CN111328344A - 增强的启动子 - Google Patents

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Abstract

新的启动子，其包含：(i) hCMV增强子序列；(ii) hCMV启动子序列；(iii)剪接供体区域；(iv)细胞‑来源的增强子序列；和(v)剪接受体区域。

Description

增强的启动子
发明领域
本发明处于用于载体、诸如质粒或病毒、尤其是病毒载体、诸如腺病毒载体中的启动子的领域中。具体而言，本发明涉及增强的人CMV启动子。
发明背景
术语“载体”是指含有或携带遗传物质且可以用于将外源基因引入生物体的试剂(诸如质粒或病毒)。腺病毒载体是载体类型的一个实例。
当载体已将遗传物质递送至生物体的细胞时，可以使用RNA聚合酶从递送的DNA转录RNA。RNA聚合酶可以识别特定的启动子元件，实现与该启动子元件连接的DNA序列的转录。
启动子是允许RNA聚合酶的结合并指导DNA的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于靠近转录起始位点的DNA的非编码区域中。在转录的起始中发挥功能的启动子内的序列元件经常通过共有核苷酸序列表征。
载体经常被称为包含“表达盒”。所述表达盒包含目标遗传物质，其以允许宿主细胞中的目标DNA的转基因转录、翻译和/或表达的方式与调节组分可操作连接。所述启动子是这些调节组分之一。如果目标DNA序列(例如，基因)与侧接该基因的载体序列异源，则可以将其称为“转基因”。
启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括猿猴和人)的启动子。大量表达控制序列(包括内部的、天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子)是本领域中已知的。
可得的启动子的实例包括但不限于，TBG启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子(任选地与增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子一起，参见，例如，Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985))、CASI启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子(Invitrogen)。
所述CMV启动子是强烈且普遍活性的。其具有在许多组织类型中驱动高水平的转基因表达的能力，并且是本领域中众所周知的。
所述CASI启动子是合成启动子，其被描述为CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和侧接泛素(UBC)增强子的剪接供体和剪接受体的组合(US 8865881)。SEQ ID NO:2是编码CASI启动子的多核苷酸序列。
在本领域中需要新的启动子。
发明概述
本发明涉及新的启动子。更具体地，本发明涉及新的人CMV启动子。
本发明提供了启动子，其包含：
(i) hCMV增强子序列；
(ii) hCMV启动子序列；
(ii) 剪接供体区域；
(iv) 细胞-来源的增强子序列；和
(v) 剪接受体区域。
术语“细胞-来源的”意指所述启动子获得自真核(例如人)细胞。
在一个优选实施方案中，所述细胞-来源的增强子序列是泛素(UBC)增强子序列。
在另一个优选实施方案中，所述启动子的组分(i)至(v)以上面列出的顺序提供，即组分(i)是第一，(ii)是第二，(iii)是第三，(iv)是第四且(v)是第五。在另一个实施方案中，两个增强子(即组分(i)和(iv))的顺序可以交换。
在一个实施方案中，所述启动子包含以下序列中的一个或多个：
(i) hCMV增强子；和
(ii) SEQ ID NO:8的hCMV启动子序列；和/或
(iii) SEQ ID NO:10的剪接供体区域；和/或
(iv) SEQ ID NO:11的UBC增强子序列；和/或
(v) SEQ ID NO:12的剪接受体区域。
在一些实施方案中，所述启动子包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12的至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或更多序列同一性。在一些实施方案中，所述启动子的部分(i)至(v)由相关序列组成。
在一个实施方案中，所述启动子包含：
(i) hCMV增强子；和
(ii) SEQ ID NO:8的hCMV启动子序列；和
(iii) SEQ ID NO:10的剪接供体区域；
(iv) SEQ ID NO:11的UBC增强子序列；和
(v) SEQ ID NO:12的剪接受体区域。
在一个实施方案中，所述增强子进一步包含：
(vi) β-肌动蛋白序列的片段。
在包含β-肌动蛋白序列的片段的该实施方案中，所述鸡β-肌动蛋白序列的片段优选包含鸡β肌动蛋白序列的5'非翻译区域并且不含启动子序列。在一个实施方案中，所述鸡β肌动蛋白序列可以与SEQ ID NO:9具有至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或更多序列同一性。在包含(vi)β-肌动蛋白序列的片段的一个实施方案中，该片段优选地存在于hCMV启动子区域(ii)和剪接供体区域(iii)之间。
在另一个方面，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少约84.1%或更多同一性的新的启动子。在一些实施方案中，所述启动子可以包括与SEQ ID NO:3具有至少约84.5%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%或更多序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述启动子可以包括与SEQ ID NO:3具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或更多序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列或由其组成。
在另一个方面，本发明涉及含有上述新的启动子的载体，诸如腺病毒载体或质粒。上面关于启动子描述的所有特征都可以并入载体中。例如，在一个实施方案中，本发明提供了本发明的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含表达盒，其中所述表达盒包含转基因和启动子，其中所述启动子包含：
(i) hCMV增强子序列；
(ii) hCMV启动子序列；
