CN113736876A - 一种快速检测染色体数目异常的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种快速检测染色体数目异常的试剂盒及其应用。在一管PCR反应液中利用31对引物同时扩增13号、18号、21号、X和Y染色体上的31个DNA位点，达到检测临床样品中13号、18号、21号、X和Y染色体数目异常的目的。所述试剂盒包含ANEU反应液、ANEU引物混合液、热启动核酸聚合酶、ANEU正常男性对照、ANEU正常女性对照、ANEU空白对照。本发明检测周期短，获得样本后可于一天内得到结果，且一个样本仅需进行单管扩增，检测技术流程简单，可实现高通量、快速、标准化的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种快速检测染色体数目异常的试剂盒及其应用。
背景技术
染色体是遗传物质的载体。正常状况下，人类体细胞中有23对染色体，每对染色体都是一条来自父方，另一条来自母方，其中，有22对染色体男女都一样，为常染色体，有1对染色体决定人类性别，为性染色体。染色体数目与结构异常是导致新生儿出生缺陷的重要原因之一，在新生儿中染色体异常率约为2.4％(染色体数目异常率约为1.4％，染色体结构异常率约为1.0％)。由于染色体上存在上千甚至上万个基因，染色体发生异常将会导致许多基因的增加或缺失，就可能造成个体的异常现象，例如唐氏综合征(多了一条21号染色体)、特纳氏综合征(少一条X性染色体完全或部分缺失或结构异常)等，都属于染色体数目异常之疾病。
临床上常见的唐氏综合征(T21)、爱德华氏综合征(T18)、帕陶氏综合征(T13)及X/Y染色体异常占新生儿染色体病的85％～95％，其异常占比约为：T2141％、T1818％、T133.2％、X单体6％、XXY6.5％、XXX3.2％、XYY2.1％、三倍体综合征0.7％。
唐氏综合征(T21)患儿有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形。临床患者面容特殊，两外眼角上翘，鼻梁扁平，舌头常往外伸出，肌无力及通贯手。患者绝大多数为严重智能障碍并伴有多种脏器的异常，如先天性心脏病、白血病、消化道畸形等。该病发生几乎波及世界各地，很少有人种差异。
爱德华氏(T18)患儿表现为生长迟缓、上睑下垂眼睑畸形耳位低小嘴小下颏皮肤斑点示指超过中指并握紧拳头、并指(趾)畸形、摇篮底足(rocker-bottomfeet)足趾大而短、室间隔缺损脐疝或腹股沟疝、胸骨短、小骨盆和肌张力增高，偶有癫痫发作、严重精神发育迟滞等，预后极差，95％在胎儿期流产，出生患儿1/3生后一个月内死亡，50％在生后两个月死亡。
帕陶氏综合征(T13)患儿表现为小头前额凸出、小眼、虹膜缺损角膜浑浊、嗅觉缺失耳位低唇腭裂、毛细血管瘤、多指(趾)畸形、手指弯曲、足跟后凸右位心、脐疝听力缺陷、肌张力过高及严重精神发育迟滞等，帕陶氏综合征胎儿多数无法熬过孕期。
特纳氏综合征(X单体)，又称先天性卵巢发育不全综合征，患者比正常女性少了一条X染色体，导致相关临床症状，包括原发性闭经、蹼颈、肘外翻、身材矮小。X染色体数目增多(XXX)，患智能落后及先天性异常的风险则加大，特别是有三个以上X染色体；克氏综合征染色体异常表现为有两条或两条以上的X染色体和一条Y染色体(XXY、XXXY等)，表型为男性，在男性活产儿中发生率为1/800，这类患者临床表现身材一般较高，四肢较长，与身体不成比例，常有小而硬的睾丸，约1/3患者会出现乳房肿大，青春期发育正常，但面部毛发稀少，有学习困难倾向；许多人语言能力不足，听写及阅读亦有困难。XYY综合征的染色体异常表现为有两条Y染色体和一条X染色体，为男性表型，男性中发病率约为1/1000，患者比正常人高，与其家庭成员相比，其智商降低10～15个百分点。体格发育基本正常，可有微小行为异常，活动过度，注意力缺乏，学习困难等。
随着对胎儿先天性染色体异常导致遗传性疾病的研究范围的扩大与深入，产前诊断越来越受到重视。以预测胎儿是否患有先天性或遗传性疾病、遗传缺陷、畸形等不正常情况，以便采取措施。现今的产前诊断技术简便、安全、可靠。主要是羊水穿刺技术和有关的实验检查。一般在妊娠16周后抽取羊水，然后进行细胞染色质检查、细胞培养做染色体核型分析或荧光原位杂交分析等。
染色体核型分析为染色体非整倍体检测的金标准方法，但该方法对样本的需求量较大，需要额外细胞培养时间，且细胞生长速度不一，做染色体的染色与排序耗时费力，平均需两周的时间得到结果，时间与人力的成本高；荧光原位杂交法将荧光素标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对杂交，在荧光显微镜下观察，检测的步骤繁琐、周期较长，灵敏度与特异性较低，受限于显微镜分辨率，对操作人员判读的要求较高。
多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependentprobe amplification，MLPA)搭配毛细管电泳仪分析，其原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，杂交后的探针通过DNA连接酶连接，再针对连接的探针进行PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后计算染色体数目。但由于需要探针杂交以及连接酶连接，步骤较多检测耗费时间约需要2天。
