CN113621694B - 一种用于鹌鹑性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于鹌鹑性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法,所述鹌鹑性别鉴定用PCR引物序列如SEQ ID NO.1和/SEQ ID NO.2所示。通过本发明的PCR引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,利用电泳结果的条带数来确定鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑的性别,具有操作简单方便,鉴别结果快速准确,便于基层推广和使用,具有广阔的市场应用前景,此外,基于本发明方法开发的检测试剂盒,可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种用于鹌鹑性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法。
背景技术
商业化家禽品种大都是以配套系模式生产的,父系一般生长速度较快,母系一般繁殖效率较高,因此都需要早期进行性别鉴定,父系要提前淘汰母雏,母系要提前淘汰公雏。肉用型家禽的公禽一般生长速度较快,公母分群饲养,养殖效益会更好。蛋用型家禽出雏时只保留母雏,公雏直接淘汰。因此家禽早期性别鉴定在生产中具有重要的意义。
目前家禽早期的性别鉴定除了伴性遗传(金银色羽、横斑羽、快慢羽)等方法外,主要通过翻肛观察生殖突起进行鉴别。但翻肛鉴别须在雏禽出生24小时内进行,超过这个时间段,雏禽肛门难以翻开,生殖突起萎缩甚至陷入泄殖腔深处,不便观察翻肛鉴别劳动强度大、工作环境差、专业性高,误鉴率也较高。
因此,需要开发一种简单方便,能够快速、准确鉴别家禽性别的方法。
发明内容
本发明目的在于解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足,提供一种设计合理,可用于家禽早期性别快速鉴定的PCR引物。
本发明通过以下技术方案实现本发明的目的:
本发明目的之一在于提供一种性别鉴定用PCR引物,所述引物序列如SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2所示。即所述引物的核苷酸序列为:
正向引物(SEQ ID NO.1):5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3';
反向引物(SEQ ID NO.2):5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
本发明目的之二在于提供包含本发明所述的性别鉴定用PCR引物的试剂盒。
在本发明的一种实施例中,本发明所述的试剂盒包含本发明所述的PCR引物、PCR反应液,在一些实施例中,还可以包含DNA提取液。
本发明目的之三在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在养殖业中的应用。
本发明目的之四在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸭性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸭性别鉴定中的应用,通过本发明所述的引物进行PCR扩增,电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭,呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭。
本发明目的之五在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸡性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸡性别鉴定中的应用,通过本发明所述的引物进行PCR扩增,电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡,呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡。
本发明目的之六在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸽性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸽性别鉴定中的应用,通过本发明所述的引物进行PCR扩增,电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽,呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽。
本发明目的之七在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在番鸭性别鉴定中的应用。
本发明所述的在番鸭性别鉴定中的应用,通过本发明所述的引物进行PCR扩增,电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭,呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭。
本发明目的之八在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鹅性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鹅性别鉴定中的应用,,电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅,呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅。
本发明目的之九在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鹌鹑性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鹌鹑性别鉴定中的应用,电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑,呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
本发明还提供一种鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑性别快速鉴定方法,包括以下步骤:
1)提取待测家禽的基因组DNA;
2)以步骤1)中提取的DNA为模板,利用本发明所述引物对,进行PCR扩增反应;
3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,
当待测家禽为鸭时,电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭公鸡,呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭;
当待测家禽为鸡时,电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡,呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡;
当待测家禽为鸽时,电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽,呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽;
当待测家禽为番鸭时,电泳结果PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭,呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭;
当待测家禽为鹅时,电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅,呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅;
当待测家禽为鹌鹑时,电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑,呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
