效量足以在受试者中提供至少1年的消除性免疫。例如，本公开的免疫组合物的有效量足以在受试者中提供至少2年、至少3年、至少4年或至少5年的消除性免疫。在一些实施方案中，本公开的免疫组合物的有效量足以在受试者中以相对于对照低至少5倍的剂量提供消除性免疫。例如，有效量可足以在受试者中以相对于对照低至少10倍、15倍或20倍的剂量提供消除性免疫。
可检测抗原。在一些实施方案中，本公开的免疫组合物的有效量足以产生如在施用后1-72小时在受试者血清中测量的可检测水平的呼吸道病毒抗原。
滴度。抗体滴度是受试者体内抗体例如对特定抗原(例如，抗呼吸道病毒抗原)具有特异性的抗体的量的测量值。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。
在一些实施方案中，本公开的免疫组合物的有效量足以产生1,000-10,000的中和抗体滴度，所述中和抗体滴度是通过在施用后1-72小时在受试者血清中测量的针对呼吸道病毒抗原的中和抗体产生的。在一些实施方案中，有效量足以产生1,000-5,000的中和抗体滴度，所述中和抗体滴度是通过在施用后1-72小时在受试者血清中测量的针对呼吸道病毒抗原的中和抗体产生的。在一些实施方案中，有效量足以产生5,000-10,000的中和抗体滴度，所述中和抗体滴度是通过在施用后1-72小时在受试者血清中测量的针对呼吸道病毒抗原的中和抗体产生的。
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100NT50。例如，中和抗体滴度可以为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NT50。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000NT50。
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100中和单位每毫升(NU/mL)。例如，中和抗体滴度可以为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NU/mL。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000NU/mL。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可以增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10log。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些实施方案中，几何平均值，即n个数的乘积的n次方根，通常用于描述成比例增长。在一些实施方案中，几何平均值用于表征受试者中产生的抗体滴度。
对照可以是例如未接种疫苗的受试者或施用减毒活病毒疫苗、灭活病毒疫苗或蛋白质亚单位疫苗的受试者。
实施例
实施例1.三重组合疫苗(流感、SARS-CoV-2、RSV)的免疫原性
在此实施例中，以高剂量(HD)和低剂量(LD)测试了包含编码流感、SARS-CoV-2和RSV抗原的mRNA的疫苗的不同组合。在本研究中，将抗原分别配制到不同的LNP中并混合，之后施用。实验如下表1所示进行。在第0天向小鼠肌内施用该剂量，并在第21天(第1次剂量后三周)和第36天(第2次剂量后两周)收集血清样本。通过ELISA针对单个HA抗原、NA抗原、RSVF前融合和SARS-CoV-2Sp2重组蛋白测量IgG抗体滴度。如下所述，在初免剂量和加强剂量后，观察到双重和三重组合的针对所有抗原的良好抗体滴度。当将NA(mRNA-1020)添加到组合中时，未发现干扰。
如图1至图4所示，在第21天，组合疫苗中其他抗原的存在没有降低针对疫苗中各单个抗原的中和滴度(例如，在组合疫苗和单个抗原疫苗之间观察到类似的中和滴度)。如图29至图33所示，在第36天(第2次剂量后)观察到类似的趋势。
图5至图7显示了使用IgG抗体的归一化几何平均滴度的结果，并且证明了与其他组合和单个抗原施用(第21天高剂量水平)相比，高剂量(第20组)的RSV/SARS-CoV-2/流感(4xHA)诱导了针对该疫苗中所有组分的强烈抗体应答。第21天低剂量水平的结果相似(图11至图13)。添加神经氨酸酶没有干扰组合物的免疫原性，因为在第21天高剂量(图8A、图8B、图9和图10)和第21天低剂量(图14A、图14B、图15和图16)的RSV/SARS-CoV-2/流感(4xHA，4xNA)组合物中观察到类似的结果。
在第36天(第2次剂量后)，结果也相似；添加编码不同抗原的mRNA对免疫原性没有实质性影响。图17至图19显示了使用IgG抗体的归一化几何平均滴度的结果，并且证明了与其他组合和单个抗原施用(第36天高剂量水平)相比，高剂量(第20组)的RSV/SARS-CoV-2/流感(4xHA)诱导了针对该疫苗中所有组分的强烈抗体应答。第21天低剂量水平的结果相似(图23至图25)。添加神经氨酸酶没有干扰组合物的免疫原性，因为在第36天高剂量(图20A、图20B、图21和图22)和第21天低剂量(图26A、图26B、图27和图28)的RSV/SARS-CoV-2/流感(4xHA，4xNA)组合物中观察到类似的结果。
表1.研究设计
/>
/>
实施例2.三重组合疫苗(流感、SARS-CoV-2、RSV)在棉鼠中的免疫原性
在此实施例中，在棉鼠中测试了包含编码流感、SARS-CoV-2和RSV抗原的mRNA的疫苗的免疫原性。在本研究中，将抗原分别配制到不同的LNP中并混合，之后施用。实验如下表2所示进行。在第0天和第28天向棉鼠肌内注射剂量。在第56天，受试者接受RSV A2(105pfu)攻击。在第28天、第56天和第61天收集血清样本，并在第61天测量肺和鼻滴度。在第56天进行进一步的ELISA以确定中和滴度。
如图33A、图33B、图34和图35所示，在第28天和第56天，组合疫苗具有免疫原性，并且组合疫苗中其他抗原的存在没有降低针对疫苗中各单个抗原的中和滴度(例如，在组合疫苗和单个抗原疫苗之间观察到类似的中和滴度)。
在第56天测量RSV A中和滴度，结果如图36所示。组合疫苗(SARS/Flu/RSV)诱导的RSV中和抗体水平与接种仅RSV mRNA疫苗产生的RSV中和抗体水平相似。就病毒滴度而言，组合疫苗完全保护受试者免受下呼吸道RSV复制(如肺病毒滴度所示，图37A)，但仅部分保护受试者免受上呼吸道复制和排放(如鼻病毒滴度所示，图37B)。
表2.研究设计
实施方案
1.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
具有编码来自第一病毒科的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；
具有编码来自第二病毒科的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
具有编码来自第三病毒科的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
其中所述第一病毒科、所述第二病毒科和所述第三病毒科各自彼此不同。
2.如实施方案1所述的疫苗，其中所述第一病毒科是正粘病毒科。
3.如实施方案2所述的疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒属。
4.如实施方案2所述的疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型流感病毒属。
5.如实施方案1-4中任一项所述的疫苗，其中所述第二病毒科是冠状病毒科，并且任选地是正冠状病毒亚科。
6.如实施方案5所述的疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型冠状病毒属。
7.如实施方案1-6中任一项所述的疫苗，其中所述第三病毒科是副粘病毒科。
8.如实施方案7所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自肺病毒亚科。
9.如实施方案8所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自呼吸道合胞病毒(RSV)。