(iii) 剪接供体区域；
(iv) 细胞-来源的增强子序列；和
(v) 剪接受体区域。
本发明的载体的另一个实例是包含表达盒的腺病毒载体，其中所述表达盒包含转基因和启动子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:3具有至少84.1%同一性的核酸序列。
在一个进一步实例中，载体(例如腺病毒载体)包含第一表达盒和第二表达盒，其中每个表达盒都包含转基因和启动子，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒的启动子是上述新的启动子。在一个实施方案中，所述第一表达盒包含所述启动子。在另一个实施方案中，所述第二表达盒包含所述启动子。
例如，在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体包含第一表达盒和第二表达盒，其中每个表达盒都包含转基因和启动子，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒的启动子是包含以下的启动子：
(i) hCMV增强子序列；
(ii) hCMV启动子序列；
(iii) 剪接供体区域；
(iv) 细胞-来源的序列；和
(v) 剪接受体区域。
在一个额外实例中，腺病毒载体包含第一表达盒和第二表达盒，其中每个表达盒都包含转基因和启动子，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒的启动子是与SEQ IDNO:3具有至少84.1%同一性的启动子。
本发明的载体(例如腺病毒载体)可用作免疫原性组合物的组分，其用于诱导受试者中的免疫应答，其在治疗中的使用方法和制造方法。本发明的腺病毒载体优选源自非人猿猴腺病毒，也称为“猿猴腺病毒”。优选地，本发明的猿猴腺病毒载体是黑猩猩腺病毒(例如ChAd155或ChAd83)。
本发明还提供了包含上面提及的腺病毒载体和药学上可接受的赋形剂的组合物。此外，本发明提供了上面提及的腺病毒载体或包含这种腺病毒载体的组合物，其用作药物、疫苗和/或用于治疗或预防疾病。
本发明还提供了诱导受试者中的免疫应答的方法，其包括将上面提及的腺病毒载体或上述组合物施用于所述受试者。本发明的载体或组合物可以用于制造用于预防或治疗疾病的药物。
附图描述
图1：根据本发明的具有双重表达盒的猿猴腺病毒构建体。反向末端重复区(ITR)侧接3'和5'末端；人CMV (hCMV)是巨细胞病毒启动子；增强的hCMV是增强的巨细胞病毒启动子；N-M2-1和FΔTM是RSV抗原；WPRE是土拨鼠肝炎转录后调节元件；∆E3表示早期基因3被缺失；纤突表示编码纤突蛋白的腺病毒基因；且Ad5E4orf6是在早期基因4(E4)区域中的替代物。
图1的载体通过如下构建：插入第一转基因表达盒代替腺病毒基因组的E1区域，且在HE2区域中，即在右ITR的下游，插入第二转基因表达盒。
图2：通过感染后48小时和96小时，在非还原条件下western印迹表明的，MRC5细胞系中表达F∆TM转基因的载体的表达水平的比较。以500和1250的感染复数感染细胞。
图3：通过感染后48小时，在还原条件下western印迹表明的，MRC5细胞系中表达NM2-1转基因的载体的表达水平的比较。以250和1250的感染复数感染细胞。
图4：来自表达RSV抗原F∆Tm的ChAd155载体的免疫原性的比较。在用5x108个病毒颗粒的剂量接种疫苗后4周和8周收集数据。
图5：来自表达M2 RSV抗原的ChAd155载体的免疫原性的比较。在用107或106个病毒颗粒的剂量接种疫苗后3周收集数据。
图6：通过具有不同启动子的ChAd155在MRC5细胞中的SeAP表达。
图7：通过具有不同启动子的ChAd155在HeLa细胞中的SeAP表达。
序列的注释
SEQ ID NO:1 – 编码野生型ChAd155的多核苷酸序列
SEQ ID NO:2 – 编码CASI启动子的多核苷酸序列
SEQ ID NO:3 – 编码增强的hCMV启动子的多核苷酸序列
SEQ ID NO:4 – 编码hCMV NM2 bgh聚A盒的多核苷酸序列
SEQ ID NO:5 – NM2蛋白序列
SEQ ID NO:6 – 编码hCMV F0 WPRE bgh聚A盒的多核苷酸序列
SEQ ID NO:7 – F0蛋白序列
SEQ ID NO:8 – 编码hCMV启动子和增强子序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1-650)。
SEQ ID NO:9 – 编码鸡β-肌动蛋白片段的多核苷酸序列(SEQ ID NO:3的核苷酸651-809)。
SEQ ID NO:10 – 编码剪接供体区域的多核苷酸序列(SEQ ID NO:3的核苷酸810-824)。
SEQ ID NO:11 – 编码泛素(UBC)增强子的多核苷酸序列(SEQ ID NO:3的核苷酸825-1127)。
SEQ ID NO:12 – 编码剪接受体区域的多核苷酸序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1128-1187)。
发明详述
腺病毒
腺病毒是具有近似36 kb的线性双链DNA基因组的无包膜二十面体病毒。腺病毒可以转导几种哺乳动物物种的许多细胞类型，包括分裂中和非分裂中细胞两者，而不整合至宿主细胞的基因组中。由于它们证明的安全性、在各种靶标组织中实现高度有效基因转移的能力以及大的转基因容量，它们已被广泛用于基因转移应用。人腺病毒载体目前用于基因疗法和疫苗中，但具有在先前暴露于普通人腺病毒后预先存在的免疫力的全世界高度流行的缺点。
腺病毒具有拥有二十面体衣壳的特征性形态，所述二十面体衣壳包含三种主要蛋白：六邻体(II)、五邻体基质(III)和有节纤突(IV)，连同许多其他次要蛋白VI、VIII、IX、IIIa和IVa2。所述六邻体占所述衣壳的结构组分的大部分，所述衣壳由240个三聚的六邻体壳粒和12个五邻体基质组成。所述六邻体具有三个保守双桶(barrel)，并且顶部具有三个塔(tower)，每个塔含有来自每个亚基的环，所述亚基形成衣壳的大部分。六邻体的基质在腺病毒血清型之间是高度保守的，而表面环是可变的。五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白；其形成纤突所附接的五聚的基质。三聚的纤突蛋白从在衣壳的12个顶点中的每一个处的五邻体基质伸出且是有节的杆状结构。所述纤突蛋白的主要作用是经由节区域与细胞受体的相互作用而将病毒衣壳与细胞表面拴系。纤突的柔性轴以及节区域中的变异是不同腺病毒血清型特征性的。