有鉴于此，需要一种准确、专一、快速来检测人类个体13号、18号、21号、X和Y染色体数目的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测染色体数目异常的试剂盒及其应用。所述的染色体指的是13号、18号、31号以及性染色体(X和Y)。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速检测染色体数目异常的扩增引物组合，该引物组合共包括31对引物对，可同时扩增以下DNA位点；具体为8个13号染色体的STR位点(D13S742、D13S765、D13S305、D13S801、D13S634、D13S258、D13S628、D13S796)、8个18号染色体的STR位点(D18S391、D18S976、D18S1002、D18S535、D18S536、D18S386、D18S875、D18S390)、8个21号染色体的STR位点(D21S1432、D21S1414、D21S1437、D21S1435、D21S1809、D21S1412、D21S1411、D21S1446)、3个性染色体的STR位点(DXYS267、DXYS218、DXS6789)和4个与性染色体数目异常相关的基因(ZFX/Y、SRY、AMEL、TAF9L)。
上述引物对如表1所示：
表1用于扩增31个DNA位点所对应的引物对
上述引物对的正向引物的5’端标记有荧光基团；所述荧光基团选自选自FAM、VIC、HEX、JOE、TMR、NED、PET、ROX中的任意一种。
上述一种引物组合在制备染色体非整倍检测试剂盒中的应用，所述试剂盒，组成成分包括ANEU反应液、ANEU引物混合液、热启动核酸聚合酶、ANEU正常女性对照、ANEU正常男性对照、ANEU空白对照；所述ANEU引物混合液中包含上述31对引物对；所述ANEU反应液中包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种。
上述检测试剂盒的检测方法为：利用31对不同引物在一管反应液中，进行PCR扩增反应，同时扩增13号、18号、21号染色体及性染色体上的31个DNA位点；将DNA待测样本使用染色体非整倍体检测试剂盒进行PCR扩增反应产生的PCR产物，以毛细管电泳仪进行片段大小和丰度的分析，以片段大小和丰度区分31个DNA位点。
本发明的特点在于：
(1)染色体数目检测的金标准核型分析细胞培养时间长，再加上染色体制备时间，在显微镜下核型分析(计数染色体数及条带分析过程)，平均检测时间约为两周。13号、18号、21号、X和Y染色体数目检测常用的荧光探针杂交技术(MLPA)，其基本步骤包括探针与靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，数据分析，整个的实验流程需要约2天。而本发明检测技术流程简单，整个流程包括荧光PCR扩增、毛细管电泳片段分析，通过特殊的引物与PCR反应体系的设计，同时将31个DNA位点在同一管PCR反应中扩增，同一样本不需多管操作，有效减少了操作时间、降低操作失误的可能，并减少了无法判读需另外检测的机率，可在一天内快速获得检测结果，容易实现标准化。
(2)本发明检测灵敏度高，样本浓度低至2.5ng/μL时，依旧能准确判读13号、18号、21号、X和Y染色体的数目。
(3)本发明所选取的DNA位点临床意义明确。
附图说明
图1为正常男性个体样本电泳结果图。
图2为正常女性个体样本电泳结果图。
图3为13-三体异常样本电泳结果图。
图4为18-三体异常样本电泳结果图。
图5为21-三体异常样本电泳结果图。
图6为X单体异常样本电泳结果图。
图7为XXX异常样本电泳结果图。
图8为XXY异常样本电泳结果图。
图9为XYY异常样本电泳结果图。
图10为三倍体(69，XXX)异常样本电泳结果图。
图11为三倍体(69，XXY)异常样本电泳结果图。
具体实施方式
实施例1
1、ANEU反应液与ANEU引物混合液配制
表2 ANEU反应液组分配制表
| 组分 | 每反应终浓度 |
| 10XTaqBuffer(Thermo) | 1.5X |
| 25mMMgCl<sub>2</sub> | 5mM |
| 甜菜碱 | 2.0M |
| dATP/dTTP/dGTP/dCTP | 0.5mM |
表3 ANEU引物混合液组分配制表
| 引物名称 | 荧光修饰 | 终浓度(μM) | 引物名称 | 荧光修饰 | 终浓度(μM) |
| SEQ ID NO.1 | VIC | 0.9 | SEQ ID NO.32 | - | 1.0 |
| SEQ ID NO.2 | - | 0.9 | SEQ ID NO.33 | FAM | 0.53 |
| SEQ ID NO.3 | NED | 0.7 | SEQ ID NO.34 | - | 0.53 |
| SEQ ID NO.4 | - | 0.7 | SEQ ID NO.35 | FAM | 0.79 |
| SEQ ID NO.5 | NED | 0.69 | SEQ ID NO.36 | - | 0.79 |
| SEQ ID NO.6 | - | 0.69 | SEQ ID NO.37 | NED | 0.75 |
| SEQ ID NO.7 | PET | 0.39 | SEQ ID NO.38 | - | 0.75 |