10.如实施方案8所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自人偏肺病毒(hMPV)。
11.如实施方案7所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒属。
12.如实施方案11所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自副流感病毒。
13.如实施方案7所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自麻疹病毒属。
14.如实施方案13所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自副流感病毒。
15.如实施方案1所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少2个具有编码来自第一病毒科的第一呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
16.如实施方案1所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少2个具有编码来自第二病毒科的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
17.如实施方案1所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少2个具有编码来自第三病毒科的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
18.如实施方案1-17中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含少于15个mRNA多核苷酸。
19.如实施方案18所述的疫苗，其中所述疫苗包含3-10个mRNA多核苷酸。
20.如实施方案18所述的疫苗，其中所述疫苗包含4-10个mRNA多核苷酸。
21.如实施方案18所述的疫苗，其中所述疫苗包含5-10个mRNA多核苷酸。
22.如实施方案18所述的疫苗，其中所述疫苗包含8-9个mRNA多核苷酸。
23.如实施方案1-22中任一项所述的疫苗，其中所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸以1:1:1的比例存在于所述组合疫苗中。
24.如实施方案1-23中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少两个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
25.如实施方案1-24中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少三个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
26.如实施方案1-25中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少四个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
27.如实施方案1-26中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少两个编码冠状病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
28.如实施方案1-27中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少两个编码副粘病毒科抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
29.如实施方案1-28中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为4:1:1的编码来自所述第一病毒科:所述第二病毒科:所述第三病毒科的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
30.如实施方案1-28中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为3:1:1的编码来自所述第一病毒科:所述第二病毒科:所述第三病毒科的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
31.如实施方案1-28中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为5:1:1的编码来自所述第一病毒科:所述第二病毒科:所述第三病毒科的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
32.如实施方案1-28中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为4:2:1的编码来自所述第一病毒科:所述第二病毒科:所述第三病毒科的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
33.如实施方案1-28中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为1:2:1的编码来自所述第一病毒科:所述第二病毒科:所述第三病毒科的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
34.如实施方案1-28中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为1:2:2的编码来自所述第一病毒科:所述第二病毒科:所述第三病毒科的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
35.如实施方案1-34中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗是多价RNA组合物，所述多价RNA组合物通过包括以下的方法产生：
(a)将编码所述第一mRNA多核苷酸的线性化第一DNA分子、编码所述第二mRNA多核苷酸的线性化第二DNA分子和编码所述第三mRNA多核苷酸的线性化第三DNA分子合并到单个反应器皿中，其中所述第一DNA分子、所述第二DNA分子和所述第三DNA分子获自不同来源；以及
(b)同时体外转录所述线性化第一DNA分子、所述线性化第二DNA分子和所述线性化第三DNA分子，以获得多价RNA组合物。
36.如实施方案35所述的疫苗，其中所述不同来源是第一、第二和第三细菌细胞培养物，并且其中所述第一、第二和第三细菌细胞培养物不是共同培养的。
37.如实施方案35所述的疫苗，其中在所述IVT开始之前在反应混合物中存在的所述第一DNA分子、所述第二DNA分子和所述第三DNA分子的量已经归一化。
38.如实施方案1-37中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗是多价RNA组合物，其中所述多价RNA组合物包含大于40％的多聚A加尾的RNA。
39.如实施方案1-38中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗是多价RNA组合物，其中所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸各自的长度彼此相差至少100个核苷酸。
40.如实施方案1-39中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗是多价RNA组合物，其中所述第一、第二和第三(以及任选地，第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五)mRNA多核苷酸各自在非翻译区(UTR)，任选地5’UTR或3’UTR中包含一个或多个非编码序列。