腺病毒基因组已被充分地表征。线性、双链DNA与高度碱性蛋白VII和小肽pX (也称为mu)缔合。另一种蛋白V与该DNA-蛋白复合物一起包装，并经由蛋白VI提供与衣壳的结构连接。就类似地定位(例如每种病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置)的特定开放阅读框而言，在腺病毒基因组的整体组构中存在一般保守性。腺病毒基因组的每个末端包含被称为反向末端重复区(ITR)的序列，其是病毒复制所必需的。腺病毒基因组的5' 末端含有包装和复制所必需的5' 顺式元件；即，5' ITR序列(其可以作为复制起点发挥功能)和天然5' 包装增强子结构域(其含有包装线性腺病毒基因组所必需的序列和E1启动子的增强子元件)。腺病毒基因组的3'末端包括包装和衣壳化所必需的3' 顺式元件(包括ITR)。该病毒也包含病毒编码的蛋白酶，其是加工产生感染性病毒粒子所需的结构蛋白中的一些所必需的。
基于在宿主细胞转导后表达病毒基因的顺序，描述了腺病毒基因组的结构。更具体地，根据转录在DNA复制开始之前还是之后发生，将所述病毒基因称为早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期阶段中，表达腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因以制备用于病毒复制的宿主细胞。E1基因被认为是主开关，其充当转录活化剂，并参与早期和晚期基因转录两者。E2参与DNA复制；E3参与免疫调节，且E4调节病毒mRNA代谢。在感染的晚期阶段期间，编码病毒颗粒的结构组分的晚期基因L1-L5的表达被活化。晚期基因从主要晚期启动子(MLP)转录，并进行选择性剪接。
HE1和HE2位点被鉴定为转基因的潜在插入位点，因为在这些特定点中的插入并不中断黑猩猩腺病毒(诸如C型或E型黑猩猩腺病毒，例如ChAd155和ChAd83)的编码序列或重要调节序列。HE1和HE2位点可以通过在任何黑猩猩腺病毒中的序列比对来鉴定。因此，ChAd基因组的HE1和HE2位点中的表达盒的克隆并不影响病毒复制周期。
腺病毒复制
在历史上，腺病毒疫苗开发已经集中于缺陷的、非复制型载体。通过缺失对于复制必需的E1区域基因，使得它们复制缺陷。通常，非必需的E3区域基因也被缺失，以便为外源转基因腾出空间。然后插入包含在外源启动子的控制下的转基因的表达盒。然后在E1-互补细胞中产生这些复制缺陷的病毒。
术语“复制缺陷的”或“不能复制的”腺病毒是指不能复制的腺病毒，因为其已经被工程改造以至少包含功能缺失(或“功能丧失”突变)，即在不将基因完全除去的情况下损害该基因的功能的缺失或突变，例如人工终止密码子的引入，活性位点或相互作用结构域的缺失或突变，基因的调节序列的突变或缺失等，或编码对于病毒复制必需的基因产物的基因的完全除去，诸如选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4 (诸如E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1)的腺病毒基因中的一个或多个的完全除去。合适地，E1和任选地E3和/或E4被缺失。如果缺失，当确定相对于另一个序列的百分比同一性时，合适地将在比对中不考虑前面提及的缺失的基因区域。
在本发明的一些实施方案中，所述腺病毒载体是复制缺陷的腺病毒。例如，在具有两个表达盒的腺病毒载体的实施方案中，所述第一表达盒被插入缺失的E1区域中，且因此这些腺病毒将是复制缺陷的。
在其他实施方案中，所述腺病毒载体是能够复制的腺病毒。术语“能够复制的”腺病毒是指在宿主细胞中包含的任何重组辅助蛋白不存在的情况下可以在所述细胞中复制的腺病毒。合适地，“能够复制的”腺病毒包含完整的结构基因和以下完整的或功能必需的早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B和E4。从特定动物分离的野生型腺病毒在该动物中将是能够复制的。
本发明的载体
基于非人猿猴腺病毒的病毒载体代表将人来源的载体用于基因疗法和基因疫苗的替代方案。从非人猿猴分离的某些腺病毒与从人分离的腺病毒密切相关，如它们在人起源的细胞中的有效繁殖所表明。由于人通常不发展对猿猴腺病毒的免疫力，因此它们有望为人腺病毒使用提供改进的替代方案。
“低血清阳性率”可以意指具有与人腺病毒5 (Ad5)相比降低的预先存在的中和抗体水平。类似地或可替代地，“低血清阳性率”可以意指小于约40%血清阳性率、小于约30%血清阳性率、小于约20%血清阳性率、小于约15%血清阳性率、小于约10%血清阳性率、小于约5%血清阳性率、小于约4%血清阳性率、小于约3%血清阳性率、小于约2%血清阳性率、小于约1%血清阳性率或无可检测的血清阳性率。使用如Hum. Gene Ther. (2004) 15:293中所述的方法，可以将血清阳性率测量为具有临床相关的中和滴度(定义为50%中和滴度>200)的个体的百分比。
在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体源自非人猿猴腺病毒，也称为“猿猴腺病毒”。许多腺病毒已分离自非人猿猴，诸如黑猩猩、倭黑猩猩、猕猴、猩猩和大猩猩。源自这些腺病毒的载体可以诱导针对由这些载体编码的转基因的强烈免疫应答。基于非人猿猴腺病毒的载体的某些优点包括在人靶标群体中相对缺乏针对这些腺病毒的交叉中和抗体，因此其使用克服了预先存在的对人腺病毒的免疫力。例如，一些猿猴腺病毒不具有与预先存在的人中和抗体的交叉反应性，并且某些黑猩猩腺病毒与预先存在的人中和抗体的交叉反应仅存在于2%的靶标群体中，相比之下，在某些候选人腺病毒载体的情况下为35% (Sci.Transl. Med. (2012) 4:1)。
本发明的腺病毒载体可以源自非人腺病毒，诸如猿猴腺病毒，例如，源自黑猩猩(黑猩猩(Pan troglodytes))，倭黑猩猩(倭黑猩猩(Pan paniscus))，大猩猩(大猩猩(Gorilla gorilla))和猩猩(苏门答腊猩猩(Pongo abelii)和婆罗洲猩猩(Pongo pygnaeus))。它们包括来自组B、组C、组D、组E和组G的腺病毒。黑猩猩腺病毒包括，但不限于ChAd3、ChAd19、ChAd25.2、ChAd26、ChAd27、ChAd29、ChAd30、ChAd31、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35、ChAd37、ChAd38、ChAd39、ChAd40、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd15、SadV41和ChAd157。或者，腺病毒载体可以源自从倭黑猩猩分离的非人猿猴腺病毒，诸如PanAd1、PanAd2、PanAd3、Pan 5、Pan 6、Pan 7 (也称为C7)和Pan 9。载体可以全部或部分地包括编码非人腺病毒的纤突、五邻体或六邻体的核苷酸。