| SEQ ID NO.8 | - | 0.39 | SEQ ID NO.39 | NED | 0.39 |
| SEQ ID NO.9 | PET | 0.78 | SEQ ID NO.40 | - | 0.39 |
| SEQ ID NO.10 | - | 0.78 | SEQ ID NO.41 | VIC | 0.48 |
| SEQ ID NO.11 | PET | 0.66 | SEQ ID NO.42 | - | 0.48 |
| SEQ ID NO.12 | - | 0.66 | SEQ ID NO.43 | FAM | 0.48 |
| SEQ ID NO.13 | VIC | 1.40 | SEQ ID NO.44 | - | 0.48 |
| SEQ ID NO.14 | - | 1.40 | SEQ ID NO.45 | PET | 0.80 |
| SEQ ID NO.15 | FAM | 0.86 | SEQ ID NO.46 | - | 0.80 |
| SEQ ID NO.16 | - | 0.86 | SEQ ID NO.47 | VIC | 1.02 |
| SEQ ID NO.17 | VIC | 0.85 | SEQ ID NO.48 | - | 1.02 |
| SEQ ID NO.18 | - | 0.85 | SEQ ID NO.49 | NED | 0.58 |
| SEQ ID NO.19 | FAM | 0.36 | SEQ ID NO.50 | - | 0.58 |
| SEQ ID NO.20 | - | 0.36 | SEQ ID NO.51 | FAM | 0.38 |
| SEQ ID NO.21 | NED | 1.12 | SEQ ID NO.52 | - | 0.38 |
| SEQ ID NO.22 | - | 1.12 | SEQ ID NO.53 | FAM | 0.45 |
| SEQ ID NO.23 | PET | 0.6 | SEQ ID NO.54 | - | 0.45 |
| SEQ ID NO.24 | - | 0.6 | SEQ ID NO.55 | VIC | 0.70 |
| SEQ ID NO.25 | PET | 0.52 | SEQ ID NO.56 | - | 0.70 |
| SEQ ID NO.26 | - | 0.52 | SEQ ID NO.57 | FAM | 0.48 |
| SEQ ID NO.27 | NED | 0.74 | SEQ ID NO.58 | - | 0.48 |
| SEQ ID NO.28 | - | 0.74 | SEQ ID NO.59 | FAM | 0.43 |
| SEQ ID NO.29 | FAM | 0.45 | SEQ ID NO.60 | - | 0.43 |
| SEQ ID NO.30 | - | 0.45 | SEQ ID NO.61 | FAM | 0.83 |
| SEQ ID NO.31 | VIC | 1.0 | SEQ ID NO.62 | - | 0.83 |
实施例2
PCR扩增与结果分析
1、样本处理：核酸提取仪(MagCore)以及核酸提取试剂盒(MagCore Genomic DNAWholeBloodKit)提取人类基因组DNA用于后续的PCR反应，DNA浓度为2.5ng/μL～100ng/μL，OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
2、扩增试剂配制：
(1)从试剂盒取出ANEU反应液、ANEU引物混合液，于室温解冻，上下颠倒混匀后，用微量离心机短暂离心，使所有液体沉降于管底。
(2)扩增试剂配制：每个扩增反应取17μLANEU反应液与5μLANEU引物混合液至1.5mL离心管中，再加入1μLDNA聚合酶，混匀并短暂离心。为了减少分液误差，在配制扩增试剂时根据样本数量(n)分别取(n+1)人份的反应液和混合酶。n＝待测样本数+ANEU正常男性对照1份+ANEU正常女性对照1份+ANEU空白对照1份。
(3)在PCR反应管中分别加入23μL配制好的扩增试剂，转移到样本处理区加样。
3、加样：在对应的含有23μL的扩增试剂的PCR反应管中分别加入2μL的待测样本基因组DNA、ANEU正常男性对照、ANEU正常女性对照与ANEU空白对照，盖上PCR反应管盖后，短暂离心。
4、PCR扩增与毛细管电泳仪分析：
(1)将PCR反应管放入PCR仪，设定反应程序(95℃/5min；95℃/30s,59℃/30s,72℃/1min,32cycles；72℃/30min；4℃/O/N)，反应体积设定：25μL。
(2)毛细管电泳分析PCR扩增产物：采用ABI3130、ABI3730、ABI3500Dx、或ABISeqStudio GeneticAnalyzer毛细管基因分析仪进行检测，取1μL扩增产物、10μL1％GeneScan 500LIZ Size Standard(以10μL GeneScan 500LIZ Size Standard中加入990μLHi-Di Formamide配制，即为1％GeneScan 500LIZ Size Standard)，95℃变性3分钟，立即放冰上2分钟，上机检测。
5、软件分析：