41.如实施方案40所述的疫苗，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的上游。
42.如实施方案40所述的疫苗，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的下游。
43.如实施方案40所述的疫苗，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的ORF的最后一个密码子与所述mRNA的多聚A尾的第一个“A”之间。
44.如实施方案40所述的疫苗，其中所述非编码序列包含1至10个核苷酸。
45.如实施方案40-44中任一项所述的疫苗，其中所述非编码序列包含一个或多个RNA酶裂解位点。
46.如实施方案45所述的疫苗，其中所述RNA酶裂解位点是RNA酶H裂解位点。
47.如实施方案1-46中任一项所述的疫苗，其中所述组合疫苗中的所述mRNA多核苷酸中的每一者与所述组合疫苗中的每个其他mRNA多核苷酸互补且不对其进行干扰。
48.如实施方案1-47中任一项所述的疫苗，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者源自天然存在的抗原。
49.如实施方案1-47中任一项所述的疫苗，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者是天然存在的抗原的稳定型式。
50.如实施方案1-47中任一项所述的疫苗，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者是非天然存在的抗原。
51.如实施方案1-48中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗还包含编码变体呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸，其中所述变体是所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中的任一者的变体。
52.如实施方案1-51中任一项所述的疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽选自由MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1组成的组。
53.如实施方案1-52中任一项所述的疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV组成的组。
54.如实施方案1-53中任一项所述的疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感HA和/或流感NA。
55.如实施方案1-54中任一项所述的疫苗，其中所述抗原性多肽包括融合(F)蛋白、刺突(S)蛋白和血凝素抗原(HA)。
56.如实施方案1-55中任一项所述的疫苗，所述疫苗还包含至少一个脂质纳米颗粒(LNP)。
57.如实施方案56所述的疫苗，其中所述LNP包含摩尔比为20％-60％的可电离氨基脂质、5％-25％的非阳离子脂质、25％-55％的甾醇和0.5％-15％的PEG修饰的脂质。
58.一种用于对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用组合疫苗，其中所述组合疫苗包含具有编码来自第一病毒科的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；具有编码来自第二病毒科的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和具有编码来自第三病毒科的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；其中所述第一病毒科、所述第二病毒科和所述第三病毒科彼此不同。
59.如实施方案58所述的方法，其中所述受试者年龄为65岁或以上。
60.如实施方案58所述的方法，其中所述受试者未满18岁。
61.如实施方案58所述的方法，其中所述方法预防所述受试者的呼吸道感染。
62.如实施方案58所述的方法，其中所述方法减轻所述受试者的呼吸道感染的严重程度。
63.如实施方案58所述的方法，其中所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阴性的。
64.如实施方案58所述的方法，其中所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阴性的。
65.如实施方案58所述的方法，其中所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阳性的。
64.如实施方案58所述的方法，其中所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阳性的。
65.如实施方案58-64中任一项所述的方法，所述方法还包括施用加强疫苗。
66.如实施方案65所述的方法，其中所述加强疫苗在所述组合疫苗后3周至1年之间施用。
67.如实施方案65或66所述的方法，其中所述加强疫苗包含至少一个具有编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
68.如实施方案65或66所述的方法，其中所述加强疫苗包含至少一个具有编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽和所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中的每一者的ORF的mRNA多核苷酸。
69.如实施方案65或66所述的方法，其中所述加强疫苗包含至少一个具有编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的变体的ORF的mRNA多核苷酸。
70.如实施方案58-69中任一项所述的方法，其中所述组合疫苗是季节性加强疫苗。
71.如实施方案58-70中任一项所述的方法，其中所述组合疫苗是如实施方案1-58中任一项所述的疫苗。
72.一种预防呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度的方法，所述方法是通过基于单剂量或单剂量加上加强剂向受试者施用有效量的实施方案1-57中任一项所述的疫苗以预防所述受试者的呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度来实现的。
73.如实施方案58-72中任一项所述的方法，其中将所述组合疫苗以20μg或50μg的剂量施用于所述受试者。
等效方案
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均以引用的方式并入，就每个所引用的主题而言，在一些情况下，可以涵盖文档的全部内容。
除非明确地相反指示，否则如本文在说明书和实施方案和/或权利要求中所用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为意指“至少一个/一种”。
还应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于所叙述方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及以上说明书中，所有过渡性短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由…构成”等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡性短语“由…组成”和“基本上由…组成”应分别是如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述的封闭式或半封闭式过渡性短语。
在数值之前的术语“约”和“基本上”意指所列举数值的±10％。
在提供值范围的情况下，在该范围的上端和下端之间并且包括该范围的上端和下端的每个值在本文中被具体考虑和描述。
序列表
<110> 摩登纳特斯有限公司(ModernaTX, Inc.)