在本发明的腺病毒载体的一个实施方案中，所述腺病毒载体在人受试者中具有小于40%、小于30%、小于20%、小于10%或小于5%的血清阳性率，优选地在人受试者中没有血清阳性率，且更优选地在先前未与黑猩猩腺病毒接触的人受试者中没有血清阳性率。
在本发明的腺病毒载体的实施方案中，所述腺病毒DNA能够进入哺乳动物靶标细胞，即其为感染性的。本发明的感染性重组腺病毒载体可以用作预防性或治疗性疫苗且用于基因疗法。因此，在一个实施方案中，所述重组腺病毒载体包含用于递送至靶标细胞中的内源性分子。所述靶标细胞是哺乳动物细胞，例如牛细胞、犬细胞、山羊细胞、鹿细胞、黑猩猩细胞、翼手目细胞、马细胞、猫细胞、人细胞、狼细胞、绵羊细胞、猪细胞、啮齿动物细胞、熊细胞或狐狸细胞。用于递送至靶标细胞中的内源性分子是表达盒。
在本发明的一个实施方案中，所述载体包含左ITR区域，缺失的E1区域，然后缺失的E3区域，以及任选地，额外增强子元件；这些随后为纤突区域、E4区域和右ITR。在向右和向左方向发生翻译。在该实施方案中，所述第一表达盒插入缺失的E1区域中，且所述第二表达盒插入缺失的E3区域中。在一个进一步实施方案中，所述两个表达盒的启动子是CMV启动子。在又一个进一步实施方案中，所述增强子元件是乙型肝炎翻译后调节元件(HPRE)或土拨鼠肝炎翻译后元件(WPRE)。
在本发明的一个实施方案中，所述载体包含左和右ITR区域；缺失的E1区域；至少部分缺失的E3区域；纤突区域；E4区域；两个表达盒，各自包含：启动子和至少一个目标抗原和，任选地，一个或多个增强子元件。将所述第一表达盒插入缺失的E1区域中，且将所述第二表达盒插入HE1位点处，即，在纤突基因的终止密码子和E4区域之间(“HE1位点”)。ChAd155 HE1插入位点在野生型ChAd155序列的bp 34611和34612之间。ChAd83 HE1插入位点在野生型ChAd83序列的bp 33535和33536之间。在向右和向左方向发生翻译。在一个进一步实施方案中，所述启动子是CMV启动子。在一个优选实施方案中，一个启动子是CMV启动子，且另一个是eCMV启动子。在又一个进一步实施方案中，所述增强子元件是HPRE或WPRE。
在一个进一步实施方案中，所述载体包含左和右ITR区域；缺失的E1区域；至少部分缺失的E3区域；纤突区域；E4区域；两个表达盒，各自包含：启动子，至少一个目标抗原和，任选地，一个或多个增强子元件。将所述第一表达盒插入缺失的E1区域中，且将所述第二表达盒插入HE2位点处，即，在左ITR的末端和E4 mRNA的帽位点之间(“HE2位点”)。ChAd155HE2插入位点在野生型ChAd155序列的bp 37662和37663之间。ChAd83 HE2插入位点在野生型ChAd83序列的bp 36387和36388之间。在向右和向左方向发生翻译。在一个进一步实施方案中，所述启动子是CMV启动子。在一个优选实施方案中，一个启动子是CMV启动子，且另一个是eCMV启动子。在又一个进一步实施方案中，所述增强子元件是HPRE或WPRE(所述增强子元件增加转基因的表达)。
所述HE1和HE2位点被鉴定为转基因的插入位点，因为在这些特定点中的插入并不中断ChAd155和ChAd83的编码序列或调节序列。因此，将表达盒插入ChAd基因组的HE1或HE2位点并不影响病毒复制周期。
在本发明的一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体的功能性或免疫原性衍生物。“腺病毒载体的衍生物”意指载体的修饰形式，例如，所述载体的一个或多个核苷酸被缺失、插入、修饰或取代。
另外的调节元件
调节元件，即，表达控制序列，除了启动子序列以外，包括适当的转录起始、终止和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和聚腺苷酸化(聚A)信号，包括兔β-珠蛋白聚A；四环素可调节系统、微RNA、转录后调节元件、例如WPRE、土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件)；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当期望时，增强编码的产物的分泌的序列。
任选地，携带编码治疗上有用的或免疫原性的产物的转基因的载体还可以包括选择标记或报道基因。所述报道基因可以选自本领域中已知的那些。合适的报道基因包括，但不限于，增强的绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶和分泌的胚胎碱性磷酸酶(seAP)，其可以包括编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性的序列，以及其他。此类选择报道物或标记基因(其可以位于或不位于待包装至病毒颗粒中的病毒基因组之外)可以用于发出质粒在细菌细胞中的存在的信号，诸如氨苄青霉素抗性。所述载体的其他组分可以包括复制起点。
如本文所用的“转录后调节元件”是这样的DNA序列，其在转录时增强通过本发明的病毒载体递送的一种或多种转基因或其片段的表达。转录后调节元件包括但不限于乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)和土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。WPRE是三部分顺式作用元件，其已被证明增强由某些(但不是全部)启动子驱动的转基因表达。
在本发明的实施方案中，ChAd155载体可以包含启动子、增强子和报道基因中的一种或多种。例如，本发明的载体可以包含ChAd155-增强的hCMV -SeAP ChAd155-CASI-seAP和ChAd155-hCMV-seAP(其任选地具有四环素开/关转录控制)，以及ChAd155 –CMV-hFerL-chEF1-seAP(其具有四环素开/关转录控制)。
在本发明的实施方案中，ChAd83载体可以包含启动子、增强子和报道基因中的一种或多种。例如，本发明的载体可以包含ChAd155-增强的hCMV SeAP、ChAd83增强的hCMVSeAP、ChAd155-CASI-seAP和ChAd83-hCMV-seAP(其任选地具有四环素开/关转录控制)，以及ChAd83 –CMV-hFerL-chEF1-seAP(其具有四环素开/关转录控制)。
使用本文提供的技术，结合本领域技术人员已知的技术，生成本发明的载体。此类技术包括cDNA的常规克隆技术(诸如在教科书中描述的那些)、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的使用、聚合酶链式反应、和提供期望的核苷酸序列的任何合适方法。
转基因
“转基因”是编码目标多肽的核酸序列，其与侧接所述转基因的载体序列异源。核酸编码序列以允许宿主细胞中的转基因转录、翻译和/或表达的方式可操作连接至调节组分。在本发明的实施方案中，所述载体以治疗或预防水平表达转基因。转基因多肽的“功能衍生物”是多肽的修饰形式，例如，其中一个或多个氨基酸被缺失、插入、修饰或取代。