本发明所述的方法,步骤1)提取待测家禽的基因组DNA可以按照本领域常规方法提取,例如可以选用包括但不限于羽毛、血液、组织、器官等进行待测家禽的基因组DNA的提取。
本发明所述的方法,步骤2)中PCR反应体系可以为本领域的常规体系,在本发明的一种具体的实施方式中,为:2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正向和反向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
本发明所述的方法,步骤2)中PCR反应程序可以为本领域的常规体系,在本发明的一种具体的实施方式中,为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
本发明与现有技术相比具有以下优点:本发明通过设计的PCR引物,进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,利用电泳结果的条带数来确定家禽的性别,具有操作简单方便,鉴别结果快速准确,便于基层推广和使用,具有广阔的市场应用前景,此外,基于本发明方法开发的检测试剂盒,可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
本发明的引物对家禽品种限制性小,因此对于所述的本发明所述的鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑没有具体品种的限制,其中,本发明中所述的“鸭”是指鸭科鸭属绿头鸭种,所述的“番鸭”又称洋鸭,是鸭科、栖鸭属疣鼻栖鸭。
附图说明
图1为本发明实施例1鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图2为本发明实施例2鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图3为本发明实施例3鸡的PCR扩增产物的电泳图谱。
图4为本发明实施例4鸡的PCR扩增产物的电泳图谱。
图5为本发明实施例6鸽子的PCR扩增产物的电泳图谱。
图6为本发明实施例7鸽子的PCR扩增产物的电泳图谱。
图7为本发明实施例8番鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图8为本发明实施例9番鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图9为本发明实施例10鹅的PCR扩增产物的电泳图谱。
图10为本发明实施例11鹅的PCR扩增产物的电泳图谱。
图11为本发明实施例12鹌鹑的PCR扩增产物的电泳图谱。
图12为本发明实施例13鹌鹑的PCR扩增产物的电泳图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1已知性别鸭鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年北京鸭,编号1-5为公鸭,6-10为母鸭,使用本发明设计引物扩增鸭基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1):5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3';
反向引物(SEQ ID NO.2):5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带,母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带,见结果如图1(其中1~5为公鸭,6~10为母鸭)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸭进行性别鉴定,并且简单易于操作。
实施例2
2未知性别鸭鉴定
2.1样品采集
采集16只未知性别的绍兴鸭雏鸭,使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ IDNO.2)扩增鸭基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带,母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带,见结果如图2(其中3、4、6、7、11、12、15、16为公鸭,1、2、5、8、9、10、13、14为母鸭)。
供试样本经过解剖,进行性器官观察,以上鉴定结果完全正确。
实施例3
1已知性别鸡鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年崇仁麻鸡,编号1-4为公鸡,5-8为母鸡,使用本发明设计引物扩增鸡基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1):5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3';
反向引物(SEQ ID NO.2):5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带,母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带,见结果如图3(其中1~4为公鸡,5~8为母鸡)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸡进行性别鉴定,并且简单易于操作。
实施例4
2未知性别鸡鉴定
2.1样品采集
采集24只未知性别的隐性白鸡的雏鸡,使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸡基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带,母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带,见结果如图4(其中1、4、5、7、8、9、12、14、17、20、21、22为公鸡,2、3、6、10、11、13、15、16、18、19、23、24为母鸡)。
供试样本经过解剖,进行性器官观察,以上鉴定结果完全正确。
实施例5
3资源保护应用
3.1将本单位地方鸡血液样本基因库中的大骨鸡、白耳黄鸡、河南斗鸡、北京油鸡、仙居鸡、茶花鸡、丝羽乌骨鸡、狼山鸡、藏鸡、清远麻鸡、瓦灰鸡、金湖乌凤鸡、茶花鸡、寿光鸡、鹿苑鸡、东乡黑鸡、边鸡、文昌鸡、固始鸡等19个品种使用本发明设计引物(SEQ IDNO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸡基因组。
3.2 PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
3.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带,母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带,鉴定结果与个体性别记录的结果一致,见表1。
表1 19个不同鸡地方品种检测结果
实施例6
1已知性别白羽王鸽鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年白羽王鸽,编号1-4为公鸽,5-8为母鸽,使用本发明设计引物扩增鸽基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1):5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3';
反向引物(SEQ ID NO.2):5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带,母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带,见结果如图5(其中1~4为公鸽,5~8为母鸽)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸽进行性别鉴定,并且简单易于操作。
实施例7
2未知性别欧洲肉鸽鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的欧洲肉鸽的雏鸽,使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸽基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带,母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带,见结果如图6(其中1、2、4、7、8、12、14、15为公鸽,3、5、6、9、10、11、13、16、17为母鸽)。