<120> 呼吸道病毒组合疫苗
<130> M1378.70177WO00
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 63/322,121
<151> 2022-03-21
<150> US 63/241,959
<151> 2021-09-08
<150> US 63/175,011
<151> 2021-04-14
<150> US 63/174,463
<151> 2021-04-13
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> SARS-CoV2
<400> 1
Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> SARS-CoV2
<400> 2
Lys Pro Ser Lys Arg
1 5
<210> 3
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 3
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccacc 47
<210> 4
<211> 57
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 4
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag accccggcgc cgccacc 57
<210> 5
<211> 119
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 5
ugauaauagg cuggagccuc gguggccaug cuucuugccc cuugggccuc cccccagccc 60
cuccuccccu uccugcaccc guacccccgu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcggc 119
<210> 6
<211> 119
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 6
ugauaauagg cuggagccuc gguggccuag cuucuugccc cuugggccuc cccccagccc 60
cuccuccccu uccugcaccc guacccccgu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcggc 119
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 7
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> R是A或G
<400> 8
ccrccaugg 9
<210> 9
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 9
gggauccuac c 11
Claims (189)
1.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
以及脂质纳米颗粒(LNP)。
2.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；
以及脂质纳米颗粒。
3.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；
包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；
以及脂质纳米颗粒。
4.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；
包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；
包含编码来自第六病毒的第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第六mRNA多核苷酸；
以及脂质纳米颗粒。
5.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；
包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；
包含编码来自第六病毒的第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第六mRNA多核苷酸；
包含编码来自第七病毒的第七呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第七mRNA多核苷酸；
以及脂质纳米颗粒。
6.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
包含编码来自第四病毒的第四呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第四mRNA多核苷酸；
包含编码来自第五病毒的第五呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第五mRNA多核苷酸；
包含编码来自第六病毒的第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第六mRNA多核苷酸；
包含编码来自第七病毒的第七呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第七mRNA多核苷酸；
包含编码来自第八病毒的第八呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第八mRNA多核苷酸；
以及脂质纳米颗粒。
7.如权利要求6所述的组合疫苗，其中所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒来自流感病毒科正粘病毒科。
8.如权利要求7所述的组合疫苗，其中所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒选自甲型流感病毒和乙型流感病毒。
9.如权利要求8所述的组合疫苗，其中所述第五病毒和所述第六病毒来自病毒科冠状病毒科。
10.如权利要求9所述的组合疫苗，其中所述第五病毒和所述第六病毒来自正冠状病毒亚科。
11.如权利要求10所述的组合疫苗，其中所述第五病毒和所述第六病毒是冠状病毒。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合疫苗，其中所述第七病毒和所述第八病毒是非流感非冠状病毒呼吸道病毒。
13.如权利要求1-11中任一项所述的组合疫苗，其中所述第七病毒和所述第八病毒来自病毒科副粘病毒科。
14.如权利要求13所述的组合疫苗，其中所述第七病毒和所述第八病毒来自病毒亚科肺病毒亚科。
15.如权利要求14所述的组合疫苗，其中所述第七病毒和所述第八病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)并且/或者其中所述第七病毒和所述第八病毒来自人偏肺病毒(hMPV)。
16.如权利要求13所述的组合疫苗，其中所述第七病毒和所述第八病毒来自副粘病毒属或亚科。
17.如权利要求16所述的组合疫苗，其中所述第七病毒和所述第八病毒是副流感病毒。
18.如权利要求13所述的组合疫苗，其中所述第七病毒和所述第八病毒来自麻疹病毒属或亚科。
19.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第二病毒和所述第三病毒彼此不同并且与所述流感病毒不同。
20.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第二病毒是选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
21.如权利要求1-6中任一项所述的疫苗，其中所述第三病毒选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1病毒组成的组。
22.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型流感病毒。
23.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒。
24.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是血凝素抗原(HA)或神经氨酸酶抗原(NA)。
25.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型冠状病毒。
26.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自SARS-CoV。
27.如权利要求1-6中任一项所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自HCoV。
28.如权利要求1-6或20-27中任一项所述的组合疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自呼吸道合胞病毒(RSV)。
29.如权利要求1-6或20-27中任一项所述的组合疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽来自人偏肺病毒(hMPV)。
30.如权利要求1-6或20-27中任一项所述的组合疫苗，其中所述第三呼吸道病毒抗原性多肽选自副流感病毒、鼻病毒、亨德拉病毒或尼帕病毒。