所述转基因可用于预防或治疗，例如，作为用于诱导免疫应答的疫苗，以通过校正或替换缺陷或缺失的基因来校正遗传缺陷，或作为癌症治疗剂。如本文所用，免疫应答的诱导是指蛋白诱导针对该蛋白的T细胞和/或体液抗体免疫应答的能力。
由转基因引发的免疫应答可以是抗原特异性B细胞应答，其产生中和抗体。引发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答，其可以是全身性应答和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包含CD4+ T细胞应答，诸如涉及表达细胞因子(例如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和/或白介素2(IL2))的CD4+ T细胞的应答。可替代地或另外地，所述抗原特异性T细胞应答包含CD8+ T细胞应答，诸如涉及表达细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+ T细胞的应答。
转基因序列的组成将取决于将向其中放置所得载体的用途。在一个实施方案中，所述转基因是编码在生物学和医学中有用的产物的序列，诸如预防性转基因、治疗性转基因或免疫原性转基因，例如蛋白或RNA。蛋白转基因包括抗原。本发明的抗原性转基因诱导针对引起疾病的生物体的免疫原性应答。
转基因诸如狂犬病病毒抗原、例如狂犬病糖蛋白(RG)、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原或其片段将适合用于与本发明的启动子一起使用。然而，本发明不限于与此类转基因一起使用。
作为遗传密码中的冗余的结构，多肽可以由各种不同的核酸序列编码。编码偏向于与其他相比更多地使用一些同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。“密码子优化的”意指在不改变氨基酸序列的情况下对重组核酸的密码子组成进行修饰。密码子优化已用于通过使用生物体特异性的密码子使用频率来提高不同生物体中的mRNA表达。
除了密码子偏爱之外，且与密码子偏爱无关，比其他更频繁地使用一些同义密码子对。此密码子对偏爱意味着一些密码子对被代表过多，而其他被代表不足。密码子对去优化已被用于减少病毒毒力。例如，已报道，与野生型脊髓灰质炎病毒相比，经修饰以含有代表不足的密码子对的脊髓灰质炎病毒表明降低的翻译效率并且被减毒(Science (2008)320:1784)。通过密码子对去优化工程改造合成的减毒病毒可以产生编码与野生型相同的氨基酸序列、但使用同义密码子的不同成对排列的病毒。通过密码子对去优化减毒的病毒生成与野生型相比减少最多达1000倍的噬斑，产生更少的病毒颗粒，并且需要多达约100倍的病毒颗粒来形成噬斑。
相反，经修饰以含有在人基因组中过度代表的密码子对的脊髓灰质炎病毒以类似于野生型RNA的方式起作用，并且生成大小与野生型RNA相同的噬斑(Coleman等人 (2008)Science 320:1784)。发生这种情况，尽管存在以下事实：具有过度代表的密码子对的病毒含有与具有不足代表的密码子对的病毒类似数目的突变，并且表明与野生型相比增强的翻译。该观察表明，会预期密码子对优化的构建体以类似于其非密码子对优化的对应物的方式起作用，并且不会期望其提供功能优势。不希望受理论束缚，这可能是因为自然进化已经优化密码子配对。
本发明的构建体可以包含密码子优化的核酸序列。可替代地或另外地，本发明的载体包含转基因或其免疫原性衍生物或片段的密码子优化的序列。本发明的构建体可以包含密码子对优化的核酸序列。可替代地或另外地，本发明的载体包含转基因或其免疫原性衍生物或片段的密码子对优化的序列或由其组成。
呼吸道合胞病毒(RSV)转基因
RSV的感染并不赋予完全的保护性免疫力。婴儿期的感染随后为症状性RSV再感染，其在整个成年期继续。这些再感染通常未被诊断，因为它们通常呈现为常见的急性上呼吸道感染。然而，在更脆弱的人(例如，免疫受损的成人或老年人)中，再感染也可导致严重的疾病。免疫系统的两个分支(体液和细胞免疫)均参与免于严重疾病的保护[Guvenel，2014]。
体液免疫应答能够中和病毒并抑制病毒复制，由此在针对下呼吸道RSV感染和严重疾病的保护中发挥主要作用[Piedra，2003]。预防性给予的免疫球蛋白G (IgG) RSV-中和单克隆抗体(Synagis)的形式的被动免疫已显示在具有支气管肺发育不良或潜在心肺疾病的早产婴儿和新生儿中在一定程度上预防RSV疾病[Cardenas，2005]。
T细胞也参与RSV疾病的控制。已经在具有低CD8 T细胞计数的患者中描述了致死性RSV感染，如在严重联合免疫缺陷、骨髓和肺移植受体的情况下[Hertz，1989]。新生儿的RSV感染的致死性病例的组织病理学显示肺部浸润物中存在相对少量的CD8 T细胞[Welliver，2007]。此外，产生干扰素-γ(IFN-γ)的CD8 T细胞的存在与RSV的动物模型中的Th2应答减少和嗜酸性粒细胞减少相关[Castilow, 2008; Stevens, 2009]。
可用作免疫原以免疫人或非人动物的RSV的合适的抗原可以选自融合蛋白(F)、附着蛋白(G)、基质蛋白(M2)和核蛋白(N)。术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”是指具有RSV融合蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。类似地，术语“G蛋白”或“G蛋白多肽”是指具有RSV附着蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。术语“M蛋白”或“基质蛋白”或“M蛋白多肽”是指具有RSV基质蛋白的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白，且可以包括M2-1 (其可以在本文中书写为M2.1)和M2-2基因产物中的任一种或两种。同样地，术语“N蛋白”或“核衣壳蛋白”或“N蛋白多肽”是指具有RSV核蛋白的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。
主要基于G糖蛋白的抗原性的差异，已经描述了两组人RSV毒株，A和B组。迄今为止已经分离了许多RSV毒株，其中任何在本文公开的免疫原性组合的抗原的背景下都是合适的。由GenBank和/或EMBL登录号指示的示例性毒株可以见于美国公开的申请号2010/0203071 (WO2008114149)，其通过引用并入本文，用于公开适合用于本发明中的RSV F和G蛋白的核酸和多肽序列的目的。在一个实施方案中，所述RSV F蛋白可以是RSV F蛋白的胞外结构域(FΔTM)。
