UA123385C2 - Рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини анкара (mva) та спосіб лікування або попередження інфекцій вірусу rsv - Google Patents
Рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини анкара (mva) та спосіб лікування або попередження інфекцій вірусу rsv Download PDFInfo
- Publication number
- UA123385C2 UA123385C2 UAA201501765A UAA201501765A UA123385C2 UA 123385 C2 UA123385 C2 UA 123385C2 UA A201501765 A UAA201501765 A UA A201501765A UA A201501765 A UAA201501765 A UA A201501765A UA 123385 C2 UA123385 C2 UA 123385C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- mma
- recombinant
- virus
- protein
- shi
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 64
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 title claims abstract description 8
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 163
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 122
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 121
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 112
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 75
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 109
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 66
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 59
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 36
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims description 29
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 27
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 25
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 16
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 claims description 15
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims description 13
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 10
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 5
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 claims description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 208000001203 Smallpox Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 3
- 206010073261 Ovarian theca cell tumour Diseases 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 2
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 244000301682 Heliotropium curassavicum Species 0.000 claims 1
- 235000015854 Heliotropium curassavicum Nutrition 0.000 claims 1
- 241001397173 Kali <angiosperm> Species 0.000 claims 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005242 forging Methods 0.000 claims 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 257
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 156
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 136
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 86
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 63
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 48
- 230000004044 response Effects 0.000 description 42
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 41
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 36
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 25
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 24
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 22
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 20
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 238000011160 research Methods 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 15
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 13
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 13
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 13
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 9
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 101800003332 Metamorphosin A Proteins 0.000 description 7
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 7
- 206010011906 Death Diseases 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 6
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 6
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 6
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 6
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 5
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 101100018424 Mus musculus Ids gene Proteins 0.000 description 5
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 5
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 5
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 5
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 101800000342 Glycoprotein C Proteins 0.000 description 4
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 4
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- -1 and P is cofactor G Proteins 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 101000756628 Mus musculus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 101710132653 Protein M2 Proteins 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 101150116749 chuk gene Proteins 0.000 description 3
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 244000025361 Ficus carica Species 0.000 description 2
- 235000008730 Ficus carica Nutrition 0.000 description 2
- 241001547860 Gaya Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 241001436793 Meru Species 0.000 description 2
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000159610 Roya <green alga> Species 0.000 description 2
- 101710200413 Small hydrophobic protein Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000587120 Vaccinia virus Ankara Species 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010001197 Adenocarcinoma of the cervix Diseases 0.000 description 1
- 208000034246 Adenocarcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 description 1
- 240000003825 Allium akaka Species 0.000 description 1
- 235000000201 Allium akaka Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 241000182988 Assa Species 0.000 description 1
- 240000005220 Bischofia javanica Species 0.000 description 1
- 235000010893 Bischofia javanica Nutrition 0.000 description 1
- 241000283726 Bison Species 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 241000566113 Branta sandvicensis Species 0.000 description 1
- OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N Bromadiolone Chemical compound C=1C=C(C=2C=CC(Br)=CC=2)C=CC=1C(O)CC(C=1C(OC2=CC=CC=C2C=1O)=O)C1=CC=CC=C1 OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108010040864 CERE Proteins 0.000 description 1
- 101100495256 Caenorhabditis elegans mat-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100227826 Caenorhabditis elegans mks-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153505 Caenorhabditis elegans tni-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100234002 Drosophila melanogaster Shal gene Proteins 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 240000008187 Erythrina edulis Species 0.000 description 1
- 235000002757 Erythrina edulis Nutrition 0.000 description 1
- 101000978703 Escherichia virus Qbeta Maturation protein A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001024566 Homo sapiens Ecto-ADP-ribosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000840540 Homo sapiens Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 101100533874 Hypocrea jecorina (strain QM6a) sor5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000015335 Ku Autoantigen Human genes 0.000 description 1
- 108010025026 Ku Autoantigen Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 101150046652 M2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000604742 Machilus thunbergii Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001139947 Mida Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100498160 Mus musculus Dach1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000531207 Oxera splendida Species 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 240000005546 Piper methysticum Species 0.000 description 1
- 235000016787 Piper methysticum Nutrition 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241000549435 Pria Species 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 208000029464 Pulmonary infiltrates Diseases 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 108010010225 RA VII Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBQKTLYFUYNAPZ-UHFFFAOYSA-N Rubia akane RA-VII Natural products C1=CC(OC)=CC=C1CC(N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(N(C1=O)C)C2)C(=O)NC(C)C(=O)N(C)C1CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC2=CC=C1OC MBQKTLYFUYNAPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000801924 Sena Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 244000166071 Shorea robusta Species 0.000 description 1
- 235000015076 Shorea robusta Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241001424341 Tara spinosa Species 0.000 description 1
- 241000019011 Tasa Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000656145 Thyrsites atun Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 244000042038 Tropaeolum tuberosum Species 0.000 description 1
- 241000767700 Tyche Species 0.000 description 1
- 206010046861 Vaccination complication Diseases 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150068402 Wipf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001377938 Yara Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N acetic acid [2-[[(5-nitro-2-thiazolyl)amino]-oxomethyl]phenyl] ester Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000010085 airway hyperresponsiveness Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 101150044992 bchB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000008873 bone osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004903 cardiac system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 201000006662 cervical adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000015111 chews Nutrition 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 102000054886 human ART4 Human genes 0.000 description 1
- 102000057422 human IDS Human genes 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 208000030500 lower respiratory tract disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- VTRAEEWXHOVJFV-UHFFFAOYSA-N olmesartan Chemical compound CCCC1=NC(C(C)(C)O)=C(C(O)=O)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C=2NN=NN=2)C=C1 VTRAEEWXHOVJFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 244000144985 peep Species 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 108010025221 plasma protein Z Proteins 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 229940024231 poxvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108010071967 protein K Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- MBQKTLYFUYNAPZ-FEZMQHRXSA-N ra vii Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N(C1=O)C)C2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N(C)[C@H]1CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC2=CC=C1OC MBQKTLYFUYNAPZ-FEZMQHRXSA-N 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000013376 serial cultivation Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 101150041594 soti gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 230000005029 transcription elongation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини Анкара (MVA), який містить щонайменще одну нуклеотидну послідовність, яка кодує мембранний глікопротеїн F респіраторно-синцитіального вірусу (RSV), нуклеотидну послідовність, яка кодує RSV-нуклеокапсидний білок N та один матриксний білок М2 RSV; і одну або дві нуклеотидні послідовності, які кодують мембранний глікопротеїн G RSV. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить рекомбінантний вірус MVA, вакцини, застосування рекомбінантного вірусу MVA для лікування або попередження інфекції вірусу RSV та способу лікування, або попередження інфекції вірусу RSV у суб'єкта.
Description
(56 | Массіпайоп м/п гесотбріпапі тоаіййеа массіпіа міги5 Апкага ехргезвіпо роміпе гезрігаюгу зупсуйаї! міги5 (БАБУ) ргоїєїпз ргоїесів саїмез адаїпві А5М спаепде / Аагіаап Б.С. Апіопів,
Ворбеїтї а. мап дег Мозір, Мазетіп Зцегег єї а!. // Массіпе. - 2007. - Мої. 25 (25). - Р. 4818- 4827
АБМ гивіоп (Е) ргоїєїп ОМА массіпе ргоміде5 рапіа! ргоїгесійоп адаїпві міка! іптесііоп /
Нопда2пиап Уми, Міда А. Оеппів, Зпгеекитаг
АВ. Рійаї еї а. // Міпиз Незеагспи. - 2009. - Мої. 145 (1). - Р. 39-47
А зепвійме геаІ-їте РОСА юг аєїесійоп апа зирагоциріпу ої питап гезрігаюгу зупсуйаї мігиз / Чеп Апп На Оса, Н. Родієг мап Юоогпа,
Ушеї Е. Вгуапіа еї аї. // дошгпаї ої Мігоіодісаї
Меїпоав. - 2012. - Мої. 179. - Р. 250- 255
ОемеІортепі ої а дпапійайме ТадМап АТ-РСА тог гезрігаюгу зупсуйаї мігив / С. Оемпитгві-
Магідог, М. бБітопеї, У.Е. Вогпапа еї а). //
Уоигпаї ої Мігоіодіса! Меїпоав. - 2004. - Мої. - 120. - Р. 41-49
Нигміа у. Г. Незрігаюгу зупсуйаї мігиз5 массіпе демеІортепі / Уиїїа Г. Нипміїг // Ехреї Неміем/ ої Массіпев. - 2011. - Мої. 10 (10). - Р. 1415- 1433 (54) РЕКОМБІНАНТНИЙ МОДИФІКОВАНИЙ ВІРУС ВІСПОВАКЦИНИ АНКАРА (ММА) ТА СПОСІБ
ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ ІНФЕКЦІЙ ВІРУСУ НУ
(57) Реферат:
Винахід стосується рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини Анкара (ММА), який містить щонайменще одну нуклеотидну послідовність, яка кодує мембранний глікопротеїн Е респіраторно-синцитіального вірусу (К5ЗМ), нуклеотидну послідовність, яка кодує КБМ- нуклеокапсидний білок М та один матриксний білок М2 Р5ЗМ; і одну або дві нуклеотидні послідовності, які кодують мембранний глікопротеїн с К5ЗМ. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить рекомбінантний вірус ММА, вакцини, застосування рекомбінантного вірусу ММА для лікування або попередження інфекції вірусу КЗМ та способу лікування, або попередження інфекції вірусу БМ у суб'єкта.
ОД ля Я -- ВЕ
Я 3 Я Й т ! . ї. . З : де де ся с се й «6 ї Ко І «і а Кк « я а я є ке ши НИ : ше ши че
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
Цей винахід відноситься до рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини Анкара (вірус ММА) як покращеної вакцини проти інфекції респіраторно-синцитіального вірусу (вірус
Е5БМ) і пов'язаних із ним продуктів, способів і застосувань. Зокрема, цей винахід відноситься до генно-інженерного рекомбінантного вектора ММА, що містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М і принаймні одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КБУ.
Винахід також відноситься до продуктів, способів і їх застосувань, наприклад, придатним для дії на імунну відповідь у суб'єкта, або придатним для діагностики інфекції К5У, а також визначення того, чи є небезпека рецидиву інфекції К5М у суб'єкта.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
К5М є важливим респіраторним патогеном. Гостра інфекція нижніх дихальних шляхів (І АТ) викликає значну захворюваність і смертність серед новонароджених і дітей у віці до п'яти років у всьому світі (А.М. Аїйуи еї аІ. (2010), Вауего У. Риге Аррі. сі. 3(1):147-155). Е5М є найбільш клінічно важливою причиною інфекції І АТ; первинне інфікування К5М зазвичай виникає до 2 років (МУ.Р. СіІелеп (1987), Рей. МігоЇ. 2:1-4; М. Мигаїа (2009), СіІіп. Га. Меа. 29(4):725-739|.
Оскільки первинна інфекція КОМ не викликає повний імунітет до К5М, часті повторні інфекції трапляються впродовж усього життя, з найбільш важкими інфекціями, що розвиваються у дуже молодих, дуже літніх пацієнтів і у пацієнтів будь-якого віку з послабленим імунітетом (У. Мигаїа (2009)|.
У 40 95 людей, інфікованих К5М, зрештою розвиваються серйозні захворювання ІКТ, що вимагають госпіталізації, з важкістю і інтенсивністю захворювання, залежних від величини і інтенсивності інфекції і відповіді організму (Аїуи еї аІ. (2010)). К5М також може викликати серйозну хворобу нижніх дихальних шляхів у пацієнтів будь-якого віку, що загрожує імунній, дихальній або серцевій системам, а також може сприяти розвитку астми у дітей надалі. В одних лише Сполучених Штатах К5М є причиною 126000 госпіталізацій і 300 випадків смерті дітей на рік ЇМ. Мигаїа (2009)). Крім того, К5М нараховує більше 80000 госпіталізацій і більше ніж 13000 випадків смерті у зимовий період серед літніх пацієнтів і пацієнтів з базовими серцево- легеневими або імуносупресивними станами (М. Мигага (2009)). Не дивлячись на важливість
Зо ЕЗМ як респіраторного патогену, на ринку на цей час немає безпечної і ефективної вакцини від
ВУ.
Е5М є оболонковим РНК вірусом з сімейства Рагатухомігідає, підродини Рпешитомігіпає
ІАПуй оеї а). (2010). Кожен вірон КБ5ЗМ містить несегментовану, негативно полярну, одноланцюжкову молекулу РНК із близько 15191 нуклеотидів, що містить десять генів, що кодують одинадцять окремих білків (М2 містить дві відкриті рамки зчитування), у тому числі вісім структурних (С, Е, 5Н, МІ, М, Р, М2.1 ї |) ї три не структурні білки (М51, М52 і М2.2) ГУ.
Мигаїа (2009)). Геном транскрибується послідовно від М5З1 до Ї у наступному порядку: 3'-М51-
М52-М-Р-М1-5Н-Я-Е-М2.1-М2.2-1І -5".
Оболонка вірусу містить три трансмембранні глікопротеїни (глікопротеїн прикріплення (5), глікопротеїн злиття (Е) і невеликий гідрофобний білок (ЗН)), а також матриксний білок (МІ) ГУ.
Мигаїа (2009)Ї. Під час реплікації вірус К5М спочатку прикріплюється до клітини-мішені в процесі, опосередкованому сильно глікозильованим білком (С. Потім вірус зливається з клітиною-господарем у процесі, опосередкованому білком Е, завдяки чому проникає через клітинну мембрану і надходить до клітини-господаря; білок Е також необхідний для формування синцитіїв, характерних для КБ5М-інфікованих клітин. Процеси прикріплення і злиття доповнюються білком ЗН. Білок МІ регулює збірку зрілого КОМ, взаємодіючи з білками оболонки Е і С і з нуклеокапсидними білками М, Р і М2.1 (дивись нижче). В оболонці вірусна РНК заключається в капсид за допомогою транскриптазного комплексу, що складається з нуклеокапсидного білка (М), фосфопротеїну (Р), фактора елонгації транскрипції (М2.1) і білків
РНК-полімерази (Г) (У. Мигаїа (2009))Ї. М асоціюється з геномною РНК, а Р є кофактором Г, вірусною РНК-полімеразою. М2.1 є фактором елонгації, необхідним для вірусної транскрипції, а
М2.2 регулює транскрипцію вірусного генома. Нарешті, М51 і М52 інгібують тип | активності інтерферону.
Клінічні ізоляти К5М класифікуються відповідно до антигенної групи (А або В), і, у свою чергу, підрозділяються на декілька генотипів (наприклад, А2 або Агопо для групи А; і В1, СН- 18537 або 8/60 для групи В), виходячи з генетичної мінливості у вірусному геномі кожної антигенної групи (М. Мигаїа (2009)). Класифікація заснована на здатності вірусів реагувати з моноклональними антитілами, направленими проти глікопротеїну прикріплення (білка с), і на підставі різних генетичних аналізів. (М. За еї аї., У). Сіїп. Місгобіої. 43(1):36-40 (2005)). Серед бо вірусних ізолятів, деякі К5М-закодовані білки є високо консервативними на рівні амінокислотної послідовності (наприклад, Е), тоді як інші широко варіюють (наприклад, с) між і всередині двох основних антигенних груп (У. Мигаїа (2009)). Білки Е із груп А і В розділяють неабияку гомологію.
На відміну від цього, білок С значно відрізняється між двома антигенними групами.
Білок С є найбільш варіабельним білком К5ЗМ з його гіперваріабельною С-кінцевою областю, що відповідає за більшість штамоспецифічних епітопів. Молекулярна епідеміологія і еволюційні закономірності С білка надали важливу інформацію про клінічні і епідеміологічні особливості
ЕЗМ. Звичайні декілька різних генотипів циркулюють одразу, а той, що переважає в суспільстві, може змінюватись щороку. Проте, значення штамової різноманітності для клінічних і епідеміологічних особливостей К5М залишається погано вивченим. З цієї причини рекомбінантні білки КБ5М супроводжуються штамовим позначенням для вказування оригінального штаму КБУ, з якого ген або білок були клоновані. Наприклад, клонований білок С зі штаму Агопо К5М позначається О(Агопто), ВЗМ Агопо С або КМ Агопто С1-білок.
КЗМ стимулює різні імунні відповіді у інфікованих господарів, у тому числі секрецію хемокінів і цитокінів, вироблення нейтралізуючих гуморальних і мукозальних антитіл, вироблення СО4ч (наприклад, Тні1 і Тнг) і СОв- (наприклад, СТІ) Т-клітин. Такі імунні реакції господарів у значній мірі відповідальні за клінічні прояви інфекції ЕЗМ, оскільки вірус викликає обмежену клітинну цитопатологію іп мімо (М. Мигайа (2009)) Фенотипічні прояви і тягар К5МУ-індукованого захворювання, мабуть, опосередковуються балансом і взаємодією в діапазоні імунних реакцій, стимульованих інфекцією КМ |У. Мигага (2009)|.
Багато попередніх досліджень показують, що клітинні і гуморальні імунні реакції відіграють різні ролі в індукування імунітету до К5М і в дозволі інфекції К5М, а також у прогресуванні захворювання |У. Мигага (2009) і посилання у ньому). Наприклад, дослідження з гуманізованим антитілом до Е показало, що тоді як антитіла до КОМ є достатніми для запобігання або обмеження важкості інфекції, вони не потрібні для усунення вірусної інфекції (М. Мигаїа (2009);
А.Б.с1. Апіопів еї аїЇ. (2007), Массіпе 25:4818-4827|. На відміну від цього, Т-клітинні відповіді потрібні для усунення встановлених інфекцій Е5М (У. Мигаїа (2009)). Індукована К5М Т-клітинна відповідь також відіграє ключову роль у легеневій патології під час інфекції. Наприклад, інтерферон-у (ІЕМу)-секретуючі Тні клітини з асоційованою СОвж СТІ -відповіддю або без неї усувають К5М з мінімальною легеневою патологією, тоді як інтерлейкін 4 (1-4)-секретуючі Тнаг
Зо клітини також усувають КМ, але часто супроводжуються значними легеневими змінами, включаючи еозинофільну інфільтрацію, що є відмінною рисою посиленої хвороби, що спостерігається під час попередніх випробувань вакцини (дивись нижче).
Не дивлячись на велику кількість інформації відносно імунології, вірусології, фізіології інфекції КЗМ, проте, залишається неясним, якого роду імунна відповідь, ймовірно, буде найбільш ефективною для індукування тривалого імунітету, а також не викликатиме посилену хворобу після вакцинації проти КМ, як описано детальніше у наступних розділах.
Попередні дослідження по розробці вакцин
Вакцини зазвичай використовують одну з декількох стратегій, щоб викликати захисний імунітет проти інфекційного агента-мішені або патогена (наприклад, вірусу, бактерії або паразита), у тому числі: (1) інактивовані патогенні препарати; (2) живі послаблені патогенні препарати, у тому числі генетично послаблені патогенні штами; (3) очищені білкові субодиничні вакцинні препарати; (4) вакцини на основі вірусних векторів, що кодують патогенні антигени та/або ад'юванти; і (5) вакцини на основі ДНК, що кодує патогенні антигени.
Первинні зусилля в області розробки вакцин КОМ були орієнтовані на інактивований препарат вірусу, поки у США протягом 1960-х років не були проведені клінічні випробування, що тестують ефективність інактивованої формаліном вакцини КМ (РІ-К5М) з катастрофічними результатами |М.К. ОЇзоп 5 5.М. Магда (2007), 9. Іттипої. 179:5415-5424). У значної кількості вакцинованих пацієнтів розвинулася посилена легенева хвороба, що характеризується еозинофільними і нейтрофільними інфільтраціями і істотними запальними реакціями після природної інфекції КЗМ |ОІзоп 5 Магда (2007) |Віапсо УС еї аІ. (2010) Нит Массіп. 6:482-92).
Багато хто з цих пацієнтів мав потребу в госпіталізації і декілька важкохворих пацієнтів померли. Тому дослідники почали шукати вірусні та/або господарські фактори, сприяючі розвитку посиленого захворювання після зараження, з метою розробки безпечнішої вакцини
К5М. Цей пошук дав багато нової інформації про біологію ЗМ і широкий спектр імунних відповідей, які він може індукувати, але безпечна і ефективна вакцина К5М залишається невловимою.
Після РІ-К5М зусилля по розробці вакцин у значній мірі були зосереджені на одноантигенних вакцинах, що використовують С, Е і, у меншій мірі, М або М2, з вірусними антигенами, що доставляються вірусними або плазмідними ДНК-векторами, що експресують вірусні гени, або у 60 вигляді очищених білків. |(Див., наприклад, МУ. ОІб7ему5Ка еї аї. (2004), Массіпе 23:215-221; С.
Тауїог еї аї. (1997), У. Сбеп. Мігої. 78:3195-3206; і 1.5. Умуай еї аї. (2000), Массіпе 18:392-3971.
Вакцинація комбінацією Е-О також тестувалася на телятах, бавовняних хом'яках і мишах
ВА! В;с із змінними результатами (Апіопів еї аї!. (2007) (телята); В. Мо55, Патентна заявка США
Мо 06/849,299 («Ше "299 арріїсайоп'"), подана 8 квітня 1986 (бавовняні хом'яки); і 1.5. Умуай еї аї. (2000) (миші ВАГ В/сС)). І Е, і б були імуногенними у телят, мишей, бавовняних хом'яків, людей, і принаймні у деякій мірі у новонароджених макак А.Б... Апіопів еї аї. (2007) (телята); В. Мо55,
Ше 7299 арріїсайоп (бавовняні хом'яки); ЇЇ. ае УмМааі! еї аї. (2004), Массіпе 22:923-926 (новонароджені макаки); Г.5. Умуай еї аї. (2000) (миші ВАГ В/с); У. Мигага (2009) (люди))|.
При цьому, проте, характер і тип імунної відповіді, що індукується кандидатами К5М-вакцин, варіює - часто вельми істотно - залежно від типа вакцини, що використовується, вибраних антигенів, шляху введення і навіть використаного модельного організму. Наприклад, імунізація живим К5ЗМ або реплікуючими векторами, що кодують білок Е Е5МУ, індукує домінантну реакцію
Тн!, що супроводжується продукуванням нейтралізуючих антитіл до Е і СОв-- СТІ,, асоційованих з мінімальною легеневою патологією при поствакцинальному вірусному зараженні (У. Мигаїа (2009) і посилання в ній). На відміну від цього, імунізація РІ-інактивованим препаратом К5М викликає домінантну реакцію Тн2, повністю позбавлену реакції СО8- СТІ, яка викликає збільшення патологічних змін у легенях (М. Мигаїа (2009) і посилання в ній). Цікаво, що введення білка б КОМ як очищеної субодиничної вакцини або у векторі, що реплікується, індукує домінуючу реакцію Тн2, що врешті-решт продукує еозинофільні легеневі інфільтрати і гіперреактивність дихальних шляхів після вірусного зараження після вакцинації, реакція дуже схожа на посилену хворобу, що спостерігається з РІ-Е5М |М. Мигаїа (2009) і посилання в ній).
Крім того, у той час як вакцинація модифікованим вірусом вісповакцини Анкара (ММА), що кодує білок Е К5МУ, індукувала антитіла до Е і Е-специфічним СОв8ж Т-клітинам у телят, вакцинація
ММА-Р-ММА-о індукувала антитіла до Е і б, але не Е- або с-специфічним СОв'ж Т-клітинам
ІА.Б.С.. Апіопіз вї аї. (2007)|.
Вакцинація мишей вірусом вісповакцини (ММ), що експресує білок Р (ММУ-Е), індукувала сильну відповідь СЮО8ж- Т-клітин, який призводив до кліренсу реплікуючого КМ із легенів, і супроводжувався такою самою або більшою втратою маси, ніж у мишей, імунізованих РІ-А5У
МУ. ОІ52емузКа еї аї. (2004)). Проте, це не було пов'язано з посиленою хворобою, викликаною РіІ-
Зо Е5М або МУ, які експресують білок б (ММ-С) (об'єднані Тн2 еозинофілія у відповідь легенів і втрата маси), у результаті підвищення секреції Тн2-цитокинів, таких як 1-4 і 1-5. Деякі спеціалісти у даній області передбачили, що у вакцини К5М, здатної індукувати відносно збалансовану імунну відповідь, у тому числі і клітинний, і гуморальний компонент, буде менше шансів проявити розширену імунопатологію у відповідь на поствакцинальне зараження (МУ. ОіІв2емуеКа еї аї. (2004)|.
Проте, у той час як вакцинація мишей ВАЇ В/с модифікованим вірусом вісповакцини Анкара (ММА), що кодує Е, З або ЕС, індукувала саме таку збалансовану реакцію, у тому числі гуморальну реакцію (тобто, збалансовану відповідь дос і Ідга) і реакцію Тні (тобто, підвищені рівні ІРМу/інтерлейкіна-12 (1-12) ї знижені рівні інтерлейкіна-4 (1-4) /нтерлейкіна-5 (ІІ -5)),, вакциновані тварини, проте, продовжували демонструвати деяку втрату маси |МУ. ОІ52ему5Ка єї а!. (2004)|.
Не дивлячись на розширення значних зусиль, направлених на характеризацію природи і міри імунних реакцій, що індукуються різними вакцинними кандидатами в різних модельних системах, залишається неясним, якого роду імунна реакція потрібна для передачі міцного і повного імунітету до К5М без схильності реципієнтів вакцини до посиленої хвороби. Через явний дисбаланс між клінічною значущістю КОМ і доступними терапевтичними ( профілактичними засобами розробка вакцини проти К5ЗМ залишається незадоволеною медичною потребою. опис
У той час як попередні невдалі спроби розробити К5ЗМ-вакцини зосереджувались головним чином на вакцинації або К5М-Е, або мембранним глікопротеїном з КЗМУ, або обома, автори цього винаходу виявили, що вакцинація рекомбінантним вірусом вісповакцини Анкара (ММА), що експресує принаймні одну антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М і принаймні одну антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М, індукує кращий захист.
Крім того, такі конструкції індукують майже повний стерильний імунітет, коли застосовуються інтраназально в порівнянні з підшкірним введенням, або навіть у порівнянні з внутрішньом'язовим шляхом введення, використаним Уууай і його колегами ІС.5. Умууай еї аї. (2000). Посилений захист може бути одержаний шляхом введення кандидатів К5МУ-вакцин інтраназально у порівнянні з внутрішньом'язовим введенням.
При вакцинації рекомбінантними ММА, що експресують мембранний глікопротеїн Е5М Е або
КЕ5М о (або обидва) (наприклад, ММА-тВМ1998), рекомбінантними ММА, що експресують принаймні одну антигенну детермінанту мембранного глікопротетну КЗМ і принаймні одну антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М (наприклад, ММА-тВМ2018), автори цього винаходу не спостерігали КМ, що реплікується в легенях протягом 4 днів після зараження, хоча геноми КЕ5М ще виявлялися за допомогою КТ-ДРСЕ. Рекомбінантні ММА, що експресують принаймні одну антигенну детермінанту мембранного глікопротетїну КЗ5М і принаймні одну антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М (наприклад, ММА-тптВМ2018), індукували кращий захист і більше зниження вірусного навантаження К5У, що виявляється за допомогою
АТ-ДРСК, оскільки вони викликали сильну реакцію СОв- Т-клітин проти антигенної детермінанти нуклеокапсидного білка К5ЗМ. Введення таких рекомбінантних вірусів інтраназальним шляхом, крім того, індукувало майже повний стерильний імунітет (фактично було відсутнє ЕЗМ вірусне навантаження, що виявляється КТ-ДРСЕ), тому що вони індукують імунну відповідь слизової оболонки і секрецію антитіл ІдА - реакції, які були відсутні, коли такі конструкції вводили підшкірно.
На відміну від РІ-К5М, такі конструкти викликають збалансовану ТП1-імунну відповідь, що генерує хорошу реакцію антитіл, а також сильні, специфічні клітинні імунні відповіді на антигени
КЗУ. З інтраназальним введенням вакцини, що продукує рівні антитіл до навіть вище, ніж ті, що одержані в результаті звичайного підшкірного введення, на додаток до індукування хорошої відповіді антитіл ІДА, захист покращується і зменшується втрата маси тіла. Проте величина клітинної імунної відповіді не залежить від шляху введення. Цікаво, що винахідники спостерігали картину Т-клітинної відповіді, індукованої за допомогою рекомбінантних ММА, що експресують принаймні одну гетерологічну послідовність нуклеотидів, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М і принаймні одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КЗМ (наприклад, ММА- тВвМ2018, що експресують білки Е і б, Н і М2 КБУ), який був схожий на відповідь Т-клітин, що індукується введенням К5У, хоча і набагато вище.
Таким чином, у першому аспекті, цей винахід передбачає рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини Анкара (ММА), що містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, що
Зо кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну Е5М і принаймні одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М.
Модифікований вірус вісповакцини Анкара (ММА)
ММА був одержаний за допомогою більше ніж 570 серійних пасажів на фібробластах курячих ембріонів шкірного штаму Анкара вірусу вісповакцини Іхорідсаллантоїсний вакцинний вірус вірусу вісповакцини Анкара, СМА; для огляду див. Мауг вї аї. (1975), Іптесііоп 3, 6-14), який підтримувався протягом багатьох років у Массіпайіоп Іпзійше, АпКага, Тигкеу, і використовувався для вакцинації людей. Проте, через часто серйозні поствакцинальні ускладнення, пов'язані з коров'ячою віспою, було зроблено декілька спроб одержання більш послабленої, безпечної вакцини проти віспи.
У період з 1960 по 1974 рр., професорові Антону Майеру вдалося послабити СМА більш ніж 570 безперервними пасажами у клітинах СЕРЕ |Мауг еї аї. (1975)). Як було показано в різних моделях на тваринах, одержаний ММА був авірулентним (Мауг, А. 5 баппег, К. (1978), Оєм. Віої.
Зіапа. 41: 225-234). Як частина раннього розвитку ММА як попередня противіспяна вакцина, були проведені клінічні випробування з застосуванням ММА-517 у комбінації з І ісїег ЕЇІбігеє
ІБІСКІ (1974), Ргєм. Мед. 3: 97-101; ТісКІ апа Носпзівїп-Міпіеї! (1971), Мипісн Мед. МУоспепзену. 113: 1149-1153) у суб'єктів із ризиком несприятливих реакцій від коров'ячої віспи. У 1976 р. ММА, одержаний з насінного матеріалу ММА-571 (що відповідає 571-у пасажу), був зареєстрований у
Германії як праймер-вакцина в програмі двоступінчатої парентеральної вакцинації проти віспи.
Згодом, ММА-572 був використаний у близько 120000 осіб кавказької національності, в основному у дітей у віці від 1 до З років, без повідомлення про важкі побічні ефекти, хоча багато хто з суб'єктів був із популяції з високим ризиком розвитку ускладнень, пов'язаних із коров'ячою віспою (Мауг еї аїЇ. (1978), 7епігаІбІ. ВасіегіоЇ. (В) 167:375-390). ММА-572 був депонований у
Європейській колекції культур клітин тварин як ЕСАСС У94012707.
В результаті пасивування, що використовується для послаблення ММА, є цілий ряд різних штамів або ізолятів, залежно від числа пасажів у клітинах СЕР. Наприклад, ММА-572 був використаний у Германії під час програми ліквідації віспи, а ММА-575 широко використовується як ветеринарна вакцина. ММА-575 був переданий на зберігання 7 грудня 2000 р. у Європейську колекцію культур клітин тварин (ЕСАСС) під депозитним номером М00120707. Послаблений
СМА-вірус ММА (модифікований вірус вісповакцини Анкара) був одержаний шляхом послідовного культивування (більше 570 пасажів) СМА на первинних фібробластах курячих ембріонів.
Не дивлячись на те, що Мауг еї а). продемонстрували у 1970-х що ММА сильно послаблений і авірулентний для людини і ссавців, деякі дослідники повідомили, що ММА не повністю послаблений у клітинних лініях ссавців і людини, оскільки може статися залишкова реплікація у цих клітинах |Віапснага еї а. (1998), У еп Мігої! 79:1159-1167; Сатої! 5 Мо55 (1997),
Мігоїоду 238:198-211; патент США Мо 5185146; Атьгобвіпі еї аїЇ. (1999), у) Мешйгозсі Ке5 55: 5691).
Передбачається, що результати, представлені в цих публікаціях, були одержані з різними відомими штамами ММА, оскільки віруси, що використовувались, істотно відрізняються за своїми властивостями, зокрема, за їх характером зростання у різних клітинних лініях. Така залишкова реплікація небажана з різних причин, у тому числі через проблеми безпеки у зв'язку із застосуванням у людей.
Штами ММА, що мають підвищені профілі безпеки для розробки безпечніших продуктів, таких як вакцини або лікарські препарати, були розроблені Вамагіап Могаїс: ММА додатково пасирувався Вамагіап Могаїс і названий ММА-ВМ. Вірусу ММА, так само як і ММА-ВМ, не вистачає близько 15 95 (31 т.п.н. з шести областей) генома у порівнянні з предковим вірусом СМА. Делеції впливають на цілий ряд вірулентності і круг генів-господарів, а також на ген типа А тілець включення. Зразок ММА-ВМ, відповідний пасажу 583, був депонований 30 серпня 2000 р. в
Європейській колекції клітинних культур (ЕСАСС) під реєстраційним номером М00083008.
ММУА-ВМ може прикріплятися і входити у людські клітини, де вірусно-кодовані гени експресуються дуже ефективно. Проте, збірка і вивільнення потомства вірусу не відбувається.
ММУА-ВМ сильно адаптований до клітин первинних фібробластів курячого ембріона (СЕБЕ) і не реплікується у клітинах людини. У клітинах людини вірусні гени експресуються, а інфекційний вірус не продукується. ММА-ВМ класифікується як організм рівня 1 біологічної безпеки за даними Центрів із контролю і профілактики захворювань у США. Препарати ММА-ВМ та їх похідні були введені багатьом видам тварин, а також більше 2000 людських суб'єктів, у тому числі людям з дефективною імунною системою. Всі вакцинації виявилися безпечними і добре переносимими. Не дивлячись на високе виснаження і знижену вірулентність, у доклінічних дослідженнях ММА-ВМ, як було показано, викликав як гуморальну, так і клітинну імунну
Зо відповідь на вірус вісповакцини і гетерологічні генні продукти, що кодуються генами, клонованими у геном ММА (ЦЕ. Нагтег еї аї. (2005), Апіїміг. Тег. 10(2):285-300; А. Созта 6ї аї. (2003), Массіпе 22(1):21-9; М. бі Місоїа еї а. (2003), Нит. Сепе ТНег. 14(14):1347-1360; М. Оі
Місоїа еї а!. (2004), Сіп. Сапсег Вев., 10(16):5381-5390). "Похідні" або "варіанти" ММА відносяться до вірусів, що мають по суті такі самі характеристики реплікацій, що ії ММА, як описано у цьому документі, але таким, що проявляють відмінності в одній або більше частин своїх геномів. ММА-ВМ, так само як і похідні або варіанти
МУА-ВМ, не в змозі репродуктивно реплікуватися іп мімо у людей і мишей, навіть при сильно придушеній імунній системі мишей. Зокрема, ММА-ВМ або похідне або варіант ММА-ВМ, також мають переважну здатність репродуктивно реплікуватися у фібробластах курячих ембріонів (СЕР), але не здатні до репродуктивної реплікації в людській лінії кератиноцитів НаСат
ІВошКатр еї а! (1988), у СеїІ Віо! 106: 761-771, клітинній лінії кісткової остеосаркоми людини 1438 (ЕСАСО Мо. 91112502), клітинній лінії нирки ембріона людини 293 (ЕСАСС Мо. 85120602) і клітинній лінії Не а цервікальної аденокарциноми людини (АТСС Мо. ССІ -2). Крім того, похідні або варіанти ММА-ВМ мають міру ампліфікації вірусу принаймні у два рази менше, а, в основному, у три рази менше, ніж ММА-575 у клітинах Нега і клітинних лініях НасСат. Тести і аналіз цих властивостей варіантів ММА описані в М/О 02/42480 (США 2003/0206926) і УМО 03/048184 (05 2006/0159699), обидві включені у цей опис шляхом посилання.
Ампліфікацію і реплікацію вірусу зазвичай виражають у вигляді відношення вірусу, продукованого з інфікованої клітини (вихід), до кількості вірусу, спочатку використаного для інфікування клітини у першу чергу (витрати), що називається "мірою ампліфікації". Міра ампліфікації "1" визначає стан ампліфікації, коли кількість вірусу, одержаного з інфікованих клітин така сама, як кількість, що спочатку використана для інфікування клітин, це позначає, що інфіковані клітини є пермісивними для вірусної інфекції і відтворення. На відміну від цього, міра ампліфікації менша, ніж 1, тобто, зниження обсягів виробництва у порівнянні з рівнем витрат, указує на відсутність репродуктивної реплікації і, отже, послаблення вірусу.
Переваги вакцини на основі ММА охоплюють їх профіль безпеки, а також доступність для великомасштабного виробництва вакцини. Доклінічні дослідження показали, що ММА-ВМ демонструє чудову аттенуацію і ефективність у порівнянні з іншими штамами ММА (М/О02/42480). Додатковою властивістю штамів ММА-ВМ є здатність індукувати по суті такий самий рівень імунітету при прайм-режимі вірусу вісповакцини/буст-режимі вірусу вісповакцини у порівнянні з ДНК-прайм-режимом/буст-режимом вірусу вісповакцини.
Рекомбінантні віруси ММА-ВМ, найбільш переважний варіант реалізації у цьому описі, як вважають, є безпечними через характерний для них виразний дефіцит реплікації в клітинах ссавців і чітко визначену авірулентність. Крім того, на додаток до їх ефективності, здійсненність виробництва в промислових масштабах може бути корисною. Крім того, вакцини на основі ММА можуть доставляти декілька гетерологічних антигенів і дозволяють одночасно індукувати гуморальний і клітинний імунітет.
У іншому аспекті винаходу, вірусний штам ММА, придатний для одержання рекомбінантного вірусу, може бути штамом ММА-572, ММА-575 або будь-яким подібним чином послабленим штамом ММА. Також придатним може бути мутант МВА, такий як делетирований хоріоаллантоїсний вірус вісповакцини Анкара (аСМА). Вірус аСМА містить сайти делецій аеї І, аеї І, аеєї ПІ, аеї ІМ, аеІ М ї МІ генома ММА. Сайти особливо корисні для вставки декількох гетерологічних послідовностей. Вірус може репродуктивно реплікуватися (з мірою посилення більше, ніж 10) у лінії клітин людини (наприклад, у людських клітинних лініях 293, 1438 і МКС -5), що потім дозволить оптимізувати шляхом подальшої мутації корисну для вакцинації на основі вірусу стратегію (див. УМО 2011/092029).
Визначення
Термін "антигенна детермінанта" відноситься до будь-якої молекули, яка стимулює імунну систему господаря виробляти антиген-специфічну імунну відповідь або клітинну відповідь, талабо гуморальну відповідь антитіл. Антигенні детермінанти можуть охоплювати білки, поліпептиди, антигенні фрагменти білка, антигени і епітопи, які все ще викликають імунну відповідь у господаря і складають частину антигена, гомологи або варіанти білків, поліпептидів і антигенних фрагментів білка, антигенів і епітопів, у тому числі, наприклад, глікозильовані білки, поліпептиди, антигенні фрагменти білка, антигени і епітопи, а також нуклеотидні послідовності, що кодують такі молекули. Таким чином, білки, поліпептиди, антигенні фрагменти білка, антигени і оепітопи не обмежуються конкретними нативними нуклеотидними або амінокислотними послідовностями, але охоплюють послідовності, ідентичні нативній послідовності, а також модифікації нативної послідовності, такі як делеції, добавки, вставки і
Зо заміни.
Бажано, щоб такі гомологи або варіанти мали принаймні близько 50 95 принаймні близько 60 до або 65 95, принаймні близько 70 95 або 75 95, принаймні близько 80 95, 81 95, 82 90, 83 Фо, 84
Фо, 85 905, 86 95, 87 95, 88 95 або 89 95, типовіше принаймні близько 90 95, 91 95, 92 95, 93 95 або 9495 і навіть бажаніше принаймні близько 95 95, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95, найтиповіше принаймні близько 99 95 ідентичність з референсним білком, поліпептидом, антигенним фрагментом білка, антигеном і епітопом на рівні нуклеотидної або амінокислотної послідовності.