31.如权利要求1-13中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含至少2个包含编码流感病毒抗原的ORF的mRNA多核苷酸。
32.如权利要求1-31中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含2-4个包含编码流感病毒抗原的ORF的mRNA多核苷酸。
33.如权利要求1-31中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含至少2个包含编码来自第二病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
34.如权利要求1-31中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含至少2个包含编码来自第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
35.如权利要求1-34中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含少于15个mRNA多核苷酸。
36.如权利要求1-35中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含少于12个mRNA多核苷酸。
37.如权利要求35或36所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含3-10个mRNA多核苷酸。
38.如权利要求35或36所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含4-10个mRNA多核苷酸。
39.如权利要求35或36所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含5-10个mRNA多核苷酸。
40.如权利要求35或36所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含8-9个mRNA多核苷酸。
41.如权利要求1-40中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含至少三个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
42.如权利要求41所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含至少八个编码流感病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
43.如权利要求42所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含至少两个编码冠状病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸和至少两个编码副粘病毒科抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
44.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸以1:1:1的比例存在于所述组合疫苗中。
45.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为4:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
46.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为3:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
47.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为5:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
48.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为4:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
49.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为1:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
50.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为1:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
51.如权利要求1-43中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗包含比例为8:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
52.如权利要求51所述的组合疫苗，其中所述第一病毒的所述呼吸道病毒抗原性多肽包含比例为4:4的HA和NA。
53.如权利要求1-52中任一项所述的组合疫苗，其中所述组合疫苗中的所述mRNA多核苷酸中的每一者与所述组合疫苗中的每个其他mRNA多核苷酸互补且不对其进行干扰。
54.如权利要求1-52中任一项所述的组合疫苗，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者源自天然存在的抗原。
55.如权利要求1-52中任一项所述的组合疫苗，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者是天然存在的抗原的稳定型式。
56.如权利要求1-52中任一项所述的组合疫苗，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者是非天然存在的抗原。
57.如权利要求1-56中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗还包含编码结构改变的变体呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸，其中所述结构改变的变体是所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中的任一者的结构改变的变体。
58.如权利要求1-56中任一项所述的组合疫苗，其中所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸中的至少一者是多顺反子性的。
59.如权利要求1-56中任一项所述的组合疫苗，其中所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸中的每一者是多顺反子性的。
60.一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含
包含编码来自第一病毒的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
其中所述多价RNA组合物包含大于40％的多聚A加尾的RNA，并且/或者所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和/或所述第三mRNA多核苷酸各自的长度彼此相差至少100个核苷酸。
61.如权利要求60所述的多价RNA组合物，其中所述组合物通过包括以下的方法产生：
(a)将编码所述第一mRNA多核苷酸的线性化第一DNA分子、编码所述第二mRNA多核苷酸的线性化第二DNA分子和编码所述第三mRNA多核苷酸的线性化第三DNA分子合并到单个反应器皿中，其中所述第一DNA分子、所述第二DNA分子和所述第三DNA分子获自不同来源；以及
(b)同时体外转录所述线性化第一DNA分子、所述线性化第二DNA分子和所述线性化第三DNA分子，以获得多价RNA组合物。
62.如权利要求61所述的多价RNA组合物，其中所述不同来源是第一、第二和第三细菌细胞培养物，并且其中所述第一、第二和第三细菌细胞培养物不是共同培养的。
63.如权利要求61所述的多价RNA组合物，其中在所述IVT开始之前在反应混合物中存在的所述第一DNA分子、所述第二DNA分子和所述第三DNA分子的量已经归一化。
64.如权利要求60-63中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述第一病毒来自病毒科正粘病毒科流感病毒。
65.如权利要求64所述的多价RNA组合物，其中所述第一病毒是流感病毒。
66.如权利要求65所述的多价RNA组合物，其中所述第二病毒来自病毒科冠状病毒科。
67.如权利要求66所述的多价RNA组合物，其中所述第二病毒来自正冠状病毒亚科。
68.如权利要求67所述的多价RNA组合物，其中所述第二病毒是冠状病毒。
69.如权利要求68所述的多价RNA组合物，其中所述第二病毒是选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
70.如权利要求60-69中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述第三病毒来自病毒科副粘病毒科。
71.如权利要求70所述的多价RNA组合物，其中所述第三病毒来自病毒亚科肺病毒亚科。
72.如权利要求70所述的多价RNA组合物，其中所述第三病毒来自副粘病毒属或亚科。
73.如权利要求70所述的多价RNA组合物，其中所述第三病毒来自麻疹病毒属或亚科。