示例性的M和N蛋白核酸和蛋白序列可以见于，例如，美国公开的申请号2014/0141042 (WO2012/089833)，其并入本文，用于公开适合用于本发明中的RSV M和N蛋白的核酸和多肽序列的目的。
转基因核酸可以编码RSV F抗原和RSV M和N抗原。更具体地，所述核酸可以编码RSV FΔTM抗原(缺失跨膜和细胞质区域的融合(F)蛋白)和RSV M2-1(转录抗终止)和N(核衣壳)抗原。
缺失跨膜和细胞质区域的融合(F)蛋白(FΔTM)
RSV F蛋白是主要的表面抗原并且介导病毒与靶标细胞的融合。F蛋白是在RSV亚组和毒株中高度保守的抗原。F蛋白是中和抗体(包括预防性RSV中和单克隆抗体Synagis)的靶标。跨膜区域和细胞质尾部的缺失允许FΔTM蛋白的分泌。识别F蛋白的这种可溶形式的中和抗体，包括Synagis，在体外抑制RSV感染性[Magro，2010]。
核衣壳(N)蛋白
N蛋白是内部(未暴露的)抗原，在RSV毒株之间高度保守，并且已知是许多T细胞表位的来源[Townsend，1984]。N蛋白对于RSV基因组的复制和转录是必需的。N蛋白的主要功能是为了RNA转录、复制和包装的目的而包装病毒基因组并保护其免受核糖核酸酶的影响。
转录抗终止(M2-1)蛋白
M2-1蛋白是转录抗终止因子，其对于全长信使RNA (mRNA)的有效合成以及多顺反子通读mRNA(其为非区段负链RNA病毒特征性的)的合成是重要的。M2-1是内部(未暴露的)抗原，其在RSV毒株之间高度保守，并且已知是许多T细胞表位的来源[Townsend，1984]。
N-M2-1融合蛋白
编码接头的多核苷酸位于编码RSV N抗原或其片段的多核苷酸和编码RSV M2.1抗原或其片段的多核苷酸之间。因此，在某些优选实例中，表达盒含有编码融合的RSV病毒蛋白N-接头-M2.1的转基因。优选的是，所述接头是柔性接头，优选包含根据SEQ ID NO:13 (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly)或SEQ ID NO:14 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)的氨基酸序列的柔性接头。
腺病毒载体的递送
在一些实施方案中，本发明的重组腺病毒载体通过表皮施用、皮内施用、肌肉内注射、腹膜内注射、静脉内注射、经鼻施用、经口施用、直肠施用、皮下注射、经皮施用或阴道内施用，而施用于受试者。
在本发明的一个实施方案中，所述载体可以肌肉内(IM)施用，即，直接注射入肌肉。肌肉血管形成良好，并且摄取通常快速。
佐剂
建立对特定病原体的强烈且持久的免疫力的方法包括向疫苗中添加佐剂。“佐剂”意指增强、刺激、活化、加强或调节针对组合物的活性成分的免疫应答的试剂。佐剂作用可以在细胞或体液水平或两者上发生。佐剂刺激免疫系统针对实际抗原的应答，但本身没有免疫作用。可替代地或另外地，本发明的佐剂化组合物可以包含一种或多种免疫刺激剂。“免疫刺激剂”意指无论是与抗原一起施用还是分开施用均诱导受试者的免疫应答的总体暂时性增加的试剂。
本发明的组合物可以与或不与佐剂一起施用。可替代地或另外地，所述组合物可以包含一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)或与一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)结合施用，具体而言，所述组合物包含免疫学有效量的本发明的编码转基因的载体。
使用方法
提供了用于在有此需要的受试者中诱导针对由病原体引起的疾病的免疫应答的方法，其包括施用免疫有效量的如本文所公开的构建体或组合物的步骤。在一些实施方案中，提供了本文公开的构建体或组合物用于在有此需要的受试者中诱导针对转基因抗原的免疫应答的用途。本发明的载体可以应用于预防、治疗或改善由于感染导致的疾病。
本发明的方法包括本发明的载体在医学中的用途。它们包括本发明的载体用于治疗由病原体引起的疾病的用途。本发明的载体可用于制备用于治疗由病原体引起的疾病的药物。
用腺病毒载体的有效免疫取决于腺病毒载体骨架的内在免疫调节能力。免疫学效力较低的腺病毒诱导较少的抗原表达。有效的免疫还取决于启动子驱动强烈且持续的转基因表达的能力。例如，由巨细胞病毒立即早期(CMV-IE)启动子驱动的腺病毒载体并不维持长期的转基因表达，因为它们诱导抑制表达的细胞因子。
“受试者”意欲为脊椎动物，诸如哺乳动物，例如人或兽医哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。
通用
使用本文提供的技术和序列，结合本领域技术人员已知的技术，生成本发明的载体。此类技术包括cDNA的常规克隆技术(诸如在教科书中描述的那些)、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的使用、聚合酶链式反应、和提供期望的核苷酸序列的任何合适方法。
除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述”包括复数对象，除非上下文另有清楚指出。类似地，词语“或”意欲包括“和”，除非上下文另有清楚指示。术语“多个/种”是指两个/种或更多个/种。此外，关于物质的浓度或水平(诸如溶液组分浓度或其比率，和反应条件诸如温度、压力和循环时间)给出的数值限值，意欲是近似的。本文使用的术语“约”意指量±10％。
现在将借助于以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1：黑猩猩腺病毒的构建
使用标准程序从健康黑猩猩分离野生型黑猩猩腺病毒类型155 (ChAd155) (WO 2016/198621)，并构建为复制缺陷的病毒，如Sci Transl Med (2012) 4:1和WO 2010/086189中所述。
通过将两个转基因表达盒插入腺病毒中的两个不同位置中来构建ChAd155：
(1) 第一表达盒组分包含经典的人CMV (hCMV)启动子和N.M2-1 RSV抗原。将该第一表达盒插入腺病毒的E1区域中(在E1区域已被缺失之后)。
(2) 第二表达盒包含增强的经典人CMV(增强的hCMV)启动子、FΔTM RSV抗原和WPRE增强子。将该第一表达盒插入腺病毒的HE2区域中(在HE2区域已被缺失之后)。
该包含双重表达盒的载体显示于图1中。
在图1的构建体中，Ad5E4orf6已被取代至早期基因4 (E4)区域中。所述取代是增加HEK 293细胞中的生产率必需的。
实施例2：来自实施例1的黑猩猩腺病毒的转基因表达
进行Western印迹分析以将MRC5细胞中的实施例6的ChAd155载体(图中标记为“双重”或“双重盒”)中的转基因表达水平与以下中的转基因表达水平进行比较：
(i) 包含单个F表达盒的载体(ChAd155-FΔTM，标记为“F0ΔTm”)，