反应程序结束后，以GeneMapper软件对PCR扩增产物进行片段大小分析，分析所需的Analysis Method、Panel与Size Standard文件可从公司网站下载，数据导入、分析参数设置和结果分析具体信息请参见GeneMapper用户手册。
6、检测峰比值计算：内控位点应为单一检测峰，其他检测位点可能为一至三个检测峰，当单个检测位点为两个或两个以上检测峰时，需计算其检测峰比值(R)，检测峰比值(R)为片段长度最短者的检测峰面积除以片段长度长者的检测峰面积，即左峰面积/右峰面积，并四舍五入至小数点后第二位。
7、结果判读：
(1)据下表TAF9L、常染色体与性染色体位点的检测峰比值(R)参考范围进行检测峰面积比的判读。若检测锋比值落于检测峰比值范围外，需要重新检测，检测结果按表4判读。
表4检测峰比值(R)参考范围与检测峰面积比
(2)检测型别按以下方式判读
A.常染色体结果判读
a)13、18、21号染色体数目无异常：对应的常染色体的检测位点中，至少两个位点呈现1:1，其余位点为单一检测峰。
b)常染色体三体：同一染色体8个检测位点中至少两个位点呈现1:2或2:1或1:1:1，其余位点为单一检测峰。
c)同一染色体检测位点中仅单一位点呈现1:1或1:2或2:1或1:1:1，其余为单一检测峰，建议重新检测，按该单一位点结果进行判读，并以其他方法学做确认。
B.性染色体结果判读：根据性染色体的检测峰面积比按下表进行型别判读，若结果不符合下表，建议重复进行PCR扩增，若结果仍不符合下表，建议以其他检验方式确认。
表5性染色体检测峰比值(R)与型别判读
实施例3试剂性能验证
1、评估本发明试剂的诊断准确度
检测14份准确性参考品，如下表，检测浓度为25ng/μL，检测三批试剂，检测结果符合要求。
表6准确性参考品的基因型
2、特异性参考品符合率
检测2份特异性参考品，如下表，检测浓度为25ng/μL，检测三批试剂，检测结果符合要求。
表7特异性参考品的基因型
3、重复性
检测2份重复性参考品，25ng/μL浓度进行十重复检测，检测三批试剂，拷贝数判断皆正确，检测结果皆符合。
表8重复性参考品的基因型
4、检测限
检测10份检测限参考品，如下表，浓度分别稀释至2.5ng/μL，检测三批试剂，检测结果重复数皆符合要求。
表9检测线参考品的基因型
实施例4
1.收集172例羊水样本，采用荷兰MRC-Holland公司研制的
Probemix P095(多重连结探针扩增法)作为参比方法，验证结果之间的一致性。
2.收集172例羊水样本采用核酸提取仪(MagCore)以及核酸提取试剂盒(MagCoreGenomic DNA WholeBlood Kit)提取人类基因组DNA，用微量分光亮度计检测DNA的浓度与纯度，172例样本浓度为2.5ng/μL-100ng/μL，OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
3.按照实施例2的步骤，进行DNA加样，以PCR仪进行反应。
4.按实施例2的步骤，进行结果分析，结果如下表，其中21三体综合症检测35例样本、18三体综合症检测19例样本、13三体综合症检测6例样本、X单体综合症检测10例样本、XXX综合症检测2例样本、XXY综合症检测6例样本、XYY综合症检测3例样本、三倍体检测2例样本、正常个体检测89例样本，共检测172例样本(表12)。
表10 172例样本检测结果
图1结果显示，正常男性个体样本13号染色体上有7个DNA位点的检测峰面积比呈现1:1，其余位点为单一检测峰；18号染色体上有4个DNA位点的检测峰面积比呈现1:1，其余位点为单一检测峰；21号染色体上有6个DNA位点的检测峰面积比呈现1:1，其余位点为单一检测峰；性染色体DNA位点为：AMEL位点检测峰面积比为1:1；TAF9L位点检测峰面积比为2:1；DXYS267位点检测峰面积比为1:1；DXYS218位点为单一检测峰；DXS6789位点为单一检测峰；SRY位点为单一检测峰。检测结果为13、18、21号染色体数目无异常，性染色体为XY。
图2结果显示，正常女性个体样本13号染色体上有4个DNA位点的检测峰面积比呈现1:1，其余位点为单一检测峰；18号染色体上有4个DNA位点的检测峰面积比呈现1:1，其余位点为单一检测峰；21号染色体上有5个DNA位点的检测峰面积比呈现1:1，其余位点为单一检测峰；性染色体DNA位点为：AMEL位点仅Chr.X检测峰；TAF9L位点检测峰面积比为1:1；DXYS267、DXYS218、DXS6789位点为单一检测峰或检测峰面积比为1:1；SRY位点无检测峰。检测结果为13、18、21号染色体数目无异常，性染色体为XX。
图3结果显示，13-三体异常样本13号染色体上有1个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有4个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1，有3个位点的检测峰面积比呈现1:1:1，其余位点为单一检测峰。检测结果为13号染色体三体。
图4结果显示，18-三体异常样本18号染色体上有2个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有2个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1，有4个位点的检测峰面积比呈现1:1:1，其余位点为单一检测峰。检测结果为18号染色体三体。