74.如权利要求70所述的多价RNA组合物，其中所述第三病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)和/或副流感病毒。
75.如权利要求60-74中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述第三病毒选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1病毒组成的组。
76.一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含
2-15个mRNA多核苷酸，所述mRNA多核苷酸各自包含编码呼吸道病毒抗原性多肽的不同开放阅读框(ORF)，其中每个mRNA多核苷酸在非翻译区(UTR)，任选地5’UTR或3’UTR中包含一个或多个非编码序列。
77.如权利要求76所述的多价RNA组合物，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的上游。
78.如权利要求76所述的多价RNA组合物，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的下游。
79.如权利要求76所述的多价RNA组合物，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的ORF的最后一个密码子与所述mRNA的多聚A尾的第一个“A”之间。
80.如权利要求76所述的多价RNA组合物，其中所述非编码序列包含1至10个核苷酸。
81.如权利要求76-80中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述非编码序列包含一个或多个RNA酶裂解位点。
82.如权利要求81所述的多价RNA组合物，其中所述RNA酶裂解位点是RNA酶H裂解位点。
83.如权利要求76-82中任一项所述的多价RNA组合物，其中至少一种呼吸道病毒抗原性多肽来自病毒科正粘病毒科流感病毒。
84.如权利要求83所述的多价RNA组合物，其中所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是流感病毒抗原。
85.如权利要求76-82中任一项所述的多价RNA组合物，其中至少一种呼吸道病毒抗原性多肽来自病毒科冠状病毒科，任选地是正冠状病毒亚科。
86.如权利要求85所述的多价RNA组合物，其中所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是冠状病毒抗原。
87.如权利要求86所述的多价RNA组合物，其中所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是选自由以下组成的组的冠状病毒抗原：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
88.如权利要求76-82中任一项所述的多价RNA组合物，其中至少一种呼吸道病毒抗原性多肽来自病毒科副粘病毒科，任选地来自病毒亚科肺病毒亚科、副粘病毒或麻疹病毒。
89.如权利要求88所述的多价RNA组合物，其中所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽是呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)和/或副流感病毒。
90.如权利要求76-82中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述至少一种呼吸道病毒抗原性多肽选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1病毒组成的组。
91.一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含
包含编码来自第一病毒的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；
包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和
包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；
其中所述呼吸道病毒抗原性多肽中的至少一者源自天然存在的抗原或天然存在的抗原的稳定型式，并且所述多价RNA组合物还包含编码结构改变的变体呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸，其中所述结构改变的变体是所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中任一者的结构改变的变体，并且
其中所述第二病毒和所述第三病毒彼此不同并且与流感病毒不同。
92.如权利要求91所述的多价RNA组合物，其中所述第一病毒是流感病毒。
93.如权利要求91或92所述的多价RNA组合物，其中所述第二病毒是选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
94.如权利要求91-93中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述第三病毒选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV组成的组。
95.如权利要求91-94中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述结构改变的变体是所述第一呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体。
96.如权利要求91-94中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述结构改变的变体是所述第二呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体。
97.如权利要求91-94中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述结构改变的变体是所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体。
98.一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含
5至15个信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸各自包含编码不同呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)，其中所述呼吸道病毒抗原性多肽源自三个不同的病毒科；以及脂质纳米颗粒。
99.如权利要求98所述的多价RNA组合物，其中所述三个病毒科包括流感病毒、冠状病毒和副粘病毒科。
100.如权利要求98所述的多价RNA组合物，其中所述组合物具有3-6个包含编码流感抗原的ORF的mRNA多核苷酸。
101.如权利要求98-100中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合物具有1-5个包含编码冠状病毒抗原的ORF的mRNA多核苷酸。
102.如权利要求98-101中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合物具有1-4个包含编码源自hMPV、PIV3、RSV和/或MEV的抗原的ORF的mRNA多核苷酸。
103.一种多价RNA组合物，所述多价RNA组合物包含
一组至少6个信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸各自包含编码来自第一病毒、第二病毒或第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)；其中所述组合物包含比例为4:1:1、4:2:2、4:2:1、4:3:2、4:3:3、4:3:2或4:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
104.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和所述第三mRNA多核苷酸以1:1:1的比例存在于所述组合疫苗中。
105.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合疫苗包含比例为4:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
106.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合疫苗包含比例为3:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
107.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合疫苗包含比例为5:1:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
108.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合疫苗包含比例为4:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
109.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合疫苗包含比例为1:2:1的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