(ii) 包含单个NM2表达盒的载体(ChAd155-NM2，标记为“NM2-1”)，和
(iii) 实施例5的包含含有F和N-M2 RSV抗原的单个表达盒的载体(ChAd155-FΔTM.NM2，也标记为“RSV”)。
western印迹分析显示于图2和图3中。
如图2中所示，用ChAd155-FΔTM、ChAd155-FΔTM.NM2 (“RSV”)或ChAd155双重盒以500个病毒颗粒/细胞的感染复数感染细胞。另外，用ChAd155-FΔTM.NM2 (“RSV”)以1250个病毒颗粒/细胞的感染复数感染细胞。在感染后48小时和96小时收获细胞，使用标准方法制备提取物，并将等量的总细胞提取物上样至SDS-PAGE凝胶上。
图2显示，ChAd155双重盒在MRC5细胞中提供了与ChAd155FΔTM相当且比ChAd155-FΔTM.NM2更高的F抗原的表达水平。
如图3中所示，用ChAd155-NM2、ChAd155-FΔTM.NM2 (“RSV”)或实施例6的ChAd155双重盒以250和1250个病毒颗粒/细胞的感染复数感染细胞。在感染后48小时收获细胞，使用标准方法制备提取物，并将等量的总细胞提取物上样至SDS-PAGE凝胶上。
在图3中，ChAd155双重盒在MRC5细胞中提供了与ChAd155-NM2单一载体相当且比ChAd155-FΔTM.NM2 (“RSV”)更高的NM2-1表达水平。
实施例3：实施例1的黑猩猩腺病毒的免疫原性
在CD1远交小鼠(每组10只)中评估实施例6的双重表达盒的免疫原性。通过将5x108个病毒颗粒肌肉内注射至小鼠中来进行实验。在免疫后4和8周通过测量RSV中和滴度来测量B-细胞应答。每个点代表单个小鼠中的应答，并且线对应于每个剂量组的平均值。该分析的结果显示于图4中。
图4显示，ChAd155双重盒提供了与ChAd155FΔTM相当且比由ChAd155-FΔTM.NM2(“RSV”)产生的B-细胞应答更高的B-细胞应答。
还在BALB/c近交小鼠(每组48只、11只或8只)中评估实施例6的双重表达盒的免疫原性。通过肌肉内注射107或108个病毒颗粒来进行实验。免疫后3周通过使用在BALB/c小鼠中作图的M2肽T细胞表位的离体IFN-γ酶联免疫斑点(ELISpot)测量T-细胞应答。结果显示于图11中，表示为每百万个脾细胞的IFN-γ斑点形成细胞数(SFC)。每个点代表单个小鼠中的应答，并且线对应于每个剂量组的平均值。在x轴上显示以病毒颗粒的数目计的注射剂量。结果显示于图5中。
图5显示，ChAd155双重盒提供了比由ChAd155-FΔTM.NM2 (“RSV”，其结果从历史数据获得)产生的T-细胞应答更高的T-细胞应答。对于106剂量，应答的该差异更大。
图5涉及“#阳性小鼠”，即对疫苗应答的小鼠的数目。
实施例3：通过具有不同启动子的ChAd155在MRC5细胞中的SeAP表达
分泌的胚胎碱性磷酸酶(SeAP)系统被广泛用于研究启动子活性。SeAP报道基因编码缺乏膜锚定结构域的人胎盘碱性磷酸酶基因的截短物。因此，SeAP蛋白被分泌至细胞上清液中，并且允许测定启动子活性而不干扰细胞。
图6显示在MRC5细胞中来自用不同启动子构建的ChAd155载体的SeAP表达。本实施例中使用的三种不同的ChAd155载体如下：
● 具有已知人CMV (hCMV)启动子的ChAd155；
● 具有已知CASI启动子的ChAd155；和
● 具有新的增强的hCMV启动子的ChAd155。
在该实验中，MRC5用moi = 250 vp/细胞感染，并在用ChAd155病毒感染后2天(48小时)、4天(96小时)和7天(1周)进行SeAP的测量。
如从图6可见，在测量的每个时间点，用新的增强的hCMV启动子构建的载体显示比其他两种载体更高的SeAP表达。
实施例4：通过具有不同启动子的ChAd155在HeLa细胞中的SeAP表达
图7显示在HeLa细胞中来自用不同启动子构建的ChAd155载体的SeAP表达。如实施例3一样，本实验中使用的三种不同的ChAd155载体如下：
● 具有已知人CMV (hCMV)启动子的ChAd155 (d)；
● 具有已知CASI启动子的ChAd155 (d)；和
● 具有新的增强的hCMV启动子的ChAd155 (d)。
在该实验中，HeLa用moi = 50 vp/细胞感染，并在用ChAd155病毒感染后2天(48小时)、4天(96小时)和7天(1周)进行SeAP的测量。
如从图7可见，在测量的每个时间点，用新的增强的hCMV启动子构建的载体显示比其他两种载体更高的SeAP表达。
序列描述
SEQ ID NO:1 编码野生型ChAd155的多核苷酸序列
Figure 767407DEST_PATH_IMAGE001
Figure 232017DEST_PATH_IMAGE002
Figure 808492DEST_PATH_IMAGE003
Figure 203701DEST_PATH_IMAGE004
Figure 549232DEST_PATH_IMAGE005
Figure 371694DEST_PATH_IMAGE006
Figure 684733DEST_PATH_IMAGE007
Figure 883633DEST_PATH_IMAGE008
Figure 83670DEST_PATH_IMAGE009
Figure 77034DEST_PATH_IMAGE010
Figure 628101DEST_PATH_IMAGE011
Figure 365113DEST_PATH_IMAGE012
Figure 170389DEST_PATH_IMAGE013
SEQ ID NO:2 编码CASI启动子的多核苷酸序列
Figure 600233DEST_PATH_IMAGE014
SEQ ID NO:3 编码增强的hCMV启动子的多核苷酸序列
Figure 638597DEST_PATH_IMAGE015
SEQ ID NO:4 编码hCMV NM2 bgh聚A盒的多核苷酸序列
Figure 913720DEST_PATH_IMAGE016
Figure 88350DEST_PATH_IMAGE017
CMV启动子序列：粗体
转基因序列NM2：斜体
bgh聚A 聚A信号：斜体+下划线
SEQ ID NO:5 NM2蛋白序列
Figure 423516DEST_PATH_IMAGE018
SEQ ID NO:6 编码hCMV F0 WPRE bgh聚A盒的多核苷酸序列
Figure 198443DEST_PATH_IMAGE019
Figure 277257DEST_PATH_IMAGE020
增强的CMV启动子序列：粗体
转基因序列F0：斜体
WPRE序列：下划线的粗体
bgh聚A聚A信号 ： 斜体+下划线
SEQ ID NO:7 F0蛋白序列
Figure 571972DEST_PATH_IMAGE021