Термін гомолог або варіант також охоплює усічені, видалені або інакше модифіковані нуклеотидні або білкові послідовності, такі як, наприклад, (1) нуклеотидні послідовності ЕЗМ-Е або К5МУ-б, що кодують розчинні форми відповідних білків К5М-Е або К5У-О без сигнального білка, а також трансмембранних та/або цитоплазматичних доменів непроцесованих білків Е5М-
Е або КБМУ-СО, (2) нуклеотидні послідовності К5М-М2 або К5МУ-М, що кодують видалені, усічені або іншим чином мутовані версії непроцесованих білків К5М-М2 або КБМ-М, (3) розчинні форми білків К5М-Е або 5М-С без сигнального білка, а також трансмембранних та/або цитоплазматичних доменів непроцесованих білків Е5У-Е або К5У-СО, або (4) видалені, усічені або іншим чином мутовані версії непроцесованих білків Е5У-М2 або Е5МУ-М.
Способи визначення ідентичності послідовностей між нуклеїновими кислотами і амінокислотами добре відомі в цій галузі техніки. Дві або більше послідовностей можна порівняти шляхом визначення їх «відсотка ідентичності». Відсоток ідентичності двох послідовностей, послідовностей нуклеїнових кислот або амінокислот -- це кількість точних збігів між двома вирівняними послідовностями, поділена на довжину коротшої послідовності і помножена на 100. "Відсоток (90) ідентичності амінокислотної послідовності" по відношенню до білків, поліпептидів, антигенних фрагментів білка, антигенів і епітопів, описаних у цьому документі, визначається як відсоток амінокислотних залишків у послідовності кандидата, які ідентичні амінокислотним залишкам в еталонній послідовності (тобто, білка, поліпептиду, фрагмента антигенного білка, антигена або епітопа, з якого вона одержана), після вирівнювання послідовностей і введення пропусків, якщо це необхідно, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей, і не розглядає будь-які консервативні заміни як частини ідентичності послідовності. Вирівнювання в цілях визначення відсотка ідентичності бо амінокислотної послідовності можна досягти різними способами, які відомі фахівцям у цій галузі б техніки, наприклад, із застосуванням загальнодоступних комп'ютерних програм, таких як ВІ А5Т,
АІОМ або Медаїїдп (ОМАЗТАК). Фахівці у цій галузі техніки можуть визначити відповідні параметри для виміру вирівнювання, у тому числі будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей.
Те ж саме відноситься і до "відсотка (95) ідентичності нуклеотидної послідовності" з відповідними змінами.
Наприклад, прийнятне вирівнювання послідовностей нуклеїнових кислот забезпечується застосуванням алгоритму локальної гомології Сміта і Ватермана (Зтійй апа Умагегтап, (1981),
Адуапсез іп Аррій Маїйетаїйсв 2:482-489). Цей алгоритм може бути застосований до амінокислотних послідовностей за допомогою матриці замін, розробленої Юаупоїйї, Айаб5 ої ргоїєїп Е Зедиєпсев апа Зігисіште, М.О. ЮБаупой єй., 5 ви,иррі. 3:353-358, Маїйопа! Віотеадіса)
Кезеагсп Еошипааїййоп, Умазпіпоїоп, О.С., О5А, ії нормалізованої сгір5Ком (1986), Мисі. Асіаз Нев. 14(6):6745-6763. Приклад реалізації цього алгоритму для визначення відсотка ідентичності послідовності наданий Сепеїїс5 Сотршиїег сгоир (Мадізоп, УМі5.) у службовій програмі "Вевірії.
Параметри за умовчанням для цього способу описані в М/і5соп5зіп Зедцепсе Апаїузі5 РасКаде
Ргодгат Мапиа!Ї, Мегбзіоп 8 (1995) (доступні від Сепеїййс5 Соптриїег Сгоир, Мадізоп, Умі5.).
Переважний спосіб установлення відсотка ідентичності в контексті цього винаходу полягає у використанні пакету програм МРОКСН, захищених авторським правом в університеті Едінбургу, розробленого Чопп Р. СоїІп5 і 5папе 5. БіштоКк, і ІптеПСепеїіс5, що поширюються, Іпс. (Мошипіаїп
Міему, Сай). З цього набору пакетів алгоритм Зтйп-Умагептап може використовуватися там, де параметри за умовчанням використовуються для таблиці підрахунку очок (наприклад, штраф на внесення делеції до вирівнювання 12, штраф на продовження делеції один і розриву шість). З отриманих даних, значення "Маїс" відображає "ідентичність послідовності". Інші прийнятні програми для розрахунку відсотка ідентичності або схожості між послідовностями, як правило, відомі у цій галузі, наприклад, іншою програмою вирівнювання є ВІ А5Т, що використовується з параметрами за умовчанням. Наприклад, ВГАБТМ і ВГАБТР можуть застосовуватися із застосуванням наступних параметрів за умовчанням: депеїйс соде-е«апаага; ЯКег-попе; зігапа-роїйн; сшіой-60; ехресі-10; МайіхХ-ВІ О5ИОМб62; Оезсгіріоп5е-50 зедиепсев; зой Бу-нІСН
ЗСОВЕ; Раїабазез-поп-тедипаапі, СепВапк-ЕєЕМВІ -008-РОВ--СепВапк сор5
Зо їгапеІайопежоміз5 ргоївіп«Зрирааїе РІК. Детальну інформацію про ці програми можна знайти в
Інтернеті за наступною адресою: пЕр:/пЕр://ріІаві.пебі.піт.піп.дом/.
Під терміном "гетерологічний" ген, нуклеїнова кислота, антиген або білок у цьому описі розуміється нуклеїнова кислота або амінокислотна послідовність, яка не присутня у геномі поксвірусу дикого типа (наприклад, ММА). Фахівцеві у цій галузі зрозуміло, що "гетерологічний ген", якщо присутній у поксвірусі, такому як ММА, має бути включений у геном поксвірусу таким чином, що після введення рекомбінантного поксвірусу у клітину-господар, він експресується у вигляді відповідного гетерологічного генного продукту, тобто, як "тетерологічний антиген" та/або "гетерологічний білок". Експресія зазвичай досягається шляхом функціонального зв'язування гетерологічного гена з регуляторними елементами, які роблять можливою експресію у поксвірус-інфікованій клітині. Переважно, регуляторні елементи містять природний або синтетичний поксвірусний промотор. "Стерильний імунітет" у цьому описі, позначає захисний імунітет у відсутність генома К5М, що детектується, коли застосовуються такі чутливі способи виявлення, як КТ-ДРСВ.
Слід зазначити, що, у цьому описі, форми однини містять посилання на множину, якщо з контексту явно не виходить інше. Таким чином, наприклад, посилання на "епітоп" містить один або більше епітопів, а посилання на "спосіб" містить посилання на еквівалентні етапи і способи, відомі фахівцям у цій галузі техніки, які можна модифікувати або замінити способами, описаними у цьому документі.
Якщо не вказане інше, то термін "принаймні", що передує ряду елементів, слід розуміти як такий, що відноситься до кожного елементу у серії. Фахівцям у цій галузі техніки будуть зрозумілі або вони зможуть встановити, використовуючи не більше ніж рутинні експерименти, багато еквівалентів конкретних варіантів реалізації винаходу, описаного в цьому документі. Такі еквіваленти охоплюються цим винаходом.
У цьому описі і в наступній формулі винаходу, якщо контекст не вимагає іншого, слово "містити" ії його варіації, такі як "містить" і "що містить", слід розуміти як включення вказаного цілого або стадії, або групи цілих чисел або стадій, але не виключаючи будь-яке інше ціле або стадії, або групи цілого числа або стадій. При використанні у цьому описі термін "що містить" може замінюватися терміном "що вміщує" або "що включає", або інколи при використанні в цьому описі терміном "що має". Будь-який із вказаних вище термінів (що включає, що містить, бо що вміщує, що має), хоча і менш бажані, коли використовується у цьому документі у зв'язку з одним із аспектів або варіантів реалізації цього винаходу, може бути замінений терміном "що складається з".
При використанні у цьому документі "що складається з" виключає будь-який елемент, крок або інгредієнт, не вказаний у заявленому елементі. При використанні у цьому документі термін "складається в основному з" не виключає матеріали або дії, які істотно не впливають на основні і нові характеристики домагання.
При використанні у цьому документі, сполучний термін "та/або" між декількома перерахованими елементами слід розуміти як такий, що охоплює як індивідуальні, так і об'єднані варіанти. Наприклад, коли два елементи поєднуються шляхом "та/або", то перший варіант відноситься до застосовності першого елементу без другого. Другий варіант відноситься до застосовності другого елементу без першого. Третій варіант відноситься до застосовності першого і другого елементів один з одним. Слід розуміти, що будь-який із цих варіантів знаходиться у межах значення і, отже, задовольняє вимозі терміну "та/або", як використовується у цьому документі. Також зрозуміло, що одночасна застосовність більше ніж одного з варіантів підпадають під значення і, отже, задовольняє вимоги терміну "та/або".
Нуклеотидні послідовності і білки Е5М
Гени КЗУ, як згадується у цьому описі, відносяться до генів або гомологів або варіантів генів, що кодують відповідний білок у будь-якому штамі К5М або ізоляті, навіть якщо точна послідовність та/або геномне розташування гена може відрізнятися від штамів або ізолятів.
Крім того, білки КБУ, згадані у цьому описі, відносяться до білків або гомологів або варіантів білків, що кодуються і експресуються відповідним геном білка, як визначено вище.
Як приклад, в цьому описі наступні терміни використовуються взаємозамінно: терміни "ген білка ЕЕ", "ген глікопротеїну Е", "ген білка Є К5М", "ген глікопротетну Є КБЗМ" або "ген Е" відносяться до гена або гомолога або варіанту гена, що кодує трансмембранний злитий глікопротеїн у будь-якому штамі КЗМУ або ізоляті, хоча точна послідовність та/або розташування генома гена білка Е можуть відрізнятися між штамами або ізолятами. Наприклад, у штамі А2
Е5МУ, ген білка К(А2) містить нуклеотиди 5601-7499 (кінцеві точки включені), як пронумеровано у
СепвВапк під інвентарним номером М11486. Ген білка К(Аг) додатково містить кодуючу відкриту рамку зчитування (ОКЕ), що охоплює нуклеотиди 5614-7338 (кінцеві точки включені), як
Зо пронумеровано у СепВапкК під інвентарним номером М11486. Нуклеотидна послідовність гена білка Е із А2 Е5М указана у 5ЕО ІЮО МО: 28.
Також взаємозамінно застосовані у цьому описі терміни "білок Е", "глікопротеїн Е", "білок Е
БМ", "глікопротеїн Е КБУ" або "Е", які відносяться до важко глікозильованим трансмембранним глікопротеїнам злиття або гомологам або варіантам білка, що кодується і експресується геном білка Є К5МУ, як визначено вище. Амінокислотна послідовність білка Е із К5М А2 вказана в ЗЕО
ІО МО: 29. Білок Е К5М(Аг) містить сигнальний пептид, позаклітинний домен, трансмембранний домен і цитоплазматичний домен (див., наприклад, ОпіРгоїкВ/Зм/із5-Ргої, інвентарний номер
РОЗ3420). Сигнальний пептид білка Е К5М А2 складається з амінокислот 1-21 із БЕО ІЮ МО: 29; позаклітинний домен білка Е Е5М А2 складається з амінокислот 1-529 із БЕО ІЮО МО: 29 або амінокислот 22-529 із БЕО ІЮ МО:29; трансмембранний домен білка Е К5М А2 складається з амінокислот 530-550 із БЕО ІО МО: 29; і цитоплазматичний домен білка Е К5М А2 складається з амінокислот 551-574 із ЗЕО ІЮ МО: 29.
Також терміни "ген білка с", "ген глікопротеїну С", "ген білка 5 КБУ", "ген глікопротеїну С
КБУ" або "ген с" використовуються у цьому описі взаємозамінно. Наприклад, у штамі А2 ЗМ ген білка С(А2) містить нуклеотиди 4626-5543 (кінцеві точки включені), як пронумеровано у
СепВапк під інвентарним номером М11486. Ген білка С(А2) додатково містить білок, що кодується відкритою рамкою зчитування (ОКЕ), що охоплює нуклеотиди 4641-5537 (кінцеві точки включені), як пронумеровано у СепВапкК під інвентарним номером М11486. Нуклеотидна послідовність гена білка С з А2 К5М вказана у 5ЕО ІЮО МО: 30.
Терміни "білок с", "глікопротеїн С", "білок з КБУ", "глікопротеїн с КБУ" або "с" відносяться до важко глікозильованому трансмембранному глікопротеїну приєднання, або до гомолога, або варіанту білка. Амінокислотна послідовність білка С із К5М А2 вказана у 5ЕО ІЮО МО: 31. Білок С
А2 ЗМ містить позаклітинний домен, трансмембранний домен і цитоплазматичний домен (див., наприклад, ОпіРгоїКкВ/5у/і55-Ргої, інвентарний номер РО3423). Позаклітинний домен білка с А2
Е5М складається з амінокислот 67-298 із БЕО ІЮ МО: 31; трансмембранний домен білка с А2
Е5М складається із амінокислот 38-66 із БЕО ІЮО МО: 31; і цитоплазматичний домен білка б А2
ЕМ складається із амінокислот 1-37 із ФЕО ІЮО МО: 31.
Використовуються взаємозамінно у цьому документі також терміни "ген білка М2", "ген нуклеокапсидного білка М2", "ген білка М2 КМ", "ген матриксного білка М2 КБУ", "ген 60 нуклеокапсидного білка М2 КМУ" або "ген М2". Наприклад, у штамі А2 КЗУ, ген білка М2(А2)
містить нуклеотиди 7550-8506 (кінцеві точки включені), як пронумеровано у СепВапК під інвентарним номером М11486. Ген білка М2(А2) додатково містить білок, що кодується відкритою рамкою зчитування (ОКЕ), що охоплює нуклеотиди 7559-8143 (кінцеві точки включені), як пронумеровано у СепВапкК під інвентарним номером М11486. Нуклеотидна послідовність гена білка М2 з А2 К5М вказана у 5ЕО ІЮО МО: 32.
Використовуються взаємозамінно у цьому документі терміни "білок М2", "нуклеокапсидний білок М2", "К5М М2 протеїн", "нуклеокапсидний білок М2 КБУ", "матриксний білок М2 КБУ" або "М2". Амінокислотна послідовність білка М2 з К5М А2 вказана у ЗЕО ІЮО МО: 33 (див., наприклад,
ОпіРтоїкВ/бмізв5-Ргої, інвентарний номер РО4545).
Також терміни "ген білка М", "ген нуклеокапсидного білка М", "ген білка М БМ", "ген нуклеокапсидного білка М КМ" або "ген М" у цьому документі можуть використовуватися взаємозамінно. Наприклад, у штамі А2 КМ, ген білка М(А2) містить нуклеотиди 1081-2277 (кінцеві точки включені), як пронумеровано у СепВапкК під інвентарним номером М11486. Ген білка М(А2) додатково містить білок, що кодується відкритою рамкою зчитування (ОКР), що охоплює нуклеотиди 1096-2271 (кінцеві точки включені), як пронумеровано у СепВапк під інвентарним номером М11486. Нуклеотидна послідовність гена білка М з А2 К5М вказана у 5ЕО
ІО МО: 34.
Амінокислотна послідовність "білка М", "нуклеокапсидного білка М", "білка М БУ", "нуклеокапсидного білка М КМ" або "М", терміни, які використовуються в цьому описі взаємозамінно, з А2 КЗМ вказана в 5ЕО ІЮО МО: 35 (див., наприклад, ОпіРгоїКВ/5мі55-Ргої, інвентарний номер РОЗА418).
Деякі варіанти реалізації винаходу
У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА експресує принаймні одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротетну К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну ЕМ, кодує антигенну детермінанту Е К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М, кодує антигенну детермінанту 5 КЗМ. У деяких варіантах реалізації
Зо винаходу антигенну детермінанту Е КМ одержують з штаму А2 КМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенну детермінанту С К5М одержують зі штаму А2 КБУ.
У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА містить дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, кожна кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну
Е5М. У деяких варіантах реалізації винаходу першою антигенною детермінантою мембранного глікопротетну К5М є антигенна детермінанта Є КМ, а другою антигенною детермінантою мембранного глікопротеїну КЗМ є антигенна детермінанта о КБУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенну детермінанту ЕЕ КМ одержують зі штаму А2 КБ5М. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенну детермінанту З КЗМ одержують зі штаму А2 КМ. У деяких варіантах реалізації винаходу обидві антигенні детермінанти БЕ КЗМ і З К5М можуть бути одержані зі штаму А2 КБУ.
У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА експресує принаймні одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротегїну КЗМ і принаймні одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротетну КОМ, кодує антигенну детермінанту Є К5М і принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М, кодує антигенну детермінанту М2 К5ЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КЗМ, кодує антигенну детермінанту БЕ К5М і принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка Е5М, кодує антигенну детермінанту М К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5ЗМ, кодує антигенну детермінанту 5 КОМ і принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М, кодує антигенну детермінанту М2 К5ЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5ЗМ, кодує антигенну детермінанту 5 К5ЗМ і принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного бо білка К5М, кодує антигенну детермінанту М ЕМ.
У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА містить дві гетерологічні нуклеотидні послідовності кожна з яких кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну КЗМ є антигенною детермінантою ЕЕ К5ЗМ і друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну КЗМ є антигенною детермінантою з КБУ. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА містить дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, кожна з яких кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну ЗМУ, і принаймні одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КОМ. У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М є антигенною детермінантою Є К5ЗМ, а друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну КЗМ є антигенною детермінантою о К5МУ, і антигенною детермінантою нуклеокапсидного білка К5М є антигенною детермінантою М2 КБУ.
У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротетїну Е5М є антигенною детермінантою ЕЕ Б5М, друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну КЗМ є антигенною детермінантою б КЗУ, антигенна детермінанта нуклеокапсидного білка Е5М є антигенною детермінантою М ЗУ. У деяких варіантах реалізації винаходу обидві антигенні детермінанти Е і 5 К5М можуть бути одержані зі штаму А2 КБУ.
У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА містить дві гетерологічні нуклеотидні послідовності кожна з яких кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КМУ, дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, кожна з яких кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну КЗМ є антигенною детермінантою ЕЕ КМ, друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М є антигенною детермінантою с
Е5М, перша антигенна детермінанта нуклеокапсидного білка К5М є антигенною детермінантою
М2 КМ, а друга антигенна детермінанта нуклеокапсидного білка К5М є антигенною детермінантою М К5У. У деяких варіантах реалізації винаходу обидві антигенні детермінанти Е і
С К5М можуть бути одержані з штаму А2 КБУ.
У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА містить три гетерологічні нуклеотидні послідовності кожна з яких кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КБУ, і дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, кожна з яких кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М є антигенною детермінантою Е К5У, а друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М є антигенною детермінантою с
Е5М, перша антигенна детермінанта нуклеокапсидного білка К5М є антигенною детермінантою
М2 КМ, а друга антигенна детермінанта нуклеокапсидного білка К5М є антигенною детермінантою М КБУ. У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М і друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну ЕМ одержані зі штаму А2 КБ5БМ. У деяких варіантах реалізації винаходу третя антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну Е5М є антигенною детермінантою Е КБУ.
У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА містить чотири гетерологічні нуклеотидні послідовності кожна з яких кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КБУ, і дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, кожна з яких кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М є антигенною детермінантою Е К5МУ, а друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М є антигенною детермінантою о
Е5М, перша антигенна детермінанта нуклеокапсидного білка К5М є антигенною детермінантою
М2 КМ, а друга антигенна детермінанта нуклеокапсидного білка К5М є антигенною детермінантою М КБУ. У деяких варіантах реалізації винаходу перша антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М і друга антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну ЕМ одержані зі штаму А? КБ5М. У деяких варіантах реалізації винаходу третя антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну К5М є антигенною детермінантою Е К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу четверта антигенна детермінанта мембранного глікопротеїну
В5М є антигенною детермінантою с КБУ.
У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КЗМ, кодує антигенну детермінанту Е КБУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта
Е КМ є непроцесованою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта Е
КЗМ є усіченою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта Є К5М є варіантом антигенної детермінанти БЕ КБ5М. У деяких варіантах реалізації винаходу бо непроцесовану, усічену або варіантну антигенну детермінанту Е Е5М одержують зі штаму А2
КЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта непроцесованого ЕЕ
КЗМ(А2) містить нуклеотидну послідовність 5ЕСО ОО МО: 28, що кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 29. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта варіантного ЕЕ КБЗМ(А2) містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 3, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 4. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта усіченого Б КЗМ(А2) не має цитоплазматичних і трансмембранних доменів антигенної детермінанти непроцесованого Е КЗ5М(А2). У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта усіченого Е КЗМ(А2) містить нуклеотидну послідовність з«ЕО ІЮ МО: 15, що кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 16. У деяких варіантах реалізації винаходу непроцесовану, усічену або варіантну антигенну детермінанту Е К5М одержують зі штаму
АГопд К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта варіантного ЕЕ
КЗМ(АГопо) містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІО МО: 5, що кодує амінокислотну послідовність БЕО ІО МО: 6. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта усіченого Є КЗМ(АГопо) не має цитоплазматичних і трансмембранних доменів антигенної детермінанти непроцесованого Е КЗМ(АГ опо).
У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М, кодує антигенну детермінанту С К5ЗУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта о К5М є непроцесованою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта с
КМ є усіченою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта б К5М є варіантною антигенною детермінантою К5М (3. У деяких варіантах реалізації винаходу непроцесовану, усічену або варіантну детермінанту б КЗМ одержують зі штаму А2 К5БМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта непроцесованого з КЗМ(А2) містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 2. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта усіченого СО К5М(А2) не має цитоплазматичних і трансмембранних доменів антигенної детермінати непроцесованого о
ЕБ5М(А2). У деяких варіантах реалізації винаходу непроцесовану, усічену або варіантну антигенну детермінату К5М б одержують зі штаму В КМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта усіченого К5ЗМ(В) (С не має цитоплазматичних і
Зо трансмембранних доменів антигенної детермінанти непроцесованого З К5М(В). У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта усіченого 5 К5М(В) с містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО:7, що кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8.
У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5МУ, кодує антигенну детермінанту М2 КБУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М2 К5М є непроцесованою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М2 К5М є усіченою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М2 К5М є варіантною антигенною детермінантою М2 К5ЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу непроцесовану, усічену або варіантну антигенну детермінанту М2 Е5М одержують зі штаму А2 К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М2 КБЗМ(А2) містить нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО: 32, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 33.
У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5МУ, кодує антигенну детермінанту М КЗУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М К5М є непроцесованою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М КМ є усіченою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М К5М є варіантною антигенною детермінантою М КЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу непроцесовану, усічену або варіантну антигенну детермінанту М К5М одержують зі штаму А2 КЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М КЗМ(А2) містить нуклеотидну
БО послідовність зЕО ІЮ МО: 34, що кодує амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 35.
У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М К5М і антигенна детермінанта М2 К5М кодуються єдиною відкритою рамкою зчитування і розділені протеазним доменом, що саморозщеплюється. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М2 КМ є непроцесованою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М2 К5М є усіченою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М2 К5М є варіантною антигенною детермінантою М2 К5ЗМ. У деяких варіантах реалізації винаходу непроцесовану, усічену або варіантну антигенну детермінанту М2 КМ одержують зі штаму А2 КБУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М
КЗМ є непроцесованою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М КМ бо є усіченою. У деяких варіантах реалізації винаходу антигенна детермінанта М К5М є варіантною антигенною детермінантою М К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу усічену або варіантну антигенну детермінанту М одержують зі штаму А2 К5ЗМУ. У деяких варіантах реалізації винаходу протеазний домен, що саморозщеплюється, одержують із вірусу ящура. У деяких варіантах реалізації винаходу протеазний домен, що саморозщеплюється, є фрагментом протеази 2А з вірусу ящура, що містить нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО: 11, що кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12. У деяких варіантах реалізації винаходу принаймні одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту М К5М і антигенну детермінанту М2 К5МУ, містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІО МО: 17, що кодує амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 18.
Сайти інтеграції в ММА
У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічні нуклеотидні послідовності, що кодують одну або більше антигенних детермінант мембранних глікопротеїнів Е5М і одну або більше антигенних детермінант нуклеокапсидних білків К5У, включені в різні сайти інтеграції в геномі
ММА або в геномі ММА-ВМ. Гетерологічні нуклеотидні послідовності, що кодують одну або більше антигенних детермінант білків Е5М, можуть бути включені в рекомбінантний ММА як окремі одиниці транскрипцій або як гібридні гени, як указано на фігурі 1.
У деяких варіантах реалізації винаходу гетерологічні нуклеотидні послідовності КМ включені в одну або більше міжгенних ділянок (ІБК) ММА. ІК може бути вибраною з І5КО7/08,
ІСЕ 44/45, ІС. 64/65, ІСК 88/89, ІБК 136/137, і ІС 148/149, переважно з ІОКб64/65, ІОК88/89 і
ІБК 148/149. Гетерологічні нуклеотидні послідовності КМ можуть бути, додатково або альтернативно, включені в один або більше делеційних сайтів природнього походження І, ЇЇ, ПІІ,
ЇМ, М або МІ ММА. У деяких варіантах реалізації винаходу менше ніж 5, 4, З або 2 сайти інтеграції містять гетерологічні нуклеотидні послідовності КМ.
Кількість сайтів інтеграції ММА, що містять гетерологічні нуклеотидні послідовності КБУ, може складати 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або більше. Рекомбінантний ММА може містити гетерологічні нуклеотидні послідовності К5У, включені в 4, 3, 2 або менше сайтів інтеграції, але переважно використовують два сайти інтеграції. У деяких варіантах реалізації винаходу використовують три сайти інтеграції. Переважно, рекомбінантний ММА містить принаймні 4, 5, 6 або 7 нуклеотидних послідовностей, включених у 2 або З сайти інтеграції.
Зо Рекомбінантні віруси ММА, передбачені у цьому документі, можуть бути одержані за допомогою загальновідомих рутинних способів. Способи одержання рекомбінантних поксвірусів або включення гетерологічних нуклеотидних послідовностей у поксвірусний геном добре відомі фахівцям у цій галузі техніки. Наприклад, способи стандартних технологій молекулярної біології, такі як технології клонування ДНК, виділення ДНК і РНК, вестерн-блоттинга, КТ-РСК і
РСВ-ампліфікації описані в МоїЇесшіаг Сіопіпд, А Іабогаїогу Мапиаї (2па Еа.) (3. Затьгоок еї аї.,
Соїд Зргіпд Нагбог І арогафогу Ргез5 (1989)|), а технології обробки і маніпуляції вірусів описані в
Ммігоїюду Меїйод5 Мапчиаї ІВЛМ/.). Манйу еї аї. (еа5.), Асадетіс Рге55 (1996)). Крім того, способи і ноу-хау для обробки, маніпулювання і генної інженерії ММА описані в МоїЇесшаг Мігоіоду: А
Ргасіїса! Арргоасі (А.). Оамізоп 4 В.М. Бїой (Едв.), Те Ргасіїса! Арргоасі 5егієв, ІВІ. Ргевзз аї
Охіога Опімегейу Ргез5, Охіога, ОК (1993) (див., наприклад, Спарієг 9: Ехргеззіоп ої депе5 ру
Массіпіа міги5 месіогв5)| і Ситгепі РгоїосоЇї5 в Моїесшаг Віооду Юопп Уміеу 4 Зоп, Іпс. (1998) (див., наприклад, Спарієег 16, Зесііоп ІМ: Ехргезвіоп ої ргоївіп5 іп татітаїйап сеїЇ5 изіпуд массіпіа міга! месіог)|.
Для одержання різних рекомбінантних ММА, описаних у цьому документі, можуть бути застосовані різні способи. Нуклеотидні послідовності, які потрібно вставити у вірус, можуть бути поміщені в плазмідний конструкт Е. соїї, в який включені ДНК, гомологічні ділянці ДНК ММА.
Окремо, послідовність ДНК для вставки може бути лігованою з промотором. Місток промотор- ген може розміщуватися в плазмідному конструкті таким чином, щоб місток промотор-ген з обох кінців примикав до ДНК, гомологічній послідовності ДНК, що фланкує область ДНК ММА, що містить неістотний локус. Одержаний плазмідний конструкт може бути ампліфікований шляхом розмноження в бактерії Е. соїї і виділений. Виділена плазміда, що містить послідовність ДНК гена для вставки, може бути трансфікована у клітинну культуру, наприклад, у фібробласти курячих ембріонів (СЕР), у цей же час культуру інфікують ММА. Рекомбінація між гомологічною
ДНК ММА у плазміді і вірусним геномом, відповідно, може генерувати ММА, модифікований присутністю чужорідних послідовностей ДНК.
Згідно переважному варіанту реалізації, клітина відповідної культури клітин, як, наприклад, клітини СЕБЕ, може бути інфікована поксвірусом. Інфікована клітина може бути, потім, трансфікована першим плазмідним вектором, що містить чужорідний ген або гени, переважно під контролем транскрипції елементу, контролюючого експресію поксвірусу. Як описано вище, 60 плазмідний вектор також містить послідовності, здатні направляти вставку екзогенної послідовності у вибрану частину поксвірусного генома. Необов'язково, плазмідний вектор також містить касету, що містить маркер та/або селекційний ген, функціонально пов'язаний з поксвірусним промотором. Прийнятними маркерами або селекційними генами є, наприклад, гени, що кодують зелений флуоресцентний білок Др-галактозидазу, неоміцин- фосфорибозилтрансферазу або інші маркери. Застосування селекційних або маркерних касет спрощує ідентифікацію і виділення створеного рекомбінантного поксвірусу. Проте, рекомбінантний поксвірус також можна ідентифікувати за допомогою технології РОК. Згодом, додаткові клітини можуть бути інфіковані рекомбінантним поксвірусом, одержаним, як описано вище, і трансфіковані другим вектором, що містить другий чужорідний ген або гени. На той випадок, якщо цей ген може бути введений в інший сайт інтеграції у поксвірусном геномі, другий вектор також відрізняється по поксвірусним гомологічним послідовностям, що направляють інтеграцію другого чужорідного гена або генів у геном поксвірусу. Після того, як відбудеться гомологічна рекомбінація, може бути виділений рекомбінантний вірус, що містить два або більше чужорідних генів. Для введення додаткових чужорідних генів у рекомбінантний вірус, етапи інфекції і трансфекції можна повторити із застосуванням рекомбінантного вірусу, виділеного на попередніх етапах для інфекції, і з застосуванням додаткового вектора, що містить додатковий чужорідний ген або гени для трансфекції.
Альтернативно, етапи інфекції і трансфекції, як описано вище, є взаємозамінними, тобто, відповідна клітина може спочатку бути трансфікована за допомогою плазмідного вектора, що містить чужорідний ген, а потім інфікована поксвірусом. Як додаткова альтернатива, також можна вводити кожен чужорідний ген у різні віруси, коіїнфікувати клітину всіма одержаними рекомбінантними вірусами і відібрати для рекомбінації, включаючи всі чужорідні гени. Третім варіантом є лігування генома ДНК і чужорідних послідовностей іп мійго і відновлення рекомбінованого генома ДНК вірусу вісповакцини із застосуванням вірусу-помічника. Четвертою альтернативою є гомологічна рекомбінація в Е. соїї або інші види бактерій між геномом вірусу вісповакцини, клонованим у вигляді бактерійної штучної хромосоми (ВАС), і лінійною чужорідною послідовністю, що примикає до послідовностей ДНК, гомологічних послідовностей, що фланкують бажаний сайт інтеграції в геномі вірусу вісповакцини.
Експресія генів КМ
Зо В одному варіанті реалізації винаходу експресія однієї, більше або всіх гетерологічних нуклеотидних послідовностей К5М відбувається під контролем одного або більше поксвірусних промоторів. У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусним промотором є промотор Рг7.5 - гібридний ранній/пізній промотор, промотор РАЗ - синтетичний або природний ранній або пізній промотор, або промотор АТІ вірусу вакцини. У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусний промотор вибирають з групи, що складається з промотора РК (ЗЕО ІЮ МО: 39), промотора Рг7.5 (ЗЕО ІЮО МО: 40), промотора РгЗупі!т (5ЕО ІО МО: 41), промотора РІ Е1 (ЗЕО
ІО МО: 42) і промотора РгНнбт (ЗЕО ІО МО: 43 |(/.5. Умуай еї аїЇ. (1996), Массіпе 14(15):1451- 14581). У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусним промотором є промотор РК5 (5ЕО
ІО МО: 39). У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусним промотором є промотор Рг7.5 (ЗЕО ІО МО: 40). У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусним промотором є промотор
Ргзупі!т (5ЕО ІЮО МО: 41). У деяких варіантах реалізації винаходу поксвірусним промотором є промотор РЕ (5ЕБО ІО МО: 42). У деяких варіантах реалізації винаходу , поксвірусним промотором є промотор РІіН5т (5ЕО ІЮ МО: 43).
Гетерологічна нуклеотидна послідовність ЕЗМ або послідовності можуть експресуватись у вигляді єдиної транскрипційної одиниці. Наприклад, гетерологічна нуклеотидна послідовність
Е5М може функціонально зв'язуватися з промотором вірусу вісповакцини та/або приєднуватися до термінатору транскрипції вірусу коров'ячої віспи. У деяких варіантах реалізації винаходу одна або більше гетерологічних нуклеотидних послідовностей К5М експресуються у вигляді злитого білка. Злитий білок може додатково містити сайт розпізнавання для пептидази або гетерологічної пептидної послідовності, що саморозщеплюється. Гетерологічна пептидна послідовність, що саморозщеплюється, може бути 2А пептидазою від вірусу ящура.
У деяких варіантах реалізації винаходу "одиниця транскрипції" вставляється сама по собі в сайт інтеграції генома ММА, але може також вставлятися з іншою одиницею (одиницями) транскрипції в сайт інтеграції генома ММА. "Одиниця транскрипції" не має природного походження (тобто, вона є гетерологічною, екзогенною або чужорідною) в сенсі генома ММА і здатна до транскрипції в інфікованих клітинах.
Переважно, рекомбінантний ММА містить 1, 2, 3, 4, 5 або більше одиниць транскрипцій, уведених у геном ММА. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА стабільно експресує білки КМ, кодовані 1, 2, 3, 4, 5 або більше одиницями транскрипцій. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний ММА містить 2, 3, 4, 5 або більше одиниць транскрипцій, введених у геном ММА в 1, 2, З або більше сайтів інтеграції в геномі ММА.
Вакцини ВА5МУ і фармацевтичні композиції
Оскільки рекомбінантні віруси ММА, у тому числі МУМА-ВМ, описаний у цьому документі, є вельми обмеженими відносно реплікації і, таким чином, сильно послабленими, то вони є ідеальними кандидатами для лікування широкого кола ссавців, у тому числі людини і навіть людей з послабленим імунітетом. Отже, у цьому документі передбачені рекомбінантні ММА згідно цього винаходу для застосування як активні фармацевтичні речовини, а також фармацевтичні композиції і вакцини, призначені для індукування імунної реакції у живому організмі тварини, включаючи людину.
Для цього рекомбінантний ММА, вакцина або фармацевтична композиція можуть бути одержана у розчині у діапазоні концентрацій, що становить 105-109 ТСіІЮво/мл, 105-5х108
ТСІЮОво/мл, 105-108 ТСІОво/мл або 107-108 ТСІЮво/мл. Переважна доза для людини містить від 106 до 109 ТСІО»о, у тому числі дозу 106 ТСІЮОво, 107 ТСІОво, 108 ТСІОво або 5х108 ТСІО»о.
Фармацевтичні композиції, передбачені у цьому документі, можуть, як правило, містити один або більше фармацевтично прийнятних та/або придатних носіїв, добавок, антибіотиків, консервантів, ад'ювантів, розчинників та/або стабілізаторів. Такими допоміжними речовинами можуть бути вода, фізіологічний розчин, гліцерин, етанол, зволожуючі або емульгуючі агенти, рН-буферні речовини і тому подібне. Прийнятні носії зазвичай є великими молекулами, що повільно метаболізуються, такі як білки, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, співполімери амінокислот, ліпідні агрегати або тому подібне.
Для одержання вакцин рекомбінантні віруси ММА, передбачені у цьому документі, можуть бути перетворені на фізіологічно прийнятну форму. Це може бути зроблено, виходячи з досвіду приготування поксвірусних вакцин, що використовуються для вакцинації проти натуральної віспи, як описано в Н. 5ІсКІ еї аї., Сї5сп. тей. УуУзспг. 99:2386-2392 (1974).
Наприклад, очищені віруси можуть зберігатися при -80"С з титром 5х108 ТСіІЮОво/мл із близько 10 мМ Ттгіх5, 140 мМ Масі рн 7,7. Для одержання вакцинних ін'єкцій, наприклад, 102-108 або 102-109 часток вірусу можна ліофілізувати в 100 мл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5) у присутності 2 95 пептону і 1 95 людського альбуміну в ампулі, переважно скляній
Зо ампулі. Крім того, вакцинні ін'єкції можуть бути одержані шляхом ступінчастої ліофілізації вірусу в композиції. Така композиція може містити добавки, такі як маніт, декстран, цукор, гліцин, лактозу або полівінілпіролідон або інші добавки, такі як антиоксиданти або інертний газ, стабілізатори або рекомбінантні білки (наприклад, людський сироватковий альбумін), що є прийнятними для іп мімо введення. Скляну ампулу потім герметизують і вона може зберігатися при температурі від 4 "С до кімнатної температури протягом декількох місяців. Проте, до того часу, поки немає необхідності, ампулу бажано зберігати при температурі нижче -20 "С.
Для вакцинації або терапії, ліофілізат можна розчинити у водному розчині, переважно фізіологічному розчині, або трис-буфері, і вводити або системно, або місцево, тобто, парентерально, підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інтраназально або будь-яким іншим шляхом введення, відомим фахівцеві у цій галузі. Шлях введення, доза і кількість введень може бути оптимізована фахівцями у цій галузі. Проте, частіше за все, пацієнта вакцинують другою ін'єкцією від близько одного місяця до шести тижнів після першої вакцинної ін'єкції.
Набори, що містять рекомбінантні віруси ММА
Також у цьому документі передбачені набори, що містять один або більше рекомбінантних
ММА, описаних у цьому документі. Набор може містять один або декілька контейнерів або флаконів рекомбінантного ММА разом з інструкціями для введення рекомбінантного ММА суб'єктові із ризиком інфекції Е5М. У деяких варіантах реалізації винаходу суб'єктом є людина.
Інструкції можуть вказувати, що рекомбінантний ММА вводять суб'єктові у вигляді однієї дози або в декількох (тобто, 2, 3, 4 і так далі) дозах. У деяких варіантах реалізації винаходу інструкції вказують, що рекомбінантний вірус ММА вводять у першому (примірування) і другому (бустинг) введенні суб'єктам, які раніше не піддавалися імунізації, або раніше імунізованим суб'єктам.
Додатково передбаченим є набір, що містить рекомбінантний вірус ММА в першому флаконі або контейнері для першого введення (приміруванні) і другому флаконі або контейнері для другого введення (бустинга). Набор також може містити рекомбінантний ММА у третьому, четвертому або т.д. флаконі або контейнері для третього, четвертого і так далі введення (бустинга).
Способи і застосування рекомбінантних вірусів ММА
Також у цьому документі передбачені способи імунізації суб'єктів-тварин, а також 60 рекомбінантні ММА для застосування у способах імунізації суб'єктів-тварин і застосування рекомбінантних ММА, передбачених у цьому документі, для одержання медикаменту або вакцини для імунізації суб'єкта-тварини. У деяких варіантах реалізації винаходу твариною є ссавець. У деяких варіантах реалізації винаходу ссавцем є щур, кролик, свині, миші або людина, а також способи включають введення дози будь-якого одного або декількох рекомбінантних ММА, передбачених у цьому документі, суб'єктові.
Суб'єктом переважно є людина, і вона може бути дорослим, причому дорослим з послабленим імунітетом. У деяких варіантах реалізації винаходу суб'єктом є дорослий старше 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 або 85 років. У інших варіантах реалізації винаходу вік суб'єкта складає менше 5 років, менше З років, менше 2 років, менше ніж 15 місяців, менше ніж 12 місяців, менше ніж 9 місяців, менше ніж 6 або менше 3 місяців. Вік суб'єкта може також варіювати від 0-
З місяців, 3-6 місяців, 6-9 місяців, 9-12 місяців, 1-2 роки, або 2-5 років.
