CN114934114A - 一种人甲状腺癌ccdc6-ret融合型基因表达检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基因检测技术领域的一种人甲状腺癌CCDC6‑RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：所述检测方法采用基因检测试剂盒，基因检测试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂为CCDC6‑RET融合基因反应液，反应液中含有用于检测CCDC6‑RET的特异性引物和探针，每个反应液中包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针；5’‑CGCAAAGCCAGCGTGACCAT‑3’；所述下游引物为5’‑TCACGGCCACCGTGGTGTAC‑3’；所述TaqMan荧光探针为5’‑(FAM)AGGATCCAAAGTGGGAATTCCC(TAMRA)‑3’，本发明具有高特异性、准确性和高灵敏度等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域的一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法。
背景技术
RET(ret proto-oncogene)即RET原癌基因，位于人染色体10q11.2，由21个外显子组成，编码1100个氨基酸的蛋白。RET蛋白活化后会激活下游的信号通路(包含RAS、MAPK、ERK、PI3K、AKT等)该信号通路会导致细胞的增殖，迁移与分化。染色体重排经常会导致RET基因中间断裂，此时RET基因3’端激酶结构域会与不同的基因发生融合，形成驱动肿瘤增殖的融合基因。这些基因包括：CCDC6、NCOA4、PRKAR1A、TRIM24、GOLGA5、TRIM33、KTN1、ERC1、MBD1、和TRIM27等等。
根据组织发生和形态结构甲状腺癌可分为乳头状甲状腺癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)、滤泡型癌、髓样癌、未分化癌、转移癌。其中,乳头状甲状腺癌是最常见的甲状腺癌的类型,约占甲状腺癌的50％。其中5％-40％的甲状腺乳头状癌发现有RET基因融合。RET基因融合也发生在非小细胞肺癌，发生频率约为1％～2％。
目前，针对RET融合基因的靶向药物有凡德他尼和卡博替尼等，这两种药物都获批用于治疗进展期甲状腺髓样癌。因此可进一步考虑将CCDC6-RET融合基因的检测用于临床应用。由于CCDC6-RET融合基因在以上疾病中的重要作用，目前对RET基因融合状态的检测已经成为辅助肿瘤诊断和治疗的重要手段之一。临床上，诊断的金标准为Sanger测序法，此办法的优点是：试验方法简单，结果直观，成本低廉。但是该技术灵敏度不高，耗时长。随着PCR技术的发展，采用荧光定量PCR技术仅需2小时即可得到检测结果，分辨率可到达10～100拷贝。
发明内容
本发明的目的在于提供用于辅助肿瘤诊断和治疗的一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法。
本发明所采取的技术方案如下：
一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：所述检测方法采用基因检测试剂盒，基因检测试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂为CCDC6-RET融合基因反应液，反应液中含有用于检测CCDC6-RET的特异性引物和探针，每个反应液中包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针；
对上述技术方案作进一步的说明：
所述上游引物为5’-CGCAAAGCCAGCGTGACCAT-3’；所述下游引物为
5’-TCACGGCCACCGTGGTGTAC-3’；所述TaqMan荧光探针为
5’-(FAM)AGGATCCAAAGTGGGAATTCCC(TAMRA)-3’；
对上述技术方案作进一步的说明：
所述反应液中包含的引物含量浓度为100μmol/L；其中引物各0.06μl，浓度为100μmol/L的探针各0.04μl；
对上述技术方案作进一步的说明：
所述核酸扩增试剂还包括PCR Mix，Mix中包括dNTP、KCl、Tris-HCl、MgCl2和Taq酶，MIX为2×工作液，配制时加入体积为总体系量的一半；
对上述技术方案作进一步的说明：
所述对照品包括阳性对照和阴性对照，其中阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株cDNA混合物；
对上述技术方案作进一步的说明：
所述的突变质粒包含的CCDC6-RET融合片段序列，该融合型RNA断裂点附近序列如下(大写部分为CCDC6基因，小写部分为RET基因)：GGTGCTGAAGATAGAGCTGGAGACCTACAAACTGAAGTGCAAGGCACTGCAGGAGGAGAACCGCGACCTGCGCAAAGCCAGCGTGACCATCgaggatccaaagtgggaattccctcggaagaacttggttcttggaaaaactctaggagaaggcgaatttggaaaagtggtcaaggcaacggccttccatctgaaaggcagagcagggtacaccacggtggccgtgaagatgctga。
本发明的有益效果是：
试剂盒采用荧光PCR技术对CCDC6-RET融合基因进行定性检测，从而辅助甲状腺癌和非小细胞肺癌等临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、准确性和高灵敏度等特点。
附图说明
图1为检测方法原理图。
图2为试剂盒对50ng野生型cDNA背景下10拷贝和200拷贝融合突变模板检测结果图。
图中：上游引物1、下游引物2和荧光探针3。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的内容作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。
本试剂盒所检测样本为甲状腺癌与非小细胞肺癌石蜡包埋组织样本，通过核酸提取试剂纯化组织样本中的RNA，再反转录为cDNA。再取总量为100ng的cDNA进入反应体系进行检测。反转录试剂可使用invitrogen TM公司ⅢFirst-StrandSynthesis System试剂盒。
反转录步骤如下：
(1)取0.1-5000ng总RNA作为模板，与1μL的random hexamers引物及1μLdNTP Mix混合，补DEPC水至总体积10μL，65℃孵育5min,再于冰盒中放置至少1min；
(2)配制如下体系：
(2)PCR仪上设置如下条件进行反应：
温度(℃)时间(min)25105050855
(3)产物于冰盒中放置1-2min后，加入1μL的RNaseH,37℃孵育20min，去除RNA模板。
qPCR检测步骤如下：
(1)体系配制：每个反应体系包含10μL的2×PCR Mix，7μL的引物探针混合液，及3μL的cDNA模板。
(2)扩增反应条件：95℃，15min；(95℃，15sec；66℃，40sec)，15个循环；(95℃，15sec；60℃，40sec)，35个循环。在第二步循环60℃收集FAM荧光。
本试剂盒采用的荧光探针PCR技术，通过设计特异性引物，上游引物能够与CCDC6基因第1号外显子匹配，而下游引物只能与RET基因第12号外显子匹配，使其只能扩增此种融合类型的突变基因，从而达到检测突变型的目的。使用本发明设计的引物探针通过荧光定量PCR方法可以对肿瘤组织中低至10～100拷贝的突变进行检测。
目前除了本发明中的qPCR技术以外，还可以通过数字PCR或高通量测序技术来进行基因突变的检测，但后两者在实验周期及成本上均高于荧光PCR方法。因此，当需要对已知突变进行检测时，该方法是目前最合适的。
以上是本发明的较佳实施方式的说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的技术人员在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化均在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：所述检测方法采用基因检测试剂盒，基因检测试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂为CCDC6-RET融合基因反应液，反应液中含有用于检测CCDC6-RET的特异性引物和探针，每个反应液中包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针。
2.根据权利要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：所述上游引物为5’-CGCAAAGCCAGCGTGACCAT-3’；所述下游引物为5’-
TCACGGCCACCGTGGTGTAC-3’；所述TaqMan荧光探针为5’-
(FAM)AGGATCCAAAGTGGGAATTCCC(TAMRA)-3’。
3.根据权利要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：述反应液中包含的引物含量浓度为：100μmol/L；其中引物各0.06μl，浓度为100μmol/L的探针各0.04μl。
4.根据权利要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：所述核酸扩增试剂还包括PCR Mix，Mix中包括dNTP、KCl、Tris-HCl、MgCl2和Taq酶，MIX为2×工作液，配制时加入体积为总体系量的一半。
5.根据权利要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：所述对照品包括阳性对照和阴性对照，其中阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株cDNA混合物。
6.根据权利要求5所述的一种人甲状腺癌CCDC6-RET融合型基因表达检测方法，其特征在于：所述的突变质粒包含的CCDC6-RET融合片段序列，该融合型RNA断裂点附近序列如下(大写部分为CCDC6基因，小写部分为RET基因)：
GGTGCTGAAGATAGAGCTGGAGACCTACAAACTGAAGTGCAAGGCACTGCAGGAGGAGAACCGCGACCTGCGCAAAGCCAGCGTGACCATCgaggatccaaagtgggaattccctcggaagaacttggttcttggaaaaactctaggagaaggcgaatttggaaaagtggtcaaggcaacggccttccatctgaaaggcagagcagggtacaccacggtggccgtgaagatgctga。
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