SEQ ID NO:8 hCMV启动子和增强子序列的多核苷酸序列
Figure 343619DEST_PATH_IMAGE022
SEQ ID NO:9 鸡β-肌动蛋白片段的多核苷酸序列
Figure 825416DEST_PATH_IMAGE023
SEQ ID NO:10 剪接供体区域的多核苷酸序列
Figure 707922DEST_PATH_IMAGE024
SEQ ID NO:11 泛素(UBC)增强子的多核苷酸序列
Figure 607876DEST_PATH_IMAGE025
SEQ ID NO:12 剪接受体区域的多核苷酸序列
Figure 550424DEST_PATH_IMAGE026
Figure IDA0002453602170000011
Figure IDA0002453602170000021
Figure IDA0002453602170000031
Figure IDA0002453602170000041
Figure IDA0002453602170000051
Figure IDA0002453602170000061
Figure IDA0002453602170000071
Figure IDA0002453602170000081
Figure IDA0002453602170000091
Figure IDA0002453602170000101
Figure IDA0002453602170000111
Figure IDA0002453602170000121
Figure IDA0002453602170000131
Figure IDA0002453602170000141
Figure IDA0002453602170000151
Figure IDA0002453602170000161
Figure IDA0002453602170000171
Figure IDA0002453602170000181
Figure IDA0002453602170000191
Figure IDA0002453602170000201
Figure IDA0002453602170000211
Figure IDA0002453602170000221
Figure IDA0002453602170000231
Figure IDA0002453602170000241
Figure IDA0002453602170000251
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Figure IDA0002453602170000301
Figure IDA0002453602170000311
Figure IDA0002453602170000321
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Figure IDA0002453602170000351
Figure IDA0002453602170000361
Figure IDA0002453602170000371

Claims (18)

1.启动子，其包含：
(i) hCMV增强子序列；
(ii) hCMV启动子序列；
(iii) 剪接供体区域；
(iv) 细胞-来源的增强子序列；和
(v) 剪接受体区域。
2.腺病毒载体，其包含表达盒，其中所述表达盒包含转基因和启动子，其中所述启动子包含：
(i) hCMV增强子序列；
(ii) hCMV启动子序列；
(iii) 剪接供体区域；
(iv) 细胞-来源的增强子序列；和
(v) 剪接受体区域。
3.腺病毒载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，其中每个表达盒都包含转基因和启动子，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒的启动子是包含以下的启动子：
(i) hCMV增强子序列；
(ii) hCMV启动子序列；
(iii) 剪接供体区域；
(iv) 细胞-来源的增强子序列；和
(v) 剪接受体区域。
4.任一前述权利要求的启动子或腺病毒载体，其中所述细胞-来源的增强子序列是泛素(UBC)增强子序列。
5.权利要求4的启动子或腺病毒载体，其中所述UBC增强子包含SEQ ID NO:11的序列。
6.任一前述权利要求的启动子或腺病毒载体，其包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12中的一种或多种。
7.权利要求3的腺病毒载体，其中所述第一表达盒包含所述启动子。
8.权利要求3或7的腺病毒载体，其中所述第二表达盒包含所述启动子。
9.任一前述权利要求的启动子或腺病毒载体，其中所述增强子进一步包含：
(vi) 鸡β-肌动蛋白序列的片段；
其中所述鸡β-肌动蛋白序列的片段包含鸡β肌动蛋白序列的5'非翻译区域并且不含启动子序列。
10.启动子，其包含与SEQ ID NO:3具有至少84.1%同一性的核酸序列。
11.腺病毒载体，其包含表达盒，其中所述表达盒包含转基因和启动子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:3具有至少84.1%同一性的核酸序列。
12.腺病毒载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，其中每个表达盒都包含转基因和启动子，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒的启动子是与SEQ ID NO:3具有至少84.1%同一性的启动子。
13.权利要求12的腺病毒载体，其中所述第一表达盒包含所述启动子。
14.权利要求12或13的腺病毒载体，其中所述第二表达盒包含所述启动子。
15.权利要求10至14中任一项的启动子或腺病毒载体，其中所述启动子包含与SEQ IDNO:3具有至少约84.5%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%或更多序列同一性的核酸序列。
16.权利要求10至15中任一项的启动子或腺病毒载体，其中所述启动子包含与SEQ IDNO:3具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或更多序列同一性的核酸序列。
17.权利要求1至7中任一项的启动子或腺病毒载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
18.权利要求1至8中任一项的启动子或腺病毒载体，其中所述启动子由SEQ ID NO:3的核酸序列组成。
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