У деяких варіантах реалізації винаходу будь-який рекомбінантний ММА, передбачений у цьому документі, вводять суб'єктові у дозі від 105 до 107 ТСІЮОзхо, у дозі від 105 до 5х108 ТСІЮ»5о або від 107 до 108 ТСІЮОзхо. Рекомбінантні ММА, передбачені у цьому документі, можуть також вводитися суб'єктові у дозі 105, 107 ТСІЮО5о, 109 або 5х108 ТСІОзо. У деяких варіантах реалізації винаходу будь-який рекомбінантний ММА, передбачений у цьому документі, вводять людині у дозі 107 ТСІЮОзхо, 108 або 5х108 ТСІЮво.
Рекомбінантні ММА, передбачені у цьому документі, вводять суб'єктові в одиничній дозі або в багатократних (тобто, 2, 3, 4 і так далі) дозах. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні ММА вводять в першому (примірування) і другому (бустинг) введенні. У деяких варіантах реалізації винаходу перша доза містить від 107 до 108 ТСІЮОхо рекомбінантного вірусу
ММА, а друга доза містить від 107 до 108 ТСІЮОво рекомбінантного вірусу ММА.
Рекомбінантні ММА можна вводити системно або місцево, парентерально, підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інтраназально або, переважно, підшкірно або інтраназально. Рекомбінантні ММА можна також вводити будь-яким іншим шляхом введення, відомим фахівцеві у цій галузі.
В іншому аспекті винаходу, у цьому документі передбачені способи діагностування інфекції
ЕМ і способи визначення, чи є ризик рецидиву інфекції ЕЗМ у суб'єкта, який може бути серйозною загрозою, особливо для новонароджених, дітей у віці від 1 до 6 років та/або літніх
Зо людей.
Автори цього винаходу виявили, що сучасні способи діагностики інфекції К5М можуть забезпечувати неправильні результати. Наприклад, імуноферментний аналіз, що використовується для визначення антитіл проти К5У, або визначення вірусу методом бляшок, не обов'язково точно визначають осіб, схильних до ризику рецидиву інфекції. Так, автори цього винаходу відмітили, що навіть при тому, що зразок узятий у пацієнта, може повернутися негативний результат у методі вірусних бляшок |див., наприклад, МУ. ОІ52ем/5Ка еї аї., 2004), такі результати можуть бути інколи помилково негативними, оскільки чутливіші методи інколи демонструють, що все ще присутні інфекційні частки К5М. Насправді такі методи, як кількісна полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу (дкТ-РСЕК), обов'язкові для підтвердження того, що суб'єкт насправді може бути інфікований К5ЗМ і піддається ризику рецидиву інфекції, або ж вакцинований суб'єкт набув стерильний імунітет до К5ЗМ. Це визначення може мати вирішальне значення, тому що повторне зараження після вакцинації інколи викликає посилену хворобу, інколи призводить до смерті.
Відповідно, у деяких варіантах реалізації винаходу у цьому документі передбачені способи визначення того, чи є для суб'єкта ризик рецидиву інфекції КЕЗМ, що включають кількісне визначення того, чи містить зразок, одержаний від суб'єкта, геноми К5М, причому присутність геномів КЗМ вказує на вірогідність рецидиву інфекції К5М. У деяких варіантах реалізації винаходу кількісне визначення того, чи містить зразок, одержаний від суб'єкта, геноми К5М, проводять за допомогою дДКТ-РСВ.
Як використано у цьому документі, термін "зразок" відноситься до будь-якого біологічного зразка, одержаного від людини, клітинної лінії, культури тканини або іншого джерела, що містить полінуклеотиди і поліпептиди або їх частини. Біологічні зразки охоплюють рідини організму (такі як, наприклад, кров, сироватка, плазма, сеча, синовіальна рідина, спинномозкова рідина, бронхоальвеолярний лаваж (ВАЇ)) і тканини організму, в яких виявлені та/або імовірно містяться КБУ, у тому числі клінічні зразки, одержані, наприклад, від суб'єктів, що беруть участь у клінічному випробуванні або іншому експериментальному дослідженні. Способи одержання тканин біопсії і рідин організму від ссавців добре відомі у цій галузі техніки. У деяких варіантах реалізації винаходу біологічний зразок містить нуклеїнові кислоти КБУ.
Як використовується в цьому описі взаємозамінно, терміни "КТ-ДРСК" або "З3КТ-РСК» бо відносяться до способу, відомого як "кількісна полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу" В деяких випадках цей метод може також згадуватися як кінетична полімеразна ланцюгова реакція (КРОК).
У деяких варіантах реалізації винаходу в цьому описі передбачені способи визначення наявності у суб'єкта набутого стерильного імунітету до К5М, що включають кількісне визначення того, чи містить зразок, одержаний від суб'єкта, геноми К5М, причому присутність геномів КЗМ вказує, що у суб'єкта немає набутого стерильного імунітету до КЗМ. Також, у цьому описі передбачені способи імунізації суб'єкта, в якого немає набутого стерильного імунітету до К5М, що включають інтраназальне введення будь-якого рекомбінантного ММА, описаного у цьому документі, суб'єктові. Додатково або альтернативно, будь-який рекомбінантний ММА, описаний у цьому документі, передбачений для застосування у способах імунізації суб'єкта, в якого немає набутого стерильного імунітету до К5М, де спосіб включає інтраназальне введення будь-якого рекомбінантного ММА, описаного у цьому документі, суб'єктові. Також, у цьому описі передбачене застосування будь-якого рекомбінантного ММА, описаного у цьому документі, для одержання медикаменту талабо вакцини для імунізації суб'єкта, в якого немає набутого стерильного імунітету до Е5М, причому медикамент або вакцину вводять інтраназально.
У деяких варіантах реалізації винаходу в цьому описі передбачені способи індукування стерильного імунітету до КЗМ у суб'єкта, який не має набутого стерильного імунітету до К5М, що включає інтраназальне введення будь-якого рекомбінантного ММА, описаного у цьому документі, суб'єктові. Також, у цьому описі передбачений один будь-який рекомбінантний ММА, описаний у цьому документі, для застосування у способі індукування стерильного імунітету до
Е5М у суб'єкта, який не має набутого стерильного імунітету до КОМ, де способи включають інтраназальне введення одного будь-якого рекомбінантного ММА, описаного у цьому документі.
Додатково або альтернативно, у цьому описі передбачене застосування будь-якого рекомбінантного ММА, описаного у цьому документі, для одержання медикаменту та/або вакцини для індукування стерильного імунітету до К5М у суб'єкта, який не має набутого стерильного імунітету до К5М, причому медикамент або вакцину вводять інтраназально.
Деякі варіанти реалізації цього винаходу також включають наступні пункти: 1. Рекомбінантний ММА, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5МУ, для лікування або попередження інфекції Е5М шляхом інтраназального введення, причому внутрішньом'язове введення виключається. 2. Застосування рекомбінантного ММА, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КЗМ, для одержання фармацевтичної композиції талабо вакцини, де фармацевтичну композицію і вакцину вводять інтраназально, причому внутрішньом'язове введення виключається. 3. Спосіб імунізації суб'єкта, включаючи людину, проти інфекції КЗМ, що включає інтраназальне введення рекомбінантного ММА, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує принаймні одну антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КЗМ, суб'єктові, включаючи людину, причому внутрішньом'язове введення виключається. 4. Рекомбінантний ММА за п. 1, застосування за п. 2 та/або спосіб за п. 3, що включає виключно інтраназальне введення. 5. Рекомбінантний ММА за п. 1, застосування за п. 2 та/або спосіб за п. 3, що включає підшкірне введення. 6. Рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 1 або 4 і 5, застосування за будь-яким із пп. 2, 4 або 5 та/або спосіб за будь-яким із пп. 3-5, де рекомбінантний ММА додатково містить нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М. 7. Рекомбінантний ММА, що містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротетїну КЗМ і принаймні одну нуклеотидну послідовність, кодуючу нуклеокапсидну антигенну детермінанту К5М. 8. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-7, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КЗМ, кодує антигенну детермінанту Е КБУ. 9. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-8, що додатково містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну Е КМ. 10. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-9, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М, кодує непроцесований мембранний глікопротеїн Е КБУ. 11. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 8-10, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну Е К5М, 60 одержана зі штаму А К5У, переважно з А2 та/або Аопо.
12. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 8-11, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну Е К5М, містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 4. 13. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 8-12, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну Е КБУ, містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО:3. 14. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-13, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну ЕМ, кодує усічений мембранний глікопротеїн Е КБУ. 15. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 14, де нуклеотидна послідовність, що кодує усічений мембранний глікопротеїн Е ММА, одержана зі штаму А К5М, переважно з
Аопо. 16. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 14 або 15, де усічений мембранний глікопротеїн Е ММА не має трансмембранного домена. 17. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 14-16, де усічений мембранний глікопротеїн Е ММА не має цитоплазматичного домена. 18. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 8-17, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну Е К5М, містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6. 19. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 8-18, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну Е К5М, містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО:5. 20. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну ЕМ, кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну С БМ. 21. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-20, що додатково містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну С КБУ. 22. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-21, де
Зо нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну ЕМ, кодує непроцесований мембранний глікопротеїн 5 КМ. 23. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 20-22, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну о
Е5М, одержана зі штаму А КБУ, переважно зі штаму А2 та/або В. 24. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 20-23, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну о
КЗМ, містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:2. 25. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 20-24, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну о
Е5М, містить нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО: 1. 26. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-25 де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну К5М, кодує усічений мембранний глікопротеїн з КБУ. 27. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 26, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту усіченого мембранного глікопротеїну 5 К5ЗМ, одержана зі штаму В КБУ. 28. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 26 або 27, де усічений мембранний глікопротеїн з К5М не має трансмембранного домена. 29. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 26-28, де усічений мембранний глікопротеїн б К5М не має цитоплазматичного домена. 30. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 20-29, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну о
ЕЗМ, містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 8. 31. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 20-30, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну о
Е5М, містить нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО: 7. 32. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 6-31, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка БМ, кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка М БМ.
33. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 6-32, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка БМ, кодує антигенну детермінанту матриксного білка М2 КБУ. 34. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким з пп. 6-33, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КБУ, кодує непроцесований білок. 35. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 32-34, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка М КБУ, одержана зі штаму А КБУ, переважно штаму Аг. 36. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 32-35, де нуклеотидна послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка БМ, кодує антигенні детермінанти нуклеокапсидного білка М Е5М і матриксного білка М2 КМ. 37. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 36, де обидві антигенні детермінанти нуклеокапсидного білка М КЗМ і матриксного більла М2 ЕМ кодуються єдиною відкритою рамкою зчитування. 38. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 36 або 37, де антигенні детермінанти нуклеокапсидного білка М К5М і матриксного білка М2 К5М розділені протеазним доменом, що саморозщеплюється. 39. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 38, де послідовність протеазного домена, що саморозщеплюється, одержана з вірусу ящура. 40. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 38 або 39, де послідовність протеазного домена, що саморозщеплюється, є фрагментом послідовності протеази 2А. 41. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 38-40, де послідовність протеазного домена, що саморозщеплюється, містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12. 42. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 38-41, де послідовність протеазного домена, що саморозщеплюється, містить нуклеотидну послідовність
ЗЕО ІО МО: 11. 43. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 37-42, де єдина
Зо відкрита рамка зчитування містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 18. 44. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 37-43, де єдина відкрита рамка зчитування містить нуклеотидну послідовність хЕО ІЮ МО: 17. 45. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КМ, і одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка КМ. 46. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 45, що містить антигенні детермінанти мембранного глікопротеїну Е К5М і нуклеокапсидного білка М К5М. 47. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 45, що містить антигенні детермінанти мембранного глікопротеїну Е К5М і матриксного білка М2 К5М. 48. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 45, що містить антигенні детермінанти мембранного глікопротеїну С К5М і нуклеокапсидного білка М К5М. 49. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 45, що містить антигенні детермінанти мембранного глікопротеїну С К5ЗМ і матриксного білка М2 КБУ. 50. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-44, що містить дві нуклеотидні послідовності, що кодують антигенну детермінанту мембранного глікопротеїну КЕЗМ і одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка
В5У.
БО 51. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 50, що містить антигенні детермінанти мембранних глікопротеїнів Е та/«або Сх В5У і нуклеокапсидного білка М БМ. 52. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 50, що містить антигенні детермінанти мембранних глікопротеїнів Е та/(або б К5ЗМУ і матриксного білка М2 БУ. 53. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-44, що містить дві нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти мембранного глікопротеїну КМ, і дві нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти нуклеокапсидного білка
В5У. 54. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 53, що містить нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти мембранного глікопротеїну Е та/або Сб КОМ, і 60 антигенні детермінанти нуклеокапсидного білка М та/або матриксного білка М2 АБУ.
55. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-44, що містить три нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти мембранного глікопротеїну ЕМ, і дві нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти нуклеокапсидного білка
ВУ. 56. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 55, що містить антигенні детермінанти двох мембранних глікопротеїнів Е КЕЗМ та/або одного мембранного глікопротеїну
С К5М їі антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка М БМ та/або матриксного білка М2
ВУ. 57. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 55, що містить антигенні детермінанти двох мембранних глікопротеїнів 5 КЗМ та/або одного мембранного глікопротеїну
Е5М Е ї антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка М К5М та/або матриксного білка М2
ВУ. 58. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким з пп. 1-44, що містить чотири нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти мембранні глікопротеїни
КМ і одну нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка К5М. 59. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 58, що містить антигенні детермінанти двох мембранних глікопротеїнів Е КЕЗМ та/або двох мембранних глікопротеїнів
Е5М і антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка М К5М або матриксного білка М2 К5М. 60. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-44, що містить чотири нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти мембранних глікопротеїнів КЗМ і дві нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні детермінанти нуклеокапсидних білків К5М. 61. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за п. 60, що містить антигенні детермінанти двох мембранних глікопротеїнів Е КЗМ та/або двох мембранних глікопротеїнів б
Е5М і антигенні детермінанти нуклеокапсидного білка М К5М та/або матриксних білків М2 КМ. 62. Рекомбінантний ММА, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-61, де ММА, використаний для одержання рекомбінантного ММА, є ММА-ВМ або його похідним. 63. Рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 1 або 4-62 для застосування як активної
Зо фармацевтичної речовини. 64. Фармацевтична композиція та/«або вакцина, що містить рекомбінантний ММА за будь- яким із пп. 1 або 4-63 і, необов'язково фармацевтично прийнятний носій або розчинник. 65. Застосування рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 17 або 4-63 для одержання фармацевтичної композиції та/або вакцини. 66. Рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 6-63, фармацевтична композиція та/або вакцина за п. 64 та/або застосування за будь-яким із пп. 2, 4-6, 8-62 або 65 для лікування або попередження інфекції К5М. 67. Спосіб імунізації суб'єкта, включаючи людину, проти інфекції К5У, що включає введення рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63 або 66 та/або фармацевтичної композиції та/або вакцини за п. 64 або 66 суб'єктові, включаючи людину. 68. Рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63 або 66, фармацевтична композиція талабо вакцина за п. 64 або 66, застосування за будь-яким із пп. 2, 4-6, 8-62, 65 або 66 та/або спосіб за будь-яким з пп. 3-6, 8-62 або 67, де рекомбінантний ММА знаходиться або вводиться у дозі 107-409 ТСІО»0о. 69. Рекомбінантний ММА, фармацевтична композиція та/або вакцина, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 5-68, де рекомбінантний ММА знаходиться або вводиться інтраназально або підшкірно. 70. Рекомбінантний ММА, фармацевтична композиція та/або вакцина, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-69, де рекомбінантний ММА знаходиться або вводиться в одиничній або багатократній дозах імунологічно незараженому або імунологічно дослідному суб'єктові, включаючи людину. 71. Рекомбінантний ММА, фармацевтична композиція та/або вакцина, застосування та/або спосіб за будь-яким із пп. 1-70 для введення суб'єктові, включаючи людину, у віці більше 2 років. 72. Рекомбінантний ММА, фармацевтична композиція та/або вакцина, застосування і спосіб за будь-яким із пп. 1-70 для введення суб'єктові, включаючи людину, у віці менше 2 років. 73. Набор, що містить один або декілька флаконів рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66 або 68-72 і інструкції по введенню вірусу суб'єктові з ризиком інфекції КМ. 74. Набор, що містить рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66 або 68-72 та/"або набір за п. 73, що містить рекомбінантний ММА у першому флаконі або контейнері для першого бо введення (примірування) і в другому флаконі або контейнері для другого введення (бустинг).
75. Набор за п. 73 або 74, що містить рекомбінантний ММА у третьому, четвертому і так далі флаконі або контейнері для третього, четвертого або подальшого введення (бустинг). 76. Клітина, що містить рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63 або 66. 71. Спосіб одержання рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66 або 68-72, що включає етапи: (а) інфікування клітини-господаря вірусом ММА (Б) трансфектування інфікованої клітини рекомбінантним вектором, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує антигенну детермінанту К5М, причому вказана нуклеотидна послідовність додатково містить послідовність геному віруса ММА, здатну направляти інтеграцію нуклеотидної послідовності у вірусний геном ММА, (с) ідентифікації, виділення і, необов'язково, очищення одержаного рекомбінантного вірусу
МУА. 18. Рекомбінантний ММА, одержаний способом за п. 77. 79. Спосіб одержання рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66 або 68-72 та/або одержання антигенної детермінанти, експресованої з генома вказаного рекомбінантного ММА, що включає етапи: (а) інфікування клітини-господаря рекомбінантним ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66 або за пп. 68-72, або трансфектування клітини рекомбінантної ДНК рекомбінантного ММА, (р) культивування інфікованої або трансфектованої клітини, (с) виділення ММА та/або антигенної детермінанти із вказаної клітини. 80. Рекомбінантний ММА та/або антигенна детермінанта, одержані способом за п. 79. 81. Спосіб визначення ризику рецидиву інфекції Е5М у суб'єкта, що включає визначення за допомогою КТ-ДРСК присутності К5М у зразку, одержаному від суб'єкта, при цьому присутність
КЗМ вказує на наявність рецидивної інфекції КМ. 82. Спосіб визначення наявності набутого стерильного імунітету проти КЗМ, що включає визначення за допомогою КТ-ДРСОК присутності КЕЗМ у зразку, одержаному від суб'єкта, при цьому присутність К5М вказує на те, що суб'єкт не набув стерильний імунітет проти КБУ. 83. Спосіб імунізації суб'єкта, діагностованого за допомогою способу за п. 82 з приводу наявності набутого стерильного імунітету проти КОМ, що включає інтраназальне введення рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66, 68-72, 78 або 80 талабо фармацевтичної композиції та/або вакцини за будь-яким із пп. 64, 66 або 68-72 суб'єктові. 84. Рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 71, 4-63, 66, 68-72, 78 або 80 та/або фармацевтична композиція та/або вакцина за будь-яким із пп. 64, 66 або 68-72 для застосування у способі імунізації суб'єкта, діагностованого за допомогою способу за п. 82 з приводу наявності набутого стерильного імунітету проти КЗМ, де вказаний спосіб включає інтраназальне введення вказаного рекомбінантного ММА суб'єктові. 85. Застосування рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66, 68-72, 78 або 80 для одержання фармацевтичної композиції та/або вакцини для імунізації суб'єкта діагностованого за допомогою способу за п. 82 з приводу наявності набутого стерильного імунітету проти КБУ, де фармацевтичну композицію та/або вакцину вводять інтраназально. 86. Спосіб індукування стерильного імунітету у суб'єкта, діагностованого за допомогою способу за п. 82 з приводу наявності набутого стерильного імунітету проти Е5М, що включає інтраназальне введення рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66, 68-72, 78 або 80 талабо фармацевтичної композиції та/або вакцини за будь-яким із пп. 64, 66 або 68-72 суб'єктові. 87. Рекомбінантний ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66, 68-72, 78 або 80 та/або фармацевтична композиція та/або вакцина за будь-яким із пп. 64, 66 або 68-72 для застосування у способі індукування стерильного імунітету у суб'єкта, діагностованого за допомогою способу за п. 82 з приводу наявності набутого стерильного імунітету проти КБУ, де вказаний спосіб включає інтраназальне введення вказаного рекомбінантного ММА суб'єктові.
БО 88. Застосування рекомбінантного ММА за будь-яким із пп. 1, 4-63, 66, 68-72, 78 або 80 для одержання фармацевтичної композиції та/або вакцини для індукування стерильного імунітету у суб'єкта, діагностованого за допомогою способу за п. 82 з приводу наявності набутого стерильного імунітету проти К5М, де фармацевтичну композицію або вакцину вводять інтраназально.
Слід розуміти, що, як і попередній загальний, так і детальний опис є лише ілюстративними і пояснювальними і не звужують або обмежують винахід. Креслення, що додаються, які включені і складають частину даного опису, ілюструють різні варіанти реалізації винаходу і разом із описом слугують для пояснення принципів винаходу.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фігура 1 ілюструє гетерологічні гени К5М, використані в тестованих рекомбінантних ММА- конструктах, ММА-тВМ1998, ММУА-твМ2018, ММА-пВМ2018АМ2, ММА-тпвМ2948, ММА- твМ2958 ії ММА-твМЗЗОВ.
Фігура 2 ілюструє специфічні реакції на сироватковий К5М Іо, виміряні за допомогою
ЕІЗА на основі ІВ Натбигд. Мишей імунізували (підшкірно або інтраназально) двічі або тричі
ТВ5 або 1х108 ТСІЮво будь-якого з ММА-тВМ1998, ММА-пВМ2018 або ММА-пВМ201ВАМ2.
Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 105 БУО В5У. Сироватку розводили 1/100 і аналізували із застосуванням К5М-специфічного ІЗ ЕГІ5А на основі набору ІВ Натрбиго, використовуючи планшети, вкриті білками Е і 5 БМ.
Фігура З ілюструє специфічні Ідс реакції на сироватковий К5МУ, виміряні за допомогою ЕГІЗА на основі ІВ Натбиго, після серійного розведення. Мишей імунізували двічі або тричі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТСІЮОво будь-якого з ММА-тВМ1998, ММА- твМ2018 або ММА-тВМ201ВАМ2. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 105 БУО
КЗМ. Сироватку розводили (1/100, 1/200 і 1/400) і аналізували із застосуванням К5М- специфічного ДС ЕГІЗА на основі набору ІВ Натбриго, використовуючи планшети, вкриті білками Е і 5 КБУ.
Фігура 4 ілюструє специфічні Ід реакції на сироватковий КБУ, виміряні за допомогою ЕГІЗА на основі ІВ Натбиго, із застосуванням планшет, вкритих лише білком Е. Мишей імунізували підшкірно двічі або тричі ТВ5 або 1х108 ТСІОзо будь-якого з ММА-тВМ199В, ММА-тпВМ2018 або
ММА-твМ2018АМ2. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 1056 БУО РВ5МУ.
Сироватку розводили 1/100 їі аналізували із застосуванням К5М-специфічного ДО ЕГІЗА на основі набору ІВ. Натбригод, використовуючи планшети, вкриті лише білком Е К5М.
Фігура 5 ілюструє специфічні Ід реакції на сироватковий КБУ, виміряні за допомогою ЕГІЗА на основі бегіоп. Мишей імунізували двічі або тричі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТСІО5о будь-якого з ММА-тВМ1998, ММА-пВМ2018 або ММА-тВМ201ВАМ2. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 105 БУО В5У. Сироватку розводили (1/100) і аналізували із застосуванням К5М-специфічного дС ЕЇГІЗА на основі набору бегпоп, використовуючи планшети, вкриті лізатом КМ.
Фігура 6 ілюструє специфічні ІдА реакції на сироватковий К5М у порівнянні із специфічними
Зо ідо реакціями на сироватковий КБУ, виміряні за допомогою ЕГІ5ЗА на основі ІВ Натбигу у рідині ВАГ. і сироватки. Мишей імунізували двічі або тричі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТСІОво будь-якого з ММА-тпВМ1998, ММА-птпВМ2018 або ММА-пвМ201вАМм2.
Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 105 БУО К5М. Сироватку і рідину ВАГ. розводили (1/100) і аналізували із застосуванням КЗМ-специфічного ДС або ІДА ЕГІ5ЗА на основі набору ІВ Натбиго, використовуючи планшети, вкриті білками Е і 5 К5М.
Фігура 7 ілюструє КЗМ Б-, ВБМ (0- і К5М М2-специфічні Т-клітинні реакції, виміряні за допомогою ЕГІЗРОТ. Мишей імунізували двічі або тричі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТСІО5о будь-якого з ММА-т7ВМ1998, ММА-тВМ2018 або ММА-твВМ201ВвАМ2. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО РЕ5МУ. Селезінки ізолювали на 48 день, а спленоцити повторно стимулювали трьома різними ЕЗМ Е-специфічними білками (К5М-1 (5ЕО
ІО МО: 19), А5У-2 (ЗЕО ІЮ МО: 20) і Е5М-3 (ЗЕО ІО МО: 21), одним НОМ Ссі-специфічним білком (А5М-4 (ЗЕО ІОЮ МО:22)), одним Е5М М2-специфічним білком (КЗМ-9 (ЗЕО ІЮ МО: 27)) або ММА-
ВМ. ІЕМу-секретуючі клітини виявляли за допомогою ЕГІЗ5РОТ. Індекс стимуляції розраховували, як описано в Прикладах.
Фігура 8 ілюструє відносне зниження маси тіла після зараження КМ (А2). Мишей імунізували двічі або тричі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТСІОво будь-якого з
ММУА-тВвМ1998, ММА-птВМ2018 або ММА-пВМ201ВАМ2. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО К5М. Мишей потім заражали 105 БУО Е5М(А2) на 49-й день. Масу вимірювали щодня з дня зараження. Вагу на день зараження використовували як первинний рівень для розрахунку відсотка відносної зміни маси тіла.
На Фігурі 9 проілюстровані навантаження К5М у легенях, виміряна методом бляшок. Мишей імунізували двічі або тричі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТСІЮво будь-якого з
ММУА-тВвМ1998, ММА-птВМ2018 або ММА-пВМ201ВАМ2. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО КБУ. Мишей потім заражали 1056 БУО К5ЗМ(А2) у день 49. Легені ізолювали через 4 дні, а навантаження К5М (БУО на легеню) визначали за методом бляшок.
Фігура 10 ілюструє навантаження К5М у легенях, виміряна за допомогою КТ-ДРСК. Мишей імунізували двічі або тричі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТСІОво будь-якого з
ММУА-тВвМ1998, ММА-птВМ2018 або ММА-пВМ201ВАМ2. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО 2К5М. Мишей потім заражали 106 БУО БМ А2 на 49-й день. Легені ізолювали через 4 дні, а навантаження КМ (оцінюється, виходячи із спостережуваної кількості копій гена І) визначали за допомогою КТ-ДРСВ.
Фігурі 11 ілюструє рівень 1/4 у ВАЇ. через 4 дні після зараження КЗМ(А2), виміряний за допомогою ЕГІ5ЗА. Мишей імунізували двічі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТОЮ о будь-якого з ММА-тптВМ199В8 або ММА-тВМ2018. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО К5МУ. Мишей потім заражали 105 БУО В5М А2. Легені промивали 1 мл
РВ5З через 4 дні, а рівень І! 4 у ВАГ. визначали за допомогою ЕЇГ ІА. (п.а.-не виявляється).
Фігура 12 ілюструє рівень І 5 у ВАГ через 4 дні після зараження КЗМ(А2), виміряний за допомогою ЕГІ5ЗА. Мишей імунізували двічі (підшкірно або інтраназально) ТВ5 або 1х108 ТОЮ о будь-якого з ММА-тптВМ199В8 або ММА-тВМ2018. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО К5МУ. Мишей потім заражали 105 БУО В5М А2. Легені промивали 1 мл
РВ5З через 4 дні, а рівень ІІ 5 у ВАГ. визначали за допомогою ЕЇГ ІА. (п.а.-не виявляється).
Фігура 13 ілюструє специфічні дс реакції на сироватковий К5М, виміряні за допомогою
ЕГІ5ЗА на основі Зегіоп. Мишей імунізували підшкірно двічі з З-гижневим інтервалом ТВ5 або 1х108 ТСІО5о будь-якого з ММА-тВМ1998, ММА-тпВМ2018 або ММА-тптВМ294А. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 1056 БУО К5ЗМУ. Сироватку від 5 мишей у кожній групі, одержану через 2 тижні після останньої імунізації, розбавляли і аналізували із застосуванням
А5М-специфічного Ід ЕГІ5А на основі набору Зегіоп, використовуючи планшети, вкриті лізатом
ВУ.
Фігура 14 ілюструє реакції нейтралізуючих антитіл, специфічних до сироваткового КМ, виміряні за допомогою РЕМТ. Мишей імунізували підшкірно двічі з З-тижневим інтервалом ТВ5 або 1х108 ТСІО5о будь-якого з ММА-тВМ199В, ММА-птВМ2018 або ММА-пВМ294А. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 1056 БУО ВЕ5МУ. Сироватку від 5 мишей у кожній групі, одержану через 2 тижні після останньої імунізації, аналізували із застосуванням РЕМТ.
Фігура 15 ілюструє КМ БЕ- ії К5М М2-специфічні Т-клітинні реакції, виміряні за допомогою
ЕГІЗРОТ. Мишей імунізували підшкірно двічі з З-тижневим інтервалом ТВ5 або 1х108 ТОСІЮОво будь-якого з ММА-тВМ1998, ММА-пВМ2018 або ММА-тВМ294А. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 105 БУО НБУ. Селезінки ізолювали на 34й день, а спленоцити рестимулювали одним КЗМ Е-специфічним білком (К5М-2 (5ЕО ІЮ МО:20), одним КМ М2-
Зо специфічним білком (К5М-9 (5ЕО ІЮ МО:27)) або ММА-ВМ. ІЕМу-секретуючі клітини виявляли за допомогою ЕГІЗРОТ. Індекс стимуляції розраховували, як описано у Прикладах.
Фігура 16 ілюструє навантаження КЗМ у легенях, виміряна методом бляшок. Мишей імунізували підшкірно двічі з 3-х тижневим інтервалом ТВ5 або 1х108 ТСІЮОво будь-якого з ММА- твВМ1998, ММА-тВМ2018 або ММмА-тВМ294А. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 105 БУО Е5М або внутрішньом'язово 50 мкл РІ-В5М. Мишей потім заражали 105
БУО КУА) на 49-й день. Легені ізолювали через 4 дні, а навантаження КЗМ (БУО на легеню) визначали за методом бляшок.
Фігура 17 ілюструє навантаження К5М у легенях, виміряне за допомогою КТ-ДРСК. Мишей імунізували підшкірно двічі з З-тижневим інтервалом ТВ5 або 1х108 ТСІЮОво будь-якого з ММА- твВМ1998, ММА-тВМ2018 або ММмА-тВМ294А. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО Е5МУ або внутрішньом'язово 50 мкл РІ-К5М. Мишей потім заражали 105
БУО К5М А2 на 49-й день. Легені ізолювали через 4 дні, а навантаження К5ЗМ (оцінюється, виходячи із спостережуваної кількості копій гена І) визначали за допомогою КТ-ЯРСВ.
Фігура 18 ілюструє еозинофільну і нейтрофільну інфільтрації у рідинах ВАГ. через 4 дні після зараження ЕЗМ(А2). Мишей імунізували підшкірно двічі з З-тижневим інтервалом ТВ5 або 1х108
ТСІЮО»о будь-якого з ММА-тВМ199В, ММА-тпВМ2018 або ММА-тВМ294А. Контрольних мишей імунізували двічі інтраназально 106 БУО К5М або внутрішньом'язово 50 мкл РІ-К5М. Мишей потім заражали 1056 БУО НК5М А2. Легені промивали 1 мл РВ5 через 4 дні і визначали відсоток еозинофілів і нейтрофілів у рідині ВАГ.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО ІЮО МО: 1 є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок С зі штаму людського
АБМ (пАБ5У) Аг (СепВапк Ассезвіоп Мо. М11486).
ЗЕО ІЮО МО: 2 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка С зі штаму А2 ПМ (СепВапк Ассевзвіоп Мо. М11486).
ЗЕО ІЮ МО: З є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок Е (варіант ВМ) зі штаму
А2 ПАБ.
ЗЕО ІЮ МО: 4 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка Е (варіант ВМ) з штаму А2 пе.
ЗЕО ІЮ МО: 5 є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок Е (варіант ВМ) зі штаму 60 АГопдуд ПАБ.
ЗЕО ІЮО МО: 6 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка Є (Варіант ВМ) зі штаму АГ опд пАБУ.
ЗБО ІО МО: 7 є послідовністю ДНК, що кодує усічений білок б, позбавленою трансмембранного і цитоплазматичного доменів зі штаму В ПЕ5М (СепВапк Ассевзвзіоп Мо.
Р2гО896).
ЗБО ОО МО: 8 є амінокислотною послідовністю усіченого білка С, позбавленою трансмембранного і цитоплазматичного доменів із штаму В ПЕ5М (СепВапк Ассевзвзіоп Мо.
Р2гО896).
ЗЕО ІО МО: 9 є послідовністю ДНК, що кодує білок М, позбавленою термінуючого кодону зі штаму А2 пПК5М (Сепрапк Ассеззіоп Мо. М11486).
ЗЕО ІЮ МО: 10 є амінокислотною послідовністю білка М, позбавленою термінуючого кодону зі штаму А2 пК5М (Сепрапк Ассезвзіоп Мо. М11486).
ЗБО ІЮО МО: 11 є послідовністю ДНК, що кодує фрагмент протеази 2А із вірусу ящура, позбавленої як стартового, так і термінуючого кодонів.
ЗБО ІЮ МО: 12 є амінокислотною послідовністю фрагмента протеази 2А з вірусу ящура, позбавленою як стартового, так і термінуючого кодонів.
ЗЕО ІЮ МО: 13 є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок М2, позбавленою стартового кодону з штаму А2 ПКЗМ (СепВапк Ассеззіоп Мо. М11486).
ЗЕО ІЮ МО: 14 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка М2, позбавленою стартового кодону з штаму А2 ПКЗМ (СепВапк Ассеззіоп Мо. М11486).
ЗБО ІЮ МО: 15 є послідовністю ДНК, що кодує усічений білок РЕ, позбавленою трансмембранного і цитоплазматичного доменів (варіант ВМ) зі штаму А2 пАЗМ (СепВапк
Ассезвіоп Мо. М11486).
ЗБО 10 МО: 16 є амінокислотною послідовністю усіченого білка ЕЕ, позбавленою трансмембранного і цитоплазматичного доменів (варіант ВМ), зі штаму А2 пПЕ5М (СепВапк
Ассевзвіоп Мо. М11486).
ЗЕО ІЮ МО: 17 є послідовністю ДНК, що кодує білок М, позбавленою термінуючого кодону штаму А2 пКЗМ (СепрапкК Ассеззіоп Мо. М11486) послідовність ДНК, що кодує фрагмент протеази 2А з вірусу ящура, позбавлена як стартового так і термінуючого кодонів,
Зо жпослідовність ДНК, що кодує непроцесований білок М2, позбавлений стартового кодону зі штаму А2 пК5М (СепВапк Ассеззіоп Мо. М11486).
ЗЕБЕО ІЮ МО: 18 є амінокислотною послідовністю білка М зі штаму А2 ПКЗМ (Сепрапк
Ассезвзіоп Мо. М11486) т амінокислотна послідовність фрагмента протеази 2А з вірусу ящура, позбавлена стартового кодонукамінокислотна послідовність непроцесованого білка М2, позбавлена стартового кодону зі штаму А2 ПЕ5М (СепВапкК Ассезвзіоп Мо. М11486).
ЗЕО ІЮ МО: 19 є амінокислотною послідовністю пептиду К5МУ-1, одержаного з білка Е КБУ.
ЗЕО ІЮ МО: 20 є амінокислотною послідовністю пептиду К5М-2, одержаного з білка Е КБУ.
ЗЕО ІЮ МО: 21 є амінокислотною послідовністю пептиду К5М-3, одержаного з білка Е КБУ.
ЗЕО ІЮ МО: 22 є амінокислотною послідовністю пептиду К5МУ-4, одержаного з білка С БМ.
ЗЕО ІЮ МО: 23 є амінокислотною послідовністю пептиду К5М-5, одержаного з білка С БМ.
ЗЕО ІЮ МО: 24 є амінокислотною послідовністю пептиду К5МУ-6, одержаного з білка С БМ.
ЗЕО ІЮ МО: 25 є амінокислотною послідовністю пептиду К5МУ-7, одержаного з білка С БМ.
ЗЕО ІЮ МО: 26 є амінокислотною послідовністю пептиду К5МУ-8, одержаного з білка С КБМ.
ЗЕО ІЮ МО: 27 є амінокислотною послідовністю пептиду КЗМ-9, одержаного з білка М2 КБУ.
ЗЕО ІЮ МО: 28 є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок Е зі штаму А2 ПЕ5М.
ЗЕО ІЮ МО: 29 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка Е зі штаму А2 ПЕ.
ЗЕО ІЮ МО: 30 є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок о зі штаму А2 ПЕ5М.
ЗЕО ІЮ МО: 31 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка С зі штаму А2 ПКУ.
ЗЕО ІЮ МО: 32 є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок М2 зі штаму А2 пе.
ЗЕО ІЮО МО: 33 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка М2 зі штаму А2 "АБУ.
ЗЕО ІЮ МО: 34 є послідовністю ДНК, що кодує непроцесований білок М зі штаму А2 ПКУ.
ЗЕО ІЮ МО: 35 є амінокислотною послідовністю непроцесованого білка М зі штаму А2 ПКМУ.
ЗЕО ІЮ МО: 36 є праймером 1, використаним у КТ-ФДРСВ.
ЗЕО ІЮ МО: 37 є праймером 2, використаним у КТ-ФДРСВ.
ЗЕО ІЮ МО: 38 є зондом 6, використаним у КТ-ДРСВ.
ЗЕО ІЮ МО: 39 є нуклеотидною послідовністю промотора Рго.
ЗЕО ІЮ МО: 40 є нуклеотидною послідовністю промотора Рг7,5.
ЗЕО ІЮО МО: 41 є нуклеотидною послідовністю промотора Ргзупіт. бо ЗЕО ІЮ МО: 42 є нуклеотидною послідовністю промотора РІ Е1.
ЗЕО ІЮ МО: 43 є нуклеотидною послідовністю промотора РгН5т.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Конструювання рекомбінантних ММА.
Одержання рекомбінантного ММА було виконане шляхом вставки КЗМ-кодуючих послідовностей разом з індикаторними промоторами (Фігура 1) у геном ММА за допомогою гомологічної рекомбінації в клітини СЕРЕ із застосуванням селекційного маркера для відбору рекомбінантного ММА. Застосування міжгенних ділянок (ІБК) як сайтів вставки описане в УМО 03/097845. Для видалення селекційного маркера був застосований другий етап гомологічної рекомбінації.
Вірус ММА-ВМУ використовували як первинний матеріал для одержання рекомбінантного
ММУА-тВвВМ1998, що містить гени для К5М-А2-5 і К5М-Е-А?2 ВМ в ІСК88/89. Оригінальний матеріал ММА-тпВ8М199 був використаний як первинний матеріал для одержання ММА- тВвМ2018, описаного нижче.
Вставки в ІОК88/89 (ММА-тВМ199В):
Кодуюча послідовність для К5М-А2-О базується на природній послідовності глікопротеїну С штаму К5М-А2. Кодуюча послідовність білка злиття ВМ ВОМ-Е-А2 також базується на штамі
В5МУ-А2, але була модифікована Вамагіап Могаіс. Обидва вставлені гени були синтезовані
Сепеагй із застосуванням людського адаптованого кодону і застосовані для клонування рекомбінаційної плазміди. Білкова послідовність К5М-А2-о демонструє 100 95 ідентичність із послідовністю РОЗ423.1 СепВапк. Білкова послідовність ВМ К5М-Е-А2 демонструє лише 99 905 ідентичність з послідовністю РОЗ420.1 бепВапк через одну одиничну амінокислотну заміну (Р на А) у положенні 103.
Вставки в ІОК148/149 (ММА-ттВМ2018):
Кодуючі послідовності для К5МУ-М-А2 і К5М-М2-А2 базуються на природних послідовностях відповідних глікопротеїнів штаму К5М-А2. Обидва гени сполучені пептидною послідовністю 2А
ІМ.О. Вуап еї а. (1991), У. Счеп. Мікої. 72(РІ 11):2727-2792|, що саморозщеплюється, що дозволяє експресувати два окремих нативних білка під контролем єдиного промотора. Кодуючі послідовності для К5М-С(В) і КЕ5М-Е АЇопд ВМ були усічені для видалення трансмембранних доменів із тим, щоб можна було секретувати експресовані білки. Всі вставлені гени були
Зо синтезовані Сепеагі із застосуванням оптимізованого кодону і застосовані для клонування рекомбінаційної плазміди. Білкові послідовності К5М-М-А2 ії Е5М-М2-А2 демонструють 100 905 ідентичність із послідовністю РОЗ418.1 і РО4545.1 СепВапк, відповідно. Білкова послідовність усіченого К5М-(В) демонструє 100 95 ідентичність із послідовністю Р20896.1 СепвВапк.