图5结果显示，21-三体异常样本21号染色体上有3个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有2个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1，其余位点为单一检测峰。检测结果为21号染色体三体。
图6结果显示，X单体异常样本AMEL位点仅Chr.X检测峰；TAF9L位点检测峰面积比为2:1；DXYS267、DXYS218、DXS6789位点为单一检测峰；SRY位点无检测峰。检测结果性染色体为X单体。
图7结果显示，XXX异常样本AMEL位点仅Chr.X检测峰；TAF9L位点检测峰面积比为2:3；DXYS267位点检测峰面积比为2:1；DXYS218位点为单一检测峰；DXS6789位点检测峰面积比为1:1:1；SRY位点无检测峰。检测结果性染色体为XXX。
图8结果显示，XXY异常样本AMEL位点检测峰面积比为2:1；TAF9L位点检测峰面积比为1:1；DXYS267位点为单一检测峰；DXYS218检测峰面积比为或检测峰面积比为1:2；DXS6789位点检测峰面积比为1:1；SRY位点为单一检测峰。检测结果性染色体为XXY。
图9结果显示，XYY异常样本AMEL位点检测峰面积比为1:2；TAF9L位点检测峰面积比为2:1；DXYS267位点检测峰面积比为2:1；DXYS218位点检测峰面积比为1:1:1；DXS6789位点为单一检测峰；SRY位点为单一检测峰。检测结果性染色体为XYY。
图10结果显示，三倍体(69，XXX)异常样本的13号染色体上有4个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有2个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1；18号染色体上有2个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有4个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1，有1个位点的检测峰面积比呈现1:1:1；21号染色体上有1个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1，有5个位点的检测峰面积比呈现1:1:1；AMEL位点仅Chr.X检测峰；TAF9L位点检测峰面积比为1:1；DXYS267位点检测峰面积比为1:2；DXYS218检测峰面积比为2:1；DXS6789位点为单一检测峰；SRY位点无检测峰，性染色体为XXX。检测结果常染色体13、18、21号染色体皆为三体，且性染色体中TAF9L为1:1的XXX，提示该样本可能为三倍体(69,XXX)。
图11结果显示，三倍体(69，XXY)异常样本13号染色体上有2个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有4个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1，有2个位点的检测峰面积比呈现1:1:1；18号染色体上有2个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有2个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1，有3个位点的检测峰面积比呈现1:1:1；21号染色体上有4个DNA位点的检测峰面积比呈现1:2，有1个DNA位点的检测峰面积比呈现2:1；TAF9L位点检测峰面积比为3:2；DXYS267位点检测峰面积比为1:1:1；DXYS218位点为单一检测峰；DXS6789位点检测峰面积比为1:1；SRY位点为单一检测峰，性染色体为XXY。检测结果常染色体13、18、21号染色体皆为三体，且性染色体中TAF9L为3:2的XXY，提示该样本可能为三倍体(69,XXY)。
依据表10及图1-11的结果，可知本发明可快速检测人类个体13号、18号、21号、X和Y染色体的数目，进而提示13三体综合症、18三体综合症、21三体综合症、X单体综合症、XXX综合症、XXY综合症、XYY综合症、三倍体(69，XXX或69，XXY)或正常个体。
应当理解的是，前述对实施方式的描述仅是以实施例的方式给出，且本领域所属技术领域中具有通常知识者可进行各种修改。以上说明书、实施例及实验结果提供本发明之例示性实施方式之结构与用途的完整描述。虽然上文实施方式中揭露了本发明的各种具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 胜亚生物科技（厦门）有限公司
<120> 一种快速检测染色体数目异常的试剂盒及其应用
<130>
<160> 62
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaggaatgg aaataggttg tacac 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccacctccag acttcccaat tc 22
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttacttcaa atggctcaga aaagaaattt g 31