110.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合疫苗包含比例为1:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
111.如权利要求60-103中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述组合疫苗包含比例为8:2:2的编码来自所述第一病毒:所述第二病毒:所述第三病毒的呼吸道病毒抗原性多肽的mRNA多核苷酸。
112.如权利要求60-111中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述抗原性多肽包括融合(F)蛋白、刺突(S)蛋白和血凝素抗原(HA)。
113.如权利要求60-111中任一项所述的多价RNA组合物，所述多价RNA组合物还包含至少一个脂质纳米颗粒(LNP)。
114.如权利要求113所述的多价RNA组合物，其中所述LNP包含摩尔比为20％-60％的可电离氨基脂质、5％-25％的非阳离子脂质、25％-55％的甾醇和0.5％-15％的PEG修饰的脂质。
115.如权利要求114所述的多价RNA组合物，其中所述可电离氨基脂质包含化合物1的结构：
116.如权利要求1-59中任一项所述的变体或如权利要求60-111中任一项所述的多价RNA组合物，其中所述抗原性多肽包括细胞表面糖蛋白。
117.一种用于对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用组合疫苗，其中所述组合疫苗包含有包含编码来自第一病毒的第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸；和包含编码来自第三病毒的第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三mRNA多核苷酸；其中第一病毒科、第二病毒科和第三病毒科各自彼此不同。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述受试者年龄为65岁或以上。
119.如权利要求117所述的方法，其中所述受试者未满18岁。
120.如权利要求117所述的方法，其中所述方法预防所述受试者的呼吸道感染。
121.如权利要求117所述的方法，其中所述方法减轻所述受试者的呼吸道感染的严重程度。
122.如权利要求117所述的方法，其中所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阴性的。
123.如权利要求117所述的方法，其中所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阴性的。
124.如权利要求117所述的方法，其中所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阳性的。
125.如权利要求117所述的方法，其中所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阳性的。
126.如权利要求117-125中任一项所述的方法，所述方法还包括施用加强疫苗。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述加强疫苗在所述组合疫苗后3周至1年之间施用。
128.如权利要求126或127所述的方法，其中所述加强疫苗包含至少一个包含编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
129.如权利要求126或127所述的方法，其中所述加强疫苗包含至少一个包含编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽和所述第三呼吸道病毒抗原性多肽中每一者的ORF的mRNA多核苷酸。
130.如权利要求126或127所述的方法，其中所述加强疫苗包含至少一个包含编码所述第一呼吸道病毒抗原性多肽、所述第二呼吸道病毒抗原性多肽或所述第三呼吸道病毒抗原性多肽的结构改变的变体的ORF的mRNA多核苷酸。
131.如权利要求117-130中任一项所述的方法，其中所述组合疫苗是季节性加强疫苗。
132.如权利要求117-131中任一项所述的方法，其中所述组合疫苗是如权利要求1-116中任一项所述的疫苗。
133.一种预防呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度的方法，所述方法是通过基于单剂量或单剂量加上加强剂向受试者施用有效量的权利要求1-116中任一项所述的组合疫苗以预防所述受试者的呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度来实现的。
134.如权利要求117-133中任一项所述的方法，其中将所述组合疫苗以50μg的剂量施用于所述受试者。
135.如权利要求117-133中任一项所述的方法，其中所述疫苗的各RNA多核苷酸配制在单独的LNP中。
136.如权利要求117-133中任一项所述的方法，其中所述疫苗的所述RNA多核苷酸共同配制在LNP中。
137.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是来自流感病毒科正粘病毒科的流感病毒抗原；和包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽是来自病毒科副粘病毒科的抗原；以及脂质纳米颗粒。
138.一种组合疫苗，所述组合疫苗包含
包含编码第一呼吸道病毒抗原性多肽的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是来自病毒科冠状病毒科的冠状病毒抗原；和包含编码来自第二病毒的第二呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第二mRNA多核苷酸，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽是来自病毒科副粘病毒科的抗原；以及脂质纳米颗粒(LNP)。
139.如权利要求137或138所述的组合疫苗，所述组合疫苗还包含有包含编码第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽的ORF的第三、第四、第五和第六病毒mRNA多核苷酸。
140.如权利要求139所述的组合疫苗，其中所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒和乙型流感病毒。
141.如权利要求139所述的组合疫苗，其中所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒科。
142.如权利要求139所述的组合疫苗，其中所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自正冠状病毒亚科。
143.如权利要求139所述的组合疫苗，其中所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒。
144.如权利要求139所述的组合疫苗，其中所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自非流感非冠状病毒呼吸道病毒。
145.如权利要求139所述的组合疫苗，其中所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒科。
146.如权利要求139所述的组合疫苗，其中所述第三、第四、第五和第六呼吸道病毒抗原性多肽来自肺病毒亚科。
147.如权利要求137所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒和乙型流感病毒。
148.如权利要求138所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒科。
149.如权利要求138所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自正冠状病毒亚科。
150.如权利要求138所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自冠状病毒。
151.如权利要求137或138所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒科。
152.如权利要求137或138所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自肺病毒亚科。
153.如权利要求137或138所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自呼吸道合胞病毒(RSV)和/或来自人偏肺病毒(hMPV)。
154.如权利要求137或138所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自副粘病毒属或亚科。
155.如权利要求137或138所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自副流感病毒。
156.如权利要求137或138所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽来自麻疹病毒属或亚科。
157.如权利要求138所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自选自由以下组成的组的冠状病毒：MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH和HCoV-HKU1。