Кодуюча послідовність усіченого КЗМ-Е АІопд ВМ була розроблена для того, щоб містити перші 526 амінокислот білка Е5У-Е, як описано Е.Р. ри еї аї. (1994) ВіоїесппоЇоду (М М) 12(8):813-818.
Мутант із делецією в М2(А2) з ММА-тВМ21ОвАМм2:
ММУА-тпвМ21ТОовАМа містить делеційну мутацію у 12-тому кодоні гена М2(А2), що не дозволяє експресуватись функціональному М2. Ця делеція викликає додавання двох амінокислот треоніна і аланіна до перших 11 амінокислот із М2 (Аг), за якими йде транскрипційний термінатор (термінуючий кодон ОСА).
Приклад 2: Імуногенність і ефективність вакцин рекомбінантних ММА, що експресують білок
Е Е5МУ, білок С КУ, білок М К5М і білок М2 КБУ.
Вакцинний кандидат ММА-пВМ199В кодує глікопротеїн (С) і білок злиття (Р) із КБУ, тоді як
ММУА-пВвМ201вАМ2 ї ММА-тптВвМ2018 експресують »усічені версії ЕЕ і б на додаток до непроцесованих білків Е і б, нуклеокапсидний білок (М) і в разі ММА-пВМ2018 також матриксний білок (М2) із К5М (дивись Фігуру 1). Метою цих експериментів був аналіз імуногенності і захисної ефективності ММА-птпВМ201ВвАМ2 ії ММА-тВМ2018В8 у порівнянні з ММА- твВМ1998 після двох або трьох імунізацій шляхом підшкірних (5.с.) або інтраназальних (Їі.п.) уведень.
Ефективність цих конструктів тестували, використовуючи модель зараження КЗМ(А2) на мишах ВАГ В/с. Дві імунізації ММА-7ВМ199В або ММА-птВМ201В надавали частковий захист, як було оцінено за допомогою КТ-ДРСК, при підшкірному застосуванні і майже повний захист при інтраназальному застосуванні. Захист, наданий ММА-тВМ2018, був кращим, ніж захист, наданий ММА-тВвВМ1998. Не спостерігалося відмінностей у гуморальних імунних відповідях, викликаних двома конструктами, хоча значні відмінності спостерігалися в Т-клітинних відповідях. ММА-7ВМ199В викликав добру ЕМ Е-специфічну клітинну відповідь, тоді як з ММА- тВвМ2018 спостерігалася сильна М2-специфічна Т-клітинна відповідь, а також більш яскраво виражена С-специфічна відповідь у порівнянні з ММА-тптВМ1998. Оскільки дос і Т-клітинні відповіді, що індукуються після підшкірної і інтраназальної імунізації, були схожими, то майже бо повний стерильний імунітет, одержаний за допомогою інтраназальних імунізацій, ймовірно корелює з індукцією і секрецією КЗМ-специфічного ІдА в сайті мукозальної інфекції. Для ММА- тпВМ2018АМ2 відсутність М2-специфічних Т-клітинних відповідей корелює зі зниженим захистом у порівнянні з ММА-пВМ2018 і призводить до подібного захисту, ніж ММА-тптВМ1998В.
План дослідження
Мишам вводили підшкірно (5.с.) або інтраназально (і.п.) їх108 ТСІО5о ММА-птВМ1998В (групи 3, 4 і 5), 1х108 ТСІО5о ММА-тпВМ2018 (групи 6, 7 і 8) або 1х108 ТСІО5о ММА-птВМ201ВАМа (група 9). Мишей заражали двічі (Групи 3, 4, 6, 7 і 9) або тричі (групи 5 і 8) згідно Таблиці 1. Двом контрольним групам вводили (5.с.) двічі ТВ5 (група 1) або інтраназально К5ЗМ (група 2) згідно
Таблиці 7. Кров брали за день до імунізації або зараження, а також у день убивання. Титри
А5М-специфічного дО визначали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). На 48-й день половину мишей вбивали. Видаляли їх селезінки і готували для аналізу
А5М-специфічних Т-клітинних відповідей за допомогою методу імуноферментних плям (ЕГІБРОТ). На 49-й день мишей, що залишилися, заражали (і.п.) 106 БУО К5М А2. Зовнішній вигляд і масу тіла контролювали щодня, починаючи з дня зараження. Через чотири дні після зараження мишей убивали шляхом ін'єкції підвищеної дози кетаміна-ксилазина і знекровлювали. Після легеневого лаважа легені видаляли, а навантаження К5М аналізували за допомогою методу бляшок і КТ-Я9РСВ.
Таблиця 1
План дослідження
Чисель Введення досліджуваних і контрольних зразків Кровопусканн | Зараженн
Гру. Клітин Схема й спа/ість а Ін'єкції (день). | Шлях Доза ная і ЕСІ5РОТ я групи о, ін'єкцію (день)бо (день)Оо, ж і тв 14135 155. п.а. 13, 34, 48 і 53 5 ІВ | 13,34і488 | - ? ВУ 14135 |іїп. 106 БУО | 13,34, 48 і 53 50 | 13,34і488 | -
З МУА-твМ1998 14135 | 5.с. 1х108 ТСІО5о 13,3, 48153 13,341488 1 -
МУА-твМ1998 14135 |їп. в 13, 34, 48 і 53
СО То 3, з4ї4ви 1 5 5 в) ММУМА-тпВМ1998 Ж Ю, 21 і 35) 5.с. ТСІО5О 5З 43 -1,20341488| -
МУА-тпвМ2гоО1в 14135 | 5.с. 1х108 ТСІО5о 18, За, 48153 13,34і488 | - й МУА-тТВМ201В | 14135 |їлп. 1х108 ТСІОво 13, 34, 48 і 53 5 |Р | 13,34і488 | - . -1, 20 34, 48 і 5 В | -1,2034і488|. - 5 М МУА- 14135 | 5.с. 1х108 ТСІОз5о| 13, 34, 48 і 53 49 твМ2018АМ2 до відносно першої імунізації.
Ж миші були заражені інтраназальним шляхом 105 БУО В5М А2. Через чотири дні після зараження мишам робили кровопускання і вбивали під наркозом. Відбирали зразки рідини
ВАГ і легенів. 8. в день 48, цих мишей вбивали, а селезінки аналізували за допомогою ЕГІ5РОТ.
Схема дослідження. Схема прижиттєвої фази приведена в Таблиці 2.
Таблиця 2
Схема дослідження прижиттєвої фази
Процедури 46 Прибуття і поміщення 85 мишей ВАЇ В/с у віварій, розподіл клітинних карток і виділення по 5 мишей на клітину
Кліпування вух, включення/виключення обстеження всіх мишей 4 Попереднє кровопускання у мишей із клітин У, К, 0 і К (пункція лицьової вени справа) о 1-е введення мишам із клітину, К, С і Кк 13 Попереднє кровопускання у всіх мишей за винятком мишей з клітин), К, 0 і К пункція лицьової вени справа 1-е введення всім мишам за винятком мишей з клітину, К, б і Кк
Кровопускання у мишей з клітин ./, К, О і К (пункція лицьової вени зліва) 2-е введення мишам з клітин), К, 0 і В
Кровопускання у всіх мишей (ретро-бульбарна пункція вени лівого ока) з5 2-е введення всім мишам за винятком мишей з клітину, К, б і
З-е введення мишам з клітин ),К, С і В 48 Кровопускання у всіх мишей (ретро-бульбарна пункція вени правого ока) остаточне кровопускання для клітинВ, Ю.Е, НК, М, Рі 48 Селезінки мишей із клітин В, 0, Е, Н, К, М, Р і Е будуть видалені для аналізу
ЕПЗРОТ з 49 по 53 Щоденна оцінка зовнішнього вигляду і маси тіла 5З Остаточне кровопускання, убивання та взяття зразків ВАЇ 4. легенів у мишей, що залишилися "х Відносно дня першої імунізації.
Матеріали і методи
Експериментальні тварини. Вісімдесят п'ять самок мишей ВАЇ В/с) Н| (Н-249) У віці семи тижнів були отримані від дапміег (Коше де5 Спепе5 Зес5, Е-53940 І е Сепеві-Заїпі-ІвІє, Егапсе).
У всіх мишей не було специфічних патогенів.
Утримання тварин. Дослідження проводили у кімнаті 117 віварію у баварському Могаїс-
Магіїпогеїйй. Цей блок забезпечувався фільтрованим повітрям при температурі 20-24 С і відносній вологості від 40 95 до 70 95. Кімнату штучно освітлювали, чергуючи 14 годин світла і 10 годин темряви. Дослідження періоду акліматизації склало 15 днів. Тварин утримували в прозорих клітках ЗеаіІЗагте "м (Н Тетр ІроїузиМоп| саде Туре П ЇЇ. - Еиго зіапдага) площею 530 см".
Клітки закривали кришкою Н-Тетр 5вєаїЇЗаїе". Клітки поміщали у систему ТЕСМІРІ АЗТ-ІМО
Зеаібагє" із циркуляційним блоком 5 ІМ іпе", забезпечуючи кожну клітку окремо НЕРА- фільтром для повітря. Підстилку для тварин міняли раз на тиждень.
Дієта і випоювання. Миші були забезпечені вільним доступом до опроміненої підтримуючої дієти (З5МІРЕ К/М-Н, опромінені, М1534-727) і води (автоклавованої при 121 "С протягом 20
Хвилин).
Процедури попередньої обробки: Ідентифікація тварин. Для того, щоб індивідуально помітити тварин у кожній клітці, проставляння клейма на вуха проводили згідно стандартних процедур.
Дослідження за методом включення/виключення. Дослідження по методу включення/виключення проводили згідно стандартних процедур.
Узяття проб крові для попереднього кровопускання. Зразки крові близько по 150 мкл були одержані пункцією лицьової вени відповідно до стандартних процедур. Зразки крові переносили в лабораторію для подальшої обробки відповідно до стандартних процедур.
Процедури обробки: Одержання і введення досліджуваних препаратів 1-3 і препарату порівняння. Одержання і введення досліджуваних препаратів і препарату порівняння проводили в кабінеті класу І мікробіологічної безпеки (НЕРАзаїеб/сіає5 І їуре Н, Кепаго) згідно стандартних процедур. Коротко, для підшкірного введення рекомбінантні ММА розбавляли у
ТВ5 для одержання робочого розчину з концентрацією 2х108 ТСІЮво/мл. їх108 ТСІОво у 500 мкл ін'єктували підшкірно згідно стандартних процедур. Для інтраназального введення рекомбінантні ММА розбавляли у ТВ5 для одержання робочого розчину з концентрацією 2х109
ТСІЮво/мл. По 50 мкл розбавлених вірусів вводили вв одну ніздрю анестезованих (ксилазином/кетаміном) тварин згідно стандартних процедур. По 500 мкл ТВ5 вводили підшкірно згідно стандартних процедур.
Одержання і введення досліджуваного препарату 4/вірус зараження. Флакон із К5М відтавали і використовували настільки швидко, наскільки це можливо через вірусну нестабільність (максимально 15 хвилин на льоду). Вірус тримали на льоду весь час і використовували одразу для зараження анестезованих (ксилазином/кетаміном) тварин 100 мкл розчину нерозведеного вірусу інтраназальним шляхом згідно стандартних процедур.
Пост-процедурні обробки:
Маса тіла. Масу тіла контролювали щодня, починаючи з дня зараження і до вбивання згідно стандартних процедур.
Забір крові. Зразки крові (близько по 150 мкл) одержували шляхом ретро-бульбарної пункції або пункції лицьової вени (Для одержання додаткової інформації див. Таблицю 1 і Таблицю 2) згідно стандартних процедур. Зразки крові переносили в лабораторію для подальшої обробки відповідно до стандартних процедур.
Евтаназія. Евтаназію половини мишей проводили у день 48 шляхом зсуву шийних хребців. У день 53, миші, що залишилися, одержували подвійну дозу кетаміна-ксилазина шляхом внутрішньочеревної ін'єкції, а евтаназію здійснювали шляхом перерізання аорти в черевній порожнині.
Зо Видалення селезінок. Селезінки видаляли асептично. Їх поміщали у пробірки, наповнені середовищем згідно стандартних процедур. Ці пробірки вносили до віварію, а потім виносили згідно стандартних процедур.
Промивання легенів і видалення легенів. Рідину ВАГ збирали шляхом промивання легенів 4 рази 1 мл РВ5. Потім легені видаляли і миттєво заморожували у вигляді двох половинок у рідкому азоті для подальшого аналізу бляшок і екстракції РНК.
Аналіз: Обробка зразків крові і зберігання сироваток. Після доставки у лабораторію зразки крові були оброблені у сироватку згідно стандартних процедур. Після одержання сироватку зберігали при -20 "С (ж 5 "С), доки не знадобиться для аналізу.
Аналіз титрів К5М-специфічних антитіл із сироваткових зразків. Загальні титри ЕГІЗА КБМУ- специфічного Ід визначали у всіх сироваткових зразках, використовуючи модифікований набір
ЕПІЗА (Зетгіоп ЕГІЗА сіаззіс, Каталог Мо ЕЗК1130): Замість кон'югованого лужною фосфатазою антитіла до людського ІдС, яке входить у набір, кон'юговане лужною фосфатазою козине антитіло до мишачого дос (Зегоїес саї: 103004) використовували як вторинне антитіло.
Титри ЕГІЗА КЗМ-Р/2-специфічного Ід визначали у всіх сироваткових зразках і рідині ВАГ, використовуючи модифікований набір ЕГІЗА (ІВІ-Натригд Кеї. КЕ56881). Замість РОЮ- кон'югованого антитіла до людського до, яке входить у набір, НКР-кон'юговане овече антитіло до мишачого Ідс (геї. ВМ-687-95/96, Зегоїес са ААСТОР) використовували як вторинне антитіло.
За винятком груп 4 і 7, титри ЕГІБА К5М-Е-специфічного ЇД0 визначали у сироваткових зразках на 48-й день, використовуючи модифікований набір ЕГІЗА (ІВІ -Натбригу Кеї. Реагенти
КЕ56881 і микротитраційні смужки КЗМ (Е-білок) (до Кеї. КЕ56692). Замість РОО-кон'югованого антитіла до людського 50, що входить у набір, НЕР-кон'юговане овече антитіло до мишачого
Ідс (тет. ВМ-687-95/96 Зегоїес саї ААС10ОР) використовували як вторинне антитіло.
Титри ЕГІЗА КЗМ-специфічного ІдА у сироватці і рідині ВАГ. визначали у зразках з 48го дня по 53й день, відповідно, використовуючи модифікований набір ЕГІЗА (ІВІ-Натригу Реї.
КЕ56881): Замість РОЮО-кон'югованого антитіла до людського ДО, що входить в набір, НеЕР- кон'юЮговане овече антитіло до мишачого ІА (геї ВМ-687-95/96 бегоїес са ЗТАНІ137Р) використовували як вторинне антитіло.
Аналіз КЗМ-специфічних клітинних імунних реакцій спленоцитів. КЗМ Е-, ВОМ с- апа В5У бо Ма2-специфічні клітинні реакції визначали через два тижні після останньої імунізації шляхом повторного стимулювання спленоцитів специфічними пептидами, як описано в іншому документі (див., наприклад, 5.М. Магда еї аї. (2000); 5. Чдопп5іопе еї аї. (2004); 5. Лапа еї аї., (2002); ї А.В. КиїКагпі еї аї., 9У. МігоІ. 67(7):4086-4092 (1993)) і виявляли вивільнення ІЄМУу із спленоцитів за допомогою аналізу ЕГІЗРОТ.
Метод аналізу ЕГІЗРОТ. Для аналізу ЕГІБРОТ використовували набір мишачого ІЕМ-гамма (ВО Віозсіепсе5, Саїанод Мо 551083). Цей аналіз проводили згідно інструкціям виробника.
Коротко, планшети покривали іммобілізованим антитілом за день до ізолювання спленоцитів.
Після ізолювання клітини переносили у планшети ЕГІ5РОТ і стимулювали різними пептидами (див. Таблицю 3) протягом 20 годин при 37 "С. Продукування ІРМу виявляли, використовуючи детекторне антитіло. Планшети проявляли, використовуючи ВО" ЕГІБРОТ АЕС Зибрвігайє 5еї (ВО Віозсіеєпсе5, Саїаіюд Мо 551951) згідно інструкціям виробника.
ЕІЗРОТ план стимулювання. Всі умови були випробувані в двох повтореннях. Пептиди
В5БМУ-1, А5МУ-2, ВБ5МУ-3, Н5МУ-4 і Е5У-5 (див. Таблицю 3) використовували у кінцевій концентрації 5 мкг/мл (1 мкг/лунку) для стимулювання 5х105 і 2.5х105 спленоцитів на лунку. ММА (контроль імунізації) використовували при множинному зараженні (МОЇ) з 10 для стимуляції 5х105 і 2,5х105 спленоцитів на лунку і конкавалін А (СопА |позитивний контроль)) використовували у кінцевій концентрації 0,5 мкг/мл для стимуляції 2,5х105 спленоцитів. Як негативний контроль, 5х105 спленоцитів культивували лише в середовищі (ЕРМІ-1640, збагаченим Сішатах, пеніциліном, стрептоміцином, 10 95 фетальної телячої сироватки і 105 М ВД-меркаптоетанола).
Таблиця З
А5У-специфічна стимуляція
Аналіз рідини ВАЇ із легенів. Клітинну характеристику ВАЇ не вдалося здійснити через проблеми фарбування. Навантаження К5ЗМУ у зразках легенів визначали за допомогою методу бляшок «ЗМ і КТ-ФРСВ.
Метод бляшок ЕЗУ. Одну половину кожної з миттєво заморожених легенів гомогенізували в 1 мл холодного середовища із застосуванням французького преса (Середовище Голка, модифікована за способом Дульбекко, збагачена 7 95 фетальної телячої сироватки). Після короткого центрифугування по дві пробірки кожного супернатанту титрували в двократних серійних розведеннях для вирощування моношарів клітин Веро в 48-лункових плоскодонних
Зо планшетах. Через шість днів моношари промивали і фіксували 1 96 формальдегідом. Через 24 години моношари забарвлювали 0,04 95 нейтральним червоним і підраховували бляшки.
ВОМ АТ-ЯРСК. Негайно видаляли по 100 мкл гомогенізованої тканини легенів і виділяли
РНК, використовуючи мінінабір КМеазу? від Оіадеп (Каталог Мо 74104). Реакцію зворотної транскрипції проводили, використовуючи великоємносний набір РНК-к-кДНК від Арріїєйд
Віозузіет5 (Сагаіюд Мо 4387406). РСК, специфічну до гена Г К5М, проводили в термоциклері з наступними параметрами: (1) 50 "С протягом 2 хвилин; (2) 95 С протягом 10 хвилин; (3) 45 циклів (15 секунд при 95 "С, 1 хвилина при 60 "С), використовуючи універсальний Мазхіег Міх для РСК від Арріїєа Віозуєтетв (Саїаіюд Мо 4352042) і суміші трьох праймерів: (1) праймер 1 (5'-
СпАА Сто дат атТА пат АСА АТО ТТ аСА-3" 5ЕО ІО МО: 36); (2) праймер 2 (5-ТТО АОС ТАТ
САТ ТТ СТО Таб САА Т-3"7 ЗЕО ІЮО МО: 37); і (3) зонд 6 (Х-ТТТ САА ССТ ато ТОА АСА ТТ бСба атт-3 (5ЕО ІО МО: 38). Число копій визначали за калібрувальною кривою плазмідного вектора РМІЗС202, що містить фрагмент гена І К5М. Подібні реакції для мишачого бета-актина використовували як внутрішні контролі для введення кКДНК, використовуючи МІС/МОВ-мічений зонд від Арріїей Віозуєіетвз (Сагаюд Мо 4351315).
Документування дослідження. Блок-схему прижиттєвої фази готували для збору всієї інформації протягом окремих етапів прижиттєвої фази. Крім того, інформацію, специфічну відносно мишей або клітки, записували на клітковій картці. Кліткові картки не розглядаються як вихідні дані дослідження, але є вимогою уряду Верхньої Баварії.
Блок-схему аналітичної фази готували для збору всієї інформації протягом окремих етапів аналітичної фази. Аналізи документували в спеціальних тестових записах або лабораторних журналах; перехресні посилання документували в блок-схемі аналітичної фази. Всю аналітичну документацію, включаючи вихідні дані, передивлялися згідно стандартних процедур. Крім того, технічні паспорти для зразків сироватки готували згідно стандартних процедур.
Обробка даних. Необроблені дані переносили у відповідні ЕхсеІ-файли для подальшого аналізу згідно стандартних процедур.
ЕГІЗА. Середні значення ОО і стандартні помилки середнього розраховували за допомогою
Ехсеї.
ЕГІ5РОТ. Планшети ЕГІЗРОТ зчитували СТІ -рідером згідно інструкцій виробника. Кількість плямоутворюючих клітин (ЗЕС) визначали у кожній лунці і заносили в ЕхсеІ-файл для подальшої оцінки. З інкубації з 5х105 і 2,5х10» клітин на лунку, кількість плям на 1х106 спленоцитів підраховували в кожній лунці. Розраховували середнє для негативного контролю і віднімали з кожного значення до обчислення середнього значення на мишу для одержання значення індексу стимуляції (5І) (частота пептид-специфічних спленоцитів миші, виділяючих
ІЕМ-у) із розрахунку на мишу.
Для пептидної стимуляції, ЗІ одержували з лунок з 5х105 і 2,5х105 клітин, крім випадків, коли плям було надто багато, щоб підрахувати, або для К5У-імунізованих тварин. У цих випадках використовували лише концентрацію 2,5х105. Для ММА-ВМ стимуляції, ЗІ одержували з лунок з
Бх105 клітинами, крім випадків, коли плям було надто багато, щоб підрахувати. У такому разі використовували концентрацію 2,5х105. Після визначення 5І для окремих тварин, середнє 51 (5ЕС на 1х109 спленоцитів) і стандартну помилку середнього (ЗЕМ) розраховували для кожної групи.
Зміни маси тіла. Індивідуальні значення маси тіла (у грамах) перед зараженням К5М були прийняті як базові значення. З цими базовими значеннями зміни ваги тіла окремих тварин (у 95), а також зміни середньої маси тіла в групах розраховували для кожної контрольованої часової точки після зараження із застосуванням Місгозой Ехсеї.
Метод бляшок РМ. Кількість бляшок підраховували в лунці з трьоеома найвищими обчислюваними розведеннями вірусу. Середню кількість бляшок, регульована фактором розведення, потім множили на 10, щоб одержати титр розчину в БУО/мл і, нарешті, множили на 2, щоб одержати титр на кожну легеню.
Зо В5М ВТ-ЯРСВ. РСВ-ампліфікації вимірювали в режимі реального часу, використовуючи АВІ 7500 від Арріїєй Віозузіет5 (Сайарюд Мо 4351107) і аналізували, використовуючи системне програмне забезпечення, що поставляється Арріїей Віозузіетв. Усі значення порівнювали з І - генним стандартом і нормували до визначення мишачого бета-актина для кожного зразка.
Результати
Аналіз гуморальної імунної відповіді: Аналіз відповіді К5М-специфічного антитіла Ід із сироваткових зразків. Сироватку спочатку аналізували за допомогою ЕГІ5А, виходячи з набору
ІВ-Натбриго, використовуючи планшети, вкриті лише білками Е і З рекомбінантного Е5М (Фігура 2 та Фігура 3). Як показано на Фігурі 2, подібні Е5М-специфічні ДС відповіді (00 у діапазоні від 0,870 до 1,347) спостерігалися зі всіма трьома конструктами (ММА-тВМ1998, ММА- твВМм2018АМ2 та ММА-пВМ2018В) після одиничної імунізації і не залежали від шляху введення, використаного для імунізації (підшкірно або інтраназально). Тоді як друга імунізація призвела до майже 2,0-3,5-кратного підвищення реакції антитіл (00 у діапазоні від 2,627 до 3,407), третя підшкірна ін'єкція мала лише незначний вплив на реакцію В-клітин, викликаючи збільшення близько 0,500 одиниць ОО у порівнянні з ОО після другої імунізації. Подібні результати були одержані за допомогою ЕГІЗА, виходячи з набору ІВ Натбигд із застосуванням планшетів, вкритих лише білком Е рекомбінантного КЗМ (Фігура 4).
Після серійного розведення сироватки (1/100, 1/200 і 1/400) К5М Е- і К5М О-специфічні результати ЕГІЗА показали, що ММА-тВМ1998, ММА-пВМ201ВАМ2 і ММА-птВМ2018 викликали подібні КОМ Е- і К5М Об-специфічні ідо відповіді, не дивлячись на додаткову експресію усіченого білка Е К5ЗМ і усіченого білка 5 КЕЗМ конструктами ММА-птВМ201ВвАМ2 і ММА-тпВМ2018 (Фігура 3). Після двох підшкірних імунізацій конструктами відповідь В-клітин усе ще була нижча у порівнянні з імунізацією лише КОМ (позитивний контроль). Для досягнення рівня імунної відповіді, викликаної двома інтраназальними введеннями К5У, була потрібна третя підшкірна імунізація конструктами ММА-тВМ. На відміну від цього, 2 інтраназальні імунізації ММА- твВМ1998 і ММА-7ВМ2018 викликали подібні В-клітинні реакції, як і дві імунізації лише ЕЗМ або
З підшкірні імунізації ММА-птВМ1998, ММА-пВМ2018АМ2 і ММА-пВМ2018, коли аналізували
ЕГІ5А, виходячи з набору ІВІ. Натрбиго (Фігура 3).
Коли сироватку знову аналізували за допомогою ЕїІ5А на основі набору Зегіоп, використовуючи планшети, вкриті лізатом КЗМ, не було виявлено відмінностей між ММА- 60 твМ1998, ММА-птВМ2018АМ2 і ММА-пВМ2018. Не спостерігалося відмінностей між 2 і 3 імунізаціями або між підшкірним і інтраназальним шляхами введення. Крім того, відповіді були нижчі, ніж реакції на антитіла, що індукуються 2 інтраназальними введеннями К5ЗМ (Фігура 5).
Аналіз відповідей К5М-специфічних антитіл ІЗА. КМ Е- і К5М Об-специфічний ІдА (виходячи з набору ІВ. Натбриго) вимірювали в рідині ВАГ. через 4 дні після зараження (на 53-й день). Крім того, також за допомогою ЕГ І5А аналізували ВАГ і сироватку К5М Е- ії К5М Об-специфічного Ід.
Результати порівняли з результатами, одержаними в сироватці прямо перед зараженням (на 48-й день), і показали на Фігурі 6.
Як і очікувалося, реакції ІДА були виявлені лише після інтраназального введення Е5М, ММА- твМ1998 і ММА-пВМ2018. Хоча до також може бути виявлений у ВАГ, ІдА був виявлений при вищому рівні після інтраназального введення. Рівні ІДА в сироватці були значно нижчі, ніж рівні
ЧО незалежно від шляху введення.
Аналіз К5М-специфічних клітинних імунних відповідей. Т-клітинні відповіді аналізували в селезінці за допомогою ЕГІ5БРОТ за два тижні після останньої імунізації (Фігура 7). ММА- тВМ1998, введений інтраназальним або підшкірним шляхом, викликав сильну К5М-Е специфічну Т-клітинну відповідь. Імунна реакція, головним чином, була направлена проти К5МУ-
Е-специфічного пептиду К5М-2, який є імунодомінантним за відсутності К5М-М2. Відповідь складала близько 2000 плям на 105 спленоцитів після 2-ої підшкірної імунізації і близько 4000 після 3-ї підшкірної ін'єкції або 2-го інтраназального застосування. Подібно до відповіді на інтраназальні введення КЗМ була виявлена низька с-специфічна відповідь на пептид К5М-4 після імунізації ММА-7ВМ199В (близько 500 плям на 105 спленоцитів) і, як і очікувалося, ММА- твВМ1998 не індукував М2-специфічні Т-клітини. Пептид М2 є імунодомінантним пептидом КЗМ у мишей. Отже, інтраназальні імунізації КОМ індукували хорошу М2-специфічну Т-клітинну відповідь більше 1000 плям на 105 спленоцитів, і майже не було Е-специфічної Т-клітинної відповіді.
Як ії ММА-тВМ1998, ММА-пВМ2018 викликав сильну Т-клітинну відповідь, але у ньому домінував М2 (більше 4000 плям на 105 спленоцитів незалежно від кількості введених доз і шляху введення). Навіть с-специфічна відповідь, викликана ММА-птВМ2018В, була принаймні в З рази вища, ніж с-специфічна відповідь, викликана ММА-пВМ199В або К5У. На відміну від ММА- твВМ1998, Е-специфічна відповідь, викликана ММА-тпВМ2018В, була дуже низькою, менше ніж 600 плям на 105 спленоцитів для пептиду Е5М-2.
АБ5М-зараження штамом А2 Е5М. Мишей заражали інтраназально 105 БУО КЗМ(А2) після двох тижнів після останньої імунізації. Масу тіла перевіряли щодня. Через чотири дні після імунізації мишей убивали. Після промивання легенів 1 мл РВЗ легені видаляли, а навантаження
Е5М у легенях визначали методом бляшок і ЕТ-ДРСК, проведеним як описано вище.
Зміни маси тіла. Усі миші втрачали масу через день після імунізації, найімовірніше через анестезію або саме інтраназальне зараження (Фігура 8). ТВ5-оброблені миші починали істотно втрачати масу через 4 дні після зараження КБУ. На відміну від цього, миші, які одержали КЗМ інтраназально протягом трьох імунізацій, не демонстрували втрату маси. Всі миші, підшкірно імунізовані ММА-пт7ВМ199В, ММА-тпВМ2018 або ММА-птВМ201ВАМ2, втратили близько 20 95 маси через 4 дні після імунізації. Така втрата маси була описана раніше Оі57ем5Ка еї аї. (Массіпе 23:215 (2004)). Проте наші КТ-ДРСК результати (Фігура 10) показують, що вона корелює з кращим захистом і ранішим виведенням К5ЗМ із легенів через викликану вакциною відповіді СТІ у порівнянні з нормальним кліренсом первинної інфекції КОМ. При інтраназальному застосуванні імунізовані ММА-тТтВМ2018 миші мали схожу втрату маси, що і підшкірно імунізовані миші через 2 дні після зараження, але відновлювалися на 4-й день після зараження через низьке навантаження К5У у легенях у порівнянні із підшкірним шляхом (Фігура 10). Подібно до К5У-імунізованої групи, миші, імунізовані інтраназально ММА-тптВМ1998В, не втрачали масу.
Навантаження КМ, виміряне за допомогою методу бляшок. Через чотири дні після імунізації було визначено в середньому 57671 БУО на легеню для неімунізованих мишей (Фігура 9). Як ії в К5У-імунізованої контрольній групі, у легенях тварин, імунізованих ММА- твМ1998, ММА-пВМ2018 або ММА-пВМ2018АМ2, не виявили бляшки А2 ЕМ після 2 підшкірних або інтраназальних введень.
Навантаження К5ЗУ, виміряне за допомогою КТ-ДРСК. Навантаження К5М у легенях також аналізували за допомогою КТ-дДРСК (Фігура 10). Не дивлячись на те, що у однієї вакцинованої миші за допомогою методу бляшок не був виявлений КОМ, геноми К5М усе ще виявлялися у мишей, тричі імунізованих ММА-пВМ1998В. Після трьох імунізацій ММА-пВМ1998В, навантаження
Е5М було у 38 разів нижче у порівнянні з контрольною групою ТВ5. Геноми К5ЗМ також виявлялися після трьох імунізацій ММА-пВМ2018, але навантаження було у 158 разів нижче у бо порівнянні з контрольною групою ТВ5. Не було істотних відмінностей між мишами,
Зо імунізованими двічі або тричі. Примітно, що зниження навантаження КБУ, що спостерігається з
ММА-тпВМ2018, не спостерігалася після вакцинації ММА-тТВМ201ВАМа2, яка була у відсутність
М2, еквівалентного ММА-тВМ1998В.
Майже повний захист, порівнянний із тим, що одержаний у групі, обробленою К5МУ, спостерігався після інтраназальної імунізації ММА-пВМ2018В, хоча п'ять копій гена Ї усе ще виявлялися у однієї миші з п'яти. Інтраназальна імунізація ММА-птВМ1998 також викликала сильне зниження навантаження К5У, але ген Ї усе ще виявлявся при низьких рівнях у трьох мишей з п'яти.
Обговорення і висновки
Хоча ММА-птВМ2018 експресує усічені версії білків Е і 5 Е5М на додаток до непроцесованих білкам Е і 5 К5М, також включеним у конструкт ММА-тВМ1998, ММА-тптВМ2018 індукував гуморальну імунну відповідь із подібною амплітудою. Обидва конструкта викликали відповідь антитіл, направлену, головним чином, проти білка Є КБУ, якщо судити за аналогічними хорошими відповідями, виміряними лише в Е К5М ЕГІЗА у порівнянні з Е і з К5М ЕГІЗА Рівень антитіл після двох інтраназальних застосувань був вищим, ніж після двох підшкірних введень.
Третє підшкірне введення було потрібне для досягнення рівня відповідей антитіл, викликаних двома інтраназальними застосуваннями. На відміну від цього, жодних серйозних відмінностей не спостерігалися в Т-клітинних відповідях, що індукуються за допомогою підшкірного введення у порівнянні з інтраназальними дорогами введення або при використанні двох у порівнянні з трьома підшкірними застосуваннями. Проте, ММА-тВМ199В8 індукував хорошу КЗМ РБ- специфічну клітинну відповідь, тоді як на ММА-пВМ2018 спостерігалася сильна М2-специфічна
Т-клітинна відповідь КОМ (з-специфічна відповідь, викликана ММА-тптВМ2018В, була також явнішою у порівнянні з ММА-птВМ1998. Характер реакції Т-клітин, індукованої ММА-тВМ2О18, був схожий на Т-клітинну відповідь, викликану імунізацією КБУ, хоча і набагато вище.
Незалежно від шляхів і кількості введень обидва конструкта захищали мишей від зараження
ЕБМ(А2), і жоден вірус, що реплікується, не міг бути культивованим із легенів. Проте, як спостерігалося раніше, підшкірні імунізації ММА-7ВМ1998 або ММА-пВМ2018 не призводили до стерильного імунітету (тобто, імунітету, який зберігається навіть після виведення цільового інфекційного агента з організму). Навантаження генома К5М (вимірюють рівні вірусної РНК-
Зо полімерази гена І) у легенях мишей, імунізованих підшкірним введенням будь-якого з ММА- твВМ1998 або ММА-тпВМ2018В, було значно знижене, але все ще виявлялося за допомогою кількісної КТ-РСЕ, а третя підшкірна імунізація не мала благотворного впливу на вірусне навантаження, не дивлячись на її збільшення при рівнях К5М-специфічного дО. Зниження експресії білка ЇЇ К5ЗМ було трохи більше вираженим після вакцинації ММА-пВМ2018 у порівнянні з ММА-пВМ1998, що може бути пов'язане із підвищенням М2-специфічного СЮОв' Т- клітинної відповіді, як і геномне навантаження ЕЗМ було вище у тварин, вакцинованих ММА- твМ201вАМ2, ніж у тварин, вакцинованих ММА-пВМ2018, подібно ММА-тВМ1998В.
Стерильний імунітет майже був одержаний після двох інтраназальних уведень будь-якого з
ММА-тпВМ1998 або ММА-птВМ2018. Це спостереження корелює з індукцією і секрецією КБМ- специфічних ІдА у ділянках слизової інфекції.
Приклад 3: Безпека вакцин рекомбінантних ММА, що експресують білок Е КБУ, білок з К5М, білок М КМ і білок М2 К5МУ, у порівнянні з РІ-АБУ.
Вакцинний кандидат ММА-тпВМ199В кодує глікопротеїн (С) і білок злиття (ГБ) К5М, тоді як
ММА-тптВМ2018 експресує усічені версії Б і б на додаток до непроцесованим білкам, нуклеокапсидний білок (М) і матриксний білок (М2) К5М (дивись Фігуру 1). Мета цих експериментів полягала в аналізі безпеки будь-якого з ММА-пВМ199В8 і ММА-пВМ2018 у порівнянні з РІ-К5М після двох імунізацій за допомогою підшкірних (5.с.) або інтраназальних (іп.) шляхів введення.
Безпека цих конструктів була перевірена за допомогою моделі зараження К5ЗМ (Аг) у лінії мишей ВАГ В/с. дві імунізації ММА-пВМ1998 або ММА-пВМ2018 не індукували підвищеної секреції ІІ -4 і ІІ 5 у ВАЇ після зараження К5ЗМ (Аг) у порівнянні з РІ-АБУ.
План дослідження
Мишей заражали двічі на три тижні підшкірно (5.с.) або інтраназально (і.п. 1х108 ТСІЮО5о
ММУА-тВвВМ1998В (групи З ї 4), 1х108 ТСІО5о ММА-тВМ2018 (групи 5 і 6) згідно Таблиці х. Три контрольні групи заражали (5.с.) двічі ТВ5 (група 1) або інтраназально КМ (група 2), або внутрішньом'язово 30 мкг РІ-КЗМ (група 7), згідно Таблиці х. На 35-й день мишей заражали (і.п.) 105 БУО БМ А2. Через чотири дні після імунізації, мишей убивали ін'єкцією підвищеної дози кетаміна-ксилазина і знекровлювали. Після промивання легенів аналізували рівніІ/ 4 і І 5 у ВАГ. за допомогою ЕГІ5А. (510)
Таблиця 4
План дослідження
Чисепьніст Введення досліджуваних і контрольних зразків Зараження
Група ь групи Ін'єкції Схема Шлях Доза на ін'єкцію (день)бо, Ж (день) ' 8
М 021 нин твМ1998 тп 35 -б. в 617500 ИЕМИИЕ То тою
ЕІ-ВБУ до відносно першої імунізації.
Ж мишей заразили інтраназальним шляхом 105 БУО К5М А2. Через чотири дні після зараження мишей знекровлювали і вбивали під анестезією. Рідину ВАГ. збирали для зразків.
Схема дослідження. Схема прижиттєвої фази наведена в Таблиці.
Таблиця 5
Схема дослідження прижиттєвої фази
Процедури
Прибуття і розміщення мишей ВАЇ В/с у віварій, розподіл клітинних карток і виділення по 5 мишей на клітину кліпування вух, дослідження за методом включення/виключення всіх мишей 0000 | евведеннямишам.о//////7777711111111111111111111 зараження Е5М(А2) остаточне кровопускання, вбивання і взяття зразків ВАГ. "х Відносно дня першої імунізації.
Матеріали і методи
Експериментальні тварини. Самки мишей ВАЇ В/с.) К) (Н-2а4) у віці семи тижнів були одержані від дапміег (Коше де5 Спепе5 бесв5, Е-53940 І е Сепеві-Заїпі-ІбІє, Егапсе). У всіх мишей не було специфічних патогенів.
Вміст тварин. Дослідження проводили в кімнаті 117 віварію у баварському Могаіс-Мапіпвгеїа.
Цей блок забезпечувався фільтрованим повітрям при температурі 20-24 "С і відносній вологості від 40 95 до 70 95. Кімнату штучно освітлювали, чергуючи 14 годин світла і 10 годин темряви.
Дослідження періоду акліматизації склало 15 днів. Тварин містили в прозорих клітинах зЗеаіЗаїє" (Н Тетр Іроїузийоп| саде Туре П ЇЇ - Его в5іапааг), площею 530 см". Клітки закривали кришкою Н-Тетр беаіІЗаїте". Клітки поміщали в систему ТЕСМІРІ А5Т-ІМО ЗваЇІЗаїтет" із циркуляційним блоком ЗІ ІМ іпе", забезпечуючи кожну клітину окремо НЕРА-фільтром для повітря. Підстилку для тварин міняли раз на тиждень.
Дієта і випаювання. Миші були забезпечені вільним доступом до опроміненої підтримуючої дієти (З5МІРЕ К/М-Н, опромінені, М1534-727), і води (автоклавованої при 121 "С протягом 20
Хвилин).