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcttttatca tcctaaaata gcttttgtct gtgtgg 36
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taagccacaa aagccacctc gaaatc 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcttgagccc aggagtttga gatc 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagacaaatt ctggctgtta ttc 23
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcatcaccat caccttcttt gactggagg 29
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aatgttgtcc cacatgtcct ttag 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cctctgtaat catatgagcc aattc 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acatcagcct gaaacctgcc 20
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agagaggaag acagagagag ggaataa 27
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggaaatattt ctcaaacatg attcatatca c 31
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cattcaaaat cttaatgtag tgcattatcc tg 32
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcactatcta tctatccatc tgtctg 26
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaggttgctt gaatccatgg atgc 24
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cactcagcta attaaattcc tg 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cttaccacag gcaatgtgac ttgag 25
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cattagggtt ctctagagag acagaaataa taag 34
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acactattgg catcccttgg tctcc 25
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
caactgattt tagggcattg aggc 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccacaggcct cctttctctt cagg 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtttggaagc gcaactctct gag 23
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
caagcagtta aggaaggaat tctattcatc 30
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gggctttcct gagcctccag 20
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ccagacaaat ggaacccata ggatag 26
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gagtgagatt tcatctgtaa aag 23
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ccgatctaga agtcatacat taaaaag 27
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gctgagcaat ttgaaaatca acaatttc 28
