CN107760793B - 鉴别锡盟绵羊和农区舍饲绵羊的引物、探针及方法 - Google Patents

鉴别锡盟绵羊和农区舍饲绵羊的引物、探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别锡盟绵羊和农区舍饲绵羊的引物、探针及方法，引物1：5'‑AGCTGTGAAAGTGTTCTTCA‑3'；引物2：5'‑GATGTTTTCATGCCTCATCA‑3'；探针1：5'‑HEX‑CACCGTCCGATATATTTCTGTCTCTCGG‑TAMRA‑3'；探针2：5'‑FAM‑CACCGTCTGATATATTTCTGTCTCTCGG‑TAMRA‑3'；本发明通过优质外型和生产性状主效基因的序列分析筛选出一个可以高效的区分锡盟本地绵羊的SNP位点，通过设计多重荧光定量PCR引物和探针检测SNP的基因型，检出率和阳性率均达到95％以上。

Description

鉴别锡盟绵羊和农区舍饲绵羊的引物、探针及方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及绵羊品种的基因鉴定检测技术。
背景技术
羊肉是消费者广泛食用的家畜肉之一。羊肉不仅营养丰富、肉质细嫩、容易消化、具有高蛋白、低脂肪、含磷脂多、胆固醇少的特点，同时羊肉的食用也没有宗教和文化的禁忌。20.3万平方公里的锡林郭勒盟有18万平方公里的优质天然草场，是传统的畜牧业生产区，同时具有发展现代畜牧业的优越条件，是国家和内蒙古自治区重要的绿色畜产品输出基地。绵羊是锡林郭勒大草原的最主要畜种之一，牲畜饲养规模连续八年稳定在1,200万头(只)以上，占主要畜种的90％左右。本地优良羊种主要有苏尼特羊、乌珠穆沁羊、察哈尔羊等。苏尼特羊于1986年被锡盟行署认定为地方品种，1997年被自治区人民政府正式命名为“苏尼特羊”，2007年苏尼特羊正式被列为国家地理标志保护产品，2010年经过国家农业部审定正式列入国家优良种畜名录。乌珠穆沁羊系蒙古羊在当地条件下，经过长期选育形成的一个优良种群，1982年经国家农业部、国家标准局的确认之下，正式批准“乌珠穆沁羊”为当地优良品种。长期以来，对于锡林郭勒盟本土绵羊的研究仅限于品种性能测定与评价，对于品种的起源与演化仅仅局限于从考古学和形态学角度进行研究，缺乏系统的基因水平研究。由于锡林郭勒本地绵羊是天然放牧型，市场上冒用苏尼特羊、乌珠穆沁羊等锡林郭勒本地羊地理保护标志的行为猖獗，并且由于缺乏有效的检验和鉴定技术，使其应有的品牌价值未能得到真实体现，出现有品牌无效益的尴尬局面。绵羊品种鉴定技术通常建立在对绵羊外型和生产性能的评价以及已有的系谱和品系的记录上。国外有利用SNP芯片鉴定绵羊品种的报道。目前国内外缺乏对苏尼特羊、乌珠穆沁羊、察哈尔羊等蒙古羊的分子鉴定报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的基于多重荧光定量PCR技术鉴别锡林郭勒盟本地绵羊和农区舍饲绵羊。
本发明的技术方案为：基于多重荧光定量PCR技术鉴别锡林郭勒盟本地绵羊和农区舍饲绵羊的引物和探针，引物和探针的序列如下：
引物1：5'-AGCTGTGAAAGTGTTCTTCA-3'；
引物2：5'-GATGTTTTCATGCCTCATCA-3'；
探针1：5'-HEX-CACCGTCCGATATATTTCTGTCTCTCGG-TAMRA-3'；
探针2：5'-FAM-CACCGTCTGATATATTTCTGTCTCTCGG-TAMRA-3'；
所述锡林郭勒盟本地绵羊是指苏尼特羊、乌珠穆沁羊和察哈尔羊；农区舍绵羊是指湖羊和小尾寒羊。
含有上述所述的引物和探针的基因检测试剂盒。
基于多重荧光定量PCR技术鉴别锡林郭勒盟本地绵羊和农区舍饲绵羊的方法，步骤如下：
(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取苏尼特羊、乌珠穆沁羊、察哈尔羊、湖羊和小尾寒羊样本DNA；
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL；
(3)利用本发明的引物和探针对稀释后的DNA进行扩增检测，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR mix 10μL，引物1、引物2、探针1、探针2各1μL，稀释后的DNA1μL，灭菌的去离子水5μL；Real-time PCR扩增参数为：预变性94℃，30s，1循环；变性94℃，5s，退火延伸60℃，31s，40循环；
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为1.5，读取FAM和HEX的Ct值，FAM的Ct≤30，SNP结果判定为A/A；HEX的Ct≤30，SNP结果判定为G/G；FAM的Ct≤30且HEX的Ct≤30，SNP结果判定为A/G。当SNP的结果为G/G和A/G时，样品判定为农区舍饲绵品种。
本发明从三个途径(线粒体序列分析-用于种属鉴定、微卫星分析-用于亲权和亲子鉴定以及优质外型和生产性状主效基因序列分析)区分锡盟本地绵羊(苏尼特羊、乌珠穆沁羊和察哈尔羊)和农区舍饲品种(湖羊和小尾寒羊)。线粒体序列分析以及28个位点的微卫星分析显示五个品种种内具有较大变异，无法高效区分锡盟本地绵羊和农区舍饲品种。最后通过大量优质外型和生产性状主效基因的序列分析筛选出一个可以高效的区分锡盟本地绵羊和农区舍饲品种的SNP位点，并自主研发检测SNP位点的引物和探针组合，检出率和阳性率均达到95％以上。目前国外主要通过高成本的基因芯片来鉴定不同品种的绵羊，但是缺乏对国内绵羊的研究报道。本发明专利是从大量的基因和SNP中筛选出可以作为区分标记的SNP位点，并设计了基于实时荧光定量PCR技术的低成本、快速的检测方法，填补了蒙古羊品种基因鉴定的空白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过优质外型和生产性状主效基因的序列分析筛选出一个可以高效的区分锡盟本地绵羊(苏尼特羊、乌珠穆沁羊和察哈尔羊)和农区舍饲绵羊(湖羊和小尾寒羊)的SNP位点，通过设计多重荧光定量PCR引物和探针检测SNP的基因型，检出率和阳性率均达到95％以上。
附图说明
图1为一个可以高效的区分锡盟本地绵羊(U-苏尼特羊、S-乌珠穆沁羊和C-察哈尔羊)和农区舍饲品种(X-小尾寒羊和H-湖羊)的SNP；
图2为通过多重实时荧光定量PCR检测绵羊SNP的基因型。
具体实施方式
1、方法：
(1)提取苏尼特羊、乌珠穆沁羊、察哈尔羊、湖羊和小尾寒羊(各30只绵羊)血液
DNA；
(2)扩增优质外型和生产性状主效基因，通过测序分析筛选出一个可以高效的区分锡
盟本地绵羊品种(苏尼特羊、乌珠穆沁羊和察哈尔羊)和农区舍饲品种(湖羊和小尾寒
羊)的SNP位点；
(3)利用本发明的引物和探针对五种绵羊DNA进行扩增检测，并将检测结果与测序结果比对发现完全一致。以上结果说明Real-time PCR的方法可以有效的检测出目的SNP的基因型(A/A，G/G及A/G)。
2、具体步骤
(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取绵羊样本(血液、肌肉、毛发等)DNA；
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL；
(3)根据SNP位点设计特异的引物和探针，引物1：5'-AGCTGTGAAAGTGTTCTTCA-3'(SEQ ID No.1)；引物2：5'-GATGTTTTCATGCCTCATCA-3'(SEQ ID No.2)；探针1：5'-HEX-CACCGTCCGATATATTTCTGTCTCTCGG-TAMRA-3'(SEQID No.3)；探针2：5'-FAM-CACCGTCTGATATATTTCTGTCTCTCGG-TAMRA-3'(SEQ IDNo.4)；利用上述引物和探针对稀释DNA进行扩增检测，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表2所示；
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为1.5，读取FAM和HEX的Ct值。FAM的Ct≤30，SNP结果判定为A/A；HEX的Ct≤30，SNP结果判定为G/G；FAM的Ct≤30且HEX的Ct≤30，SNP结果判定为A/G。当SNP的结果为G/G和A/G时，样品判定为农区(小尾寒羊和湖羊)品种。
表1 Real-time PCR反应体系
Figure BDA0001499489630000031
Figure BDA0001499489630000041
表2 Real-time PCR扩增参数
Figure BDA0001499489630000042
3、基因检测试剂盒的设计
该试剂盒的试剂如表3所示。
表3基因检测试剂盒
试剂 说明
Probe qPCR mix 反应体系(酶、dNTP、Mg<sup>2+</sup>)
序列1 引物
序列2 引物
探针1 探针
探针2 探针
模板1 SNP-A/A对照
模板2 SNP-G/G对照
模板3 SNP-A/G对照
灭菌的去离子水 补充反应体系
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 锡林郭勒职业学院
<120> 鉴别锡盟绵羊和农区舍饲绵羊的引物、探针及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctgtgaaa gtgttcttca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgttttca tgcctcatca 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgtccga tatatttctg tctctcgg 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccgtctga tatatttctg tctctcgg 28