Процедури попередньої обробки: Ідентифікація тварин. Для того, щоб індивідуально помітити тварин у кожній клітині, проставляння клейма на вуха проводили згідно стандартних процедур.
Дослідження за методом включення/виключення. Дослідження за методом включення/виключення проводили згідно стандартних процедур.
Узяття проб крові для попереднього кровопускання. Зразки крові близько по 150 мкл були одержані пункцією лицьової вени відповідно до стандартних процедур. Зразки крові переносили в лабораторію для подальшої обробки відповідно до стандартних процедур.
Процедури обробки: Одержання і введення досліджуваних препаратів і препарату порівняння. Одержання і введення досліджуваних препаратів і препарату порівняння проводили у кабінеті класу І! мікробіологічної безпеки (НЕКАбзаїесб/сіає5 І їуре Н, Кепаго) згідно стандартних процедур. Коротко, для підшкірного введення рекомбінантні ММА розбавляли у
ТВ5 для одержання робочого розчину з концентрацією 2х108 ТСІЮво/мл. їх108 ТСІОво у 500 мкл ін'єктгували підшкірно згідно стандартних процедур. Для інтраназального введення, рекомбінантні ММА розбавляли у ТВ5 для одержання робочого розчину з концентрацією 2х109
ТСІЮво/мл. По 50 мкл розбавлених вірусів вводили вв одну ніздрю анестезованих (ксилазином/кетаміном) тварин згідно стандартних процедур. По 500 мкл ТВ5 вводили підшкірно згідно стандартних процедур.
Одержання і введення вірусу К5М(А2). Флакон із К5М відтавали і використовували настільки швидко, наскільки це можливо, через вірусної нестабільності (максимально 15 хвилин на льоду). Вірус тримали на льоду весь час і використовували одразу для зараження анестезованих (ксилазином/кетаміном) тварин 100 мкл розчину нерозведеного вірусу інтраназальним шляхом згідно стандартних процедур.
Одержання і введення РІ-К5У. 30 мкг РІ-К5М у 40 мкл ін'єктували внутрішньом'язово.
Евтаназія. На 35-й день миші, що залишилися, одержували подвійну дозу кетаміна- ксилазина шляхом внутрішньочеревної ін'єкції, а евтаназію здійснювали шляхом перерізання
Зо аорти у черевній порожнині.
Легеневий лаваж. Рідину ВАГ. збирали шляхом промивання легенів 4 рази 1 мл РВ5.
Аналіз
Рівні 1І--4 і 1-5 вимірювали у супернатанті ВАГ, використовуючи комерційно доступні набори
ЕМІЗА (ті! 4 РІ АТІМОМ ЕГІЗА від еВІОБСІЕЄМСЕ Саї М" ВМ5613 ії ЕЕАОМ-5ЕТ-СО МІ -5 ЕПІЗА від еВІОБСІЕМСЕ Саї М" 88-7054-22).
Документування дослідження. Блок-схему прижиттєвої фази готували для збору всієї інформації протягом окремих етапів прижиттєвої фази. Крім того, інформацію, специфічну відносно мишей або клітки, записували на клітковій картці. Клітинні картки не розглядаються як первинні дані дослідження, але є вимогою уряду Верхньої Баварії.
Блок-схему аналітичної фази готували для збору всієї інформації протягом окремих етапів аналітичної фази. Аналізи документували у спеціальних тестових записах або лабораторних журналах; перехресні посилання документували у блок-схемі аналітичної фази. Всю аналітичну документацію, у тому числі вихідні дані, переглядали згідно стандартних процедур. Крім того, технічні паспорти для зразків сироватки готували згідно стандартних процедур.
Обробка даних. Необроблені дані переносили у відповідні ЕхсеІ-файли для подальшого аналізу згідно стандартних процедур.
ЕГІ5ЗА. Концентрації цитокінів визначали по калібрувальній кривій відповідного набору
ЕПЗА.
Результати
Збільшення вироблення І! -4 (Фігура 11) і 1 -5 (Фігура 12), подібне тому, що спостерігається з
РІ-ВБМ, не спостерігалося для ММА-тпВМ199В8 або ММА-тпВМ2018 Обидва цитокіни були нижчими за рівень виявлення, коли мишей імунізували інтраназально ММА-тВМ1998 або ММА- твмМа2го18.
Обговорення і виводи
Ї ММА-тпВМ1998, ії ММА-пВМ2018 не індукують посилене захворювання у порівнянні з РіІ-
К5ЗМ за оцінкою відповіді ТН2.
Приклад 4: Порівняння ефективності імуногенності і безпеки різних вакцин рекомбінантних
ММА, що експресують білок Е КМ, білок з К5ЗУ, білок М К5М і білок М2 КБУ.
Вакцинний кандидат ММА-тпВМ199В кодує глікопротеїн (С) і білок злиття (ЕР) К5М, тоді як бо ММУА-тпВМ2018 експресує усічені версії Б і б на додаток до непроцесованим білкам,
нуклеокапсидний білок (М) і матриксний білок (М2) Е5М, а ММА-пВМ294В експресує одинЕ і2 5 непроцесованих білка, нуклеокапсидний білок (М) і матриксний білок (М2) Е5М (див. Фігуру 1).
ММУА-тпвМ294А є проміжним продуктом при клонуванні ММА-тВМ294В, який усе ще має одну касету клонування. Ця касета клонування не впливає на експресію трансгена або імуногенні властивості трансгенних білків. Мета даного експерименту полягала в аналізі імуногенності, ефективності і безпеці ММА-7ТВМ294А у порівнянні з ММА-пВМ199В і ММА-птВМ2018 після двох імунізацій підшкірним (5.с.) шляхом введення.
Ефективність імуногенності і безпеки цих конструктів перевіряли, використовуючи модель зараження КЗМ(А2) у мишей ВАЇ В/с. Ми підтвердили, що, не дивлячись на зміни в ММА- твМ294А (еквівалентний ММА-птВМ294В) у порівнянні з ММА-пВМ2018, він індукує подібні В- і
Т-клітинні відповіді і надає аналогічний захист. Цей експеримент показав, що конструкти (ММА- тВвМ2018 або ММА-тВМ294А), що експресують принаймні одну антигенну детермінанту мембранного оглікопротеїну КЗМ (Б їі б) і принаймні одну антигенну детермінанту нуклеокапсидного білка Е5М (М або М2), індукують кращий захист, ніж конструкт, що експресує лише антигенні детермінанти мембранних глікопротеїнів КЗМ (ММА-пВМ1998В).
План дослідження
Мишей вакцинували (5.с.) 1х108 ТСІО5о ММА-тВвМ294А, ММА-тптВМ1998 або ММА-тВМ2018 за схемою «прайм-буст» (день 0 і 21) згідно Таблиці 6. Контрольні групи обробляли двічі підшкірно ТВ5 або К5У-А2 згідно Таблиці 6. Інактивований формаліном (РІ) -К5М ін'єктували внутрішньом'язово (і.т.) один або двічі згідно Таблиці 6.
Кров збирали за добу до кожної імунізації і до зараження, а також у день убивання. Для 5 тварин з груп 1-5 на 34-й день визначали титри К5М-специфічних Ідс і титри К5М-специфічних нейтралізуючих антитіл за допомогою ЕГІЗА і РЕКМТ, відповідно.
На 34-й день, деяких мишей (Таблиця б) убивали шляхом ін'єкції летальної дози кетаміна- ксилазина і остаточно знекровлювали. Селезінки видаляли і готували для аналізу НБУ- специфічних відповідей Т-клітин за допомогою ЕЇ І5РОТ.
На 35-й день мишей, що залишилися (Таблиця 6), заражали 105 БУО К5МУ-А2 Через чотири дні після зараження мишей убивали летальною дозою кетаміна-ксилазина і остаточно знекровлювали. Після легеневого лаважа легені видаляли, а навантаження КЗМ аналізували
Зо методом бляшок і КТ-ДРСЕ Аналізували клітинну інфільтрацію і рівні цитокінів у рідині ВАГ.
Таблиця 6
План дослідження
Чисель- ож ни ПЕ кл Міли ТЕО
Ін'єкції ін'єкції | Шлях п. (день)! (День) 2 групи ін'єкцію (день) 1 тов р -.201345 | - 7.201343 | - 0 і 21 зов | ль 20і3 1 8.с. тбрю Главі 177 - 7.201343 | - ев 7.201343 | - 7 | 5 |Рня5М | 0 (т. | 5омкл | -ї,20,34і39 | 35 1; відносно першої імунізації 2; мишей заражали інтраназальним шляхом 105 БУО В5У-А2. Через чотири дні після зараження мишей знекровили і вбили під анестезією, а рідину ВАГ і легені зібрали для зразків. 8: у день 34, цих мишей убили, а селезінки аналізували за допомогою ЕГІ5РОТ.
Схема дослідження. Схема прижиттєвої фази наведена у Таблиці 7.
Таблиця 7
Схема дослідження частини | прижиттєвої фази
Процедури
Прибуття і розміщення мишей ВАЇ В/с у віварій, розподіл клітинних карток і виділення по 5 мишей на клітку 4 кліпування вух, дослідження за методом включення/виключення всіх мишей попереднє кровопускання у всіх мишей (пункція лицьової вени справа) 61111111 евведвння.///////ССС за остаточне кровопускання, вбивання і взяття зразків селезінки для клітин
В, Б,Б,нН, Кім за кровопускання у мишей, що залишилися (ретро-бульбарна пункція вени правого ока)
З 35 до 39 щоденна оцінка зовнішнього вигляду і маси тіла 39 остаточне кровопускання, вбивання і взяття зразків ВАГ і легенів у мишей, що залишилися 1; відносно дня 1-ої імунізації
Матеріали і методи
Експериментальні тварини. Самки мишей ВАЇ В/с.) К) (Н-24) у віці семи тижнів були одержані від дапміег (Коше де5 Спепе5 бесв5, Е-53940 І е Сепеві-Заїпі-ІбІє, Егапсе). У всіх мишей не було специфічних патогенів.
Утримання тварин. Дослідження проводили в кімнаті 117 віварію у баварському Могаїс-
Магііпогеїйй. Цей блок забезпечувався фільтрованим повітрям при температурі 20-24 С і відносній вологості від 40 95 до 70 95. Кімнату штучно освітлювали, чергуючи 14 годин світла і 10 годин темряви. Дослідження періоду акліматизації склало 15 днів. Тварин утримували у прозорих клітинах 5еаіІЗате" (Н Тетр ГІроїузиПоп| саде Туре І ЇЇ - Еиго «апаага), площею 530 см. Клітки закривали кришкою Н-Тетр беаІЗаїе"м. Клітки поміщали к систему ТЕСМІРІ А5Т-ІМС
Зеаібагє" із циркуляційним блоком 5 ІМ іпе", забезпечуючи кожну клітку окремо НЕРА- фільтром для повітря. Підстилку для тварин міняли раз на тиждень.
Дієта і випоювання. Миші були забезпечені вільним доступом до опроміненої підтримуючої дієти (З5МІБЕЕ К/М-Н, опромінені, М1534-727) і води (автоклавованої при 121 "С протягом 20
Хвилин).
Процедури попередньої обробки:
Ідентифікація тварин. Для того, щоб індивідуально помітити тварин у кожній клітці, проставляння клейма на вуха проводили згідно стандартних процедур.
Дослідження за методом включення/виключення. Дослідження за методом включення/виключення проводили згідно стандартних процедур.
Узяття проб крові для попереднього кровопускання. Зразки крові близько по 150 мкл були одержані пункцією лицьової вени відповідно до стандартних процедур. Зразки крові переносили в лабораторію для подальшої обробки відповідно до стандартних процедур.
Процедури обробки: Одержання і введення досліджуваних препаратів і препарату порівняння. Одержання і введення досліджуваних препаратів і препарату порівняння проводили у кабінеті класу І! мікробіологічної безпеки (НЕКАзаїес/сіає5 І їуре Н, Кепаго) згідно
Зо стандартних процедур. Коротко, для підшкірного введення рекомбінантні ММА розбавляли у
ТВ5 для одержання робочого розчину з концентрацією 2х108 ТСІЮво/мл. їх108 ТСІОво у 500 мкл ін'єктували підшкірно згідно стандартних процедур. По 500 мкл ТВ5 вводили підшкірно згідно стандартних процедур.
Одержання і введення вірусу К5М(А2). Флакон із К5М відтавали і використовували настільки швидко, наскільки це можливо через вірусну нестабільність (максимально 15 хвилин на льоду).
Вірус тримали на льоду весь час і використовували одразу для зараження анестезованих (ксилазином/кетаміном) тварин 100 мкл розчину нерозведеного вірусу інтраназальним шляхом згідно стандартних процедур.
Одержання і введення РІ-К5У: По 50 мкл РІ-К5М вводили внутрішньом'язово.
Пост-процедурні обробки:
Забір крові. Зразки крові (близько по 150 мкл) одержували шляхом ретро-бульбарної пункції або пункції лицьової вени (для подробиць див. Таблицю 7) згідно стандартних процедур. Зразки крові переносили у лабораторію для подальшої обробки відповідно до стандартних процедур.
Евтаназія. Миші одержали подвійну дозу кетаміна-ксилазина шляхом внутрішньочеревної ін'єкції, а евтаназію здійснювали шляхом перерізання аорти в черевній порожнині.
Видалення селезінок. Селезінки видаляли асептично. Їх поміщали в пробірки, наповнені середовищем згідно стандартних процедур. Ці пробірки вносили до віварію, а потім виносили згідно стандартних процедур.
Промивання легенів і видалення легенів. Рідину ВАГ збирали шляхом промивання легенів 4 рази 1 мл РВ5. Потім легені видаляли і миттєво заморожували у вигляді двох половинок у рідкому азоті для подальшого аналізу бляшок і екстракції РНК.
Аналіз:
Обробка зразків крові і зберігання сироваток. Після доставки в лабораторію зразки крові були оброблені у сироватку згідно стандартних процедур. Після одержання сироватку зберігали при -20 "С (ж 5 "С), доки не знадобиться для аналізу.
Аналіз титрів К5М-специфічних антитіл з сироваткових зразків. Загальні титри КБМ- специфічного дс ЕГІЗБА визначали у всіх сироваткових зразках, використовуючи модифікований набір ЕГІЗА (Зегіоп ЕІ ІЗА сіазвзіс, Сагаїюд Мо ЕЗК1130). Замість кон'югованого лужною фосфатазою антитіла до людського ДС, яке входить у набір, кон'юговане лужною фосфатазою козине антитіло до мишачого Ідс (Зегоїес саг 103004) використовували як
Зо вторинне антитіло.
Аналіз титрів К5М-специфічних нейтралізуючих антитіл із сироваткових зразків. Коротко, готували 2-кратні серійні розведення тестованої сироватки і визначену кількість БУО КМ додавали до сироваткового розведення. Після 185 хвилин інкубації при 36 "С (52 С) і 5 95 СО» (14195) його додавали у заздалегідь засіяні чашки, що містять клітини Веро. Через два дні чашки фіксували, імунозабарвлювали сумішшю К5МУ-специфічних антитіл і підраховували бляшки.
Аналіз КЗМ-специфічних клітинних імунних реакцій спленоцитів. КМ БЕ- і К5М М2- специфічні клітинні реакції визначали через два тижні після останньої імунізації шляхом повторного стимулювання спленоцитів специфічними пептидами, згідно стандартній методиці, і виявляли вивільнення ІЕМу із спленоцитів за допомогою аналізу ЕІ ІЗРОТ.
Метод аналізу ЕГІ5РОТ. Для аналізу ЕГІЗРОТ використовували Моизе ІЕМ-Сатта-Кії (ВО
Віозсіепсе5, Каталог Мо 551083). Цей аналіз проводили згідно інструкціям виробника. Коротко, планшети вкривали антитілом імунодефіциту за день до ізолювання спленоцитів. Після ізолювання клітини переносили у планшети ЕГІЗРОТ і стимулювали різними пептидами (див.
Таблицю 3) протягом 20 годин при 37 "С. Вироблення ІБЕМу виявляли, використовуючи детекторне антитіло. Планшети проявляли, використовуючи ВО" ЕГІБРОТ АЕС Зибрвігаіїє 5еї (ВО Віозсіепсе5, Каталог Мо 551951) згідно інструкціям виробника.
План стимулювання ЕГІ5РОТ. Всі умови були випробувані у двох повтореннях. Пептиди
В5БМУ-2 і К5У-5 (див. Таблицю 8) використовували у кінцевій концентрації 5 мкг/мл (1 мкг/лунку) для стимулювання 5х105 і 2,5х105 спленоцитів на лунку. ММА (контроль імунізації) використовували при множинному зараженні (МОЇ) 10 для стимуляції 5х105 їі 2,5х1095 спленоцитів на лунку, а конковалін А (СопА І|позитивний контроль)) використовували у кінцевій концентрації 0,5 мкг/мл для стимуляції 2,5х105 спленоцитів. Як негативний контроль 5х105 спленоцитів культивували лише у середовищі (КРМІ-1640, збагачена Сішатах, пеніциліном, стрептоміцином, 10 95 фетальною телячою сироваткою і 107 М В-меркаптоетанола).
Таблиця 8
А5У-специфічна стимуляція
Аналіз рідини ВАЇ:
Два зразки були одержані цитоспіновим центрифугуванням (800 обертів на хвилину, 5 хвилин) 100 мкл рідини ВАЇ. Зразки сушили протягом ночі, а потім забарвлювали. Зразки аналізували методом мікроскопії, щоб визначити відсоток еозинофілів і нейтрофілів. Потім центрифугували частину ВА, що залишилася (12000 обертів на хвилину 5 хвилин). Після підготовки, супернатанти ВАЇ зберігали при -20 С (- 5С) до аналізу. Рівні //-4 ії 1/-5 вимірювали у супернатанті ВА, використовуючи комерційно доступні набори ЕГІЗА (тії! 4
РІАТІМОМ ЕГІЗА від евіІО5СІЕМСЕ Са М" ВМ5613 і КЕАОМ-5ЕТ-5О МІІ/-5 ЕЕГ І5А від евіОзСІЕМСЕ Саї М" 88-7054-22).
Аналіз навантаження К5М у легенях
Навантаження К5М у зразках легенів визначали за допомогою методу бляшок К5М і КТ- аРСВ.
Метод бляшок КЗУ. Одну половину кожної з миттєво заморожених легенів гомогенізували у 1 мл холодного середовища із застосуванням французького преса (Середовище Голка, модифікована за способом Дульбекко, збагачена 7 96 фетальної телячою сироваткою). Після короткого центрифугування по дві пробірки кожного супернатанту титрували у двократних серійних розведеннях для вирощування моношарів клітин Веро у 48-лункових плоскодонних планшетах. Через шість днів моношари промивали і фіксували 1 96 формальдегідом. Через 24 години моношари забарвлювали 0,04 95 нейтральним червоним і підраховували бляшки.
В5М ВТ-ЯФРСЕ. По 100 мкл гомогенізованої тканини легенів тут же видаляли і виділяли РНК, використовуючи мінінабір КМеазу? від Оіадеп (Сайад Мо 74104). Реакцію зворотної транскрипції проводили, використовуючи великоємносний набір РНК-к-кДНК від Арріїєйд
Віозузіет5 (Саїаіюд Мо 4387406). РСК, специфічну до гена Г К5М, проводили у термоциклері з наступними параметрами: (1) 50 С протягом 2 хвилин; (2) 957 протягом 10 хвилин; (3) 45 циклів (15 секунд при 95 "С, 1 хвилина при 60 "С), використовуючи універсальний Мазхіег Міх для РСК від Арріїєа Віозуєтетв5 (Саїаіюд Мо 4352042) і суміші трьох праймерів: (1) праймер 1 (5'-
СпАА Сто дат атТА пат АСА АТО ТТ аСА-3" 5ЕО ІО МО: 36); (2) праймер 2 (5-ТТО АОС ТАТ
Коо) САТ ТТ СТО Таб САА Т-3" ЗЕО ІЮО МО: 37); і (3) зонд 6 (Х-ТТТ САА ССТ ато ТОА АСА ТТ
Са атт-3 (5ЕО ІО МО: 38). Число копій визначали за калібрувальною кривою плазмідного вектора РМІЗС202, що містить фрагмент гена І К5М. Подібні реакції для мишачого бета-актина використовували як внутрішні контролі для введення кКДНК, використовуючи МІС/МОВ -мічений зонд від Арріїей Віозуєіетвз (Сагаюд Мо 4351315).
Документування дослідження
Блок-схему прижиттєвої фази готували для збору всієї інформації протягом окремих етапів прижиттєвої фази. Крім того, інформацію, специфічну відносно мишей або клітки, записували на клітковій картці. Кліткові картки не розглядаються як вихідні дані дослідження, але є вимогою уряду Верхньої Баварії.
Блок-схему аналітичної фази готували для збору всієї інформації протягом окремих етапів аналітичної фази. Аналізи документували у спеціальних тестових записах або лабораторних журналах; перехресні посилання документували у блок-схемі аналітичної фази. Всю аналітичну документацію, у тому числі вихідні дані, передивлялися згідно стандартних процедур. Крім того, технічні паспорти для зразків сироватки готували згідно стандартних процедур.
Обробка даних. Необроблені дані переносили у відповідні ЕхсеІ-файли для подальшого аналізу згідно стандартних процедур.
ЕГІЗА. Середні значення ОО і стандартні помилки середнього розраховували за допомогою
Ехсеї.
РЕМТ. Бляшки перенесли у макро для підрахунку титру РЕМТ згідно стандартних процедур.
ЕПІЗРОТ. Планшети ЕЇІЗРОТ зчитували СТІ -рідером згідно інструкціям виробника.
Кількість плямоутворюючих клітин (ЗЕС) визначали у кожній лунці і заносили в ЕхсеІ-файл для подальшої оцінки. З інкубації з 5х105 і 2,5х105 клітин на лунку, кількість плям на 1х106 спленоцитів підраховували у кожній лунці. Розраховували середнє для негативного контролю і віднімали з кожного окремого значення перед обчисленням середнього значення на мишу для одержання значення індексу стимуляції (5І) (пептид-специфічна частота ІЕЄМ-вивільняючих спленоцитів) із розрахунку на мишу.
Для пептидної стимуляції, ЗІ одержували з лунок з 5х105 і 2,5х105 клітин, окрім випадків, коли плям було надто багато, щоб підрахувати, або Е5У-імунізованих тварин. У цих випадках використовували лише концентрацію 2,5х105. Для стимуляції ММА-ВМ 51 одержували з лунок з
Бх105, окрім випадків, коли плям було надто багато, щоб підрахувати. У такому разі використовували концентрацію 2,5х105. Після визначення 5І для окремих тварин, середнє 51і (ЗЕС на 1х1056 спленоцитів) і стандартну помилку середнього (БЕМ) розраховували для кожної групи.
Метод бляшок РМ. Кількість бляшок підраховували у лунці з трьома найвищими обчислюваними розведеннями вірусу. Середню кількість бляшок, регульовану фактором розведення, потім множили на 10, щоб одержати титр розчину у БУО/мл, і, нарешті, множили на 2, щоб одержати титр на кожну легеню.
В5М ВТ-ЯРСВ. РСВ-ампліфікації вимірювали у режимі реального часу, використовуючи АВІ 7500 від Арріїєй Віозузіет5 (Сайарюд Мо 4351107) і аналізували, використовуючи системне програмне забезпечення, що поставляється Арріїей Віозузіетв. Усі значення порівнювали з І - генним стандартом і нормували до визначення мишачого бета-актина для кожного зразка.
Цитокіни ЕГІ5А. Концентрації цитокінів визначали за калібрувальною кривою відповідного набору ЕГІЗА.
Результати
Аналіз гуморальної імунної відповіді:
Для обох відповідей - НеМ-специфічного 50 (ЕГІЗА, Фігура 13) ії КЕ5М-специфічного нейтралізуючого антитіла (РЕМТ, Фігура 14) - ми не спостерігали яких-небудь відмінностей між трьома конструктами (ММА-"7ВМ1998, ММА-пвМ2018 і ММА-тВМ294А)
Аналіз клітинної імунної відповіді:
Як і очікувалося, ММА-птВМ294А мав подібний характер Т-клітинної відповіді, що і ММА- твМ2018 (Фігура 15), викликаючи як Е, так і М2 специфічні відповіді, домінувала М2 Т-клітинна відповідь. На протилежність цьому, лише ММА-пВМ1998 викликав Е-специфічну відповідь, але
Зо на більш високому рівні, ніж ММА-птВМ2018 і ММА-тВМ294А.
Аналіз навантаження К5М у легенях:
В5М-зараження штамом А2 КЗМ. Мишей заражали інтраназально 105 БУО КЗМ(А2) через два тижні після останньої імунізації. Через чотири дні після зараження мишей убивали. Після промивання легенів ї мл РВ5 легені видаляли, а навантаження К5М у легенях визначали методом бляшок і КТ-ДРСВ, проведеними як описано вище.
Навантаження К5М, виміряне методом бляшок. Через чотири дні після імунізації у середньому було визначено 29842 БУО на легеню не імунізованих мишей (Фігура 16). Як і в
ВА5М-імунізованої контрольної групи, не були виявлені бляшки А2 К5М у легенях тварин, імунізованих ММА-тВМ1998, ММА-тВМ2018 або ММА-тВМ294А після 2 підшкірних введень.
Навантаження КБУ, виміряна КТ-ДРСК в режимі реального часу. Навантаження К5М у легенях також аналізували за допомогою КТ-4РСК (Фігура 17). Тоді як Е5М не був виявлений методом бляшок в будь-якої з вакцинованих мишей, геноми К5М ще виявлялися у мишей, імунізованих підшкірно двічі ММА-пВМ1998, ММА-тВМ2018 або ММА-тпВМ294А. Для ММА- твВМ1998, навантаження К5М було у 45 разів нижче у порівнянні з контрольною групою ТВ5.
Геноми К5М також виявлялися для ММА-пВМ2018 і ММА-птВМ294А, але навантаження було сильно знижене у порівнянні з ММА-тпВМ1998, у 416 разів і у 281 раз нижче у порівнянні з контрольною групою ТВ5, відповідно.
Аналіз ознак підвищеного захворювання
На відміну від партії РІ-К5М, що використовувалась в експериментах, описаних у Прикладі 3, нова партія, що використовувалась у цьому дослідженні, не показала якого-небудь підвищення продукування ІІ -4 або 1-5. Проте, ми змогли з цією партією виявити інфільтрації еозинофілів і нейтрофілів у рідині ВАЇ, що є основною ознакою підвищеного захворювання для РІ-ВБУ.
Жодних ознак підвищених захворювань не було виявлено для ММА-тВМ1998, ММА-тВМ2018 і
МУА-твМ294А.
Обговорення і висновки
Не дивлячись на відмінності між ММА-тпВМ294А (еквівалент ММА-тпВМ2948) і ММА- твМ2018, обидва індукували аналогічні В- і Т-клітинні реакції і надавали аналогічний захист, не викликаючи підвищеного захворювання. Обидва конструкти викликали кращий захист, ніж ММА- тВМ199В, який експресує лише антигенні детермінанти мембранних глікопротеїнів (Е і 5).
Інші варіанти реалізації винаходу будуть очевидні для фахівців у цій галузі з розгляду опису і практичного застосування винаходу, розкритого у цьому документі. Передбачається, що опис і приклади слід розглядати лише як ІЛЮСстративні, а дійсний обсяг і суть винаходу вказані у наступній формулі винаходу. сСИНСОК ПОСЛІДОВНЕ «Аз Вахтаківв Мох АЛЕ «150» БАКПЯНА РЕКОМВІНВиТНОгО МОДВІКОВАНОГгО ВБІБУСУ БІСПОВАКНИМНИ АНКАРА
СМУВЕ РЕСПІВАТОВНОСВМНЦИТІВЛЬНОКО ВІВЖУСУ ВМ
«іп ВМІЗаатрРСВ с дж Не понз саун
ОК я не пре ЗиЗУИ «іх ар «ЕВ» пе о ББЄТВ, ЗЕ? «Іі піде еі «ЗВО» Б 15005538. «Ех апа еаеО «БО» 45 сії Бабевпеівй Узква З, кві ії «шіїз я «Вій» ДНК «гій» Пюдський спеспіратовно- синцитізльний віпуУЄ ЇБВЯУР, штам де «МН 1 ацресчаоа зсзазувсоса зсодассдес заезЗаосссточ заедозосу пове шока
БО заствостоас кЗсосасса газостоссвоа сесвзатекза зоссованес сзреосаЗ їж зксозссоседа зчозессвузе сзковксахс вазсассачес сзасстакезе «сассвЕсако я хх щи кЕбаксстєса зчодчесавоса сазачезасх сссзссасаз сстаксахосв зцчасуснаси
З бспосзааскз вдазаласскаве «боса, пиЗалисазз зиссссаУ щчоачкаксаце стссаззсвесс ссазссвзаб сахсаускач ззсвозвеса Кескоеево оси СОСЕ
ЗБ судити сестер сумом десант дераатЄвяс венах за зоссзоцесне зозалессае свссзашевоа вчасаравсвз звчссоссовкс сеажоссває
ЗО засоазсоккее зсмихМрваочЕ Зсссзастсо зоещоссмаса зсавкссзс савсваасоссе ха зсстчЕх ся сезксктчсаа Зевс васвазаазс созасзазав азсевсавосє о зачсстасеса зам еєкво сстузаавеї зесваслчавмі зососавцес спазцаесвсо о ззвізосчазя зучезоссаве свесвазссс вссозвоазаас ссассасав свассвосавУ по
КИ ассазеаквос сапсвсосе зссоавеесвосс авсассамр ссеалессчя зЗссувсаав з вк вач ре крана ри ув орви КО, х шо ЕЕ шогж у: спеласнцуззва ссісссзовоа сна овус Зачачевасс стаз во сс оо ща
Ввссвспссссу ГУК! Бас СЕ Са ХХ Іа ана Вис сах З С Ко
ВУ
М ра вії» ЗВ
СД ВчНЬЯ ЖІ зичу
М шІлЛИОК ту лм ВАЛІЗУ пох Ж кЕїй» ПВЯУ штам БУ бо бе тик "Зенео Жочихе Я г оч ох п Ж от Зк ех з до ТЕ
Мек 5ег гтуа Вей Був бар» сів де Ткк діз губ ТВх їз бій Вк ТЕ 13 5 ТО ї5 пос: я ШК Тодхуч 11 КУ Я ке тк ЛЬ Ше итде. у хижа Ж хх Ук Ж
Ткр вар о Тнх їес Ай Ніж йо Гн. Вбе їі Бех бвх Су їм о ТУуК БУВ -х їх В КТК а т ЗО
За ж «чук бю 35 3 Ст ую Кам м т акуєї бом Б ку Жмн В хо йод їен Ав ев БУ ех Уві Віз бів о їів Те Бей беї Їіз Бе) йіз Мех че їй к
З5 45 5 ж. з НЯ хо бриф Ж жо б ше Ті щ с С ьше сода Ж сука Ж же ба
Хі ї1іє вк Ве беж без Ті Ті зів діа Тіє бів бе ї15 дів беж
БІ 5 щі х, фшти Я хо оду. Ко фія жу М скік 51 как и Я га . З лька ків дво Мія Буз УА Тв хо Те о ТВу дів Тіє ї3фе пів Блю дів їВЕ ще сх зе ща зв ТВ ЕВ с с жі КУ - не Ме ч ри МК Ум ку: ЧОН Я си Аж хМвХх ЗА їів був дае тах тТВвх Без ЖБВЕ Тук З; Тв ЗіЗ вшйх ЕЖа АВ їдмз сі Хі бер Без ЯевЕ дви Без сек ів їіє ТВх деж бій бі ТЕ чи тях т со КМ ТА рих кни Не т ха її Уидоу ббЖіоюх ЗУ ю 0 пр ху ХА Ж хв ж У ХЕ за Хек їх ів рем діз зех тТпХ ЖОу вЕЗ Бі Уві Буш Бех їж Бей Біб жеЖ 115 12 їі55 сного УМ ож ж ше щ йог хр. х. Фора Зо Зх ком як Ко мк сум їх тк УЯМ Був ТВ ву Вщп ОїЇВЕ ТМнх Тв тТвЕ Бі» ТБЕ біз вЖОа дах
Мах Ва
Мч дк фа тя ух топку «лк п со Еожк яки и КЧН Ж но жу що їв ХО жНЕ Тв цу бій Зх біз Аввро їв БО Бі дек Бе БЖа дав «ах Ж их р
М 155 15 жо М хх жк Зуег С їі мк: - Тан 73 0 йжк Ковш і ТЕху г дви Мав Ве ні спе піз Уа) Бе Аза обу Зах хо Су шах Ті Сув их СКечА "Ух їЕУ ут УТ роя Ж 20 пу УМ ух джує й з їж. Я орхоз о Вех БУВ ве ШИШКУ НН ех дви Ави БЕжо Зрж Су ТЕБ А1із ї3е Су Був ху ї3е хз АЛЕ СБуш сяк же чі 150 НЕ їз прот. Крачух й Ж ат її хх фе сбжку ку ї їх с Жах Жовтих лучех ЛИЖ я тожя мув Без сіу був Буд ТНЖ ТвВх Таж бе КжОо ЖЕ Був Був БЕЗ тТвЖж Ту
Зк кобю т
МКУ КУ М боках Мі е Сбхююує баки о лкх лугу жи Тов усе Я у СА хто х їж Я ее Ж ожу --к
Був тТВвХ ТВ БУВ Пуз дар оВже уз Без сію тв Тв Буя йвек бе 5) сем, то склу
КАЄ Може ЯУ си п ож у вн сте ЗЕя же. 5 кожух її У їх - Кт я. КЗ Ме тек чаї вже Так обме Був БгОо ТЕ по» бій жо ТВ ів в тТВвЕ жважх о бУЗ ге бат ЕК заг
Ко ж а чі ее ей ку ши хм 1 я й Зх Рідке чи Сов кожи М каяч Й Я ож
ТвВу дви щі хе ТвжЖ Тв Гео бео ТБ ех бви Тк Твк обі Важ Вже и ше ШУ ВИМ т. Ж не дну й Уха Ж ЕЕ ре кю сх кожух соч сід ів ТВЖ йех бів Меї сій ТМЕ о бре Нів Зв ТБ бек Бек Ба бу се 77, Є ї:
Мох зе Ми же Ук ша її шоу п аю ее Я ую беж аа її
Аа о рко Беж ВкО бек п ов) дек їв ЖВЕ Беж пів ТУЮ Бе Бех ів чи К; ; єКшЕх, ав швУ
Шк да ек тіж М жк уУ Щит у С ж
Вхо бер Бек ко бра двох рез ко
СЕК с чех З
КК в кЕі» 75
Коен пт сах ДЕК
УКВ МІУ зво ТЗ «83» ВИиБУ штам Ал чхасОо» ї воззааское Бчасоссев споссавсчеє зсассвиав Коса сосок каси ксзося зЧедуссацаа свісвісхна зЗазбкскоос зуздизоске свзщсЗсооЕЗ 4 ши «зсвазоццее зсесавоашас ссічатввсс зассчцоївоз вес саесезкочах
З я клен» у КУ А БУ санек вим ка ни а Че тей кре ці хе Же вики ми пе МАВ Ви УК имя ЕХ голе й ех Ух кушкихсаном Мсезазиачеаа хезвсгкчсех зЗиеасСсчасо Козача цоевиоЗВа ед
ОМ т іч оп ие леузик ж и сли ша тут кі щи Уч ях фот мира ур ух 200 як и ск у твозавскод всашуєасва зсевсусеоо еко весссокеевЕ Зовекосакє псодссасся вевзософус свзаввчесчав свупссса баба ззева сасаесовас за щи звозоссазав зузосавеУє сессссазвус задаззсзза апозосзчо сосоцох шещекчсУсе соц саасає саккомивиє фас васоЗ су севаЧах Зецевошея «Д ззвсчсчава поваесавчве севтавакчос сезшекокосса сззавозазюв сЗзОКчКоє за шу яка у же ва, т зи а НН -- шо о бю хв у у шо ен о стзвасав чо поса ассва засо зссосузацзав севоевБоЗао зазсазческе кесссвксОє савовзавЗовоа ацевосаоса Ббовзпсаасвх свое заоасаускис кессевкеє дфеавсвааєвт аще Де Зисероваснях кре а
БИ та цезачесеца севаесекеа зсжеасстас акзскзвоста аозБцечани песто
ЕД
Б сх ке си Фо ит ка ую їх зи й кс хх сао УЖ мн ие ЧИ вч зссказвксвсою сзКссвесви сеавосассеад зазавасосе со свасва сзкосвове ца шочосчсавих здачі еасва пессасувас ассвісвзваз аазувочичс заисЕаочеа
НН засади цс ссскпЕвоза ства атосає авось за естев сао
ЗЕ
«сус зсасса ссазсасавз ззезшивВає заскакисеосє бузамосчех кекс заз ех кчосаседсу зсласзесоЗ сазсозУса Ес сссає «засо аєс зе
НН севчадеваес «часа оа совсвосаті заипаческов сосок с соваассаве
ВІЗ ссзсзсаася косасассве Сазсссозвва свсзаскзса завссзксяІ глссвЗацаси 1550 паси ссв чсадееє сасоссссса ззсоссвосо сЗзСсосеа опо їв авукоасасс соезочснахаз Заасасваув зесвсоваоа секс саа севскоєза зл 1386
КвсчізЗЕсска зтаваєсцсвае чЧаасвссзкоа бесасозчосва звсвоесава стаз задово зсвааааос чЧезоцсзава сосен гсассааськ ксасувеосо
НЕ
БощиЕчЕссх мовосчасуа зЗЕксдасзис чав озчсс вових асса перо
НЕ сазечесеце сссссаховз завувпоччс зазоссосо зсевсзова сзсзЗасвау при
ЗБ азевосвева ясжновіаВи імКнжносмако вковтозоза сеча собаці сирі
ЕМ дже шик екон и ке ак в теж у ру ри усу ид ум лю пику хх я ня ЧИ стчассцевЯ печчУсссКЕ посчтассак зацзессочка шозссоскУє павоешиоУвою ї585 ввичексащше сао сах свасаакзКкє зоскісКсоса вся дек 1755 «Вій» 4 ол, ам ка З'Я «вій» БІЧОВ.