供试样本经过解剖,进行性器官观察,以上鉴定结果完全正确。
实施例8
1已知性别白羽番鸭鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年白羽番鸭,编号1-5为公番鸭,6-10为母番鸭,使用本发明设计引物扩增番鸭基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1):5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3';
反向引物(SEQ ID NO.2):5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带,母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带,见结果如图7(其中1~5为公番鸭,6~10为母番鸭)。
以上结果表明本发明能够快速准确对番鸭进行性别鉴定,并且简单易于操作。
实施例9
2未知性别黑羽番鸭鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的黑羽番鸭雏番鸭,使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增番鸭基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带,母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带,见结果如图8(其中2、3、5、7、10、11、13、14、17为公番鸭,1、4、6、8、9、12、15、16为母番鸭)。
供试样本经过解剖,进行性器官观察,以上鉴定结果完全正确。
实施例10
1已知性别扬州鹅鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年扬州鹅,编号1-5为公鹅,6-10为母鹅,使用本发明设计引物扩增鹅基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1):5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3';
反向引物(SEQ ID NO.2):5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带,母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带,见结果如图9(其中1~5为公鹅,6~10为母鹅)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鹅进行性别鉴定,并且简单易于操作。
实施例11
2未知性别莱茵鹅鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的莱茵鹅雏鹅,使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ IDNO.2)扩增鹅基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带,母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带,见结果如图10(其中1、4、7、8、11、13、15、16为公鹅,2、3、5、6、9、10、12、14、17为母鹅)。
供试样本经过解剖,进行性器官观察,以上鉴定结果完全正确。
实施例12
1已知性别日本鹌鹑鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年日本鹌鹑,编号1-4为公鹌鹑,5-8为母鹌鹑,使用本发明设计引物扩增鹌鹑基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1):5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3';
反向引物(SEQ ID NO.2):5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带,母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带,见结果如图11(其中1~4为公鹌鹑,5~8为母鹌鹑)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鹌鹑进行性别鉴定,并且简单易于操作。
实施例13
2未知性别中国白羽鹌鹑鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的中国白羽鹌鹑雏鹌鹑,使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鹌鹑基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为:
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL,10μmol/L正方向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
PCR反应程序为:95℃5min,(95℃30s,60℃30s,72℃30s)35循环,72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带,母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带,见结果如图12(其中3、5、6、9、10、11、13、16为公鹌鹑,1、2、4、7、8、12、14、15、17为母鹌鹑)。
供试样本经过解剖,进行性器官观察,以上鉴定结果完全正确。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种用于鹌鹑性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaagagt ttcagcactt ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcataatag gagctcgagc ca 22
Claims (6)
1.一种PCR引物或包含所述PCR引物的试剂盒在鹌鹑性别鉴定中的应用,所述应用具体为通过所述的PCR引物或所述的试剂盒进行PCR扩增,电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑,呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑;所述引物的核苷酸序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.1所示、反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的试剂盒还包含PCR反应液和/或DNA提取液。
3.一种鹌鹑的性别快速鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取待测鹌鹑的基因组DNA;
2)以步骤1)中提取的DNA为模板,利用引物进行PCR扩增反应;所述引物的核苷酸序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.1所示、反向引物序列如SEQ ID NO.2所示;
3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑,呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法,其特征在于,步骤1)提取待测鹌鹑的基因组DNA选用羽毛、血液、组织或器官进行基因组DNA的提取。
5.根据权利要求3所述的鉴定方法,其特征在于,步骤2)中PCR反应体系为:2×PCR Mix25μL,10μmol/L正向和反向引物各1μL,50-100μg/ml模板DNA 2μL,超纯水21μL。
6.根据权利要求3所述的鉴定方法,其特征在于,步骤2)中PCR反应程序为:95℃ 5min,95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s 35循环,72℃ 10min。
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