Claims (1)

1.基于多重荧光定量 PCR技术区分锡林郭勒盟本地绵羊和农区舍饲绵羊的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取苏尼特羊、乌珠穆沁羊、察哈尔羊、湖羊和小尾寒羊样本DNA；
（2）检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100 ng/μL；
（3）利用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的探针对稀释后的DNA进行扩增检测，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR mix 10 μL，SEQID No.1所示的引物、SEQ ID No.2所示的引物、SEQ ID No.3所示的探针、SEQ ID No.4所示的物探针各1 μL，稀释后的DNA 1 μL，灭菌的去离子水5 μL；Real-time PCR扩增参数为：预变性94℃，30 s，1循环；变性94℃，5 s，退火延伸60℃，31 s，40循环；
（4）Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为1.5，读取FAM和HEX的Ct值，FAM的Ct≤30，SNP结果判定为A/A；HEX的Ct≤30，SNP结果判定为G/G；FAM的Ct≤30且HEX的Ct≤30，SNP结果判定为A/G；当SNP的结果为G/G和A/G时，样品判定为农区舍饲绵羊品种；
所述锡林郭勒盟本地绵羊是指苏尼特羊、乌珠穆沁羊和察哈尔羊；农区舍饲绵羊是指湖羊和小尾寒羊。
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