Сеча УК з. КУ «ХА» ВЕЗУ штам йх кат «ще 4 я їм: їв гор тіж їй ток й жено жів жів Же Як Тім бі жу
Ме: січ їж дей їі БЦ Був Вів Аж біз Ті Тв Тк ї3Зіз ее ТВу
З Ех зх, у 1 ве 16 15 1 ха бю ба їз ВБфіох Вл бе б ух ж тк вах вх ва 5 ри Зк із Уві ХХ Рое Суб БВ ді век БУ Зі Аве Ті ТЕ бАіМ Бі рве з МЕ З
Хріхі МЛ сек ож сеча бів ВЗ 425 бдмжо ТТ ахшо МК и бігу хе бе ж жо ЖК тк ша щех ТпПЕ Сув Бек дія УВА Бех був бау Тук во Бех Віа Бев ї5 чО ях йоги Сп о ЖК кг М жу Ме е В со пах її т ок Ше ОН Кен тоже б сх дтч тТвЕ і ТтТкр о тТуУєЄ ТБх Бек Уві Кіє ТЕ Лів бі їіше ВБу 8Зви Ії
ЗИ 5 а таз їі Ле те ОКХ г ЗІ тя В і Ух т тах У ках ех зу маш АВ щу МА Ват чи їм де волів іш тв Муз хек Їх Був сг Уже ек че ек ще 15 ЕН и НИ НН керма да ан с и НН а А . бітів зво дв о Ббуз Тк У Вп віз Маї ТаХ б3м Та й бер еу
Зх Го и. ко см їжа В ча с, Є Поки Час ЕЕ З пух мас бів чек Зп БЕО Віз УВК Аза Ав лу із джхЗ люЕЗ бів бео Вже чих З Уц з
НН 1,5 115 бач У су жо бе Ск жу у йоги и же Ж ххх 3. Щоуза ПЕ. вра
Акт Бе Меб деп о Тух ТВЕ їжа два о без йфа Бе о птш ЗМ дз о Ззі ТВЕ «як док чек 135 їх їх
Жук В кож жі зх у ун - мо дам В т ХІДю ие Томи ТУ еко Храм Ж ох кож У кт с
Ммви шек БУувБ Був Мк ЗУБ Ат дкО Бе іфма пі Бтве іні Жаемз3 біу Уаї а ззщц БИК їз їз 143 ка би ше тів КЗ божу ка Ух сонне, и ин АН З УНН не НН А біт йех Віз Тіе дів Хек бі бат Віз Узі пек був Мі їн ія їж 3 яко лек со 3 Їж 155 185
Фі дт г г Журн ри: тоже бурж ВІ Жах том Мен -е доп піз ці пів ЗМаз вав Вуз Тіє був бек Віз їз Цео бек ТБх вай був хх отв ск ьоя хі їв зу г уж Зозу сл ж іх у Ї Н ет Ше Тозекх Ж З
Вів тузі УЗА БОЖЕ Її: Жех Аз сі Ма) йех Уві зе їх хек бжж Уді г хе хе іще їх їзЗе
Ж ше шану Х КЯ Козкко Мох Ул й сх дян як. Б Зош Ж ошрух Бе - ие ча жто ме вв о їе Бу з тУК їі Бер ому Ша їв; ба БЕб (ле тва дао «кп ср и ее Я
АМО Р «АТ
Х ках ЖЖ та Ус дамо бах ах Жах та Е сх Ум Ак ж Ук їУуш БІВ Щек сСув Беє тіж ех йвпо ті фіз; тТБж тТаї бів ско Бе Філ
Уа їх ж Кк БК
В ВА ем
Ел. її ща ох о и а ьо ен На Ура божих КТ иа і Ше Я у щіз Був ди Алп ода цео ев о сій ї3е ТЕ Аха ЗБ» Ре пех Уві до чути зав Ка кдх
Ка КУ ха5 М лож Ух Ше Є о Ух ЗУ ук бю Се У Я Ух ст Марк 2 вів Баш Уві Си пе о Бжс Уві Зек їМг о Зетж МеЄ Сев тах деалоБех МИ ак шк Мк о я х є. КЕ до. Ку їх кеш Кк г й Ж ж І голок. їви цес Щек Бем Хі бе аю Мес ре іє ТОК дей Авробоп Бу Буз у тек де ух
ВЖЕ ЕС ТИ жо й ско о З ши їз Ох чи чн чи она НК о уж бе ує о жу іо Ме бес Аза дво Уві Зіп Тіз тваі хз біп зій ех ТУук Зех Кі хе кг зак шт й РКО зх ко бе т хх Жана ух щих СОТ дм лу ку Кк ке ВШ за ень Я Трек мех ве ів Сів був сіб бій бтаї беб йдіз ТУ Тв чаї сій їм Ба
БЖ г лх жо М 3 те Мжнеж З гу гу КЕ Ж ее Ст у Укр ле Жде ї ' ж че Кк ух
Бем ожхух жауУ УА 53 Ав тах РКО СУ ТІ ув бе Нв ТАЄ вх рКо
БежУКеЯ вух ек лревек 5 ЗІ 35 КУ
Ж бука бю бл че Е кує Ж кукі и и Жов фо ч собу Т їх УМ г. де
Мен СУ тв ТВО ВО їх Ба ам ці Бек бо їіє Су іжнх ТвЕ ДКЗ а за чле 5 33 335 тпх 5 ех с І УЮ РЕК й, 5 Ме т ж Те Ж КУ. ре т с
Її Взв жа спі Тхв Тех Су Бар ода Лів ЗіУу ех Узі беж Вре Бе 353 335 БК
Хе жі з тавра їчатє Жах Хр зе Мр хх Тк т нь шок ШЬ я
КЕ зап впав ша ж Бу Ту т7зі бій бах Вл вх З ча ба я ав поле ко ек Ви їх му сх вч шт. с хх схе Ж сви що їх Ме взпойес Бев тТвх без Вже) дес цпієя Уві зв Без Сух дв оУві чу тд кв
ЗО ЗТ Зо а зЧткі: Кчу оку бла Му ско й ов а б бу Жах ж 3вв'сАв вВме Ав вхо був Тугє бар осСуУув Був Кі Же ТЕ дек був ТВХ аз Кф гм Фа ах Кт С юку, У шик Ж уз Зх я льше Я Фо жк зво Ущі Щек щек дек УА їі ТВк бек ем 01у із її Уві бек Сув гук щ :
ЗО 315 315
Зо УЗ ку боже МОМ к о Ж ках гаю Ми М хо лу тк дж Мох ж хх То У їтУх Біт Му ТКЕ Бу Су ТБ Біз Хек Ази уз дав Аку ШУ її їів ях з ЗЕ зак чаї 35
Ко. ЕК ние, і г: ке ск Жов. каси сх 3 Яку ск йощшу Ховк УАДУ ее КХ
Муз Енжх Кіз Шекх Яви слу СУш Аве оТУюК Ува Мак Ази Був з3АЖ Мей АЗо
ЕК ча 5 вч нь КЗ о -3 и Ме Тбазжо Кам їх «с Хна їж Ж хх
Тве Уві Беж тв)і сі ВапоТвт о Зе) Тук ТУх Уві бай цу піп ші зку
БУК аз ай
Х зх Хікзя З Уха яким а т охн ІЙї хе 1: тку Я хз їх «ОМ Зркзче Ше
Ммув ХзЕ Бей Тук УВА цу ЗМ Біб Бгз їЮе їі Азкй РБе ТУєЄ ВзшО рКо
Я й о «5
СЕ: 375 що я аемх й і З ухил з а сх У ек М Бо х сх ау зх з інча хі Бе Рго цех аз» бін Ве о вор о віз Зех ів ер БА УВА деп 485 ща Ве пк Жак іх БУ т Фах ост ух Жак: у: поко гонику жа НН ША інв мЗв їі босом дек Тех Аза Не їі ет їжа чек й Аях це дю ке що ох 0 БІК ЖИ 1: ЖК сг ях ха ашут ЩО тла бле бра Мр; бує Ше т Мекко й віх їх Віз Бей Уві Ази біз Щ1У Був бек ТЕЖ ТВЕ бвв о Ї)е Ме ді ТВЕ тож шо Кк
ША ЗМ НУ
ЗК их т Ж ве ВОДО жу Кк У т нс Хиа х як тк ех ст «УА
ЇВЖ ТЇїв ТЗ ї1іе ті їзв Хі) чаї їі їм о їеб Бех їж ї11і8з та щі
УМ 43 ге ка ЗИ У Зах тка Т.х. оз жи Фев «о Жнхи З пе бак З ік їз Бе) зи ЖУК Куз був вів джкч Беж ТА Бкоа УФ ТвЕ Ки де хай з ЗЕ ЗБ
Жак У о. тах Жду їй ж ЖК Хсзюч В вх с ч ЄУкхла бе па
Був Ар біб мні. Мек сі ХЕев вв дяв бі вія ке БЕ АВ шк щ кох
ЗЕ УТ
«ПЕ 5 зе КОТ а
Ж чсж» у каїЕ» РІКУ мВ ун ев АНЕ
КЕ е МУЗ ЖКЕ пику якою пчоуж уж «Же ВЕЖУ штам АЗБЕТНІ «ап й деки пт фо кх пан а а чн і зівзаасте созкосозазз сессзасусе взісасовсна осо сзсаВОоє ех
КО касети чат свегстатоезОМ пази аЇсе асовазоссткя хЗзоІ«чсЕ
З гу За З Ж я ї АК 122 1 жкзнзаЗик аск хн сова паста споссчечаї сассассова іца стізесовася сСсззаоваза сзезчусосавс сзсвскховосс ссаававокчає стос ср «М утсветехоз сю ев мг щевИ их ее и ЕН п о ЕН м М оо ох ке ик и ие сасдоваскочє фсааосвновиа семасцює Е з зпочзажоїчиє вах «екс чозасаеє
КВ
ЖМК зом сецесв зов ссзо сздазовоа спос хз зазива свозоссзао
ЗО а о о стелю юку пу М У Єжи у у жи 0 Зх гу а с гу у семи тхчиу оо рухах свуврви У М В звсавссвзав зчассваує дфаепсоскоазє зазеазсзча засос сов
ЕІ: пп чн на чан В, чн чи а цу мит аа ву и чи оч у чн ух пече бозосаакае саксасосвЯс зесеечека сСубскавяВх шк
ШОЮ, що чЧтазцесовач сззаслаазчає слазазсоофсс сооссзсса ссаасавцчє сусп
Б оо а я НН а и ВН а о НА о о НН ку тн шт щи це зер тузастсавсо попе зе чассвах ззочзчсК сої сезоВОсУо авазсвасксс сасосакоЗ завсазосат зосбоассзаа ссазевасаї соуваавсва вк акочацексс засво сеавссио сетосоваеов соч са оаво
І: чека совессосзЕ Чеосвсстаєс асесквассв зосжчечаче: соєву
ТвИ зве акірщичя Море керів Зо ков ое кі оте ви Фу дк ро ях зксеазсчаса сасесаКсак савасоасохня зкжанаєсевВ ковоасавона сага вай тай сечу к ові и" щук Ух секр цилк ми и хх сотки ет 0 клучу дю теж в и йоасусчсечс возвесівсав сакоЗзсаезо зісжікезеу звопазаецов чок цоакацчеках сессзкасе сукоаксоває зососсоссзек дФааацесщєв свосаосоє
Зв сеча ахка стаасесавае «чашках звсзБобаЄо засесеає суасащае
І я качЕВзссзса всазвсоцосо свчочещосв есе сово вчопоссецчас зідезвао чем
АК сзоззозасс Фріске сон освВКа ас тоза сссіцосскос сезадісаво «3 кт 514 пспсчсаевоз Зоазасаксое сзвосссваоа квозасісса зозоовкавВ: Ккосавовое тавочсаксса чоеЗесиВе засво сосеа зчоецоссах бокс сва сеча дах
ХХ зачиЗсессЗ стачсввоза чЧезсадциЗсла Взксассвасв осені секс е 1328 схил бзсзкзессв «ач ФоазЗосзосаса гссзсззаса зсзвосзосза совозсзвак «ах зешЕ звосаавоа ссвазачссо сФевозчсззва засос са кеазбозаєье созочасосю сей ги "дону зх С ев жі ии Мері и ов пусту в В пд овече м І М ховав сказ сск созусувоза зссозасзсс засассевзес зозбсозасув Завсабсавао
ЗЕМ
ЗО свлавоссооа секісвзкосви зевузусдао засос с зоваїзезаа сссооцсаао ів зчсавспасва зсзесаєзчакх саспзоссаєЄе зесассвсаз ссзвекзкчах соссзсеаце 16585 «сечатсюеся Коцосекасх зскзкассое взазассезса зезеокабаух засесевех нина ен НМ мн нн м ко в км и в п М В лк
ЯМ азазвісвас сСзсссЗзазсах сзвасзакакс Ческксссов асо сих ї ї а З «Ех в «із УТА
Ко НЕх хх - «ж щБЕлОоє ет уя АХ вес нн г «Вій ЗВБУ штам АЗОВ «МИ» в су Как ми зал Ж су ВОЗ хо Ж і. зок сяк ку з Жокуж Як
Мак обін Бей Бко ів їз СУув Аія Ава Аза Тів Тв ТВ" Лів їв Аж ї 5 та ї5
ШУ а: у я сах. з тож В се св бе 7 ях Тр ке ВН її «бух длв ові ТОВх Бе Сез ББе діа вк бе 51їжв два ТР твх іа пів бе пог ее де ка а Б ткеає КІ Сію фо ку жилих Ве ХК Фк т КЗ я ко Жак Кум у. з ее
Ту піп пех Тож Сув жк Віз ті бек обуз Пі Тух їх: Бех Вів дм й ї он У Фк Ж хо ду їх жо З ШЕ ше и їм КАШ щи ЯК
Зха Тв сі Тер о ТУжЖ ТКх бдех ТЗ її Те їі біб ої беж ва Ті
За 5 У божу м го б со жахоз Му з хх тіж шик хе ку «ак з хг х Ж вх
Гуз біч йзп Оу Сувз Ям пз ТВХ Аз ліз Ббуз Уаі бта БеО Ті Дух
Гея сет БА соку еВ 1 за м 21 31 Та т тиєхаж бок, шу тк їх бок Ку т тах
Сай ав обжиа ВВЕ па УЖ Би Аа вів у ТВ пає лез мі ЯКО сяМа я КТ Зо че же, жосу и ех го жжуми Ж я З а я су ку ож ск ще з АН Я СИ
Мак осів за ТБЕ Кто Аз дія аа ва Ак Віз Ако вкч піз беб Бке 155 155 115
Щек й ЖЕ лиж см зе ках хе Вк -. У че ще сто ши Ж Зк
Ато Бае Меб лю тТуХ ТМНЕ їз Аза вай ТБх Бу Був ТК двО УвВе ТВЕ хх 4 р «ув 115 Ухо ЇЖУ
Хо хх г, УШШ Що Тука Кеяке му ЩІ ох ТУ лк: жо ет тт вх х зви бек бу Муз Ат був Ах Вт Бе їх пі Бе без зїма діт тах 3 г ях ах її 155 їі рен ник нн и Я пам нич и на чи шплу ех Аза Ті біз йех Зі Їів Вів Уві дех Був Уаі ем Мія БЕщ за5 З ж тва ЗЕ
А ММ АЖ ВМ
Я ях со ду Б да ї с жа Ж лу чех т Е хз ях я - те ; чле ів щі я БА ча дат МУ НУ Ву ЕЕ дів їі ін 5 ТІ дав НЯ ча, хх зт 155 Мо іт оо ж тя 0 каду т шия бик же х ож у Схожа Ха гос Жук В коток «і зів Мах Уві Зшек Без ех й спів Уві Мах МзЕ Бем тп Бех ьУе Уві
Мне 35 М тн Вх Ж хе К Маю Жах що Жак йт я бах: Зам Шк Тк ха 5
Вам ойзв Ме) Бе Аз о їк Хі Аа Був ав ін і БКко ее ув» Ав се сво тк їз в Ж тіж і жд тк жі дже ква тіщ и я а тТіш мів па мів
Був Бі Беж Сув Акта іє беж Дав Ті бів Тв Мі Ті пів рве бів 21 ві 8 й як жи ж дея ех там т 7334 За жі м о ух 0 5 М бат тк 5ів Бу дав Вав дж Мен о зез 53іш їз ТВх вже сКм о ваеБ ех УК вай ех тртрр плющ, заг
СЕ АХ Зх «и зх віче хв ик аю Ве г- ху ж Мети т «Ж А То пох дилєк «о там вів Уаї їлу їВх Ехо Удль Бех Жвх жЖжЖ Мек ії) тах деп яеЖ І
Жах: її я хг тару Ж Фо жом Х ке бло Зно. Мо: ху а на ЕН
Бу о Бец бек Без їів дп Ав о Веї РБко їі ТБЕ Аз» дар Біб вуз Був «кх "зу тучиху
МИ 255 і и ч у Коха я Є АН ям Се щчдИ - ки сл КІ Мк уж же жи їхніх Мег сек йап ойав Уві біз їїів Узі дес; бій бій Зах Тут Бех Тіш «з ц ярих ту ші «ВО ех у не ШИ Так ко Ж я КОЖ окуня ле їх їі щї 2 т сУут кас
Ме бек зі їів був Бі Бін Уві Бей бів Тук Заі УА Ба Ме БЕ са лих дит
ЗО ях 320
Хот Тихе шт а У іх сю Ві Ж Км сю Ж она Ж ож 35 кру нах Жіик ви їж Фом Узі Тіз АБ ТВпх хо Се їх бух бео Ні жВву Зек БЕЗ тд, рр тк г 310 315 КЗ оку бе ім є Й син НН М НВ гони у НК я у их о Х сх пруюю ас от зви; осСУуж ТВвх Тк йно ТвВх був біз пі ех йво хі Су ев ТВБЖ вед за КТЗ а
Мт Моне Моє Ж хх бер ХВішио ско Ваз Мат 3 шо 02: Мою В бавуї М Ве
ТЕ Авр Акч оіУу ТІр Тук Сую Ах дав Азія ЗА бек Уві ет Бе РБе 4 За З рює Сг КІ тя їх ух Ж ку Ж ж й Соч їх Яни же КУ їз ех вхо Бій Аіва Біб УвЗЕ Сув був Уві Біб ех два дез Уа КВе був БВ чик дет зи
АВ зв зи зош в НК НН НС зачекати женя Жах Хзакмо ож дк
Ук меж лав Зег Бен ЇВЕ Без в ех ів Узі АБ Бей СУв Аза таз перех днк щи
Зо 375 зна
Ми бл КЕ йо ке Жозе о бах окт ух Ж ска Т В шо «оба Ж юс: ох ке во обл Ва Ав о БкОМ Без Туює Аяю су Мт 136 Ме ТЕ Бак Був ТВЕ
У дк Заг Уч до, ах
Зх Зо Ка ЕІ - тк, я - «о Жжрдч 5 ЖЕ пл «аа ж щ- Фк а че ги й Кз.
ВЗвв заї Вех Беї бех Узі Тіз Твк беж бе бі Аза Кіз зві Бех пу нд чо К
ЕВ СВ 15 ек ж ки ж зн Жтехи Мр че ШИ Шелак бо боючну ЖЖ Ж За
ТжУк міт Муз ЗБЕ уз Су ТЕ Ліз Зах Аз о зуз Аза о Ягч біт Бізе їі
Зкй ха 135 ся се се : с се са щу о дл З п оч . ши ще
Кмжж ТВх Рів бах ап осві Су Азр ої Зі йех 5ав був сплу таї Вер с Оу . І:
З 40 «5 твху Уві бек бві і вв ТВ; Її ТК Жук Зві вва о бУуш бій Зі біх зпх УваА Зак УВІ сбру АЖ ОКХ щі УЖ тУуК хв аа Беж ша хі ау 458 гчени ЗО де Ж су хе я виш не Я пк я т Яка Ж а Я У п - Ууки
Буз Зежх їм ТУкК Уві був Му піз Бхз 110 їі5 Аз Бе Тух Бво Рхо
КУ же ож де ах
Ех Я СВУ чо ч и цпелюї 1Ум ох мух Щ є «їх йхожха о щоуюю по СЖхуює Ст с. ФУ оял жа ух їв Мі Ве Бк Беж зв оБіО ре Аве Віз Зек ї4е пех зів Уві аа аЗо ях ж Хо ее Е Фуко кн Не - та ех божу її хо дах щи тк ач пі Бу її деп обБьк Бех Се) дія ЕМе їі Аз Буш Бех йво Бім ев
БЕН Зх ЗІ ще ща х ян М мк т воду Мах мор ж Ж у нео їізи нів Ав Уві Ав йпьа Бі Буд шах ТВ тих Аз Хоб Мей їі тТпх ге дОожьат вояк,
ЗУ БЕ Зш У ок ек ШКО льше Ж од ж Ж ІЧ їх Ж ех Жов «ем Тк Кі Кеш чу
Їх жів їзе їі Заз їі зе Уді її беб Беца (ес ЇМ (Це іа 84 що ов я 53 Зла чи та жо Хо бокал о їх Ж аку ие ше Се Ме ОУН УЖ 20 Ж сх
Бі їні Мей деи Тук Су5 Був Віз Ах Зех ЖЕ БЕ Уа ЖЖ Їжа ех 545 Б 55 Ка
Кл -х ол, х ТІ Ех му ши Уже ох век ке ЖЕ хг, оч о був АжЕ Бій Бей ех біу Хі БИ ОАви бі Аза КЕе Бех АБО та «я «АК ув «из МНК кщичт «ЦИ у асцвесзЕ созвсезасск себсасоскЕ зЗссвш5вкоо совсеасту сЗсоваса о
ТВ прова усу мит де польову ж хв шу В ач р в Шут ху ке ях осо у мл уксків гм ххх годи заззрсвслее босвсявссях свесчсЗчоУу ассвотаена ассасасоопа ззазчавЕвте з їх тозасвевис совсасаоне ссоссоссова ачзазсзаЄ сссоссзвавсяа зсссясвак
Тс. вюЕишкисоссся са свосва капи чесаса же авсвоваачео кове ск шо сесзссвока стсезасаав зобсосзваво аосвосса сосваассва пачок я
За -еказвазвсссс зссссвзава сосасстаав азвасссзваЗ вістасивіса коса
Би «кхезвзасттсу Косссезтзтс сексу звозассаас сссозсаватст свабстоєава ко
С зисзусссс сізазизапсс аададдасайй сота сівЕса звис адсхаа сало зоссвоссшКх скзасвзчсс качана ссквеМакка засос сени «но зпсзечаста сбзакзазавов сузіссннаа всашокосса завезискаа дача и 230 дух Же сю ть практ у ря режим пори яю я жо; уд М дети аа оту в крезу ММеКМ зутасзавос сзуссвачава зосозавеско ззавосессо авсузчасас сосок
ЗК
ВИС ке Жажй свдчучив олива В прин дачу й федри учи ІВ сі о ке М В ше вотум дао ву ри схашісвовео пзокозаіас бабБсасвсийо зазна вовка Зисзпеосае
ВЕ савсавкее ссоазЗавови сдесссиска асссвовико своє зозависактци чу ех а зесстсвес оса ща «ах В «ії» Уа «кіш Банох о Ваш зді т кій ЗЕКБУ штам В «ав В ше жк мн ен НН НН А С 4 Зх . ке бів ринко Ж хо т
Меї їіє їі дех ТВ дек їеє їі Ті Аза Вів їі Тіз Вре їі тів ч К зх І н- х КМ хе
ФК ак ча Хо 11 феки. їм яв е-Я ук я хе, ХУвия ТфЙх З ся ж Шах веж Ама дав нів Св УВА ТнХ Ї2-»н о їТвх ХЕ Уві ЗБЖ о Заі са Ттвх Хе з -я ех о В КІ їж вав Мі тв 5іб Б вза Тію бек Че Жує Тже) ТВ біл Уві теку
Уха ХЕ 15 хктех о ХВ Же кто иа З югох у хухат МВ ж а М жу уж Жим СХ я
БЕ ба ко Узі дз бек ве фУж ів Бк ЖЕ ТЕ ТВУ Бех Вк тів що ща що
НЕ ЖБК во Бек Аза Та Ха Бек БкКОо вд ТнжЖ Був Бех пІВ о Тйх Мія в Не та в
Щі ща Же з. хх шк боку б жк що Кл Ку В о бр М о
Мів Тнх Тьк їз біо ТВ був БІ Аку бів ЗВ Тьх Бех Ту Бі ТЕ
З з
Я «хсх о бачу Ме Я ажкк хх жк бами Жянсу о Вбя Мя Ук ХЖонтах Ж пе ср взв був Без пес ТБ бух мех Ахо бек буз вна Бр Бу Буд їв ка лк шк ках ня іх 4316 ря У кодах тет 2 ча ни ОР: ге М оди с жу хи Же бу їх пе Ж
Бу во Вар ТУ Мі вне сів таї ББе дво Ба Уаі Бко Суд йех Ті 7 дскі тя 115 15 155 йтак Б 5 са толк оч в но ка а Не а НВ НЯ ожежи бу СТ с НЕ
Сув сіу Взв Аяп Біо бек су ев Ме їі Пт БУ ЇВХ Ті Бхо йеЕ хл «Мк й 130 135 145 башту 5 шк Жде Ж і Х ху шо а Фк їй жкух ще Щщахує т зику туге ВЕ у- аа о БУ БЖ БУ Бу був хо Тк о їіз ев Ві ТВЖ вжи Бу Бу Ту ак АЖ ше км 145 156 ї55 ік «сф Чу вою и Е щомсє й т Жужух Ж де їв не на и НК
ТВЖ Був ТїВу ТМ ба був Ахо вер о БхО уз ТВХ Бхо Аїз Бу МОЇ Бо 155 17 їТ5
Жах оку Ст шк ще ОК Кук Її ра ТА ж ех Ж ква и ни ее лох Ух де. зу МУ бум ха ле тах дав охо АіЗ Був Бу Без їх Зем ЗУ ЖИ ге за5 ав 155 АНУ МО ра Бі божу мч Шерех у зи спе Ше я БОКУ З ч "бос їх - Ж їйЕ АЮ ХУ ВОЮ ж Бас їзЗє ех Бій Чет тля Маі веб Аве тво її 85 УЧИ 5 ї35 ши РОН:
Ук сут ра У. обу хи т ПАН па є хХ к Ше б сук Мово Жду
ТЕЖ Ух БУ ТУЮ ТЛЕХ ів ба зів ій Беж лм Мля шах ТоЕ Твжх ех ії 5 ср р ЖАЗ Же нг ка фея хо їж тм КД що - п ж тії: г. схухє 81 жо Шеую «1 х тах Ша бів дши ХВХ веЕоО Ядеж бет Тв осїрБ її15 Бкго Тк віз хвк щі Бе пах ка КЗ 5 ЕН
УхУк НЕК - ях З с їх Бео бе БЕЗ бах тр Ж жах став й «ЕМ З ат з двух «шїїх 1136
СО У Ки
Же ДоЕях ЗЕ ж ув ак ж ха МКУ ща А «еп» а пе ожрчучи о чех уж т тує ктів ии ши уиУ МУФТУ схІфУК у хи 0 муч у у кину и зкзчскскчя зЗскаеаціова чесчавсзас асосстчавося впоеесВєЕ чека кссее 5 ки в НИ скидки я кт дк с ни ча ут кишаанвизсв сосасссвцва зацевисзчс зесечсеосЯя асасекесвв сивсоЗ аску 158 дя сказвазсвоев ссавеаати чека сізоссчассв созасзасоє савссвовас а щих і ктсвссочоес сдаксоцзає зесусесоос зкуазесечє кодесозчча узвивесвго хи
Ж авцзвссстас здудасоссза ствссасусо зазассвасоя зсобоучаваЕ Фассвссеве
ГК х Ка зи чтацезЗчаса сова оцева зЗоаежаеча кисчвизео сазеоееУво садово
ЗИ ассзазахсс зчассвасвЕ созвазксєчау зчесочцавз сстасавауаз засустивав ий зазасозчос ззчсзЗчессс сова зсвзчв сасозасаос сочасстеяа свїовссякеє щи скчзтасассш соевЗесеасе сассавсваву стазчосциса пдеавеаваас сплеск жест цзкся дассвнуІссаз сзасзочеоеся звуззезача Єдавцецаха сао стцсссввоз засос своокестас узузечекоЗ заавацєсвомо совок во ззсзтактоу вусзстссоЇ саскусосву Весауевсов заУчсеусао сзвувукуча
МКК
КЗ зЗасвксткоОсп ссосстахх сетсваое скесзпсозсвоа чссазцає зссзачахуй тн чу тиж джеми сх сх ш - х еліта ананасів ззечооющ соезасетоя зЧааззасаєс абаскопесс зоЗосацеяче Зсечесещах 850 зкоззсззУя Суха часа кас зсосазавус зас еча пасок ж кассвгаксс говасавссе савочессоюс ків Зовс бозасссвВуЕ сосссаЕе
ЗЕ зас сує бсосссзчавна сусвуєссозча соззоасаков сзоочачеа софоовсє
ЖЕН:
ЗКУ сссвуазвзвос почасскцев сЗлодесдяс ззаЗзссВсЗ сеззпозасх зааздазаве
ВКА
ЗИ час саїссв зстзевесао Зосочасстсг асзЗесавоаз застане света із павзскзавсо соззоазасова сус соч тік «ій» 15
ЖК Я
СОЯ У
«і БМК «КА БНВЗУ брреня АХ «ща 15 ще В КУ з уко у, тк х ст Ух ї Фе он ШІ ха 6 с ак чо К мет віз ква Бек вуж ТВі Мей їеи Ав» Азо ТЕ о Ап БУ Зв БІВ
КІ ГчЯ т зе 3 З 15 їх токал З сухо дк. с я Жоуюо Ж т Мак УК кое Ше БУ ще дсюою В Ка ау як дл
Зе)з ви дек Бех бек Беа Тек Трх 318 ій Акч Бек ЩЕ бі вве Зах пе те ж я ой М м еще Жду Хеф Жкух паю Ме уде ку ет ОК ах Фа і С Я ху Жахи Же бек їі бо Те о Бко Ай о ТЕ дю Уві біб БУ ія ї1іє Аа БУЗ Бе СУв 7. ше «Кк 35 чо 45
Ех» -ч чн Жив бік 1 БУ КУ р НК КН 135 г; А ск Я вх ау Ме беб о їев Хі ТВх 015 Аво Азіз бвбпобів Без Ре ТвІ щЩіУ Ббеб щт цщц От ам ах ке ше ще як Ж У ї Жак Ух: ке сем те. с К : Я сх он Жож КН З г І ке Ех їів БіУ Меє Пео Тук Аіз Меб Зех Вк без (У Вка ша ав ТВх Тзфе а КЕ Кох Во
Ж шо Ж Ж жує му МК хх, ще Уж Ух у Уха. ха ж ху Хуг КТ Муки Я а З га їтя її М; АжЯ АвроАів Бі ТуУух Нів та їта Аіз Ам ов ЖЕ Ажрв
За ЗУ її мч ск кох о АС АН ННЯ шо У чНЬх є. сук тхбчаж я саїі твЕ ТВ Мія Джо сій дав о її: вав бат Був БІ Ще Б ВВЕ се ххх дж ж
ВІН МУ 149
КЗ С ОчЯ Мк хто Сон ЯКО Шеду жк о У мо рух ж Бе реж Я Кл т и жив ок тУВі Мо Хак БО ів дек ло ХК Так бі біз із діє АБ зе ЗАЗ ск щ - 115 120 їх5 ж Ж бах ж х с бик Хасх Ж лах Мав Жоавміх Ж пех жим З аж їіз біз Зах Кхя мук Бек Тут Кув Був Межє Пец був пін Мек піз ба чо м з ча
А ЖМ 5 155
Чаї Віз Бжое піз Тух аАкц Ніз яв беж БО й о Сувз між Ме їі їла
З з і МО - зе зд Ех, З
Аа А АХ НЕЮ
З Ч їх. Що іх й м Хом пк МИ УНН жі Хо хх КМУ хх й їжа Суз тів ліз дія їв Уві їі тТвж Бу без дів дія сі» бер Ах я жк же як 155 Іо 15 шк ТТ, Хоект бр МОХ Сех т кс ук АХ а пе й дич Ж зжиж бат вк ощіУ Мей ТБх йіз Уві їЇ1іе путч Ак віз бвб дво Уві бе це два
З за їх У ї85 їв їз да У Ша Моя Як З й їх те Торук Ух ун Хе хе важ ше Ме сук
СА Ме Муз Кк Тук Му БіУ Сзи ев Ріо був Вар о ї18 Аза Взв бек ко я сут і СІ КМ 935 би о Хах її ОХ Кук т сх хе мк щі Шк лях па та ще зх вве тех ПЗ МУаї РБе бів БУВ нів хо Ні Бе її вв Узі вве хв т учи сус шАЙ шах Ка жк КА я чі. ач КЯ сту и хв фу ТЯ хх си ще хі руту нів Біне бі ї18 Аза 5» Бех Я То АКУ біУ Біу Беж дкч 3. а тт кс; тку ук ше хх М а и
У УВК Гек 51 гад ах сві М. я ем ше не насе М Не Ко а І пі Тіз бе діз ЗЗіУ Бей не мес дав Дів ТУх О1Уу Віз Зі бій Уві зав зей ря ух хо ее еф оди Хдмех що жде ж ув 5 я вч Я ро чех паж ЖК кх Мч че «о хом Ж сом
Меб ішо Аха Тр Бі чай ем Аза Ба беж Заі Бжз баз Жів Мет фена туш НЯ Бач ши шо шле бла ЩІ хі дет а А Ді 235 ку 3 у 3 Зв 3 їжа У БВ сіу Ніз іа Зев Уа бів Аз бін Ме біз бій Уві Уа біз чаї ТУЕ тк пе зле
В ей зва а о Я Я отв м: т ву вах й я жк во ба ЩА рю Ж шах пі ТУкК Віз пів їв зва щШіУ Біт Бій біз Бі Бе Тух Чіз Ті бе
ЕЕ як с Ук, аз газ ЗО ою Же ши Тк ЕЕ ис ШК. р Сх ж ех я УНН ЧАНН я 5 а З т
Зв Ав Бхо Буз Аіз дах б без) бах бе) ТВх бік Бе Без Вії РБе
КУ Ка ЗЕ ЗО
Медеї Мк ївщ 13 ті С Ві тя ДІ її Так й. ті со жк хх КЗ
Бек Бек Мі Уві Бей су Ави Лія Азія Бі ев о слау їіє Ме сі Щі
ЗЕ 30 335
Уексх Сх НІ Мі сою біюею б "Же и Шк. Жосух МЕ 0 Ж охя їх хх Жахи Щі
ЇїЖх Ак Біу ТМпж хо хз Аза Зі Азе щео їх АБО із віз БУВ АХ пат дек ди а 445 ЗО тк ЩО. с а ох: . ВХ ке Аж ух ку ск тя «5 СУТЬ ШИ
Тжх Віа Бім БЗіз їви Був БІіЦШ Ва БіУу Уві їх Авки Тук Бех УЗ) Її 355 350 355
Азов бе ТЕ вів Б3ін бів Бема бін Вів їі бух Ні біз Без Аж БЕЗ за їт5 ївп
Ж охежк ЛУ ха жу жом хіх у. з
БУБ Ар о йхп дао Уві ій їі
Ек бух оо КО «ех «ії З оче ВУ я «вій дик ту пк, ч г. сх кекюк ою їх ще «сиіх вівУс вшщушУу 1ЕБІ,
Се З «еНнн 15 ж зх дю ек ще ху ер Бити рн рн і ОК а и в НС тиша МХ КК КО чекав я мере сс че паску МАКИ ко 53 «і» 18 ж. й «Е1їх 18 саше мало кві ЕЩУ «ах» 15
З швіх бах соті ших Ст ода жахи Ж й оох Ж чо тки щує Чо ит йбушедхо Ж Мун во дал ве Ащю жо ев був оц Лі сів Бар Уві см беж дян Вже ї і. ї1п 15 ку
АЖ ЖК
«жа як «віз ДНК шу АНІ силі КВ ке» ВЕБУ БО МД «З 3 зкчазсвово зонасосекя сазвпктееава вЕссоооєє зсаоскчай суда
ЗУ! чес са зоссвзсзаска сеКсзвВаЕао сс ивВея сЕостосиах спос: а
КОМ
ККсзезсза ассуЗавссв засво дво ачся ксузхавсссЕ часу дм м ие, зубри мк ж умо фе . жу р ух м вух ди ща зже я, я чоезчсвцесоя сочавсооза сзаазосЧач ззвакасзеес сс соЗсасчее заз ве ззазгоссвсв Ксозосацуса савсзасвсо зссаатдосваз попсокцсЗЕ чуосакцее
З зацеїспскча сесовосізава сезсчасячах зксвачаавє боса аова сузавовае ї5
У ее суті сет феи У й хз мами знана Не о а а НН вистссксой зак ссоЯчх щфоесвасаса чес веа:сзазаву севссуЗва ш чай ззсавасваче застави Сусасооава соч чссег спо Ззавеаааах
С зесазоаавсяа сссолуаах совок зкЕсвссахсв збаассссаа аа
Я зЕзЗсосолвсв сезассассв сосезавзавс аа сс зна «ах 18 кі» ІЗ
ФТЕ Я грехю че БИ ШЕ о ше о и у я че «вій» ВЕУ шеам ДО я ЕТ З «жк 14
Мек беж вх ку йо Роз був бе ре із Ті жа бік нів СУБ жу . ш аг 5 1 не 15 15
Може З 5: ау му ча ВО жнку ки ач ха. т ті дя й учи НК їм балу Му Акч СУБ Наз Бе Зеж Наш дзвожЖУукК ВБе бін ТЕ БгЗ БЕ
Ж 5 За їх ие: ще шоу. ЗКУ пе В ро т Зм ке чн нн чи се. ке нн
Нівз вла Беб Бей тва Ак сіб Ави вне о Ммеї без ваг ве зів бе; ГУ зу ЯКЕ ях
ХУ мак ем К ск тія ех Я такі буку 1435 Тв Ії ві ді чех щеЖ вав Буш ЗЕ кА Де тах вм Щек піз ТЕ пе Сея від щІЗ ку дк ще
КУ ЗУ що т хі З суттє йашт мяз бу т Кз аге Ж дкля й п» хи ух дж дж Жах пай Мей дев вжч ТЕ ів біб Тух БІВ ев Біт Уві чаї сі Уві Бе - - -к пох щЕ т тв що а бли С, их са ху ьо Уха очах Оса пра т чу Фбаж кю КОТ пу ім дех Тук Зі ау Беж Жів Ва» о Аве Тіз ТнЖ Був сій щех ів Се5
ЗЕ щи к ща зи з5 хе Же ферит У то т ох: ке А Ь ух КА стук тка є щу й
Чаї віз Ме век рми Це Ме) ТЕ сім си йзва Зах ав» аз їі Гуз : ет жи - Феї: ЕЖЕає Коко « схе ; я о я бркте
Був Без дк дев ав бій бім іа ап о Заж Бжз Ку ле Ака Уві Тух жк пет «ее
КК КМ ка с Ух се ЩІ З чл ах ше Ох КІЛ шт Б ж Те вх ех ах, їх сут її со я дан їпЕ Ма4 сіє вх ТУух СА св Бек Ав одЗха був Авводал ба І ух з: І з 135 ї5о
З 7 и че шт Ж Ж ж теж т їх ложках вх Жодним Зх ЖК хх Жов нк їв іє Ні Ме; пев Бе Ах Бе; ВЕо біз АБ Ті їв Був БУ ТВЖ чле шо ше се 135 15 ї55 і се ве Ах лют, за Ж ЗУ Я ах Ж окуєю н Ки ве и ль Як ще пт їж буз еп отТвЕж Бей Авр бів нів Був йдевж біб ТБх Сі депобЕе БЕ лек з ех со іа 175 ї75 си хі бок і у хі У ния ке ТАМ ке я з оч пОЖ м шо Мас Мох зх їз Зі йех ТВк о баї ех Аз о їн йзо во Ні Аїз МУ Дей За вах їі5З ї85 із жВвЕОТВЄ каїйе 15 «їі Ї5Т5 моя тм «ЕЕ НЕ
Кене пе їв хх т тре «кі ВКЕХ штам БЕ ст Е кап» 15 зЕззаассоє сезЕсстова зачесане абезосквоса сс осЧоеоче КОКО
ВО ет кеасск ссесссвасдав как зссочаа пасе кквоє зако асося Ессе ла й
Ж зесаяняацаай всосїпосос ссбесуєсх спосо стата сказ свї свсавеееаа «й зво скмУззаса їзвавззвазаз звані Ффадвосзако сезаззесза азсвевЕкааа а ку я Ж КЕ же дк нене Ше же їссуєчі кім о ок ажурних о ВІВ КІВ бах б сЖІу МО ру кирй ийх маюх «кавжчавскоч зба оеасва завкзекчес аску васоасвазве зок таса
КН пееасаоса зсваксчачс свозоФфсуУ с«стзсссожгс скасоавссв сасссскаа
БЕ закгаскзава зуасзаясує свсосссвус завзадодая ааатасаех ссссодаєке
СК нен тЗаокестЗс ассфскауєЄ зва ссаска сстосваваяє сососвіесу ще чним тсазсававї свзвушсвоєв сЕосксссва сзавованує сус соваєсЕ і че пом сосок стсвостсї азазєзсксу зссксваааа СтзсвековЕ певне чееуя Ксостасстяє зЗвасазасач ссскессоса севосваєає сао
ЕВ ятсдваєсссо весвевасва Кеажтавошето ссоувавстя ссозоджатт сеосоєчває зо пекар св сзаосвсескоах стекасесве акзестсвсста звосбсссвась себе 7Еа вдоАтя зоссовссяс ззакзассяо звазаастся сзїссаавав сзсоссловск веседесадю вассУктакву сасїзсжеєс зсКассввааа звечаесс сзЗоевочие
ВАН зеовадеих стстутасто доссасоцає зозсоктвео дезавобося бвеотеосов
ЗО не ши ксавакассова вуазззакос вавевЕКвоуєс сзасавоцвас сзассофозе
Мао паасветутя езгаасзссоа сосен ос ссЕсЕссосо зесозааво ства
То сазкссвасе зва совзкассакз аактссстса сежесостЕо ово вах