158.如权利要求137或138所述的组合疫苗，其中所述第二呼吸道病毒抗原性多肽选自由hMPV、PIV3、RSV和MEV、亨德拉病毒、尼帕病毒和PIV1病毒组成的组。
159.如权利要求137所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自乙型流感病毒。
160.如权利要求137所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽来自甲型流感病毒。
161.如权利要求137所述的组合疫苗，其中所述第一呼吸道病毒抗原性多肽是血凝素抗原(HA)或神经氨酸酶抗原(NA)。
162.如权利要求137-161中任一项所述的组合疫苗，其中所述疫苗包含大于40％的多聚A加尾的RNA，并且/或者所述第一mRNA多核苷酸、所述第二mRNA多核苷酸和/或所述第三mRNA多核苷酸各自的长度彼此相差至少100个核苷酸。
163.如权利要求162所述的组合疫苗，其中所述组合物通过包括以下的方法产生：
(a)将编码所述第一mRNA多核苷酸的线性化第一DNA分子和编码所述第二mRNA多核苷酸的线性化第二DNA分子合并到单个反应器皿中，其中所述第一DNA分子和所述第二DNA分子获自不同来源；以及
(b)同时体外转录所述线性化第一DNA分子和所述线性化第二DNA分子，以获得多价RNA组合物。
164.如权利要求163所述的组合疫苗，其中在所述IVT开始之前在反应混合物中存在的所述第一DNA分子和所述第二DNA分子的量已经归一化。
165.如权利要求137-164中任一项所述的组合疫苗，其中所述mRNA多核苷酸各自在非翻译区(UTR)，任选地5’UTR或3’UTR中包含一个或多个非编码序列。
166.如权利要求165所述的组合疫苗，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的上游。
167.如权利要求165所述的组合疫苗，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的多聚A尾的下游。
168.如权利要求165所述的组合疫苗，其中所述非编码序列位于mRNA的3’UTR中，在所述mRNA的ORF的最后一个密码子与所述mRNA的多聚A尾的第一个“A”之间。
169.如权利要求165所述的组合疫苗，其中所述非编码序列包含1至10个核苷酸。
170.如权利要求165-169中任一项所述的组合疫苗，其中所述非编码序列包含一个或多个RNA酶裂解位点。
171.如权利要求170所述的组合疫苗，其中所述RNA酶裂解位点是RNA酶H裂解位点。
172.如权利要求137-171中任一项所述的组合疫苗，其中所述LNP包含摩尔比为20％-60％的可电离氨基脂质、5％-25％的非阳离子脂质、25％-55％的甾醇和0.5％-15％的PEG修饰的脂质。
173.如权利要求172所述的组合疫苗，其中所述可电离氨基脂质包含化合物1的结构：
174.如权利要求137-173中任一项所述的组合疫苗，其中所述抗原性多肽包括细胞表面糖蛋白。
175.一种用于对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用权利要求137-174中任一项所述的组合疫苗。
176.如权利要求175所述的方法，其中所述受试者年龄为65岁或以上。
177.如权利要求175所述的方法，其中所述受试者未满18岁。
178.如权利要求175所述的方法，其中所述方法预防所述受试者的呼吸道感染。
179.如权利要求175所述的方法，其中所述方法减轻所述受试者的呼吸道感染的严重程度。
180.如权利要求175所述的方法，其中所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阴性的。
181.如权利要求175所述的方法，其中所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阴性的。
182.如权利要求175所述的方法，其中所述受试者对所述抗原性多肽中的至少一者是血清阳性的。
183.如权利要求175所述的方法，其中所述受试者对全部所述抗原性多肽是血清阳性的。
184.如权利要求175-183中任一项所述的方法，所述方法还包括施用加强疫苗。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述加强疫苗在所述组合疫苗后3周至1年之间施用。
186.一种预防呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度的方法，所述方法是通过基于单剂量或单剂量加上加强剂向受试者施用有效量的权利要求137-174中任一项所述的组合疫苗以预防所述受试者的呼吸道感染或减轻呼吸道感染的严重程度来实现的。
187.如权利要求175-186中任一项所述的方法，其中将所述组合疫苗以50μg的剂量施用于所述受试者。
188.如权利要求175-186中任一项所述的方法，其中所述疫苗的各RNA多核苷酸配制在单独的LNP中。
189.如权利要求175-186中任一项所述的方法，其中所述疫苗的所述RNA多核苷酸共同配制在LNP中。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63/174,463 | 2021-04-13 | ||
| US63/175,011 | 2021-04-14 | ||
| US63/241,959 | 2021-09-08 | ||
| US202263322121P | 2022-03-21 | 2022-03-21 | |
| US63/322,121 | 2022-03-21 | ||
| PCT/US2022/024497 WO2022221335A1 (en) | 2021-04-13 | 2022-04-12 | Respiratory virus combination vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117750973A true CN117750973A (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=90281538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280041649.0A Pending CN117750973A (zh) | 2021-04-13 | 2022-04-12 | 呼吸道病毒组合疫苗 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117750973A (zh) |
-
2022
- 2022-04-12 CN CN202280041649.0A patent/CN117750973A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230108894A1 (en) | Coronavirus rna vaccines | |
| US20210228707A1 (en) | Coronavirus rna vaccines | |
| US20230338506A1 (en) | Respiratory virus immunizing compositions | |
| US20230355743A1 (en) | Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines | |
| US20240100151A1 (en) | Variant strain-based coronavirus vaccines | |
| JP2024050973A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡドメインワクチン | |
| WO2022221335A9 (en) | Respiratory virus combination vaccines | |
| WO2022221440A1 (en) | Influenza-coronavirus combination vaccines | |
| EP3746090A1 (en) | Rsv rna vaccines | |
| WO2018170347A1 (en) | Zoonotic disease rna vaccines | |
| CN117529335A (zh) | 爱泼斯坦-巴尔病毒mrna疫苗 | |
| WO2023283642A2 (en) | Pan-human coronavirus concatemeric vaccines | |
| WO2023283651A1 (en) | Pan-human coronavirus vaccines | |
| WO2023283645A1 (en) | Pan-human coronavirus domain vaccines | |
| EP4355891A1 (en) | Coronavirus glycosylation variant vaccines | |
| WO2022266010A1 (en) | Mrna vaccines encoding flexible coronavirus spike proteins | |
| WO2023092069A1 (en) | Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use | |
| CN117750973A (zh) | 呼吸道病毒组合疫苗 | |
| CN117750972A (zh) | 流感-冠状病毒组合疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |