ES2864999T3

ES2864999T3 - Ensayos de PCR multiplex específica de alelo para la detección de mutaciones en el receptor de estrógeno ESR1

Info

Publication number: ES2864999T3
Application number: ES17755486T
Authority: ES
Inventors: Xiaoying Chen; Sean Chien; Claudia Litterst; Ha Tran
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2037-08-18
Also published as: CN109790568A; JP2019531061A; EP3500681B1; US20180051325A1; CN109790568B; JP7007364B2; EP3500681A1; WO2018033615A1

Abstract

Un kit que comprende tres recipientes, en el que: (i) un primer recipiente contiene un par de cebadores específico para ESR1 V422DelV, un par de cebadores específico para ESR1 S463P, un par de cebadores específico para ESR1 L536H, un par de cebadores específico para ESR1 L536P, un par de cebadores específico para ESR1 L536Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536R y un par de cebadores específico para ESR1 D538G; (ii) un segundo recipiente contiene un par de cebadores específico para ESR1 K303R, un par de cebadores específico para ESR1 E380Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536_D538>P, un par de cebadores específico para ESR1 Y537C, un par de cebadores específico para ESR1 Y537N y un par de cebadores específico para ESR1 Y537S; y (iii) un tercer recipiente contiene un par de cebadores específico para ESR1 S341L, un par de cebadores específico para ESR1 L429V, un par de cebadores específico para ESR1 V533M, un par de cebadores específico para ESR1 V534E y un par de cebadores específico para ESR1 P535H; conteniendo cada uno de los recipientes dos o más sondas específicas para una secuencia diferente del gen ESR1, en el que cada sonda está marcada con un fluoróforo y un desactivador; un par de cebadores específico para una secuencia de control interno; y una sonda específica para la secuencia de control interno y marcada con un fluoróforo y un desactivador; y en el que los recipientes comprenden oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 24, 113, 134, 158, 178, 264, 261, 262, 285, 286, 298, 314, 394, 407, 31, 42, 90, 415, 447, 469, 476, 477, 481, 528, 59, 60, 70, 231, 235, 237, 245, 350 y 388.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayos de PCR multiplex específica de alelo para la detección de mutaciones en el receptor de estrógeno ESR1

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El setenta por ciento de los cánceres de mama son positivos para receptores de estrógeno (ER), y aunque la mayoría de estos pacientes responden inicialmente al tratamiento hormonal, aproximadamente un 20-30 % se volverá refractario al tratamiento. Los datos recientes sugieren que las mutaciones activadoras en el gen del receptor de estrógeno (ESR1), que se adquieren durante el tratamiento con antiestrógenos y que rara vez se encuentran en el cáncer de mama primario no tratado positivo para ER, están asociadas con la resistencia. En muestras de cáncer de mama refractario a hormonas se ha identificado un número creciente de mutaciones en el ESR1 activadoras localizadas en el dominio de unión al ligando; las mutaciones más comunes incluyen K303R, E380Q, V392I, S463P, K531E, V534E, P535H, L536Q/R, Y537S/N/C, D538G y R555C. Si bien el mecanismo de acción no está completamente aclarado para todas las mutaciones, se ha demostrado mediante experimentos in vitro que las mutaciones L536Q, Y537S/C/N y D538G estabilizan el dominio de unión al ligando del receptor de estrógeno en una conformación activa, permitiendo, por tanto, el reclutamiento de coactivadores transcripcionales en ausencia de ligando. La hipersensibilidad a estrógenos se considera el mecanismo para la mutación K303R.

La detección de mutaciones en el ESR1 tiene, por tanto, potencial para predecir la resistencia a hormonas y dirigir el tratamiento. La secuenciación de próxima generación (NGS) es un enfoque común para dicha detección, ya que permite la detección simultánea de muchas mutaciones con pequeñas cantidades de muestras. Sin embargo, la NGS es muy laboriosa, larga y costosa.

La PCR digital (PCRd) constituye un procedimiento altamente sensible que se ha empleado para la detección de mutaciones en el ESR1, pero tiene una serie de inconvenientes: el flujo de trabajo de la PCRd es largo y requiere un equipo especial, y la multiplexación está limitada por el número de canales ópticos disponibles en los actuales instrumentos de PCRd. WANG et al, EXPERIMENTAL AND MOLECULAR PATHOLOGY, 2015, divulgan un ensayo de PCR multiplex en tiempo real específica de alelo para el cribado de mutaciones en el ESR1 en cáncer de mama metastásico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En el presente documento se proporcionan kits, ensayos y procedimientos para detectar mutaciones en el gen ESR1 y procedimientos de tratamiento para individuos con cánceres sensibles a hormonas.

En el presente documento se proporcionan kits que comprenden uno o más recipientes, de los que cada uno contiene dos o más pares de cebadores, siendo cada par de cebadores específico para una secuencia diferente del gen ESR1; una o más sondas específicas para una secuencia diferente del gen ESR1, en el que cada sonda está marcada; un par de cebadores específico para una secuencia de control interno; y una sonda específica para la secuencia de control interno. En algunos modos de realización, cada sonda está marcada con un fluoróforo y un desactivador. En algunos modos de realización, el kit comprende 1 -10 recipientes, por ejemplo, 2-5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más recipientes. En algunos modos de realización, cada uno de los recipientes contiene dos o más pares de cebadores (incluyendo el par de cebadores del control interno), por ejemplo, 3-16, 4-10 o 5-8. Por ejemplo, todos los pares de cebadores para todas las mutaciones del exón 8, el control interno y otras dos o más mutaciones se pueden incluir en un único tubo. En algunos modos de realización, cada uno de los recipientes contiene de tres a cuatro sondas (incluyendo la sonda para el control interno). En algunos modos de realización, cada recipiente contiene además una ADN polimerasa termoestable.

En algunos modos de realización, el kit incluye además controles positivos, por ejemplo, muestras con mutaciones en el ESR1 conocidas, y/o un control negativo, por ejemplo, una muestra que no incluye mutaciones en el ESR1.

En algunos modos de realización, cada secuencia diferente del gen ESR1 se selecciona del grupo que consiste en que comprende ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R, ESR1 D538G, ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N, ESR1 Y537S, ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H. En algunos modos de realización, el kit incluye al menos dos pares de cebadores seleccionados del grupo que consiste en un par de cebadores específico para ESR1 V422DelV, un par de cebadores específico para ESR1 S463P, un par de cebadores específico para ESR1 L536H, un par de cebadores específico para ESR1 L536P, un par de cebadores específico para ESR1 L536Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536R, un par de cebadores específico para ESR1 D538G, ESR1 K303R, un par de cebadores específico para ESR1 E380Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536_D538>P, un par de cebadores específico para ESR1 Y537C, un par de cebadores específico para ESR1 Y537N, un par de cebadores específico para ESR1 Y537S, un par de cebadores específico para ESR1 S341L, un par de cebadores específico para ESR1 L429V, un par de cebadores específico para ESR1 V533M, un par de cebadores específico para ESR1 V534E y un par de cebadores específico para ESR1 P535H. En algunos modos de realización, al menos un cebador incluye un nucleótido modificado no natural.

En algunos modos de realización, el kit comprende un par de cebadores específico para ESR1 V422DelV, un par de cebadores específico para ESR1 S463P, un par de cebadores específico para ESR1 L536H, un par de cebadores específico para ESR1 L536P, un par de cebadores específico para ESR1 L536Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536R, un par de cebadores específico para ESR1 D538G, ESR1 K303R, un par de cebadores específico para ESR1 E380Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536_D538>P, un par de cebadores específico para ESR1 Y537C, un par de cebadores específico para ESR1 Y537N, un par de cebadores específico para ESR1 Y537S, un par de cebadores específico para ESR1 S341L, un par de cebadores específico para ESR1 L429V, un par de cebadores específico para ESR1 V533M, un par de cebadores específico para ESR1 V534E y un par de cebadores específico para ESR1 P535H. En algunos modos de realización, el kit comprende además una sonda que detecta específicamente ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R, ESR1 D538G, ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N, ESR1 Y537S, ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H.

En algunos modos de realización, el kit comprende (i) un primer recipiente que contiene un par de cebadores específico para ESR1 V422DelV, un par de cebadores específico para ESR1 S463P, un par de cebadores específico para ESR1 L536H, un par de cebadores específico para ESR1 L536P, un par de cebadores específico para ESR1 L536Q, un par de cebadores específico para L536R y un par de cebadores específico para ESR1 D538G; (ii) un segundo recipiente que contiene un par de cebadores específico para ESR1 K303R, un par de cebadores específico para ESR1 E380Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536_D538>P, un par de cebadores específico para ESR1 Y537C, un par de cebadores específico para ESR1 Y537N y un par de cebadores específico para ESR1 Y537S; y (iii) un tercer recipiente que contiene un par de cebadores específico para ESR1 S341L, un par de cebadores específico para ESR1 L429V, un par de cebadores específico para ESR1 V533M, un par de cebadores específico para ESR1 V534E y un par de cebadores específico para ESR1 P535H. En algunos modos de realización, el primer recipiente contiene además sondas específicas para ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R y ESR1 D538G. En algunos modos de realización, una única sonda detecta específicamente ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R y ESR1 D538G. En algunos modos de realización, el segundo recipiente contiene además sondas específicas para ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 ESR1 Y537C, ESR Y537N, ESR1 Y537S. En algunos modos de realización, una única sonda detecta específicamente ESR1 L536_D538>P, ESR1 ESR1 Y537C, ESR Y537N, ESR1 Y537S. En algunos modos de realización, el tercer recipiente contiene sondas específicas para ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H. En algunos modos de realización, una única sonda detecta específicamente ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H.

En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 K303R se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 479, 481 y 484, y en algunos modos de realización, las secuencias del cebador y de la sonda comunes son las SEQ ID NO: 476 y 477, respectivamente. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 S341L se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 239, 240, 242, 245, 246, 247, 253, 254, 255, 256, 257, 258 y 259, y en algunos modos de realización, las secuencias del cebador y de la sonda comunes son las SEQ ID NO: 235 y 237, respectivamente. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 E380Q se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 32, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, y en algunos modos de realización, las secuencias del cebador y de la sonda comunes son las SEQ ID NO: 528 y 31, respectivamente. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 V422DELV se selecciona del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 287, 294, 295, 296, 297, 298, y en algunos modos de realización, las secuencias del cebador y de la sonda comunes son las SEQ ID NO: 285 y 286, respectivamente. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 L429V se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 778, 79, 80 y 81, y en algunos modos de realización, las secuencias del cebador y de la sonda comunes son las SEQ ID NO: 59 y 60, respectivamente. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 S463P se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 281, 282, 283 y 275, y en algunos modos de realización, las secuencias del cebador y de la sonda comunes son las SEQ ID NO: 261 y 262, respectivamente.

En algunos modos de realización se usan un cebador y una sonda comunes para amplificar y detectar todas las mutaciones del exón 8 de ESR1 en el ensayo, por ejemplo, las SEQ ID NO: 314 y/o 394 y 407, respectivamente. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 V533M se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 322, 329, 330, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 352 y 353. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 V534E se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 364, 365, 367, 368, 370, 371, 373, 378, 388, 391, 392 y 393. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 P535H se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 181, 188, 189, 190, 191, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 208, 209, 212, 225, 226, 228, 229 y 231. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 L536H se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 96, 101, 104, 105, 107, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 y 117. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 L536P se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 134, 135 y 137. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 L536Q se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 141, 151, 154, 155, 157, 158, 159 y 160. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 L536R se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 161, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 179 y 180. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 Y537C se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 397, 408, 415, 416, 417, 418, 419, 420 y 424. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 Y537n se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 426, 436, 441, 445, 446, 447 y 448. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 Y537S se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 449, 459, 466, 467, 468, 469, 470, 471 y 472. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 D538G se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 21, 22, 23, 24 y 25. En algunos modos de realización, el cebador específico de alelo para detectar la mutación ESR1 L536_D538>P se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 y 93.

En algunos modos de realización, el kit incluye oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 24, 113, 134, 158, 178, 264, 261,262, 285, 286, 298, 314, 394, 407, 31, 42, 90, 415, 447, 469, 476, 477, 481, 528, 59, 60, 70, 231, 235, 237, 245, 350 y 388. En algunos modos de realización, cada recipiente incluye un control interno, por ejemplo, las SEQ ID NO: 511, 514 y 517.

Se proporcionan además procedimientos para determinar (por ejemplo, detectar) la presencia o ausencia de dos o más mutaciones en el ESR1 en una muestra de un individuo, que comprenden (i) obtener una muestra del individuo; (ii) llevar a cabo una PCR multiplex específica de alelo para determinar la presencia o ausencia de dos o más mutaciones en el ESR1. En algunos modos de realización, la muestra se selecciona de sangre, plasma, suero, orina o tejido mucoso (por ejemplo, de un hisopo bucal). En algunos modos de realización, el individuo tiene o se le diagnosticó un cáncer sensible a hormonas (por ejemplo, cáncer de mama o de ovario positivo para el receptor de estrógeno y/o el receptor de progesterona). En algunos modos de realización, el individuo se está sometiendo a un tratamiento hormonal. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además proporcionar un tratamiento hormonal al individuo antes de la etapa (i) (por ejemplo, tratamiento con un SERM, un inhibidor de aromatasa o un bloqueante de la LH). En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además proporcionar un tratamiento modificado al individuo cuando se determina la presencia de una mutación en el ESR1 en la etapa (ii) (por ejemplo, un tratamiento hormonal adicional o quimioterapia estándar).

En algunos modos de realización, el procedimiento comprende llevar a cabo una PCR multiplex específica de alelo para determinar la presencia o ausencia de diez o más mutaciones en el ESR1, por ejemplo 10-20, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19. En algunos modos de realización, las dos o más mutaciones en el ESR1 se seleccionan de ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R, ESR1 D538G, ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N, ESR1 Y537S, ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H. En algunos modos de realización, las dos o más mutaciones en el ESR1 incluyen ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R, ESR1 D538G, ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N, ESR1 Y537S, ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H.

En algunos modos de realización, la PCR multiplex específica de alelo se lleva a cabo usando un kit como se describe en el presente documento, que comprende, por ejemplo, 1-10 recipientes, por ejemplo, 2-5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más recipientes. En algunos modos de realización, el kit comprende tres recipientes. Por ejemplo, la PCR multiplex específica de alelo se puede llevar a cabo en tres recipientes de modo que (i) ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, L536R y ESR1 D538G se detectan en un primer recipiente; (ii) ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N y ESR1 Y537S se detectan en un segundo recipiente; y (iii) ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H se detectan en un tercer recipiente.

En el presente documento se proporcionan además procedimientos para proporcionar un tratamiento modificado para un individuo con un cáncer sensible a hormonas (por ejemplo, cáncer de mama) que se está sometiendo a un tratamiento hormonal (por ejemplo, SERM, inhibidores de aromatasa y/o bloqueantes de la hormona luteinizante). En algunos modos de realización, el procedimiento comprende (i) obtener una muestra del individuo (por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, tejido, FFPET, etc.); (ii) llevar a cabo una PCR multiplex específica de alelo para determinar la presencia o ausencia de dos o más mutaciones en el ESR1; y (iii) proporcionar un tratamiento modificado al individuo si se determina la presencia de una mutación en el ESR1. En algunos modos de realización, la etapa (ii) se lleva a cabo usando un kit como se describe en el presente documento.

En algunos modos de realización, la PCR multiplex específica de alelo determina la presencia o ausencia de diez o más mutaciones en el ESR1. En algunos modos de realización, las dos o más (o diez o más) mutaciones en el ESR1 se seleccionan del grupo que consiste en ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R, ESR1 D538G, ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N, ESR1 Y537S, ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H. En algunos modos de realización se determina la presencia o ausencia de ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R, ESR1 D538G, ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N, ESR1 Y537S, ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H.

En algunos modos de realización, las etapas (i)-(iii) se llevan a cabo de 0,5 a 5 años después de que el individuo comience a recibir el tratamiento hormonal. En algunos modos de realización, el procedimiento se lleva a cabo más de una vez durante el tratamiento hormonal, por ejemplo, para controlar la potencial resistencia del tumor al tratamiento hormonal. En algunos modos de realización, el procedimiento se lleva a cabo periódicamente, por ejemplo, cada 6 meses, mientras que en algunos modos de realización el procedimiento se lleva a cabo tras la progresión clínica en el individuo (por ejemplo, crecimiento tumoral, respuesta reducida al tratamiento hormonal, etc.). En algunos modos de realización, la etapa (iii) comprende proporcionar al individuo un tratamiento hormonal adicional o una quimioterapia estándar.

Además, en el presente documento se proporcionan procedimientos para tratar a un individuo con un cáncer sensible a hormonas (por ejemplo, cáncer de mama o de ovario). En algunos modos de realización, el procedimiento comprende (i) proporcionar tratamiento hormonal al individuo; (ii) obtener una muestra del individuo; (iii) llevar a cabo una PCR multiplex específica de alelo para determinar la presencia o ausencia de dos o más mutaciones en el ESR1; y (iv) proporcionar tratamiento modificado al individuo si se determina la presencia de una mutación en el ESR1. En algunos modos de realización, el tratamiento hormonal es SERM.

En algunos modos de realización, las etapas (i)-(iii) se llevan a cabo 0,5-5 años después de la etapa (i) (después de que el individuo comience a recibir el tratamiento hormonal). En algunos modos de realización, las etapas (ii)-(iii) se llevan a cabo más de una vez durante el tratamiento hormonal. En algunos modos de realización, el procedimiento se lleva a cabo periódicamente, por ejemplo, cada 6 meses, mientras que en algunos modos de realización el procedimiento se lleva a cabo tras la progresión clínica en el individuo (por ejemplo, crecimiento tumoral, respuesta reducida al tratamiento hormonal, etc.). En algunos modos de realización, la etapa (iv) comprende proporcionar al individuo un tratamiento hormonal adicional (por ejemplo, un inhibidor de aromatasa y/o un bloqueante de la hormona luteinizante) o quimioterapia estándar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A, 1B y 1C comparan la discriminación de cebadores y sondas para detectar muestras mutantes y naturales. La figura 1A muestra los resultados (curvas de crecimiento/amplificación) usando cebadores y una sonda diseñados para ser específicos de K303R que muestran una pobre discriminación entre la muestra natural y la mutante. La figura 1B muestra los resultados usando cebadores y una sonda diseñados para ser específicos de K303R que muestran una mejor discriminación entre la muestra natural (verde) y la mutante (azul; rojo). La figura 1C muestra los resultados usando cebadores y una sonda diseñados para ser específicos de L536_D538>P que muestran una buena especificidad de detección para el mutante (azul; rojo) en comparación con la muestra natural, en la que la muestra natural (verde) no muestra señal.

Las figuras 2A, 2B y 2C también comparan la discriminación de cebadores y sondas para detectar muestras con la mutación L536R y naturales. Las curvas de crecimiento/amplificación muestran ciclos en el eje X y la señal en el eje Y. La figura 2A muestra los resultados usando el cebador específico de alelo L536R_RS01, que muestra una pobre discriminación entre la muestra natural y la mutante. La figura 2B muestra los resultados usando el cebador específico de alelo L536R_RS09, que muestra una mejor discriminación entre la muestra natural (verde) y la mutante. La figura 2C muestra los resultados usando el cebador específico de alelo L536R_RS04, que muestra una buena especificidad de detección del mutante en comparación con la muestra natural, en la que la muestra natural (verde) esencialmente no muestra señal.

La figura 3 muestra la especificidad de los cebadores y la sonda diseñados para ser específicos para la mutación P535H (rosa; azul oscuro) en comparación con otras muestras mutantes de ESR1 (todas las demás curvas/colores).

La figura 4A muestra las curvas de crecimiento/amplificación para un control positivo para la mutación E380Q (MC, las dos curvas en la parte superior izquierda), una muestra positiva para la mutación E380Q (IN008, las dos curvas siguientes más abajo), una muestra con E380 natural (f Fp ET_w T, las dos curvas siguientes más abajo) y un control sin molde (NTC, línea plana en la parte inferior).

La figura 4B muestra las mismas curvas de crecimiento/amplificación sin las curvas de control positivo para la mutación E380Q.

La figura 5 muestra las curvas de crecimiento/amplificación para un control positivo para la mutación D538G (MC, curva en la parte superior izquierda), 3 muestras positivas para la mutación D538G (D538G, las tres curvas siguientes más abajo), muestras con D538 natural (las 48 curvas siguientes más abajo) y un control sin molde (NTC, línea plana en la parte inferior).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Introducción

En el presente documento se proporciona un ensayo de PCR multiplex para detectar la presencia de mutaciones en el receptor de estrógeno humano (ESR1). Estas mutaciones se asocian con la resistencia al tratamiento hormonal en pacientes con cáncer con cánceres sensibles a hormonas (positivos para ESR1 y/o positivos para el receptor de progesterona) que eran sensibles al tratamiento hormonal cuando se administró inicialmente. Los ensayos se pueden llevar a cabo con muestras no invasivas (por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, etc.), de modo que se pueden llevar a cabo pruebas repetidas en un paciente en tratamiento hormonal sin extraer múltiples biopsias de tejido.

Los ensayos descritos en el presente documento se basan en tecnología probada y ampliamente aceptada y proporcionan resultados exactos, reproducibles y rápidos.

II. Definiciones

Los términos "receptor de estrógeno", "ER" y "ESR1" se usan de manera intercambiable en el presente documento a menos que se indique de otro modo. ESR1 también se puede usar para hacer referencia al gen que codifica la proteína ER.

El término "multiplex" se refiere a un ensayo en el que se detecta más de una diana.

Los términos "receptáculo", "recipiente", "tubo", "pocillo", "cámara", "microcámara", etc., se refieren a un recipiente que puede contener reactivos o un ensayo. Si el receptáculo está en un kit y contiene reactivos, o se está usando para una reacción de amplificación, se puede cerrar o sellar para evitar la contaminación o la evaporación. Si el receptáculo se está usando para un ensayo, puede estar abierto o accesible al menos durante el montaje del ensayo.

Los términos "detectado individualmente" o "detección individual", que se refieren a un gen marcador o producto de un gen marcador, indican que se detecta cada marcador en una reacción multiplex. Es decir, cada marcador está asociado con un marcador diferente (detectado por una sonda marcada de manera diferente).

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) e incluyen ácidos nucleicos naturales (adenosina, guanidina, citosina, uracilo y timidina), no naturales y modificados. El término no se limita por la longitud (por ejemplo, número de monómeros) del polímero. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y en general contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque en algunos casos, los análogos nucleotídicos pueden tener otras uniones. Los monómeros se denominan típicamente nucleótidos. El término "nucleótido no natural" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una base nitrogenada, glúcido o grupo fosfato modificado, o que incorpora un resto no natural en su estructura. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen didesoxinucleótidos, nucleótidos biotinilados, aminados, desaminados, alquilados, bencilados y marcados con fluoróforo.

El término "cebador" se refiere a un ácido nucleico corto (un oligonucleótido) que actúa como un punto de inicio de la síntesis de cadenas polinucleotídicas por un ácido nucleico polimerasa en condiciones adecuadas. Las reacciones de síntesis y amplificación de polinucleótidos incluyen típicamente un tampón apropiado, dNTP y/o rNTP, y uno o más cofactores opcionales, y se llevan a cabo a una temperatura adecuada. Un cebador incluye típicamente al menos una región hibridada a la diana que es al menos sustancialmente complementaria a la secuencia diana (por ejemplo, que tiene 0, 1, 2 o 3 emparejamientos erróneos). Esta región tiene típicamente una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 nucleótidos, por ejemplo, 12-25 nucleótidos. Un "par de cebadores" se refiere a un cebador directo y otro inverso que están orientados en direcciones opuestas con respecto a la secuencia diana y que producen un producto de amplificación en condiciones de amplificación. En algunos modos de realización, múltiples pares de cebadores se basan en un único cebador directo o inverso común. Por ejemplo, múltiples cebadores directos específicos de alelo se pueden considerar parte de un par de cebadores con el mismo cebador inverso común, por ejemplo, si los múltiples alelos están muy próximos entre sí.

Como se usa en el presente documento, "sonda" quiere decir cualquier molécula que se puede unir selectivamente a una biomolécula diana específicamente destinada, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de interés que hibrida con las sondas. La sonda está marcada de forma detectable con al menos un resto no nucleotídico. En algunos modos de realización, la sonda está marcada con un fluoróforo y un desactivador.

Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido para formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia A-G-T (A-G-U para ARN) es complementaria a la secuencia T-C-A (U-C-A para ARN). La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, donde todos los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases. Una sonda o cebador se considera "específico para" una secuencia diana si es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana. Dependiendo de las condiciones, el grado de complementariedad de la secuencia diana es típicamente mayor para un ácido nucleico más corto tal como un cebador (por ejemplo, más de un 80 %, 90 %, 95 % o mayor) que para una secuencia más larga. En algunos modos de realización, la expresión "cada par de cebadores específico para una secuencia diferente del gen ESR1" indica que cada par de cebadores amplifica específicamente una secuencia diferente, por ejemplo, un alelo o una mutación diferente, del gen ESR1.

El término "amplifica específicamente" indica que un conjunto de cebadores amplifica más una secuencia diana que una secuencia no diana a un nivel estadísticamente significativo. El término "detecta específicamente" indica que una sonda detectará mejor una secuencia diana que una secuencia no diana a un nivel estadísticamente significativo. Como se entenderá en la técnica, la amplificación y detección específicas se pueden determinar usando un control negativo, por ejemplo, una muestra que incluye los mismos ácidos nucleicos que la muestra de prueba, pero no la secuencia diana, o una muestra que carece de ácidos nucleicos. Por ejemplo, los cebadores y las sondas que amplifican y detectan específicamente una secuencia diana dan como resultado un Ct que se distingue fácilmente del fondo (secuencia no diana), por ejemplo, un Ct con al menos 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20 o 10-30 ciclos menos que el fondo. El término PCR "específica de alelo" se refiere a la amplificación de una secuencia diana usando cebadores que amplifican específicamente una variante alélica particular de la secuencia diana. Típicamente, el cebador directo o inverso incluye el complemento exacto de la variante alélica en esa posición.

Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos, o dos o más polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o aminoácidos que son iguales (por ejemplo, aproximadamente un 60 % de identidad, por ejemplo, al menos cualquiera de un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o identidad mayor en una región especificada, cuando se compara y alinea para obtener la correspondencia máxima en un margen de comparación o región designada) como se mide usando los algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros por defecto, o por alineación manual e inspección visual. Véase, por ejemplo, el sitio web del NCBI en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Se dice entonces que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas". El porcentaje de identidad se determina típicamente sobre secuencias óptimamente alineadas, de modo que la definición se aplica a las secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como a las que tienen sustituciones. Los algoritmos usados comúnmente en la técnica representan huecos y similares. Típicamente, la identidad existe en una región que comprende una secuencia que tiene una longitud de al menos aproximadamente 8-25 aminoácidos o nucleótidos, o en una región que tiene una longitud de 50-100 aminoácidos o nucleótidos, o en toda la longitud de la secuencia de referencia.

El término "kit" se refiere a cualquier fabricación (por ejemplo, un envase o un recipiente) que incluye al menos un reactivo, tal como una sonda de ácido nucleico o conjunto de sondas o similares, para amplificar, capturar, marcar/convertir o detectar específicamente ARN o ADN como se describe en el presente documento.

El término "condiciones de amplificación" se refiere a condiciones en una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, amplificación por PCR) que permiten la hibridación y extensión dependiente de molde de los cebadores. El término "amplicón" o "producto de amplificación" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene toda o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico diana y que se forma como producto de la amplificación in vitro por cualquier procedimiento de amplificación adecuado. Un experto comprenderá que un cebador directo y otro inverso (par de cebadores) definen los límites de un producto de amplificación. El término "generar un producto de amplificación", cuando se aplica a los cebadores, indica que los cebadores, en condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de una nucleótido polimerasa y NTP), producirán el producto de amplificación definido. Diversas condiciones de PCR se describen en PCR Strategies (Innis et al., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Academic Press, NY, 1990).

El término "producto de amplificación" se refiere al producto de una reacción de amplificación.

El producto de amplificación incluye los cebadores usados para iniciar cada ronda de síntesis de polinucleótidos. Un "amplicón" es la secuencia seleccionada para amplificación, y el término también se puede usar para referirse al producto de amplificación. Los límites 5' y 3' del amplicón están definidos por los cebadores directo e inverso.

Los términos "individuo", "sujeto" y "paciente" se usan de manera intercambiable en el presente documento. El individuo puede estar en la situación de prediagnóstico, posdiagnóstico pero pretratamiento, recibir tratamiento o postratamiento. En el contexto de la presente divulgación, el individuo típicamente busca atención médica.

El término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a cualquier composición que contiene o que se sospecha que contiene ácido nucleico. El término incluye componentes purificados o separados de células, tejidos o sangre, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas, partes sin células o lisados celulares. La muestra puede ser FFPEt , por ejemplo, de un tumor o una lesión metastásica. La muestra también puede ser de tejido congelado o fresco o de una muestra líquida, por ejemplo, sangre o un componente sanguíneo (plasma o suero), orina, semen, saliva, esputo, moco, semen, lágrima, linfa, líquido cefalorraquídeo, enjuague bucal/de garganta, lavado broncoalveolar, material lavado de un hisopo, etc. Las muestras también pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro de células obtenidas de un individuo, incluyendo líneas celulares. La muestra también se puede procesar parcialmente a partir de una muestra obtenida directamente de un individuo, por ejemplo, lisado celular o sangre sin glóbulos rojos.

La frase "obtener una muestra de un individuo" quiere decir que se proporciona una muestra biológica del individuo para pruebas. Se puede obtener directamente del individuo, o de un tercero que obtuvo directamente la muestra del individuo.

La frase "proporcionar tratamiento para un individuo" quiere decir que el tratamiento se prescribe, se recomienda o se pone a disposición del individuo. De hecho, el tratamiento se puede administrar realmente al individuo por un tercero (por ejemplo, una inyección a pacientes internos) o por el propio individuo.

Una muestra o un valor de "control" se refiere a un valor que sirve como referencia, normalmente una referencia conocida, para su comparación con una muestra de prueba o condiciones de prueba. Por ejemplo, se puede tomar una muestra de prueba de una condición de prueba, por ejemplo, de un individuo que se sospecha que tiene cáncer, y comparar con muestras de condiciones conocidas, por ejemplo, de un individuo sin cáncer (control negativo), o de un individuo que se sabe que tiene cáncer (control positivo). En el contexto de la presente divulgación, la muestra de prueba es típicamente de un paciente con cáncer de mama. Un control también puede representar un valor promedio o un intervalo recogido de una serie de pruebas o resultados. También se puede preparar un control para las condiciones de reacción. Por ejemplo, un control para la presencia, calidad y/o cantidad de ácido nucleico (por ejemplo, control interno) puede incluir cebadores o sondas que detecten una secuencia que se sabe que está presente en la muestra (por ejemplo, un gen de mantenimiento tal como beta-actina, beta-globina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), proteína ribosómica L37 y L38, PPIasa, EIF3, factor 2 de elongación de la traducción eucariota (eEF2), DHFR o succinato deshidrogenasa). En algunos modos de realización, el control interno puede ser una secuencia de una región del mismo gen que no es comúnmente variable (por ejemplo, en un exón diferente). También se puede añadir un polinucleótido añadido conocido que tenga, por ejemplo, una longitud determinada. Un ejemplo de un control negativo es uno que carece de ácidos nucleicos o uno que incluye cebadores o sondas específicos para una secuencia que no estaría presente en la muestra, por ejemplo, de una especie diferente. Un experto comprenderá que la selección de los controles dependerá, por ejemplo, del ensayo particular, de modo que el control sea apropiado para el tipo de célula y el organismo. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden diseñar controles para la evaluación de cualquier número de parámetros. Por ejemplo, se puede idear un control para comparar el beneficio terapéutico basado en datos farmacológicos (por ejemplo, semivida) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de beneficio y/o efectos secundarios). Se pueden diseñar controles para aplicaciones in vitro. Un experto en la técnica comprenderá qué controles son valiosos en una situación dada y podrá analizar datos basados en comparaciones con valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la significación de los datos. Por ejemplo, si los valores para un parámetro dado son muy variables en los controles, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.

Los términos "marcador", "marca", "resto detectable" y términos similares se refieren a una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen tintes fluorescentes (fluoróforos), agentes luminiscentes, radioisótopos (por ejemplo, 32P, 3H), reactivos de alta densidad electrónica o un resto basado en afinidad, por ejemplo, una marca de poli-A (interactúa con poli-T) o de poli-T (interactúa con poli-A), una marca de His (interactúa con Ni) o una marca de estreptavidina (separable con biotina). Un experto comprenderá que un marcador detectable conjugado con un ácido nucleico no es natural.

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4.a ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989). El término "un" o "una" pretende querer decir "uno/a o más". Los términos "comprender", "comprende" y "que comprende", cuando preceden la recitación de una etapa o un elemento, pretenden querer decir que la adición de otras etapas o elementos es opcional y no se excluye.

III. Muestras de ácido nucleico

Las muestras para la amplificación de ácidos nucleicos se pueden obtener de cualquier fuente que se sospeche que contiene ácido nucleico. Se pueden tomar muestras de tejido incluido en parafina y fijado con formol (FFPET), biopsia de tejido o células en cultivo (por ejemplo, obtenidas de un paciente o que constituyen un control). En algunos modos de realización, la muestra se obtiene de manera no invasiva, por ejemplo, de orina, piel, hisopo, saliva, sangre o una fracción de sangre.

En una muestra que incluye células, las células se pueden separar (por ejemplo, usando filtración o centrifugación basada en el tamaño), dejando de este modo los ácidos nucleicos sin células (ANsc), incluyendo ácidos nucleicos en exosomas, microvesículas, partículas víricas o aquellos que circulan libremente. De forma alternativa, las células se pueden lisar para obtener ácidos nucleicos celulares, ya sea en presencia de partículas de vidrio magnéticas (MGP) o antes de la adición del lisado celular a las MGP.

Son conocidos procedimientos para aislar ácidos nucleicos de muestras biológicas, por ejemplo, como se describe en Sambrook, y hay varios kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de aislamiento de ARN de alta pureza, el kit de ácido nucleico vírico de alta pureza y el kit de aislamiento de ácido nucleico total MagNA Pure LC, el kit de aislamiento de ADN para células y tejidos, el kit de aislamiento de ADN para sangre de mamíferos, el kit de aislamiento de ADN FFPET de alta pureza, disponibles de Roche). En el contexto de los procedimientos divulgados en el presente documento se recoge ARN, aunque en algunos modos de realización el clasificador se puede usar con ADNc preparado previamente.

IV. Cáncer con receptor de estrógeno mutado y tratamientos

Los tumores sensibles a hormonas se tratan comúnmente con tratamiento hormonal. Los tumores insensibles a hormonas típicamente no responden al tratamiento hormonal. El término "tratamiento hormonal" se aplica a una variedad de tratamientos que bloquean el efecto de las hormonas que afectan al crecimiento del tumor. En algunos casos, sin embargo, tales como determinados cánceres de útero y riñón, se prescribe progesterona o una versión sintética de la misma.

El cáncer de mama a menudo es sensible a hormonas, y los pacientes diagnosticados con cáncer de mama se someten a pruebas para determinar si el tumor es positivo para el receptor de estrógeno (ESR1) y/o el receptor de progesterona. Los tumores positivos para receptores se pueden tratar con agentes que interfieren con la producción de estas hormonas. La ablación ovárica se puede llevar a cabo para extirpar los ovarios usando cirugía o radiación. La cirugía suele ir seguida de quimioterapia adicional. Los moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMS) que bloquean el efecto del estrógeno sobre el ESR incluyen tamoxifeno, raloxifeno, toremifeno y fulvestrant. Los tratamientos adicionales incluyen inhibidores de aromatasa (por ejemplo, anastrozol, exemestano, letrozol) y bloqueantes de la hormona luteinizante (LH) (por ejemplo, goserelina, leuprolida). Estos tratamientos se pueden usar en combinación, por ejemplo, un SERM con un inhibidor de aromatasa para pacientes posmenopáusicas o un SERM con un bloqueante de la LH para pacientes premenopáusicas. Tratamientos similares se consideran eficaces para los cánceres de ovario positivos para el receptor, mientras que el cáncer de próstata se puede tratar con bloqueantes de la hormona luteinizante, antiandrógenos y/o bloqueantes de la hormona liberadora de gonadotropina.

Además, los pacientes se pueden beneficiar de la quimioterapia estándar. Esta puede incluir CHOP (ciclofosfamida; doxorrubicina; vincristina y prednisolona) o R-CHOP, que además incluye rituximab y/o etopósido. El combinado se puede administrar periódicamente durante un período de tiempo establecido, o hasta que se detecte la reducción del tamaño del tumor y/o de los síntomas. Por ejemplo, CHOP o R-CHOP se pueden administrar cada 2 o 3 semanas.

Independientemente del tratamiento que se seleccione, típicamente comienza con una dosis baja de modo que se puedan determinar los efectos secundarios y se incrementa la dosis, por ejemplo, hasta que aparezcan efectos secundarios o dentro de la tolerancia del paciente, o hasta que se observe un beneficio clínico.

Después del tratamiento inicial, los pacientes se pueden volver resistentes al tratamiento hormonal. Se cree que la resistencia al tratamiento hormonal se debe, al menos en parte, a mutaciones en el receptor de estrógeno. Muchas de estas mutaciones se encuentran en el dominio de unión al ligando, de modo que el receptor está activo en ausencia de liberación de estrógenos. Los ejemplos incluyen K303R, E380Q, V392I, S463P, K531E, V534E, P535H, L536Q/R, Y537S/C/N, D538G y R555C. Las pruebas para detectar mutaciones en el receptor de estrógeno permiten tomar decisiones terapéuticas más eficaces para los pacientes. Las pruebas pueden ser periódicas durante el tratamiento hormonal, por ejemplo, antes, durante o después de la observación de resistencia. Por ejemplo, un paciente que recibe tratamiento con SERM se puede cambiar a un tratamiento hormonal diferente o una combinación de los mismos, o a una quimioterapia estándar.

V. Am plificación y detección

Para la detección y cuantificación se puede usar una muestra de ácido nucleico, por ejemplo, usando amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, usando cualquier procedimiento dependiente de cebador. En algunos modos de realización, se lleva a cabo una etapa de transcripción inversa preliminar (también denominada RT-PCR, que no se debe confundir con PCR en tiempo real). Véase, por ejemplo, Hierro et al. (2006), 72:7148. El término "qRT-PCR", como se usa en el presente documento, se refiere a transcripción inversa y PCR cuantitativa. Se pueden llevar a cabo ambas reacciones en un único tubo sin interrupción, por ejemplo, para añadir reactivos. Por ejemplo, se puede usar un cebador de poliT para retrotranscribir todos los ARNm en una muestra con una cola de poliA, se pueden usar oligonucleótidos aleatorios o se puede diseñar un cebador que sea específico para un transcrito diana particular que se retrotranscribirá en ADNc. El ADNc, o ADN de la muestra, puede formar el molde inicial para la amplificación cuantitativa (PCR en tiempo real o cuantitativa, es decir, RTPCR o PCRc). La PCRc permite la detección y medición fiables de los productos generados durante cada ciclo del proceso de PCR. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica, y los kits y reactivos están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Roche Molecular Systems, Life Technologies, Bio-Rad, etc. Véase, por ejemplo, Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR, vol. 50.

Se puede usar una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa termoestable separadas, por ejemplo, en una reacción de dos etapas (transcripción inversa seguida de la adición de ADN polimerasa y amplificación) o en una reacción combinada (añadiendo ambas enzimas a la vez). En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se amplifica con una polimerasa termoestable tanto con actividad transcriptasa inversa como con actividad dependiente de molde de ADN. Los ejemplos de enzimas incluyen la a Dn polimerasa Tth, el sistema de polimerasas C. therm y las divulgadas en los documentos US20140170730 y US20140051126.

Las sondas para su uso como se describe en el presente documento se pueden marcar con un fluoróforo y un desactivador (por ejemplo, TaqMan, LightCycler, Molecular Beacon, Scorpion o sondas con dos marcadores). Los fluoróforos apropiados incluyen FAM, JOE, TET, Cal Fluor Gold 540, HEX, VIC, Cal Fluor Orang 560, TAMRA, Cyanine 3, Quasar 570, Cal Fluor Red 590, Rox, Texas Red, Cyanine 5, Quasar 670 y Cyanine 5.5. Los desactivadores apropiados incluyen TAMRA (para FAM, JOE y TET), DABCYL y BHQ1-3.

Los dispositivos de detección son conocidos en la técnica y se pueden seleccionar según sea apropiado para los marcadores seleccionados. Los dispositivos de detección apropiados para la PCR cuantitativa incluyen los sistemas cobas® y Light Cycler® (Roche), los sistemas de PCR en tiempo real Pr ISM 7000 y 7300 (Applied Biosystems), etc. El sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad) y Rotorgene Q (Qiagen) disponen de una detección de seis canales, lo que permite un mayor grado de multiplexación.

Los resultados se pueden expresar en términos de ciclo umbral (abreviado como Ct y, en algunos casos, como Cq o Cp). Un valor de Ct más bajo refleja el logro rápido de un nivel umbral predeterminado, por ejemplo, debido a una concentración de ácido nucleico diana más alta o una amplificación más eficaz. Un valor de Ct más alto puede reflejar una concentración de ácido nucleico diana más baja o una amplificación ineficaz o inhibida. El ciclo umbral se selecciona, en general, para que se encuentre en el intervalo lineal de amplificación para una diana dada. En algunos modos de realización, el Ct se establece como el ciclo en el que la señal de crecimiento supera una línea umbral predefinida, por ejemplo, en relación con el valor de referencia, o determinando el máximo de la segunda derivada de la curva de crecimiento. La determinación del Ct es conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7363168.

VI. Kits

En el presente documento se proporcionan kits para llevar a cabo una PCR multiplex específica de alelo para detectar mutaciones en el ESR1. Los kits incluyen cebadores y sondas para detectar específicamente mutaciones particulares en el ESR1 como se describe en el presente documento.

Para detectar ESR1 V422DelV se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 284 o 287-300, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 285 o 302-311 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 286 o 301. Para detectar ESR1 S463P se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 260 o 263-272, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 261 o 274-283 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 262 o 273. Para detectar ESR1 L536H se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 96-105, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 106-120 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 94 o 95. Para detectar ESR1 L536P se puede seleccionar un par de cebadores de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 121-130 y las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 131-140. Para detectar ESR1 L536Q se puede seleccionar un par de cebadores de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 141-150 y las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 151-160. Para detectar ESR1 L536R se puede seleccionar un par de cebadores de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 161-170 y las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 171-180. Para detectar ESR1 D538G se puede seleccionar un par de cebadores de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 4-13 y las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 14-27 o 550. Para detectar ESR1 K303R se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 473, 474 o 478-487, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 477, 489 498 o 576 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 477 o 488. Para detectar ESR1 E380Q se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 28 o 32-42, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 29, 30 o 44-53 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 43 o 54. Los cebadores para detectar ESR1 L536_D538>P se pueden seleccionar de las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 84 93. Para detectar ESR1 Y537C se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 394 o 397-406, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 395, 408-425 o 574 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 396 o 407. Para detectar ESR1 Y537N se puede seleccionar un par de cebadores de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 426-435 y las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 436-448 o 575-577. Para detectar ESR1 Y537S se puede seleccionar un par de cebadores de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 449-458 y las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 459 472 o 578. Para detectar ESR1 S341L se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 232, 233 o 238-247, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 234, 235 o 250-259 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 248 o 249. Para detectar ESR1 L429V se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 58 o 61-70, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 59 o 72-81 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 60 o 71. Para detectar ESR1 V533M se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 312-318, 322-333, 355 o 356, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 319, 320 o 336354 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 321, 334 o 335. Para detectar ESR1 V534E se pueden seleccionar un par de cebadores y una sonda de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 357 o r363-373, las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 358-362 o 378-393 y las secuencias de sonda SEQ ID NO: 363 o 374-377. Para detectar ESR1 P535H se puede seleccionar un par de cebadores de las secuencias de cebadores directos SEQ ID NO: 181 -190 y las secuencias de cebadores inversos SEQ ID NO: 191-231.

Además, para las mutaciones en el exón 8, se puede usar un cebador directo común o inverso común para amplificar cada producto de amplificación, y se puede usar una sonda común para detectar cada producto de amplificación. Un experto comprenderá que se pueden realizar ligeras variaciones en las secuencias, por ejemplo, adición o deleción de 1-3 nucleótidos.

Los cebadores específicos de alelo seleccionados de los divulgados en la tabla 5 para cada mutación se pueden incluir en el kit, junto con cebadores y sondas comunes correspondientes a esa mutación.

En algunos modos de realización, el kit comprende 1-18 soluciones madre que comprenden pares de cebadores y sondas específicas de alelo. Las soluciones madre pueden incluir opcionalmente ADN polimerasa e incluir opcionalmente un par de cebadores y una sonda para detectar un control interno. En algunos modos de realización, el kit incluye 2-5 de dichas soluciones madre, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 soluciones madre.

En algunos modos de realización, las mezclas de solución madre comprenden además tampones, dNTP y otros elementos (por ejemplo, cofactores o aptámeros) apropiados para la transcripción inversa y la amplificación. Típicamente, la mezcla está concentrada, de modo que se añade una alícuota al volumen de reacción final junto con la muestra (por ejemplo, ADN), enzimas y/o agua. En algunos modos de realización, el kit comprende además una transcriptasa inversa (o una enzima con actividad transcriptasa inversa) y/o ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa termoestable tal como Taq, ZO5 y derivados de las mismas).

En algunos modos de realización, el kit incluye además componentes para la purificación de ADN o ARN de una muestra, por ejemplo, una muestra no invasiva o de tejido. Por ejemplo, el kit puede incluir componentes del kit de aislamiento de ácido nucleico total MagNA Pure LC, el kit de aislamiento de ADN para células y tejidos, el kit de aislamiento de ADN para sangre de mamíferos, el kit de aislamiento de ADN FFPET de alta pureza, los kits de aislamiento de ARN de alta pureza o MagNA Pure (Roche), los kits DNeasy o RNeasy (Qiagen), los kits de aislamiento de ADN o ARN PureLink (Thermo Fisher), etc.

En algunos modos de realización, el kit incluye además al menos una muestra de control, por ejemplo, ácidos nucleicos de una muestra (o muestras agrupadas) no cancerosa o de una muestra (o muestras agrupadas) con mutación en ESR1 conocida. En algunos modos de realización, el kit incluye un control negativo que, por ejemplo, carece de ácidos nucleicos o carece de ácidos nucleicos con mutación en ESR1. En algunos modos de realización, el kit incluye además consumibles, por ejemplo, placas o tubos para la preparación de ácido nucleico, tubos para la recogida de muestras, etc. En algunos modos de realización, el kit incluye además instrucciones para su uso, referencias a un sitio web o un programa informático.

VII. Ejemplos

Diseño de ensayo

Se diseñaron ensayos de PCR multiplex específica de alelo para detectar 18 mutaciones en el gen ESR1. Las mutaciones detectadas se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Mutaciones en el ESR1

Los cebadores y las sondas generados para los ensayos se muestran en la tabla 2. Un experto comprenderá que la lista no es exhaustiva y que las secuencias de los cebadores y/o de la sonda se pueden modificar ligeramente con respecto a las mostradas, por ejemplo, añadiendo o restando uno o unos pocos nucleótidos, desplazando la posición del nucleótido modificado o usando un nucleótido modificado diferente en un sitio dado (por ejemplo, N4_Et_dC en lugar de t_BB_dC). La mutación detectada se indica en el nombre del cebador/sonda. FS# y RS# se refieren al cebador específico directo y al cebador específico inverso, respectivamente. CF# y CR# se refieren al cebador directo común y al cebador inverso común, respectivamente. F_P# y R_P# se refieren a sondas directas e inversas. Si bien las sondas del exón 8 están marcadas para mutaciones específicas, se pueden usar para detectar cualquier mutación en el exón 8; la especificidad de alelo para este ensayo se determina mediante cebadores específicos de alelo. Como ejemplo, para detectar la mutación D538G, se puede usar cualquier cebador ESR1_D538G_FS# con cualquier cebador ESR1_[Exon8mut]_CR# y cualquier sonda ESR1_[Exon8mut]_F_P#, y cualquier cebador ESR1_D538G_RS# se puede usar con cualquier cebador ESR1_[Exon8mut]_CF# y cualquier sonda ESR1_[Exon8mut]_R_P#.

Las modificaciones incluyen t_BB_[dNTP] = N6-terc-butil-bencilo [dNTP]; N4_Et_[dNTP] = N4-etilo [dNTP]; N4_Bz_[dNTP] = N4-bencilo [dNTP]; N6_Me_[dNTP] = N6-metilo [dNTP]; pdU = 5-propinil-desoxiuracilo; 7_Dz_dG = 7-desaza dG; LNA-[dNTP] = ácido nucleico bloqueado [dNTP].

Tabla 2. Secuencias de cebadores y sondas

Selección de oligonucleótidos para la detección de mutantes con alta sensibilidad y especificidad

Los cebadores se seleccionaron para garantizar que la señal del muíante se pudiera detectar de forma sensible y específicamente en comparación con el natural. Se usaron un par de cebadores y una sonda diseñados para ser específicos para la mutación ESR1 K303R y para la mutación L536_D538>P para detectar el molde mutante añadido al ADN natural en una proporción de 1:1600 (100 copias de ADN mutante en 160.000 copias de ADN natural) y en ADN natural solo. La amplificación y detección específicas de alelo se llevaron a cabo con cobas z 480. Los datos se expresan en curvas de Ct graficando los ciclos de amplificación frente a la señal de fluorescencia (que indica la detección del producto de amplificación)

La figura 1A muestra una reacción específica para K303R sin discriminación. Los cebadores y la sonda seleccionados amplifican y detectan la señal de las muestras mutante y natural esencialmente en el mismo nivel. La figura 1B muestra una reacción específica para K303R con mejor discriminación. Los Ct de las dos muestras naturales están desplazados al menos 2 ciclos hacia la derecha. La figura 1C muestra una reacción mucho más específica para L536_D538>P, que también es lo suficientemente sensible como para detectar ADN mutante en una proporción de al menos 1:1600. Las muestras naturales no se detectan en absoluto, mientras que las muestras mutantes tienen un Ct de alrededor de 35-38.

En las figuras 2A, 2B y 2C se muestra una comparación similar con cebadores y sondas diseñados para ser específicos para la mutación L536R. La figura 2A muestra una reacción sin discriminación usando el cebador específico de alelo L536R_RS01. El natural se amplifica esencialmente en el mismo nivel que el mutante. La figura 2B muestra una reacción con mejor discriminación usando el cebador específico de alelo L536R_RS09, donde el natural tiene un Ct retardado de al menos 5 ciclos en comparación con el mutante. La figura 2C muestra una reacción con buena discriminación usando el cebador específico de alelo L536R_RS04. El natural tiene un Ct de más de 50 ciclos, considerado no detectado, en comparación con un Ct del mutante en el intervalo detectable de alrededor de 35.

Especificidad de la detección de mutaciones multiplex

Los conjuntos de pares de cebadores y sondas se sometieron a prueba en multiplex para determinar la especificidad y garantizar que no detectarían otras mutaciones en el ESR1. Se prepararon mezclas de muestras separadas para cada uno de los 18 mutantes enumerados en la tabla 1, a las que se añadió ADN mutante y natural 1:1 (5000 copias de cada uno). Se añadieron pares de cebadores y sondas específicos para las 18 mutaciones. La figura 3 muestra una curva de Ct ejemplar con alta especificidad para ESR1 P535H. Las dos curvas más a la izquierda, con un Ct de alrededor de 25-30, representan la detección específica de la mutación ESR1 P535H presente en la muestra (indicada con una flecha clara). Los Ct para los otros conjuntos de pares de cebadores y sondas tienen un Ct mucho más retardado (indicado entre dos flechas negras).

Linealidad del ensayo

También se detectó una linealidad de detección en todo un intervalo de concentraciones de molde para cada mutación. Como ejemplo, se usaron un par de cebadores y una sonda específicos para ESR1 S341L para amplificar 5-5000 copias de molde mutante en un fondo de 10.000 copias naturales. Los resultados se muestran en la tabla 3 y muestran que el ensayo es altamente lineal.

Tabla 3

Detección de mutaciones en el ESR1 en muestras de plasma artificiales

El ensayo se sometió a prueba en fondo de plasma para determinar si los componentes del plasma interferirían. Se añadieron 1000 copias de ADN mutante a 2 ml de plasma normal (natural). El ADN se extrajo con el kit de preparación de muestras de ADN cobas®. A cada reacción de PCR se añadió ADN equivalente al de 0,5 ml de plasma. Se añadieron conjuntos de pares de cebadores y sondas correspondientes a cada mutación. Los resultados ejemplares se muestran en la tabla 4. Los datos muestran que el ADN mutante se puede detectar de forma sensible en fondo de plasma natural.

Tabla 4

Oligonucleótidos seleccionados

Se seleccionaron cebadores específicos de alelo que muestran una buena especificidad por la secuencia mutante en base a los criterios anteriores. Estos se muestran en la tabla 5 a continuación con la denominación del cebador y la SEQ ID NO entre paréntesis. Las entradas en negrita indican cebadores que muestran selectividad y especificidad en la configuración del ensayo mostrada en la tabla 6 a continuación, aunque otras combinaciones también funcionan bien.

Tabla 5: Cebadores específicos de alelo seleccionados

En el caso de los cebadores RS para el exón 8, se puede usar cualquier cebador CF para el exón 8, por ejemplo, V533M_CF03 (SEQ ID NO: 314) o Y537C_CF01 (SEQ ID NO: 394). Se puede usar cualquier sonda para el exón 8, por ejemplo, Y537C_R_P01 (SEQ ID NO: 407). En general, se puede usar cualquier cebador Cr y sonda F correspondientes para cualquier cebador FS específico de alelo. De forma similar, se puede usar cualquier cebador CF y sonda R correspondientes para cualquier cebador RS específico de alelo.

Los ejemplos particulares incluyen K303R_CR02 (SEQ ID NO: 476) y K303R_F_P01 (SEQ ID NO: 477); S341 L_CR02 (SEQ ID NO: 235) y S341L_F_P02 (SEQ ID NO: 237); E380QCRP3 (SEQ ID NO: 528) y E380Q_F_P01 (SEQ ID NO: 31); V422delV_CR01 (SEQ ID NO: 285) y V422delV_F_P01 (SEQ ID NO: 286); L429V_CR01 (SEQ ID NO: 59) y L429_F_P01 (SEQ ID NO: 60); y S463P_CR01 (SEQ ID NO: 261) y S463P_F_P01 (SEQ ID NO: 262).

Configuración de ensayo de ejemplo

Se busca diseñar un ensayo altamente multiplexado para detectar el número máximo de mutaciones en un número mínimo de recipientes de reacción. En las tablas 6 y 7 a continuación se muestran ejemplos de ensayos de tres recipientes. Las mutaciones del exón 8 se agrupan para permitir el uso de un cebador directo y una sonda comunes. Si se desea, un experto comprenderá cómo identificar la(s) mutación/mutaciones exacta(s) del exón 8 que da(n) como resultado una señal de mutación positiva usando, por ejemplo, secuenciación o PCR con sondas específicas de la mutación.

Tabla 6: Configuración ejemplar del ensayo para la mutación en el ESR1 multiplex específica de alelo

Tabla 7: Configuración ejemplar del ensayo para la mutación en el ESR1 multiplex específica de alelo

Un experto comprenderá que se pueden realizar diferentes configuraciones, dependiendo de las mutaciones de interés y la disponibilidad de canales de fluorescencia. Por ejemplo, se puede incrementar el número de tubos para permitir la detección individual de mutaciones en el exón 8. A medida que se incrementa el número de canales de fluorescencia, se incrementará el número de mutaciones que se pueden incluir en un único tubo.

Detección de la mutación E380Q en muestras FFPET en reacciones multiplex

Se extrajo ADN de 142 muestras FFPET (mama, ganglios linfáticos, pulmón, hueso) de pacientes con cáncer usando el kit de preparación de muestras de ADN cobas®. El ADN (50 ng/reacción) se analizó en cuanto a mutaciones en el ESR1 por la PCR multiplex específica de alelo como se describe en el presente documento (realizada por duplicado). Los resultados se muestran en las figuras 4A y 4B. Una muestra (IN008) resultó positiva para la mutación E380Q y tiene una curva de crecimiento/amplificación similar a la del control positivo (MC) de la mutación E380Q (véase la figura 4A). La figura 4B muestra los mismos datos sin el control positivo de la mutación E380Q. Los resultados se confirmaron usando PCRdd.

La muestra positiva para la mutación E380Q muestra un perfil que se distingue claramente del E380 natural y del control sin molde. Los resultados también muestran que los ensayos multiplex descritos en el presente documento son eficaces para detectar mutaciones específicas en el ADN de muestras clínicas FFPET.

Detección de la mutación D538G en muestras de plasma en reacciones multiplex

Se obtuvieron muestras clínicas de plasma (2 ml de plasma) de 103 pacientes posmenopáusicas con cáncer de mama metastásico que recayeron durante el tratamiento con un inhibidor de aromatasa o en los 12 meses después de la suspensión. El ADN se extrajo usando el kit de preparación de muestras de ADNlc cobas® y se analizó en cuanto a mutaciones en el ESR1 por PCR multiplex específica de alelo como se describe en el presente documento. Tres muestras dieron positivo para D538G, como se muestra en la figura 5. La figura 5 muestra los resultados de 51 muestras, 3 positivas para D538G y 48 con D538 natural. También se muestran los controles positivos para la mutación D538G y sin molde, y las muestras positivas para D538G muestran perfiles que se distinguen claramente. Los resultados se confirmaron usando PCRdd.

Los resultados muestran que los ensayos multiplex descritos en el presente documento son eficaces para detectar mutaciones específicas en el ADN de muestras clínicas no invasivas (plasma).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un kit que comprende tres recipientes, en el que:

(i) un primer recipiente contiene un par de cebadores específico para ESR1 V422DelV, un par de cebadores específico para ESR1 S463P, un par de cebadores específico para ESR1 L536H, un par de cebadores específico para ESR1 L536P, un par de cebadores específico para ESR1 L536Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536R y un par de cebadores específico para ESR1 D538G;

(ii) un segundo recipiente contiene un par de cebadores específico para ESR1 K303R, un par de cebadores específico para ESR1 E380Q, un par de cebadores específico para ESR1 L536_D538>P, un par de cebadores específico para ESR1 Y537C, un par de cebadores específico para ESR1 Y537N y un par de cebadores específico para ESR1 Y537S; y

(iii) un tercer recipiente contiene un par de cebadores específico para ESR1 S341L, un par de cebadores específico para ESR1 L429V, un par de cebadores específico para ESR1 V533M, un par de cebadores específico para ESR1 V534E y un par de cebadores específico para ESR1 P535H;

conteniendo cada uno de los recipientes dos o más sondas específicas para una secuencia diferente del gen ESR1, en el que cada sonda está marcada con un fluoróforo y un desactivador; un par de cebadores específico para una secuencia de control interno; y

una sonda específica para la secuencia de control interno y marcada con un fluoróforo y un desactivador; y en el que los recipientes comprenden oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 24, 113, 134, 158, 178, 264, 261, 262, 285, 286, 298, 314, 394, 407, 31, 42, 90, 415, 447, 469, 476, 477, 481, 528, 59, 60, 70, 231, 235, 237, 245, 350 y 388.

2. El kit de la reivindicación 1, en el que cada uno de los recipientes contiene de tres a cuatro sondas.

3. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos un cebador incluye un nucleótido no natural modificado.

4. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada recipiente contiene además una ADN polimerasa termoestable.

5. Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de dos o más mutaciones en el ESR1 en una muestra de un individuo, que comprende:

(i) obtener una muestra del individuo;

(ii) llevar a cabo una PCR multiplex específica de alelo para determinar la presencia o ausencia de dos o más mutaciones en el ESR1, en el que la PCR multiplex específica de alelo se lleva a cabo en tres recipientes, en el que la presencia o ausencia de mutaciones en el ESR1 se determina en los tres recipientes como sigue: (i) ESR1 V422DelV, ESR1 S463P, ESR1 L536H, ESR1 L536P, ESR1 L536Q, ESR1 L536R y ESR1 D538G en un primer recipiente;

(ii) ESR1 K303R, ESR1 E380Q, ESR1 L536_D538>P, ESR1 Y537C, ESR1 Y537N y ESR1 Y537S en un segundo recipiente;

(iii) ESR1 S341L, ESR1 L429V, ESR1 V533M, ESR1 V534E y ESR1 P535H en un tercer recipiente; y en el que los recipientes comprenden oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 24, 113, 134, 158, 178, 264, 261, 262, 285, 286, 298, 314, 394, 407, 31, 42, 90, 415, 447, 469, 476, 477, 481, 528, 59, 60, 70, 231, 235, 237, 245, 350 y 388.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el individuo tiene cáncer de mama y se está sometiendo a tratamiento hormonal.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 o 6, que comprende llevar a cabo una PCR multiplex específica de alelo para determinar la presencia o ausencia de diez o más mutaciones en el ESR1.