Май вестденясу їсзаєсзкик савссссвав габзастоба ззассасово свчсававсх. 1-0 м ман стосу ссат сосок часа ЗСУВ суша 1-55 вва Я ствчінатав завассоавое астассзача ссеЕкиссяв соусах їі ня асзавоачост сшЗаївекуко вела зас ка секс пвапая поизааадиєх ставозЕсааа чопочачосса ваза ЕХх сопспасоо втедеовеке «скссовсза абокозБоос вубасссосс вуста соз звазвісавє
КО засЕсскчс дтадезтсаа сеєбаннсвва сок ства азаззоєкаязЕ вззесесЕче зІаавсезІсаз ос Зипсваа сазциссстоз сс зІса5 азззостазе: сазессосєзе згас соусЗО ше 1555 зудезетаста зов
НЯ
«І і15 жає ххх «РАМ Бах «1» Біло ско чееу зок у «Зк «213» БЕВУ феажв ДУ «ап 1 й пе хе ! ж дія дей дія Ізв тТВЕж ТЕ Їїї8 їв й із ЗіБ ем Бк їїі65 Бей БУ Аза йо й їіе ївжЇ ТАКЕ їїз їв Ах
Межє зіз ем Ркб ї1їе ій МУЗ Аза дао вух тіе тТнжЕ тк тя н Ол 5 к 1 15 ії Х ях тд ЗК пе Су раз вія ех ВВЕ БІ Ав тів ТЕ о БіЗ Св вив
Авв чаї ТО вве сСуа Бе Азія ВЗех Бек поп ха ї36 ТЕ біз бр те МЕ За
Ко КУ щу ї СЕ ї сх с. т. « Фу Ел Же; са лих ца бвЕ Су йву йіз бУаі ех був бі Жук Бер Бех Вів Б
Ух АВ ОБЖ ЕЕ Ух Зх із Уві вах щу Ах Ку ПУ й я СХ х гКОяя х че з ЧЕ з «5. с ЗЗР Я аззї ее щу тів ау В йсот нт двт о Заі Хі ТЕ Хі бів іш й бай лів вхо їв Бі Тхор Те Теж Лех Уаї ТЇіе Тех ЇЗіе Би фен ех
Кох лен У - в кй
КК ЖК су
Б З Я ско Куч -й З у Кука Жах іт
Був з Ват ув СУ йавоспі Твх Вер Дів Бета бі їж ви зів Буз
БУ БА Ал Був Су два осіб ТК Вер Ліз ев Уа) Ту хі Бу : Й ам я
ЗУ Та ЕВКЗ ВО
БУ хх і ! : : від чаї ТЕ піц ви Пій тей тез се Ух ЯК сік ТА ЗчЕк ої ек бак Віз Беж ЕОТтЬвЕ Щщ а їни сів се еу
Би со Мен во пу Тк тв Ачк Дід й я з щі 4 хе що ах ЗЕ ша т о 4 хї ху. бот фу кчж В й Буки 3: КУ їх
Ме мів Щек ТНжЖ БО Аів Аїв дав вва йку дів вка йо Бій Ббев ВЕ ет о ек ТпЖ вже і кр зе з 1О ї95 15
ТОК ТеУК ТВК Її з аа ЖЕ Буш Буз ТВх ява чаї ТВЕ і В ї хЖУК ХЕ її Ї Ї г ще ї С к ше перу ях ОТИХ. і - ож
БкЗ Бе Ма дл ук хУлаЖх зош Бе Я аж БУВ зу ТВ
Й ее ТЕ Ге 1535
Кен Ка ї о Ач й : У х зу ОЕМ дк гі Же ХХ дшх мо що За х се веа бух хо мо ЕМП мя ОО м Я ївю Бех Муз Був Аже Бу АТО ВкФф Бе і шу Бе їз Сем БУ За
У і са ; шо «чі зе їй їжа КА кам
К З З з х в ові с : щу у чо сбадю ЕЯ "За Від ах са їм хі змо Мі ямі зіу хвх Віа Зі віз Беж сі тів Аза Уа» Зах цу Уді бе нів шо 145 ЕЗО 355 чу
З у сі 1 Тож - « Слух Жви вхум ту п КБ за Ж ож ж Е ГУ ж с хх 5 тп уж 1 МАУ ; її Ге Ех ЇМ Я вав БУ 5
ЗМ ошіуУ біз Уві вав іт Хі БУ век Аіз Ббем бе бех ТВХ пет Бу зах ї7в іт їх ї7 са Май Єв Її Су вза щі» та Беж Заі їм) ТВЕ Ще Хо Ж віз тв Уві бек мес Зах Азп біт ті Бех Уві Без ТВ пек би
Мо 155 МО ; ще ще ов сег М Бк Ж хек у піз бом ум че ша ї-о Вхр ви Бех Ляй ТУЮ Лів Ажр БУ 30 Бема би Ктш 316 Заї Аза
Би аг заг
У КО М зол ж Ме ща бжх жу Ждех пе їі беж а Жах но им іх
Буд ів Бе Су Аха їла Беж два ТіЩ іо Тв Маю Лі біз ВМе ій дм -х що
ТЕЗ 1 ЖЕ «її х з 2 Ки т ЗЕ, У Ел тах свя пе ік: ТВ Фах дк боку ій бив дей бай дкз во пев змі 118 ТБЖ Зк зів Ве дек Уві яв с су ку Осі схоже жішнм її ау ска г М чок ока с щі ті сіу Уві їТВк УМХ БжоО бві бек ТВх бух Мебї їм ТВ Аза Бех БІ "ах, "вх «т х
Ка: -- Р
КУ ск сою Хем жа Я с. г г: Зк Ж ка ую Щек Сеня ни НН мем ей ек Бей 3із Дав зве Мес ВхО їі Твх Ав Ав осАвя Беж Де
ЗКеНИ КВ жо
У меч ших за жу я ж мі кт іа рю ую скан Жук ті у їмех Мет йеж дя Аза оті бів Хі Узі дк мів зів Бах Тух БЕ Та чав хз сочоия са о Же Ті хі тар р ож З Ж щі Зх баня Я 4 Ж ру бавіх о Те мех Беж Це Тіз Бу5 біз 031 Уа Бен дав Ту Узі Уві біб пев Бо т . Урни шини чен "Зегуч є дУжс йзкосю Чек Чо крах Ж осук 1 пяймож о бю Уухея ман оїжк сім Уві їх Зею упх гкоО Суз ТІрЮр о Зуйх без НЕВ Тв дек Би гук ж з 5 рих
ЗУ зі З КУН тов їз бе пру В міне Ж ща іа мк Щи Ж їн їм; Жбфк о дугах
Шеи Су ТВЕ ТтТвх Зап Твьх Був міч бі дех жа їі бчБ би їж ду меру ях ж с ускж Й бо скани б гг ще хх з В с Фк ж сук су
Їж о Аво Ах О1у Тер ТУ СУ їз) азо азів ЗУ Бех Уві Бек Ре ке з 45 5 пове жу хе з бб'ууу джхатих Ж ках УВО ж ази пкт ДИ с дек ож хо біз бів біб Твр ос У зуй ж іх йет Ват; Аж Мі Ве Суд ца в
М ж ди з на не нн Я тах Хр ко ке ї в боках ЗІ їх Ме дшиа о Зет бе ТВЕ без Бо Бех Бі 83 зв Бео Суз Аа Ул
КО у ІЗ ди Ме СУК у же шику Ж аж тях Зак іо БАС Зк ОКУНЯ пав ли аз їзе РБе Аяп руо Ух ТУЖЕ АЗОВ Суз Буз їіє Маї БЖ вк Був ТВЕ блок жу 2 Ср б з юр ез Шкує Том лк щу че Сук біз
ЗЕ ча дет Щек Щек бак КіФ ТЕ ех ів І У Від Ті щі ЗЕ У 415 че іх мує «КІ хх сяк б Ж жк ах пику ЩІ Хека є би м їУ ч и У Кя шо а
ТУЖ іт БЖ Тв У Су ТБХ Аза Бех дя Був Аз Ат БІ Хі 18 хх КУ хо 4425 ГБ ЗИ т се "ТЕЖ у . Фр. ої з, ши жо йХахи Ж ше: Зі ду х т. г. Ж а ГООшІ 1-7 Как
КУ Твх пре ет хв о 3іу Суб дя Ту Уві бек Зни Був пі Уві Кр 135 за 445 т ся ж Са и Са г: рен ТЯ Схряж "Кк Те ін са т. с ешІ п НИ т
Тв очаї Жет Уві Сі йва ТВЕ Ме); Тут Тук чаї Ав чув піп о шім Бу я 55 «Ей тм бу я ба же зе Ки и Он У ЕН х Е я У з х ш- зу шШет їм Тук Ті Буш спі» січ Вхо Ті їі за Бе Теж дДзв Бко ат та зп о Ії я ге: Фо - Ще, 3 леж дез я їй а ме в 2-х чи їжи Уді Бе Бкз бак обер пі бе АЗО Кіа Бек тів беж біп Уаі Авх
ЕЕ З ща сажу фі КУ 5 Уч ск же У Ку Ж ех. -е ях аю й т ГУК баб зв Кі Аз зів щех Бзз Аза ге їі ку МУ ех вер оз пе
ЗцО ЗУ в т щя х хг ст М пи їх ЗІ ще ба жк
Меп ніх Аза чаї айва Віа бі пу ЗаЖ тТВвх тп бай
Зіх з «ід «ух БЖ «хіт ДВК порча по «3 ЦевУучна сащиі»
СВК ЛЬ т В їм стос сти июх, ху «че в тки роси соуси вики М. их «жи» СОМ А, во кодує злижхий Білож. яки містить нептмжщвссаваннив тобілок В хх? р ч лу ливі се сах стуки ох хх - 2.0 дек ему
БАБУ штаму БІ, Злихме з фрасменм протеази А з вірусу ящУру» знитУ З непроцевсвиним бодеєсм МИ з зіреєУ ЗЕБУ ве АХ, «ЯК 17 зозчесскоца здсазаєчечаа зосчвасчас зоссозавсв азувосаам Ока що сзазсвсв стоазоссвчвИ завшжассоче ззовзоцсвесш аспассессав схасоесЗу т3й во саозвафеаса ксзахавасх зма кч сепскзаксз ссовзЗакос сзассвсває жа
Кеєвссяв боксах о меаєсосо зеоаосетх фезЗосоачуа свое яв зезассссоас зоадпасзссоч севссчозоа вазузссзасто зсобаоавозе зассассеве а стзсзоущаса ковасЗосав зуавахааву кКесозЗзачи Чассвошас сао васс
Зо зссзвозаксс взЗаксяевасве сузодвксому ззосозави сптвсазозва закдскзава зх чазассчесо заоїнссо созаусасвав свсововасс ссзассясаа сова е чо сЕчЕчсвосв сосессеоск сексесввач сЕЧоссостоа чсочвсвавес З соЄ чоисчІчасса сасозассев сао счсси зазазсоаваа Сова сеаццоскх
СУКНІ сізссозвазс абсазсоуссва сазсттсостас зач осо аавназсвес совок ака зво стя ЄчсасессоЯ сексЗсссвУу аобсазсвоса песо чесаз сво лова ча
Я чЧасасеккос сопесУсакк сакчаасчсс сассеноеко дося дебававо
БЕН засо созасазозї дпвазазевео точ воцосзчеЗ зов оЗа я ввктчочаса хкадечаяоеч каса шесссачааЄє соц соусЗи часи ще тассесвсс сСпазасвзосю сезоуємксс ссоссеКссо Сшеаєссачьк сесссасеке
БЕ з еІ Єпрессозуваа бесбезосоууа седана Мр завіа поси 1020
ЯМ пессзоувасс аучакскава ствозососєс вабфусесваєсу сосзаосацрюї пава
ЗА
МН тост ассв зсевсажсЯо зсезавосто зсаЗссоаоа авобззаачє сзбеазшево
ЕЕ
Ач тезесзаасе схазззасав соасцедаво сеча бсодабоеї зааашоеЗцоо
В чиноаессча авачесаасос соцесосвос зовсзовасо сосспсазих сзазагссо жу І в чопозвосаос бСзаасцосав пссозКоссас стсвосовзсв воссаскеков фіачососсюх
Хоть
АЗК сатсаекискаєс соцсссосв заЗвежЕкака сездазссоаа оса сао соВа іо ззсаїссоавкз сестзазЗеза чассзвацсцеа чесочсезчаас боуекецае сувузааєає 453 пух ук ск и "УЖ тиж Ух у УЖ 0 му у хе м жує соду у Я ми ких о сх хе ЗК пе шк й ум ж з де ху Же ж учи о ОО песоскоччоз сСзуссдовак зесчоевас сасассеацов «еашвевеа сс
АБО садещсце Фероцеках пззсвазоста сочасеча каасусєца совівисваЗ 155О отримай уже к зт си т и дюгетх усу их ака о о сб кое х уж хх вачдоскзкЗ зсзасозаса всбезавокос сссзачакес зач асяя св еа ми
НВ ож зосстагаску азазпсазосо Завзавзсвас азцсзувосав босзтсУуєє сазосеогя псесасвсу кустцазавза зассассваа ззоессскоу зкассозеза зтссаксвоє 14740 зксзахивис соваалвавя сасозбебос сасвсмазод ассвсоюсва завсавсває 18 воском ія «йїпх ІВ «ЖІ БИ иа Я жвучу хх Ваввох «дій» речи
ЕЕ пров мож ща ; й х іо що ол еко ме Й тека? ни жМИ Бідак, що містить непровесаваннйя М-білеожЖ З віржсу ВЕУ штам ще, ЗвичтиМх З феземеням преоетявазм а в о вірУуЄ ящутуУ, ЗПИЖМ В верропесованним білисв Мо З вірусу ВАЗУ дом Ас, «ММ її дак о жіх лих по кох жк . . тм там погишо в -4
Мет Віз їй пек був Уві Був і; Ав Вжю тв Зеб АхвобУв Ажрозій й : ой й 1 5 18 15 їв ее беж Зак й пу ТУух ТП іє із бу ех ТрБжоіу Аве ода
За 75 хх
КЕ Кк КВ їїі2 Азв оЖВх Бк Азо Тух зр оМаїк шій був Нівз Хі Авпобув ги Куз 48 з с ї- лою с ж ке КІ ех т сх хг тою ках. сф ж тзхї піт Ме йеч ої їі Тих 0ію ав ові дкп о МіЗз Був ВН ТЕ пау щеч о в З
Зіе сіу ва: без Туж Бія Меї бак Аз) Тнзи їхіу АкФ ОМ Аво ТБ Ті» «5 та КУ аа как Ж та Бк - їде Кв ж, ї аз ЖЖ й ЖІ А ще
Му бів за вВкоа Аве дія Сі Тек Ніх У) Пежо Аіз вхп о ші Маї дер й ще ще 85 зо 5 чаї Жнж Твж Міз йсе бів зро тів бязі Муз мій Меї Буз БбБзе 01 їпд вс ай хаї це) їн їжи Афін обеє беа Те Твкобіз ї1 Бій її аз тів З 115 153 їіхУ іїз вім бек АтшЩ ГУ бек Теж Був тя Ме їв Бе біз Ме осі Ба їхо МІВ 145
: пох х : дю пов бі меж їі: її їв х ер о фко ве СУ щі мех сіє Ті: 1 Віз Бо сіб Ту Аг Ні дар бас хо вро оСув | Ех й чаї ія Беж сій Тух Ага Ні Ат дк КЕ їв хе зЕВ 155 А
У що й то із бів пі» вв вка х х їв їж о тУві Тфе БЖ Бу їм дів біз Бі вВзю ВЕ З їжи Су Лів АТяЯ Аве їжа Уві ЩЗфе ТЕ фуя їв ДІ: я є -е
Мини: «жк 17 мае
М
. 1 їі йеч вка вла деп дев Узі їшеб уз два тех сі жи Тх Аза Уві її) та ВЕ Ол ФМ МУ Уї Кз ше век осі Бе ТНх АХЗаЯа Маї М їв і В її їни КОЖ ї бер їн шк вів Бивнд деЕ : «Ей Бі реч ів БЕ УЗ вар бі вів вий пек ін Меї ех дкоа фею Був ці Її ів вро кум аю КЕ бін Мет вуж дкФфФ тек рух Б3К Без бе ; але 185 тай вих ке що г - аЗесвкх Ве 233 бі: Уа тою хім СУжЖ Ні вхо мів ББе Хі бр о Хві бе Ущі ще схав Та Ба 533 бу вів «Ів па МВ їх І:
Бре тТук бім ча) Би бім Суж Ні важ
КЗ КУН т ії ж
М ех г би Же Хр зд хе
ЩА З іх Щек ТЕ о Ато біз щі Хак о втт Ма Фів хау т їж З в 8 б Же ТІК хх у КОСА
Мі Бе піу Те Аля бай бе щек їптТ АКЗ меш зав я «долрих Кк Ах
Мих ХІМ С
МА ЖА шах пох до поч піс вів ші іт а 1 зіУ Мі Бе ха б01іуУ Бец бве мМеє дев лів Тух піУ із щі Біб У. зу аєш ие ля зЗау ее Кле ек за зад «Б ЕІ ко КУ . Я Мами б ажех
КЕ зач о жах че Вт тя М БЕ що з ж с їй їз дід їв ще хі ТУ ав ва бів Мет без его їі) ДІ пет іє М Бех ТЯ му км Ж ау
Мес Без вка Тр Зі» Мві Тео му вив
Уа за Ка
ХМ мн й хек ще я ач Ша Я ху трак ух : р В А с єн ПіФЗ Зві чаї Ін ді жа тх ків із дек щі ів від біз Бей ба; Бі ві Чі іх віу Мів дів бек УВі сп АТ оо я зак
Й кВ т мих ке ех й с ех до ЄВ, Ха ж Ж тех
Щ с-4 жк чі мл піч Еф теж Кі Ті Теж я суваю щО Зі Би о бдма ім ді ії вів Бі гу Бе ие жпьи Жук йіз ші вуз зва обу БіЖ БО й 7 зав «те Я МК
ЗЕ ша
Віз бек їхні Бец йеж Ін: ТЕ бік бе рез нія ре є ШЕТЮ ун щі Как тих Мам ше М Ам МАК з КОХ ЖК вла одяй ко цу віз ба зу бе веж Се Тих се й й ЕК Зі УК ах З Зх хх
УЖЕИ М ск - КУ Ві й3» Бо бі Ті Маеж щі м ші пі і б ЗК їх; Кн шт В КЗ ЯН ЗЕ Я МО ау АЖ ВИ ех сх, шжж паж За Мав жна ЗУ ви бів А мі у Ук р. КІ я заз з а віт В. . хи Же їв ов век діх в В ід о Че Н су ст; ак Там УЖ ЖАшК пів як УЖ х.
ТтЖж вка Бі тв Без Ат ай сій бар оБви тебе АЕ М ї
Б ЗОН У кв З жа за мая
ЩО т.ч ЕН жу ее Мак ЗР о Хих ше У піз бат щі Ма тів дам жиє Еш КБ кіз Я 41 ке Ж зЗаім вай бі да же Яку КЕ де
ТтЕ діа біз бій їм; бух Біб Бай щі и чех т о и М 55 ЗВО її н а жна ШК а с меру х щ5щжем пів їі їв мів із їм йжн Бех ште Хна кт в'я іа вим та щі дів Ті му а сл ех
Бар ота жвВЕ АБ СІМ см бе см зда 7 Акт зфк М
ЩІ Зх 5 й пиОШа -к; х зе МЕ кожним соя У ж ож се одука, жк Ь я Фо Ж ие ув Ахв Аз Ази УВі сій Мен ої Аза Бпе й ої ву Бу ява аа дає сьо ку с
За ЕН з я ет; ща чи на чани ди а а а п а на і и и а НЯ пі дав» Уві зм пак дв Бко Бі БЖ ЗвЕ ах дкФф бай БЖ Су був її М ях їх я 1 315
Фо А я ЗК вуж й а хх м. Ох З ії щи Же хх, я Ум сЗаж ве іч хів ла Бі нія Сул Мей яз БАЗУ Бе АкЕч Суз Ніз Вце цех ж КІ кА
СИ и СК зи «бю. Жлька Я аю Хр ух Ферми прин. пк шо Кк Фо ко ме пн Яся
МНівз Вап їУК Бе сів Тїтр о БкОо Бі НіЖ Азв ко їз Уві хо бів Вао а ня мя а З 35 440 445 ах Зсак Ж кк е Му ОТ Со с що 0 ща ен и СИН с і НЕ тБе Меї Зб деп хз Кі Бе Був Бех Меб Бею Уж Явак Кі ВМНО ТВІ сх У вих Й
С 55 а се М жа Км підває КЯ ки М Х х жа - в х о КУьх з й СУ ях Пк їж Бак сан Кі меж пі вів дів Біс їз яв дхЯ Таж бін ша тУх ях дотех я ап ва я С за ме ге тях ЩЕ т сх ах й Жодшь Зо бік Тім ок не не ИН
Віва ей сті Уві Таз бів Ущі же біс йех ТуУжЖ 318 Фу бек Тіз вай що моя сь ц ях 4з5 за
КУ Ж ки жу, л. х ГУ їх с Р ст. жи КУ Ох Я «зд ж т. ж Ж схе с. азв''іє ТнжЖ був Бів Бек дів Суз Уві Віз ма цех Був ей їм ТЕ со ток їх г
БУ БУК Бій г т «Мк х со фазу Му Тс Я з чої Ж ох що хз лох С ев й ож ма земи дви Щек дер о Аню їі Був Був би лез ба дво біз бів ех
Фо ко яклуд іх ЗО ва ж ще са ч х Може сеї Урежа шен чу хі Ха ткач сет
Ази зе Рус без зів люд УЗ ТК ав отВЕ ах сіє Беж тТух її 51 30 за 540 ех дав дз У дай два їх ЦІ тв хі НІВ о їи Був вро їз -х В БЖ еУжшЖ Лаб ап ЗУ Бай їй каш ВХ Бе реа ЗУБ ВК Сем
За за5 С пхати Ж Хю біу ку Ж Ж Оз АН жом шо 54 хз бій Аврвотаї ей БУ Бу ТВкЕ гі У ла ТКУ во Блбв хів Ні ке вм де пах ТІ 55
Хе жи хи Уа КЗ з да Яку є«х Ко ую вх ит Фрхж є Ки жк ж їж Мах Кз ТМ» їі ба дав о ВкОо Був і Бех Тк УдаА де Вар отВх
Зо ва а ши йо шо В Ж, У ск у че щі Ух о ря жа вв опіВ Ада Ук яп о АжЖи дво тБЕОжНЕ
Гея г
ХВ ХУ БО кій ЕВ
Се еНЯ лох «вії 15 кій Білак хуя (45 ЯК «213» щеучна аж їКУ й си чи ик,
ВЕ старі вн ча ЕК Ти я. ке синтетичне ко дя гом я а «ще 15
БТувхрж вах . За 4 Бу Б - б ЇХ Зв Звк бі в
ТвЕ ТУЮ Меї Цей ТКЕ й
ТпЕ ту З 5 рев сій» ак ж щ в «іш Вінок
Я» щу ЧчНУ
Як жор куту ШИ
ЗЕ ЖАМ Що вевтих, ; са жи ЗУ менти ке» Сбивжтетцнн
БеОКОА я «ча ЖИ
Я ж, ліз Уві ЖвВе біб Її
Був йвВт Ліз Уві ТЕ
Тк бак У АВ т. у АД і у. в хх
Кя зу 3 я кхкиіде я ср хи ОК, київ 15 «жі ВІН о я
ХК пови ежій» ее а
АКТУ й
Же й пептид, щі чечиМи 6 пептид, же пинтєетмичниМ пе
ЕК а
Е а чи
Тія З | | що й «ай» 23 ц Ма вів Вхоз бай ВЕд ; Кс Б КУ МОВ Й я ж АВ: Ж її піб ЗвжЖ б БЕ 15 тів їн бец ж іє З ще що Уж іт МКМ ЕВ КЕ 15 шк ММ ш- к
З і хх жк ту же ях з мі» 1 «вій» Бін у ЖК т- 4 піднесе ву «їх щеУЧНА
ЖК Й и шк бек Ше люТЕЕМ, я га за ний ее се ШИН теТНУНИМ кА ких щен є Ему М в са» й | їз пух Ба і у її Вкох вав СУ З му у: де ма ШОК хх й : її Сев Був дк ТІ жа тТев дів її пев о ій па 5 с ке я
Сена Нья За каиіхх З се Балик кажи 0 БОЛЕ
СКЗ пЕречиа ше ЕК
Ор шк жа а вентиля. спимтагичвВМм ЕТ сих бинти
Зодж й жи
«ЦПЗ 3 жо біс Же Ж во ач Важ Вір уж ке мзув Тук ТВЖ їз бів Ак бек ТВ оду
БУ Кк 3 во м за «Її Он шал н
УЗА БУ зу ту ай моху сша ВАЛИК
Ки Кр -х «віх бррузня хи Мх
Кк дкужух сим м 254 о. тачка лу «ки» Синтетичний пептих. ве Зк «Кия
Є реж 2 жу схе я хх М ри ба Ве зва ек ви ТЕ Бій Ба о бжОо Аа Іа х к 3 І «Ж ях
КА З
БУК Кчя Ж
Тк ох ки «діт мАНОК ж лах хтів «Жак Щи МНя «ик
Си ї «іти фути сте Ух «ЕМ ОСиМмтТекимМиЙ ХелЕе»
Ку, тк «М Кх АкОСя
Ж М ее Жещая М Ул КТ б зує ух
Щек ВЕ їм о Біу Акз баз АЗВОТВЕ 118 ї БІ свя вх «ЕМ И ж кава М аю 23 реч «жЖаши БАЛОН Е
КО дексу чешки ВИБУчНа
КК мекв
СОЯ реву, Кк Я КУ
Ж сСинеежняНиКМ МЕТИ д. «сао х мк тів БЕ У Ваз тів ді ВІ ЗБК Сп
МА ЖК МУ ВВЕ БЖ Вк Ух шк ЕОМе 4 5, х о «Вій» 7 зу те «віх з «Мій» Біде о іі ж з «кі шШтечна «их х
Слкдиее їх ух УК ик ва КУ МЕТИ Ге ЕМО е «аж з нак ех ЗНУ х хх о ШЕ Ни їх ке хх хх
Зеж тек її б3іу ех ї31іє йзо дай їж х Я ї ке
Сея КЕКУ
Ам ХО «ії» 785 «СІМ ДКЕ се М сода 7
Сжае МННУ штам де сен ей аксззчачсцс Каахссссва зУсвавкося вктассвсва остсвевоас зЗгсасвекх
ТОВ уж в сум лк ух хх дуби дефіс чув те о бцЕтстщскК стпуссвава сессвссойаа ззассі кат вассавсата сезсдпсвоЕ 155 зчсезазассх вксКовимас скоса за щаака скеззезосвЕ ваствеазаа ткавусєзаса косзадоавеа Свезозквах завмер сгзаФфувава вікова ва зай
АЛЕ М савуцзассау збзазшкав звасчсиУуся всвоватече засос сосна
Ко тствссвасавз всвавсцазс сСсачазузова ствесавече ков аваа Кесвошісжае захкзссваза зазосвакас васаккнаус засвазвуза звзазачайе обоз вою куки Ока В ук ек ЖІ5 і джури стою - г "й у уки ди Я ож ух аву вх ще
СЕчссауЗкз ссзасокус «сус Зсасастєкз бавсстявазах собоасеаса заз цеваа созасавово сававазелос стаскатсса сааасазасе сад аассвао
Ярош ай ктвісазвку заз ззУє собеасосвас аввоакчтац зесстсовзвааа совкзсаввЕ завсзасєхщЕ свссеаЕКУє ззасавусаа адотосезса ассзавевї адпвавоека зхазачессксс засзазадав свесацвога сЕзсеслесів ссазазаасо сах зссвоачічіва соівовссожЕ зазсхасссвс зкЕзссвасев зтавЕоаасе збоїв акссвасуека бассобасавсе вааоузксовзу аававуекаа сакссваасна ща «а уки ви щоку пог оз Уж ехуз хомих Еш се го чех г пт кат: зсозцаса ат касех сзсатес зЕзасаечави ечовазЕсо засабвкУка пря
З є ре і нн І КН зу ую ко жа ка я З дя МК В ля тю В зсасзасіво сасевкакоу Бе ака чає зозоситякх зчзаззсівсв сзесзиссс
З стакзтасав ссвасясавв зчавзоасчесс авасвссех бвасзазчавно асвоаиа
МО тзасвста а зевакчеааа асевасвбоЕ сбеБісссво азастцзвас зо зазчЕЕ
АВК заавксеааее зач коа счасасаактч авовВосссаа сзекваобазу Сзаззенавх 114 сссрсаака сСспвоякаке єзвзасскссаза сзЕчаКЕЧса зааккацає бссвааавния 05 г Же жо и ил джере Ж у о си я М русі ріих м ух го их М ри оф ше. закзсвачка дексеекках сеоабстсота дозвуєссаєоо ЗсовеЗеВа Соесававоє 155 вавЕЧівсяч сетсоевсаа заассогосда зесвувзача свсеккссаз соч еооецах лук
І кі чавкссвксва зквавооцчає зчасвостаса песбтивзаУєа зсасассаа безе авх
КЗНЕ зачсвацааеч сбказавзксх ставзхзаваз зчбчавссва тазсававек сезкчасеоа 14355 ттадіактских ссссткоаоз асккоаніЗсв ссазЕасскс зазїсвасза заяча вае
УНН папапистая са каЕксля гавазесслзЕ зада зба бом сацадіссв саскЕзЕс-я саззисечаМ счавеУасивое вуз шоза сопе 1580 косвисеасва зтаксовзкоавк авсгасівка есезві на сізеазїваї абтоассвися аж і-й свв че нн о и и о і гаавксчесЗ біоцчасеевЕ сосвкасовЕ «аа ссваза зчсозВвоссосвух свочосавус їй ззазахсаакх козалеоссає ззасватаве чеаеосазчез аа ззак
Коб «ам и
Се НИВУ ЗК «Кіїз 578 вач ж жгну
СЕРЕ 0 БІЛО «137 ВЕЖУ штами йХ «ап» 8
Меж зів Без Беца Хі їз бух Віа дав із Ті ТБЖ Тв Іі6 Ббеб ТВх 1 5 10 ї5 1. чу 3 Мб им б Ро Жов бу 01, у ет пе оЯтбнчемо 23343 Год вів ті ТИХ бе Су РОЄ Аза Бек хін БО Аз отвфе Тнж піч Біб це
КЕ ККУ За
Тух зіп Бех ТВЖжЖ Су вк Віа Мак Бек БУ Зі ТУЮ же Чек Атїя ей дк м ск ке СВ 5
Момі бю 3 м суху Ок є фахує ле т3ЗжЖ вк т їх їх яка оз
Вк тп о ЗаУ Тв о хжх ЇБх бех Уві фі їБжк бів Зв оїви зе зв ЇЛе
Ол сх щЩ-
ЯМ а ще
ХХ хг т х їЗаиту У НІ чук ж їж т зх Ж. Ж сту Ж, ст їтуш схо Аа обу Суз дай су ТИК Вер ліз Бтя Уві Був їм Ті вух
Ви то Тт5 БУ сх Я у ЧК ся зе же З оавст КН ЯМ ОМ я Ж ку Гак. Тож Жду
Бім охо їжа йероБув Ттж Без Ав о йів Тві ТВх Біб Ббем біз Бей іжпа
З ж Бе що й шим х здх Фон ж йо Поддко жо . М ж ук т Ух дже клі
МеБ бів Вес Тк Ріє Ржкоз Твк о Азпй йзкй Ах Віз Вк бо б Бем Вк ль «пк ях 125 130 ткож ЖЕ зд Мох Мих бю Ті В зият ? дах - що Жозе сину хх зх Жтм п
Аха ке Мет Адв Стук їБЕ Себ зай вва Аза МУЗ Муз ТИВ вав УВА ТрЕ 4-3: «Ж 5 118 іа 125
Хот Те ж т Е ян го У. ке лУЕ 1 1 а Тиїк бок г. Тл сх її їні: Бех уз сСуз вгоч Без Бех Зк Ре Без Бу ве ей їх піу Ух зт «Ук Зх 130 ї135 4 а Я ої ЗК 5 Хе їх ха У сх ех ми зх б Я я хост біш зак Аза їі Аза ех бі Таї вів 931 йех був Уві Би Віз Сем ха То с 5 ше
ІЧ ще 155 5 ан х хх 1 5 КУ хе яко чу нг Ту ува кум б Не піз 51 у Бім МЗі й Бе Хі їв Зак Аза шу ес ЗеЕ ТУ АФ Був ся ст г но КЕ Уа
Кк З ее нов Не Не хви -Мї т я Зк бухух «ах ТЕ
Афв Мао чаї Бек зем Бех ян бі За Беж Уві їз УВК Зак був УА
ІВ 185 НЕ с не Гек жк "г кох уж СУ мо шт, ше ее т ах, клин цей ойзвоїен МУ Ахп ТУЮ (із вар о бе пій Ббем оїео то біє Увл БО
СУ вин ук 155 ке КУА
Жах з пох ее с Ну и НО Ул на кує їж тку Фа їуУув іп бек Сувз беж їі Мдех бвБпа Ті ій ТБ ал бів вав фе опи
Мі іх пе се сум чн сі ЖІ бла о их ве Жаее а ам пай БУ зв за вх б Бема БЕЗ сіє ХБЕ Ака віч ББе беж тва ад кутку МК б зді
БУЬН Я Ж «Я бл її а їРщі Ск СМ ор ЗЕ Сиве ли о ж Дю х тру а В сі. о кі,
Азія шпіу Маї ТВк ТвЕ ко бві ес ВЕ ТУк МЕЖ Бео ТТ дав о йек сів ск сх чщх ве щи ча г оо же Ком хе Кут я Ж ще У я. Жорж кю Ж шу мн ШИК іма Мем Хек й їі Ащп о Аею Мет Бо їі ТВх яв АВ бів Ба Буш де 283 аа
ДЕК ще шк ся беж в ті м є Фр ї г Я пух сухе Жук Ох ія Жеї Хек Ах вв Уві сів Ті Чаї без піп ів бек ТУЮ БЕ ТА ка я о
Ми бек тла Ті їм (та сА ж 5 що лляна Ж Уха тк их
Ме дек та Те мух (Зм зів тах ва вій т її баз УвЕ Ба ми КЗ я шу за
У ди с аст 332 5318 ху М хе уза б т Ж авшо Ж зії а що кум. Же хг
Мем жук Зіу та) ї3іе БЕо ТВХІ Бо Су Тжр бує Беб Нів ТвВкх Жеж Вто ще Ка ЗІ За
Жук дх. А ше МИ ще вх хо жав вх Сов ау ожнх дк х - їхіяєа Ж ода УЖ зх й ей Су Так те да ТВЕ їУє Сів б1іу беж Ав гів Сув без Тв Аа дж хіх дк
КУ ЗО 3435 же : дае У у Мі іє из фра жу 5 гія За о (у дзрк они. З їМх вВзр асо біУу ТЖо ТУуЄ буз Або во) віз Бі цех заї Чек Ве рНЕ ча ак дк ї4 345 У жу Ук 31 я г Кк. ор ха ект чу її жу хх - с
Ехо сів Азв 030 ТМ Су Куз Мді Бій Бах АБ Аж Узі Бе сСУуй две ри зЕв век
Ба Зк лдериую ЖАХ ї ем Ще х оку Фома Же Ж Ехо Ше де ха
ВЕЖ Ме Ай Зшж Кбеи їв Бем о БхоО Бек САМ Зав дай Об був вапоУвА зе сх ще
БУКВ ЗТ що оку жк З да хх Ж ях буучкь Ж ак г са" Кока кум Ж сего Й лк. У кер оїзіз Бе Аза го Бу Тк АБО бух був її Ме Теж о йек Був ТВБЕ зв ЕК 3а5 о - ДОА за ках кю хх мае ма біз іх пл З У Жде їх зов о уві Бек Яек Бек Уа тів Тс бех ей Зі віз Ті Узі пес Сух жо 3 я щ 5 ВО 45 - ска оютв АКролк Ху т Я дж Теж «ваш хв за КУ Ж їЕ Бі пу ТЕЖ бу Ста ТВЕ ів ех дав БУ лава вка спі Ті її гу ЯК дОлх яко 5 щу "ет їх хкй кт З ак З ки у Я Улакжо хв тиж Мк ож Б ї- Хе
ВУ ТЕ Ве Зеї Вав піу Суз дер ТуУхХ Уві бек бал уз П1У Меї 33 135 545 45 жит гаї фа у іс пще іа жо че ія ЗК фа баг вух жі жу її Зах беж Уві шіу ВВи Ту бен Ту ТУЖ Заї Аза обу пів осів 1
СО 58 СН и НЕ я ВО КНУ З дує жі 53 3515 бу гі жі к Уа Ум ще зу йМтУж Ввт во Тух Узі Муз БЗ3У ЗІ Рко Тіє її Ба ББез Тек вар о вго «5 с 5 С
Ха їх бах Ше сухо Вт ті М х У бу Фев в Ух іа Св) Ве бко Зевх двроб5із ВБе Авр олія ЯзвЕ їз ек сій Уві ВявБ зх хг Ж зи З жо
ЗИ Ж ж Моя ле й хм КУЛЬ її Кк пе чо . ж ТУ Х ах щі Був її йзв осів щеб ів дів Бе тів дз Без Беж дар ПМЮ Тянз
Б щих ко ех
КИ ВИХ За ож ше Хе 15 х хо ОР Туктах Ша Мі рек Є шк хх пт їФч НІВ дз Уяі ап віз біУ Був Зак ТЕ ТЕ дав ів Ме Ії ТВЕ ке хи ха
АВ око мя поря Х Хід жк зхсз Кз ра А Кі Хм Те о є Ж кує Ж хх ут
ТВ їі хів їз Узі Сів жів Уві Ті їж Гео Зех бе їі 5з3з Уд3і як пли ях е3й 35 за
ГУМУ ре я Хе кг їж КК х Хот х. ко З Ижм о ше ХЕ Чу ох с У:
Сі їж їм бе) ТУЮ Суб пуб Аїа вхо Зк ТЕ о БхоОо Уві ТВх ем ех
ЗаВ 55 53 З є х. ше КУ о ОК ах КИ сх УВІ х у К дев кох
Був ав; Осій боб беж зі Кіз вав о й5в їі діЗ ріка дак вав
Фк ля ща ХМ «вій 30 кхащіх ЯЗ ре сит жк МНЕ
ЮК тр, реч св ДС «БІ» МЕАМ там де «ВО» ЗО зкзадчсазов асазчуассв ЗезЗассосо вазасосскочоа засос чес сске ваксзотне кое сакиза баокеомеч сСасозазеЄєсла зостозааче «есе їх аксзессоуа зосафоостоече саме ремаеют зфсаюсецес Зайсвекес спроосвссмаво я в 1853 кехассвося зЗеросаасса беваскозоо ссовосвева соаковссоз засо зай
ТОК ссеповозаїсв волаасвопас сепсвостаєс сгласссвоиа веоссїсвнсї сепсис шепсачасса зсчайасосос сеЄсшевоссвк сочасссата зосесеаче ще це хр
КУ сесазсавос ссзасеечас сесосечєсач ассаєвассе шескасеве сек як
ЗБ вача чЕ сового оєв пезовсовос зсаззазеоз заззвасассвс саосвовсви аг
Кене вссевчошка чоеашесвео сешбсзеєсвая зоесяченсв зчосесссс савзоссаве чно засзаУкксс аеексозаК кс зве зве оса десни
За воссзикоцЗ созксусав пошассссс васазчазче созусвазва звссвовасє
БО у КІМ манну м зга хи ре уко су сірими суху тиж жан жує дум жу уєюую ху кі жащееьаска зиаащескас сюкувасасну Всслаасо зсссоввесе позваассвИо ко звуззасвазвя ваотУкзссеас сессавцсос зссоЗацуваос сезсевсай свосасова о; Й асгстазсавссв ссвосасосЕ Зеозасссс васасевкса ссавкесозча пековсавоє
КН с вона о а а швах вул приручити «Ж Уж д ут ик их печена сскконоая пасе часа каси вВІрошеу я КАХ
З зсстасссссз зоасассескаа ссвуссказе взосссосса зозосюсова воза вах
«ех ЗІ
Коен тав ем А шах
Срок хе «віх» Білою поле» ЖЕК глек що кеш ВКМ бтам Ме дк ЙО Ж ха Я
М Ха Жах Ма ак не нка Ки ННЯ Зх птах ЛИ баки іх ть
Ммек хек Бтуа дапоБув Авромій дк ТЕ Віз Су ТВЕ Бей Біб дк ТЕ
З х, ь за ї 5 18 15 ау о ук вія Ж ти ЩА м кош і їхчує Хо Кк ге хв а. га хоча ч са чу їв вав Твх Сеи ал МіЗз без без вве їі Беж дах СУ їж УЖ БУ й Бао Хо
Ж Мак РИ Міда дк щі их з їз с ие Кашу ско пк х Мін
Бец ал зені Без Чет УА Вів Біб їіз ТВК їеи Зек її5 Беб дів мес -х шк 9
Зх че як чу кк поршня МО ке Же хе се я и як я де Фе щ хи Фа же їх Кі Беж ЖБЕ бек безе 318 фін Аіз дів 53 бі БНе іє Бія Бех
ЗО АБ що
Її вам ЩЕ Ж вва и Мах їх хе бу тою Ж ло з, ме ь чо
Аіз Ажй Нів Був таі ТЕ Бе ТВ ТтТВвЕ дів їїі6 г) бій зв діа ТЕ
З та ЗО бо Ку Ж шк шщеобч о бр ж Хр бін Має бета Ж стоячи ХХ п зок ОК ух вк щі бів БУ АБ ТБ ТБвЖ о Бко Тв Тує ем Тв о йів дв о вБка сів й Яра хк а 5
Б те 1 Й ее Жуу беж фслзк о Же Жим 3, чл кру Му жа Ж зер ЗА Хі Бек о бкоО Чех Але о Буо Бек о зам бі ТВБх ех Бі ТЕ ТВ ї оч як чо 152 15 і б кота ХХ ОКУ фі рія духу 1: хх ту бу Я -е ЕЕ с в
ТЇБЕ їі її Аїз бек Тв ТвБж Руб бі Уві Був Яєеї ТБх Без шщів Бек дяк з зе 5 їЖО ке прі Ук пк щ. Коук рн зи як би су важ Зк вку її ке йно ТУ пи З .