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tctaactttg cctgcttgaa ctg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gaacatacta tgtgctccac agg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ttgggtgggg catagttcaa ttc 23
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctctctttgc tcctcagctt gtagac 26
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gttaactatg tattgctcac agatcacgaa g 31
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cgttgttcta agggcttcag ac 22
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ttactagcca taaacactga gaaggg 26
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acatacatgt acatgtgtct ggg 23
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acatatttac tgccaacact tgtccttc 28
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
cttttcaatt ctataactcc cttc 24
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gatttgacgt atattattga gtcctg 26
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gatcattaca cattctatgc atgtaac 27
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cctaattgct gtgcctttat aaaaatg 27
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cactctacca ctacagaata gttttg 26
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cgcaccattg cactccagcc 20
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aagaaagata ggtagataca tagaatgg 28
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tttctgccca ctcccagcct tc 22
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
acgtaatact tgacaatgat cataaatg 28
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
actggtaact aactgttaac taactttac 29
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gttttatttg tcattcctaa tgtggtc 27
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
atcagctgca taatttaaaa aaataaaact c 31
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ccgagattgt gccattgcac tcc 23
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
tatcctaaga aattaggctc ggatttc 27
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gattgcaaac ttcattatgt gctgg 25
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tcagactcca agttcttcag ttttgag 27
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ccaayagaag ataagtttac ayaacc 26
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tttcttggtg gayaagagya tgttgc 26
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gctttcgtac agtcatccct gtac 24
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gatgattaca gtccagctgt gcaag 25
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ccctgggctc tgtaaagaat ag 22
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
aaccatcaga gcttaaactg gg 22
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
tttaacctga tggcttgcat ttgc 24
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
ctgacccaaa actacctgtc aaaag 25
Claims (5)
1.一种快速检测染色体数目异常的扩增引物组合，其特征在于：所述引物组合包括31对引物对，可同时扩增以下STR位点和基因：8个13号染色体的STR位点：D13S742、D13S765、D13S305、D13S801、D13S634、D13S258、D13S628、D13S796；8个18号染色体的STR位点：D18S391、D18S976、D18S1002、D18S535、D18S536、D18S386、D18S875、D18S390；8个21号染色体的STR位点：D21S1432、D21S1414、D21S1437、D21S1435、D21S1809、D21S1412、D21S1411、D21S1446； 3个性染色体的STR位点：DXYS267、DXYS218、DXS6789；4个与性染色体数目异常相关的基因：ZFX/Y、SRY、AMEL、TAF9L。
2.根据权利要求1所述的扩增引物组合，其特征在于：所述引物对包括： 扩增D13S742的引物对：SEQ ID NO.1 ~ 2；扩增D13S765的引物对：SEQ ID NO.3 ~ 4；扩增D13S305的引物对：SEQ ID NO.5 ~ 6；扩增D13S801的引物对：SEQ ID NO.7 ~ 8；扩增D13S634的引物对：SEQ ID NO.9 ~ 10；扩增D13S258的引物对：SEQ ID NO.11~ 12；扩增D13S628的引物对：SEQID NO.13 ~ 14；扩增D13S796的引物对：SEQ ID NO.15 ~ 16；扩增D18S391的引物对：SEQID NO.17 ~ 18；扩增D18S976的引物对：SEQ ID NO.19 ~ 20；扩增D18S1002的引物对：SEQID NO.21 ~ 22；扩增D18S535的引物对：SEQ ID NO.23 ~ 24；扩增D18S536的引物对：SEQID NO.25 ~ 26；扩增D18S386的引物对：SEQ ID NO.27 ~ 28；扩增D18S875的引物对：SEQID NO.29 ~ 30；扩增D18S390的引物对：SEQ ID NO.31 ~ 32；扩增D21S1432的引物对：SEQID NO.33 ~ 34；扩增D21S1414的引物对：SEQ ID NO.35 ~ 36；扩增D21S1437的引物对：SEQID NO.37 ~ 38；扩增D21S1435的引物对：SEQ ID NO.39 ~ 40；扩增D21S1809的引物对：SEQID NO.41 ~ 42；扩增D21S1412的引物对：SEQ ID NO.43 ~ 44；扩增D21S1411的引物对：SEQID NO.45 ~ 46；扩增D21S1446引物对：SEQ ID NO.47 ~ 48；扩增DXYS267的引物对：SEQ IDNO.49 ~ 50；扩增DXYS218的引物对：SEQ ID NO.51 ~ 52；扩增DXS6789的引物对：SEQ IDNO.53 ~ 54；扩增ZFX/Y基因的引物对：SEQ ID NO.55 ~ 56；扩增SRY基因的引物对：SEQ IDNO.57 ~ 58；扩增AMEL基因的引物对：SEQ ID NO.59 ~ 60；扩增TAF9L基因的引物对：SEQID NO.61 ~ 62。
3.根据权利要求1所述的扩增引物组合，其特征在于：所述引物对的正向引物的5’端标记有荧光基团；所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、TMR、NED、PET、ROX中的任意一种。
4.如权利要求1所述的引物组合在制备染色体非整倍检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒，组成成分包括 ANEU 反应液、ANEU 引物混合液、热启动核酸聚合酶、ANEU正常女性对照、ANEU正常男性对照、ANEU 空白对照；所述ANEU引物混合液中包含引物组合物，所述的引物组合物为权利要求 2的引物组合获得；所述ANEU 反应液中包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：利用31对不同引物在一管反应液中，进行PCR扩增反应，同时扩增13号、18号、21号染色体及性染色体上的31个DNA位点；将DNA待测样本使用所述检测试剂盒进行PCR扩增反应产生的PCR产物，以毛细管电泳仪进行片段大小和丰度的分析，以片段大小和丰度区分31个DNA位点。
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