ТНх Твх УЗ був тн Муз дз ЖвЕ Жвж те Тв бій Твх вів бко дек ж з 5 Кг ї5Е 135 135
Ж Мен Же Ж «ех Ж й ух с шу їн Ше с Ч ду М зув Вхо Тв Тлх був бів ко бів Аж Був Без ВО бех без Бжо Али з жк Зк жа т 145 155 їх 15 фон Мох хх єї «тм зе КІ « є кчах ї- ки Є За у д Я
Зап оАвЕ Бе Мів ве бо кі РК дао Ве Узі БХхОо Сув Зв їз Су ам ее жк 165 ЕТ АТ кача М оку Фржтихм ЖИ к бчЧе ме бе С з учтаме ЖЖ Мч м-н уже хх ол дет Аяк во ко Тк су ТжроАЇів сів Суб був вч їі рРкО два Був з сзхх з вв - вк і8о їв їз
Жук Ше їчхвкех жк й со кує умо Мн ок ле Мірою т же жк я ее чи : зу ЖхоОЇ ЗА Буш жа ТБ ТВх ТВЖ бух БЖО ТБЖХ Був бУуз БЕО Так бен - вк суху як
ККУ КУ и
Тож: брак ствах о ХУ ус ша не и АНЯ зе 1 бр Ту жо о Х жкжшо БК
Муз ТвЕ ТЕЖ пуж пу дво ве БУ БЕ Біз ТБЕх Тв Бе пет беж ЩІ т сяк з 215 15 ми
Укі БЕЗ ТВЕ ЖЖ Був Бко Так осі біб Бжо ТБу Таж вав ТБЕ ТвВх бух
Тк ат ТЕ: г ях За а Я
Тну вав її їі Твх тТвж о ев Без Тк йеж аз Тс ТІ бі два З ка Б Я --ї те я св я ке им ШК Є де уже Мк є Можу беж Ко а зі їео ТвХх бек сів Мей За ТтОх ге бів Вес ТЕ Беж Щек бій сі ж ИУ ба, са вай еще ато - мух ХЖоею уж Дек Р хг - ГО - шк Хкф Же ЖЖ о шк уз Фев дап ово Зеж Рус пек бів Уві дек ТВ ївВх зе ЗАЧ ЖУК Бк ЗеЖ са та М 5 й х зо Фаюує 0 Кюфя тую що уч ух лока сх
Жко ЗеЕ Ж БЕЖ ЕКО Аа ЖБЕ гЕО АхЗ БУВ жу каз 35 «Еїїх 55 «дій» ДЯЖ ие чья КУТ У с З ккїї ВЕУ штам йх «арх З закчссвсзая цпузакосоя аа сова аоссчас з Зсхсзаз зді о зссвккста фрісяасазска стстоазЗЕза совсосссаса свсуЗзиккЄ вапвсававе «зе їі
Між вІсЧссва авсздзахаок сазопеосаса ЗасззазцЕа Се воске ассеуглавса із зЗкоезазекеа сазазекУся саонасвцва чека сс Сеча ацо Бус
МЕТ чзвавчз:а сафатсовас зззвсвасаеа асозаасваї сзосасча буссвбзаое в
ЗЕ ОО ДЖ І хи кн дчже и ж Я о Еф чу т, сек ус жк кв, як гос кож ки, я чо ср звзасссскся сеізеавсесва КеЗзссакчах вксзаазаваче сова ззасва Єзавовоа
ЗБ авімниосса зувізаззЗи чіасзасвасї зссвзсассвес зсасЕцавях свое
СЯ запзазтбазво звавссзроса СсЕчекавав ззавозссат сесдаочеаки зззоаааавоє зи зксзавазсва сактззчакаї созсзазчаус віавоснсса зсзасссвзва ззазосзае що
Зав зитазаесте савзасзвсоса сзссвазавт авкізакасса пек
БІО
Ман ек рек КК ет Я вії» і ке Я є «ей БЕЛСВ
СОСКУ іш диму ж сах МНЗУ црам де
СКУ с. ль «міх 33 - Н м кож дю Жолекхо Мито жк дог Жуюмиа ж 133 В вух дл ту Я, теж хм аб Мах Акз Ажхч Бак о Бе» Кув Був бБе Бій хе Аказу б3У Кія був Бей : В мк -х 1 5 їй А ос Ж їх жо т те мож ши ККУ Мох пу я ол тру бю ю Ще
Аяв Біт Був Ака Су Ні Бне бек МНів дав тую Бе Біб» Те бе БЕ щі Зк зи а 25 Зо жі 4 жом . па уся ех ех з км їх, са Ж Й Де ті чі їх
Міз Аія рез їеб; хі Ак баб аа Ба Ме іде дл АкЯ Ті Меб о Буж пох щ як 4о 45 шва Мдех тож йде тд з Чіках тої фу тої та поше міт кі ві: ек щес аю пуй щежЖ ха дав хпх бем ек за Зі ВЕ Бі Аза ія кое ех ХХ
ЕЕ БУ я о Ше ххх Фежчнк ре кмо Ва ку що Я з їх у хв ге хі кі дк Км зз)и меш вве йко ївжЖ січ зі ТУук піз Бе зі Узі тва баАвЖж Уйх Сам ее све -к дк я ТО ТУ За т НЕ ЕІ Хек Жан Бл ва бок Же ббе шу Кут фу нумо що й
ЗУ беж ТужЖ Хі З1іу Бек Гі Авт о бва Ще ТЕ був Піп Зех Аз су т та вх на що з5 лиж хе ж во Тая їі мо зх сії башт їх Мкуї Мк жо Ж оту
Уві Аіз Мет Бех Бу Бе Меб ТБ біз Бей Зап обдек Дю Ав Тв Був
ЯН а аг
КЕ 10 10 а СНІ Е же Хо Ми тахіх М Жмежує Женох Хо Жлте о Му ЛЯХ бю зу сем йха йзр Ап оіч бім їжі Беб Бех БЕб Му Її Аго Маї ТуЕ
Е у Е «аж хх зе 335 хо 125
І : пр дя ех нь мк ВН о Не не ШИ НЯ Кома с екз Хом й З джем 03 дав ївж Уві лів Бех ТУук Кі6 біз Бех Хв дез Мт вав вав уз ЗА
Ох Зо ШК я 155 ї5О
Мне ї 15 Кш пи СЕ ДЯ Жук з ЗУ боку їмо ха Ж їж Же Вів бео їж був Вже Її Кто Вів Хар Уві бей Буш був ТКХ шик Кт що: ке її 152 ї55 ї5
МН гя а вч чЯ чо хх Ул ен и о НН х кож дя Ще хів зу Ази Тах баб аа біе Ні Су Щек їз ТВ Ті Аза два вка зе зе чук ах 170 ЇМ ока ях че се Важ с З я Я я ре КЕ хі зх у с що хе ув Блім цех ТВжЕ Маї Бек Ажб ТБх ав вав Кі дів Беж Ва) ВЖИ Вар жо ї85 Її тка СВК
ТвЕОжНЕ кій» 38
«дії 1175
Олю ще «кіс Дяк «Вій» БЕЯУ шеам де «а 35 асзистсеиа зчезавачеева чав асасесавиа вачабеаась соц БеаВО
В вчЧивазівся ссзієсавоч зчачсвсацуз заказ свекЗ абвокоскав Ева у їх5 свззааввовсв ссветавзаи акззасакч ссаккааєов сецввоцатоцє Сезахваєавае 186 сосаоссазЕ кзасатоїяЄ Збсвсамеч аБоасссвУуЧе сСвцозачаза адпасвесака ха зваатасксва сеча асв веаксзкоаса зазносазвкз пвакачатаї засаасасеє оо паксавоазса ккваспозав ззавахцева кккованкче Квасеодах звастеваса зо зптоваекес звабсласас хчацесазяаа коссвизанах сстасазава завескоаеа оз ем ззавсоннія есе стоє вззавизоацо сабовесос сезаїкакЗа пава до аю тхакзоасач саасастазе затазосказа ЄЄзвосвасва засво БФ цяепй 355 зЗесосчаска задавав їаасукетк вавазкзаза бузкасукка саввааевоа. а стасосавзу асвізчосва свусттесак свзазкоєско заавасакск совисккава й часа ета КСВ сасвосасва жссскаса чзачшезаа сеоуєсова 7 та чаЧчаїксо сечових сабзаакси Кекоцесвя засавоах Ззкес
БЕ зсвзїссказ саззассвуУх сваззекаке зсзЕКасувс збсасоззсає зозаоцсвчаЗ ща асоозаснн сортових сСтвезааксає зсепозадав: Зло ззсациве вав
Бассвісає Бодасаеск: зеаааозсса как аксї кЕзвсссввЕх сосебсзе зай
Коссацраз пебівачсав косе че скваудеовова Боцдзаваса свое з тулк
МЕМ сочазизас зетассвсв часова веузсакаєяу сюоуваєвавокх звазиззвааЕ х кер я да в ту ковки их дир мит и уз Ве кожи ччкУкчасса зскасачік зсововехсЗ зсаосвовач зассзоааазчє сассаавасах я 1145 мок й їх ох ою ке ху п ряд фо Кік оку вк КК света с свавзвовтав зв сазах ска яз ач квії» ЗІ рон зжїи КаІНсеЖ уд, ІТИ зможу Уа
Ям ВКМ вруєм й щи з
Ха 5 се Зх гук ба лозу ї? що х - ж ще З шужть З же око йжеу Ж ом ее
Ме Аза бен бе му Уві Буз зем Аво Знав ЖНх бо яз був Ащр пів 1 х 13 ї5 ж 5 Жим ху Мат ножа т ох кою ож Єважою: пк ше мем цем бек беж Бек БУ ТуУух ТВХ їі зів дже дек Тис пі Без де яку Шк І
Й поко ке
У еще Сб Мроднух що й че я ШК З сх Же ую філо ж кос гі їїе Вр о тТвк Бжо Аве Теж Айр осві сів бу Ніж Е3зЗе дяк Був ем сСюхв зх І зх я ай 35 г Ки ж пише вн шо На у ж ЖЖ г ск ЩЕХ єв тону Іф СК, хх ОД хи ПТохжхх ау Мав мем і-й ЩА їпх бам Азов Він аа Мів Був ЕБе Тв БІ у 58 ще бли вах Мо КУ М В х Хе я ство Х щі (тк мех Ех че а А щи їі ЗіУу Меб ем Жук йіз Ме ек ка Бей) щі Ака ЗЕ аю тВЕ її6 5 т ту й
У г. Чо ще зе В У фу гу ше 2 т: їх хі МО КУ МАЮ ж
Му їз їез йху З8в бів піт ТК Нав Уггі Був дів вза оСіу 81 яр щ-к м мк и зо Зх ща ку Я ш ух МК тік В оо У ка тах тк Шах СТ чаї тнс тк нів АхЗ бік вав Бі Ап о Б3іу Був Зо Мас бу ЕВе Баш ке т 3 Ка У
М 105 ІЗ з де баях М бене тож че Міна Ха З ух я ж ах ях т
Уді бо Твх во Бів Зежх бе вх ТвЕ 510 їіе с3ю 115 йо їі ЗВ пок Сх ЗК 1 їх ЕЕ СК Кене
Жах КІ р - те Тако ам Т мо вк ЖИ МО Ж їх ЗУ ий чи зів Зі ех ха вуж ек ТУЮ Муз Беж Бех бен Був ПМ МеВ осі 51
Кей жк, хай 138 15 1
Ки ШЕ Ше їх у КУ Кк то хх м х я джу а Ач о сич нь ча вла кжа за тує вхо МБ ло зе ХО Бе Су У МВ Зі їз че о зи кому 145 Не 135 ї50 покУХ ска лох 5 х їх ох ЧЕ ж й чн Ж че С ке ох І тлу Ж чеку
Кез Су тів вів вів бе Узі їі ТБЕЖ бух Сео Базі дія бі дв» БЕ 155 їй ЗМУ тд у ТУ дух еко ше в НК ку ех ще НІ НН же УВО оих Хояек Ж сх чех БАу зва ТЕ лав Зі сів вкЗз вагу вів вав деп УЗА Бі був Бай ри У Кя є Й
КО ін5 ЕІ сркх вд ат ОН кож Жуки г оукля Же ХЕ х жі А 5 у ух ж піз Жеї Зв ж ТУЖ тв біжЖж і бе БЕ БУ Ар ів віз Веб Бех зцпе ЕЕ тв х 195 ке ях
Яку дет як Ждняу бу Жук ХЛ шо Тек їмо ЖК Ж т «я 5 чи
Тве ТтТук 513 Уді Бе біб б Ні Ве Ніж ВНе їі» вза Узі Бе Уві ря ж че ер «АХ Не ОА жк
ЖК ж ЖУК М гу ше ОВ Ж г де І ННЯ лан ее і ня Бе ее хі
Між Жке зЗіФ Сів аз Зав Хевк дек ТБ дя су біу Звж ЛЯ Са» ій -охк тус ач. пат ха Р 35 4
ЧИ х ГУК Ж БА 1 ХЕ ха ха Ге Др ШК о м В о НИ ак КК аа хх соУ їАе ве ліз піу кед Бе Меї вав віз Тек біб ів Фі пав АХ гуд прим ик ша З 5 кох Ж ог безе ект ШТ ло ж щи 12 хх т баз ких З хо бе ла Ман Жов
Ме мезо Аке Тр осі Уаї Сецз дів Пцуз Зех Узі мМув йви ЩЗіж МеЖ їж
МУК ак зай яви Ох я хат пі. ТЕ. Ж З ме Ж З р ря жом В, рок аю «хх ях с бу жах
Ві Вів Ліз Бек Уві бів Аз сам Ме -ам спів ві Уві пає Уві ух "ув рен зад ші ша ей хх о НО йо ІЗ я Ж ци Ж му І 1; 8. ха о Ж чи Ми бу м м и ів ЖжЕ Аза щЩіюб жо Бе аж пі бій вів баб БТ Тек МНів іє без , зак ем аа З ЗО
Хошає о Маму дних Ко ж х сш дек я о чу я С Ж но таж. АЖ о А ди вай о БкКба Був ів Зек цен мер Зек пев ЖВх Зі Вре рух Між вне с ту ло 5 ри шечЯ
Зі ХЕ ЗО оз лану її 014 Ж З ййеж й Бі їй їду сі ау жі гу Мдув са тах діт
Зах лах Узі Уві їз Бі Ав Аз ів Бах фа щі У Тів Ме зі зі
Ко о 735
Фе зх ВК ду ую Поу боса 3 ще жо За вна Я жа щК.
ТУух Жхв Бім Так ко Вха баб Біб дер без тус Ав Аза Аза Був ВІВ маг дак сект 34 заз ЗО
Ха у З хо г а жди т кім вач му ж. Ве и хх вач чн с "ска
Тек вів бім ЗМ їж; Му з Ан» лу Зв їз» аз бек Бек Уа бе 3х5 Бе ааЗ
Го Фосуту ММ 3 5 Кл ка ху й хз Тр Не Же ХХ кр М дя з 4 Ки тк дав оце Їж Аіз зам осів Бей віч вла їі БУух КМів о сів бе бе Бказ та ЗУ З й хо жує щу роя я кош Кос
Пух Азев вав двев а бів Бе) «Вій» ЗЕ ках я
ОВО енх т вч МЕ ек огбалсв гл жт «Вій ШЕУ чна «хе сект пед чні «ий» ВТР праймер. «0» 36 пзастсачс Сачка зов леї
У
«ах
Мель ях «Ії 5
Ти ж, я. кЕід» Дек кіз» ручна «их ее Ір ше ШИЮ єю ром ах я кА» жу еВСВ плювмМех, «кант Я тксяочстасс зехЕКсосстО сс ще «З ежійх ЗВ «кі й жа УЖЕ «кі» ДЕК «кі» Втучна «а» ЕС енд межи и ЕК КН. «ВО» Я сккофавсскя обов сосок з режи «війв З ста дм кшії» 45 «кій» ДднЕ подане Ше Я сю «кій» шеУузна оо ие сей» СинтежизнемМ променю, лей пак, тк «іх З зааавісчаз азс ахккк стече вата п «10» ад
ЕН КУ
ЖЖ ї У Іа 4 елу о тух, ту «дій» ДНЕ «ж Шу чна «ах «ака КМиТетичниМ пЮОМОтОЮ» «00х Зп ссесвавосса сс сККІКх всвахавокЕ скссавоссаї азваквагзав сасввеввих що засо звеячскозва заквквижест явВЕсевЕКою «асо за
М
«ході кхії» 75 «их «вай» сСеитетичний пременвею, «НМ» «3 тваававссв ззазаЕвекс їтвесстасач Засизивиоа еЕЕБЕЄсКЕКе сКесоаЕееЕ о згзазкевзаса ває
За «кіп» ай «й» ши «вішх ДНК «АїЗ» пюБучЗна «Еш «ка кКинтетичниМй пОсМКЕОЮ. «Ме «а чеЕккезава БЕМКЕІЕКЗЕз ЗзКазаскассс чав севазававеезЕ сао вЕ гпсзозаксс Фабазазакс ззазавсках сстевсесаї сесзводісо зас вззавасе 12 чаазависве ставах Кпевсчуксс зпаковаааех заававсевс севазеесає оакасоассс зон Заававссах сива созсвОоще «ій» 43 «ії» 15 «Вів» ВНЕ «иа» щу чНЗ же» «ака» синтетичний праметсю. касткавааа сБсозаавахаа вквзсаааоЗе КескзваЗа ОБУ савак каву зазїаазктае зазеаакеЕс «тету а зессоЕкаа зиск а
Claims (20)
1. Рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини Анкара (ММА), який містить: (а) щонайменще одну нуклеотидну послідовність, яка кодує мембранний глікопротеїн Е респіраторно-синцитіального вірусу (КЗ5М), де зазначена нуклеотидна послідовність кодує амінокислотні послідовності зЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 16 або 5ЕО ІЮ МО: 6, р) нуклеотидну послідовність, яка кодує КЗМ-нуклеокапсидний білок М та один матриксний білок М2 ЗМ, і с) одну або дві нуклеотидні послідовності, які кодують мембранний глікопротеїн К5М 0.
2. Рекомбінантний вірус ММА за п. 1, який відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність, яка кодує мембранний глікопротеїн Е К5МУ, містить нуклеотидні послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, 5 або 15.
3. Рекомбінантний вірус ММА за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що як нуклеокапсидний білок М К5У, так і матриксний білок М2 К5М кодуються єдиною відкритою рамкою зчитування, розділеною протеазним доменом, що саморозщеплюється.
4. Рекомбінантний вірус ММА за п. 3, який відрізняється тим, що протеазний домен, що саморозщеплюється, є послідовністю фрагмента протеази 2А з вірусу ящура.
5. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність кодує матриксний білок М2, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність КМ 5ЕО ІЮО МО: 14 без стартового кодону метіоніну.
6. Рекомбінантний вірус ММА за п. З або 4, який відрізняється тим, що єдина відкрита рамка зчитування містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотні послідовності зЗЕО ІЮ МО: 10, ЗЕО ІО МО: 12 та 5ЕО ІЮ МО: 14 без стартового кодону метіоніну.
7. Рекомбінантний вірус ММА за п. З або 4, який відрізняється тим, що єдина відкрита рамка зчитування містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 18.
8. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. З або 4, який відрізняється тим, що єдина відкрита рамка зчитування містить нуклеотидну послідовність хЕО ІЮ МО: 17.
9. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність, яка кодує мембранний глікопротеїн з К5М, одержана зі штаму А вірусу БМ, переважно зі штаму А2 та/або В.
10. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність, яка кодує мембранний глікопротеїн з К5М, містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотні послідовності зБЕО ІЮО МО: 2 та 5ЕО ІЮ МО: 8.
11. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-10, який відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність, яка кодує мембранний глікопротеїн С вірусу К5ЗМ, містить нуклеотидну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 1 та 5ЕО ІЮО МО: 7.
12. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-11, утворений на основі ММА-ВМ, Зо депонованого в Європейській колекції клітинних культур (ЕСАСС) під номером М00083008.
13. Фармацевтична композиція, яка містить рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-12 та фармацевтично прийнятний носій та/або розчинник.
14. Вакцина, яка містить рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-12 і фармацевтично прийнятний носій і/або розчинник.
15. Застосування рекомбінантного вірусу ММА за будь-яким з пп. 1-12 для виготовлення фармацевтичної композиції з метою лікування або попередження інфекції вірусу КМ.
16. Застосування рекомбінантного вірусу ММА за будь-яким з пп. 1-12 для виготовлення фармацевтичної композиції з метою лікування або попередження інфекції вірусу К5М у суб'єкта шляхом інтраназального або внутрішньом'язового введення.
17. Застосування рекомбінантного вірусу ММА за п. 15 або 16, який відрізняється тим, що рекомбінантний вірус ММА знаходиться або вводиться в одній або декількох дозах імунологічно наївному або імунологічно компетентному пацієнту-людині.
18. Застосування рекомбінантного вірусу ММА за будь-яким з пп. 15-17 для введення пацієнту- людині віком старше 2 років.
19. Застосування рекомбінантного вірусу ММА за будь-яким пп. 15-17 для введення пацієнту- людині віком молодше 2 років.
20. Спосіб лікування або попередження інфекції вірусу КОМ у суб'єкта, який включає інтраназальне або внутрішньом'язове введення суб'єкту рекомбінантного вірусу ММА за будь- яким з пп. 1-12.
- КхЯ ІМ К х Ме щ Ку ХУ ке ЗЕ хе З ш Кх Ко БУ В її щ за т ней : БЯ ПЕ ЩЕ ПИ гу НЕ Ід ІБ Ж п; І Ж гу 1 КЕ ТА ХУ. - ОК З НЕ і во ЕК її Ж їх Ж НКУ р їх ко 1 Же ок ОК ок НИ Ех КУ м шк щ БУ в ЩА ж ща 5 м о І НО у о с І НО МІ еВ Е в Кк ІІ ве ке НН шу КПА с, У Гл зе їж ! 2 З З й ї З но. Ж хх - ОО шок Тх БУ ІІ зош де ри ре У Ша г ж іі їж: ще ! НК оо КІ д БВ : ЦЕ ХЕ шко І5щА ЩО ОН Я Ж: де 8.15 ОО 5 кої іч т а 11 МАТ ВА НЕЗУА я ЖЕ Ж ОР ВОК: ХчУУх НО Ох хх ЖАВ ОС І Іхи шОБ Ї ун и ни ї пої КТ ЖЖ мить : : М дек Шен М: ї ї ЩЕ п ний СК р ще на: кг 1 АЖ Б її І и же і о В о о Зони Е и Ге І Ве В НЕ І І їж Не і І я Бе КО КО її МО ЕК ЩЕ яЩЯ НИ Боож Ї МО Я ек ІІ їжі іш ЩО: : ї ї Но Ку Н Я кю ТИХ Зх Ж не ї З Би І пиикх і: Шени, Кн рої в Н хо ех г ТІ НН ку КОХ ВЕ 3 3 Ці ІЖ їж ї щі 4 1: Км ЕН НН УВУ З її хо ЕК ІК МЖЇ ОЙ Ж ПК ЕН: тк РЕ як ЕОМ В; МІ ке Ії ЕН ВЕНИ: вк 1 І ке м кон а і я и ї ї КУ як. ТЕ 3 пах фжуж вті дк з де імунізації
Я. після іч інунізаий «ля Ко бмунізанії КУ Й дм ко зх ж Я с првн Я-ВК іронії - нівчя Зак Емукічанії З В ще щ ння Х Н рве ОЩЕ х ї ї Га зи г рн ши я К З - : ЩЕ ще Б 5 З і ж щі 28 фуееянтя ш-- . й і. що З Б ше. ! ЗУ ДЕН и КУ КОН С В ше шщ ше щ щ з х З з Ко я Ф их ши ше нн 5 ІІ ; ! ЩЕ ще | ІЗ ух ння ми оо . У 5 З З Ме ТИ я 5. У : о МКООО0ЗЮ Ве З ХМккнннтня В З МО -- Кк Ж В НЕ. шо 2 ї о в шк зма ння з Ж ! З ША ШЕ. я ре ТИН 55 ЩО КУ І ЕХ ЯЗ з о п КВК шия за х. як Ж Е я Я шк КМ о сен Як пеюжн ВВ а пхжхх Е ТИ Я жк м сн от БЯ ТІВ ПК ще ж ОК Зк Ж прудка ВК нов ЩІ УА шк шк . - з Н ЯК ВН ПОВ т ПО: ЗВ М В я 5 Я хх В. о ях за г. ХЕ що КУ Я сек Від меми Ж ОН В Х ВУ ХХ сш КЗ ЕС: Зх се ж ія й х ж СО ОН УНН ЗА
- . х тк Ка м ке ех я Я Я ще КЗЗ г ОМ КК ех. в ще и м за А 2 Ко ех Що Й М й Кн сдй Же ч мо Не Й Ух як?
ЖЕ нн в В х Ку ЕЗ б КУЗЯ п в В ОКУ я ях мкВ х іона ОК оо Й в : їх Яхве ; в Я кож ни, й Сов КЗ КЕ нн и нн ой ря х Й ик Ба З ї со Полк я Ж СКОВЕНЕ фесесюєюєєєюююсюккккуккккккукеккуккт КК йо ко фуд Вт ехткжж ш хе и ТИ сід Й р Кові Ті сере Мекка; По, 5 Пужее вве зі чи - її з З во ко ою: я Мк м Ж Ме КК ік їх я НК: аванни щ В ТЕ КВК 5
- а. КичАя СКУ с, сю 8 хх: ІЗ пречйхе КК Я їх жжжжжж жітті кпк тіні тт я кітч тки Ка З ЕЕ УК кв Му ях З ОгУ г ах ВІН Те ке кВ В ж їх в я : Щ пу ї кров КК КВК у: хх. сх Бе ЗК се, Фа, Є. 5 ЕЕЯе р МУ НКїх ня х З шко оку ї рев МК НН ж їх Кк и ана з. х - ВІД ненні сх
ЖЖ. як зі мк Жука і: Козвезення вік. З НК Іє ККУ У т оо кунх : З З і о З ва: й н рошня ЗЕ по с НИК сс секукукккккккнн. Ех ЗЕ Зкенхотосносттсо нн дк дюн В ннннен еВ ання в що КЕ ЗО ЗО Я ях ї ЖЕ ВДКИ фроооооаюдююютюскх ооо ВВ фасон де ДВ ВВ ен вх їк ЕЕ Во до Не що ща : ШЕ пиши ше ше ек ше ше во ках М Коен ЕЕ ЕЕ В ща я 5 ТК ЕК о ДО ми и нт і як вк к вв їх ТУ ї ПИ КИ ТПИТИОЇ ИИИК. НК: оон Ок Її УК БІПИИ ПИ ооо ПИВ ПИ ре й ї дн В дон Кс З: ПИШИ - їси З ХНУ: ен юкухиих В ес В кю В ннк щи. Я ще Ох ЗУ Хв КИ Конт уко: МИТІ : ї УК Ко ПИ ШИМИ ПК ШИК ї Е МУКУ рекет де вк ОО я Ох Ку І ПЕН КБОИИНИОІ дання ННЯ ЕН ин ще це с дя ВОК оо щу я да з -е ща дн В окр ЯН хо НЯ В недттй КИ ннкодею ВЖК оо нн г хх «ех БЕЗ ех вх я ЖЕ х яке ще У ще в КЕ ких ак щі ; ше ши ше ВИШ С ії шк ши Шк ШИ й Я хо ха Я Ко «щу ще «ЖЕ ках А «КЕ хі: СЯ В що Со Є як З я Я же Ку ща а « Бк ях Х Я
ЇХ хо імунний Я зіеляа її Вау Ж «вісля до імунізкнії Я «уйсни Зої інуніанйї щ ; х В БУХ я ж ше ше ши віх : ЗХ ЗК сх ЕЕ ХХ З Ж ІДЖКЕ Дону КК нн в ше шк шк ше т ЩЕ ї ж чх хх с КК пек сш КК У і г ВІНИК: - . Ж Пе нема шк шк в ще ше. -- - Х Н ож гі У ах ЛК гот АХ "ш в. шщ й я Я се шини ши о шк ше Я я зе Же о зе о хх . ще іх Ж КУ Коднннннннтнннаннннн З нини о ще СВ ех -- В ша З З. я У : З м З я я 8 : ск рення . се ї рун . ше ж з ши щу КЗ я Шини . КИ ши ех - ще 5 я ше а Є шк АК ше зві Я ж є в В НН Ям с : У ЖЖ і: ЕЕ: он окон нн ння нал, Кннн кн нон кн б й. ШІ їв і: гЗ Е І д банок С ше шо ши і мені - птн ж нн ж я з | : В | Ш п. що ЦЕ ккеехккюкюккюхю ОХ ЕЕ. пок 5 вн ее хх Я : о | 5 що о - Ж її ї ЦІН дукскєєюккктю кю ВК КК кн МИВКе КК ее В КК «Ку В ВК Ж не ОН г: г г її го ше й ше. зав Мк ВОВНА ов ВО що й З Ох КЕ в Я я Ж кі Кй и ск Ше ще їК в з К Ко ях з ях
1 ЗВ: ЗИМ ЗИ НЕ ЗНИЖЕН і КУ к ї що ОВ ож ОБО ж 1 кн хх : я Ж ОЖ ОХ ЖЖ ЖІ І і й ж х КУ Ж Ж ЖІ 1 Н Еш 1 КЗ З х С ЗНИЕ : Ме 1 А 3 У ї 5 Ж ШІ о орвумуюуи її ож й хх В я ЖІ ОО Ко Я ! Ж Я Я Ж МО ХЕ : кВ Ех ХК : Н Е З РКК ! | і | ! ї З : ех УМО : і Е : | НВ : | Е і нин; : | ! | «ВВЕ - і Н і 3 і іх і Е і і : | Її : : ї Е : Е ; : 3 і Н : і ЩО і Е за о по зо й : ши Е : : КЕ і К ооо х ї : і ї о и ! : і | ко й М З хе Я ях г К-я Індекс суму цний Чеережжи: знесення сечафічанх ЯК ревюретевузнх зів ва ТО. весевновниснв БЕМІ ві ОБ г а я ак ШК: о о ИН о НИЙ Шо
У І. ех ни ня ин Ж У Ом КО й сен ШОУ як Я Бе ВК пихи ІЗ х с З ух з ; Я й: нена ФО дк Я є і і: й б В у; ке ї а же КУ тт во Ж і: хі т т Жу Ж ГДНННня йк ї їж хіхЕ ї ха се 4 ой? Я ше ши а й Е З жену п нин я ее з
«жк. 5 1 З кожи клюють, хе ж СУ сш ї воОООяЕ ше а во с НН Віда ЗВО ж, Ше МОВО 0000 квамеюв ох я ша ше БО се мееюамен ох і "В Зх Он кали Кеш Ж ооо с 0 ЯНОМ Нюх Ше ши но о я що Косар На Мо КЕ Х чес піст зр ен С во В
МКК Фр ня н-к ТВ ВХ КВ тт у у КК юю ююютююеккх я ж 5 СЗШ ДЕ ее М: ВО НН С; т код 55 я щх кн ж - о
Ме. я З в З що ТЕ Сх МЕ ге ще шо - Х у: Ж Еш КЗ ЖЕ Ж ЩЕ Я ки дк ше ши ще ше шк Шк ШЕУ СжеЙ ке ВН НН Ше: Ж Я ше ши ни ше ШК І 5 я Шк ше ШК ШЕ ш шк Ин НЕ ЩА М ШК М ВИ ЗМ МЕ а Ян З - І НУК и ун пе КК Ж В 5 й я, -ко Сх Сх ї З 5 м здннх 08Я З ща що ща гай ї ВАЖКЕ ру фа ВІД У Уа вн ВВ шо що Тех с ЖИ З ж ще щх 5 як С КЕ ж 5 ЕВ Ей 5 сежжжже жи ОХ но а за ах куки ОВ прим ща -- ж м ї ща Її В 5 я З ко Ж - А ВК Во щ-е З щи ВИК шо В ши ши ше ше ше ши ши й ж й о ЕЕ ще щі ши що Ж Б Ї Ж. се с ВК Ж Кс екс Я ше сш: ше ше шк шик ше ШЕ ШІ вх : ше Ше ше ШИ ШЕ ШЕ М я ярі. НЕ Ей Я . ння пня . - те ККУ іх 5 ч їй Б ЗЕ Я Ме Е- я ; я. . Б я Я а рЙ й к-
-. К У що 5 є з як щ о Кк я й ше ше ше: ії
Я пиннняох - . : Е І" їв Н й ї | вто ке . я ак а з зе щ- «а я Ко Я як ши ши ши шк шк в а чаї чи І І НИ о Е а К-й ЕЕ ск ше шо «чне з. ЩЕ ЖЕ. жу, щ-к І З : Б В 5 ни НН ! їі о ; М ЗО ї ко КЕЕОООЯ зоововвах ВО шщЕ- ї о ще СОЯ З ОКО я ї щ- ш-е- вх ші ще ще 5 во же 0 В Ко ще 0 г х Ко 5 і я зе я й ж й як Кз я Ж и ще ще ще во « її 2 ; с ше п. х ЕКЗ брнкеткетютех кет М ПО Я я і 5. ЗОЗ ї - ї щ о т щ зе, щі «дк Кк лак ЗО Вт ОВ и я КЕ Е с 5 і; з ще : ЕЕННК В ОВ ИН ве 1 дя М. Ба ВО бе і дО Ес м ня т К. обуххнннкнн кують КК, сухедеютню КК оеоуєт ВИН ус муєт ЖЕК сну З Я я Кй ву со У | а во су - Ж Ко КО Я Ж І ях Кон КЗ ! шк Ше Кк де а Б СЯ -Е бів
Кк оон нн вн нн поковок КІ і В ет НН Е І : Зе ї ЕН й : ї Є жрхаиед вм: КЗ З ще Ек ши й - око нн п хххкжхккжанхя . дхххкхх Ж що -- . Моя не у п ХВ орнея Во ! ОВ КУ ; пи шк ЗК : у З . - В В ; :щ, | ох а МВУУ феееетеетнтетнннннх денні Шеокх ння колл ня ях 5 т ши ші ще ї ще: ок ще КУ ж ї Бо я Ку ву - 5 г Мо К Як Кз ж 5 Я 5 о І к. ЯН ТЕЖ я Ки он, п. ШЕ її г де і : ; Б ЗЕ Меч 58 КО мВ о с я щі а КЗ щі А В в- . З ее щ ЩЕ Ж м Ко ща Я ях їх як Ж що : ши СН: я а я ЕЕ жк є ЗА Я м ше ше НН. якіх Я НК З ТЕ що о І я В 5 як СО Ж Я ії В а Ох КЕ З к з Ії З КЕ я що я Я і-ї З я -е В 5 й я щ кл Би в. ШЕ ше шщ Я їі В ПИТИ ВК п СВ КТ Е : 5 ше ше ще ще
Щ. Ей | шщ щ ще що Шк и шини ше шк ше що : т ї М. З ще же ще ГЕ; Ки од Ех їх ; в Се 1 с: ше: ше ше и и мк Я з ой де ча ЕК ЩЕ ах й Ка І ек НИЙ чне ії
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261678367P | 2012-08-01 | 2012-08-01 | |
| EP12005594 | 2012-08-01 | ||
| PCT/EP2013/055483 WO2014019718A1 (en) | 2012-08-01 | 2013-03-15 | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA123385C2 true UA123385C2 (uk) | 2021-03-31 |
Family
ID=66440168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201501765A UA123385C2 (uk) | 2012-08-01 | 2013-03-15 | Рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини анкара (mva) та спосіб лікування або попередження інфекцій вірусу rsv |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP6895944B2 (uk) |
| DK (1) | DK2879702T3 (uk) |
| ES (1) | ES2767324T3 (uk) |
| HU (1) | HUE047102T2 (uk) |
| LT (1) | LT2879702T (uk) |
| PT (1) | PT2879702T (uk) |
| UA (1) | UA123385C2 (uk) |
| ZA (1) | ZA201500606B (uk) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT2879702T (pt) * | 2012-08-01 | 2020-02-04 | Bavarian Nordic As | Vacina para o vírus sincicial respiratório (rsv) de vírus vaccinia modificado recombinante ankara (mva) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2684578A1 (en) * | 2007-03-21 | 2008-09-25 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Chimeric antigens |
| EP2461825B1 (en) * | 2009-08-04 | 2017-05-31 | The Government of The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, | Anti-rsv immunogens and methods of immunization |
| US9173933B2 (en) | 2010-10-15 | 2015-11-03 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus Ankara influenza vaccine |
| WO2012085936A2 (en) * | 2010-12-20 | 2012-06-28 | Panacea Biotech Ltd | Recombinant respiratory syncytial virus plasmids and vaccines |
| WO2012089231A1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Okairòs Ag | Paramyxovirus vaccines |
| CA2879915C (en) | 2012-08-01 | 2022-07-05 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| PT2879702T (pt) | 2012-08-01 | 2020-02-04 | Bavarian Nordic As | Vacina para o vírus sincicial respiratório (rsv) de vírus vaccinia modificado recombinante ankara (mva) |
-
2013
- 2013-03-15 PT PT137177218T patent/PT2879702T/pt unknown
- 2013-03-15 UA UAA201501765A patent/UA123385C2/uk unknown
- 2013-03-15 HU HUE13717721A patent/HUE047102T2/hu unknown
- 2013-03-15 ES ES13717721T patent/ES2767324T3/es active Active
- 2013-03-15 LT LTEP13717721.8T patent/LT2879702T/lt unknown
- 2013-03-15 DK DK13717721.8T patent/DK2879702T3/da active
-
2015
- 2015-01-27 ZA ZA2015/00606A patent/ZA201500606B/en unknown
-
2018
- 2018-12-26 JP JP2018242562A patent/JP6895944B2/ja active Active
-
2021
- 2021-06-04 JP JP2021094027A patent/JP7317896B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2021137023A (ja) | 2021-09-16 |
| JP2019068833A (ja) | 2019-05-09 |
| HUE047102T2 (hu) | 2020-04-28 |
| JP6895944B2 (ja) | 2021-06-30 |
| ES2767324T3 (es) | 2020-06-17 |
| PT2879702T (pt) | 2020-02-04 |
| JP7317896B2 (ja) | 2023-07-31 |
| LT2879702T (lt) | 2020-02-10 |
| DK2879702T3 (da) | 2020-02-24 |
| ZA201500606B (en) | 2020-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7113924B2 (ja) | 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）フィロウイルスワクチン | |
| US20210196814A1 (en) | Recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) Respiratory Syncytial Virus (RSV) Vaccine | |
| Enjuanes et al. | Molecular basis of coronavirus virulence and vaccine development | |
| US11571471B2 (en) | Recombinant modified vaccinia virus ankara (MVA) equine encephalitis virus vaccine | |
| US20090214587A1 (en) | Recombinant virus and use thereof | |
| US11896658B2 (en) | RSV vaccines and methods of production and use thereof | |
| UA123385C2 (uk) | Рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини анкара (mva) та спосіб лікування або попередження інфекцій вірусу rsv | |
| WO2024079285A9 (en) | Treatment using a one-to-stop attenuated sars-cov-2 virus | |
| CN113227360A (zh) | 具有新型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的DIs株来源的重组牛痘病毒 |