CN113981106B - 一种对雉科动物进行早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对雉科动物进行早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对。本发明提供的方法包括如下步骤：以待测雉科动物的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，如果得到一种扩增产物、待测雉科动物为或候选为雄性雉科动物，如果得到两种扩增产物、待测雉科动物为或候选为雌性雉科动物；特异引物对由SEQ ID NO：1所示DNA和SEQ ID NO：2所示DNA组成。本发明具有以下优点：雄性雉科动物和雌性雉科动物具有条带数量的区别，并且特征带的差异约为400bp，可通过琼脂糖电泳检测，操作简单方便，不容易误判，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种对雉科动物进行早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对。
背景技术
雉科属于鸡形目。雉科动物的形态特征：头顶常具羽冠或肉冠，或头部或颈部裸露的皮肤。嘴粗短而强，上嘴先端微向下曲，但不具钩；鼻孔不为羽毛所掩盖着；翅稍短圆；尾巴长短不一，尾羽或呈平扁状，或呈侧扁状；羽毛着色范围从隐蔽到黑暗到明亮的图案；腿很坚固，脚趾短钝爪，拇指抬起，雄性常具距，但有时雌雄均有，跗蹠裸出，或仅上部被羽，后趾位置较高于他趾。雉科动物居住在多种多样的栖息地，包括热带雨林、丛林、沙漠、林地、竹丛、耕地、高山草甸、苔原和森林边缘。
目前人工饲养的雉科动物主要有火鸡、雉鸡、鹧鸪等，一般称之为雉科禽类。雉科动物生产中，一般需要的雌禽的数量要远远大于雄禽的数量。在自然交配时，雌雄配比一般为10:1，人工授精，比例则可达20:1。因此，需要进行早期性别鉴定，提前淘汰雄性幼雏。雏雉科动物在雌雄在外形上非常相似，无法从体型外貌进行鉴别。目前雉科动物早期的性别鉴定主要通过翻肛观察生殖突起进行鉴别，泄殖腔下部有两个浅红色椭圆形球状突起的为雄雉科动物，有浅粉红色八字状皱襞的为雌雉科动物。但翻肛鉴别须在雏雉科动物出壳一天内进行，雏雉科动物肛门难以翻开，生殖突起萎缩甚至陷入泄殖腔深处，不便观察。翻肛鉴别劳动强度大、工作环境差、专业性高，误鉴率也较高。通过分子生物学手段，快速、准确的进行雉科动物早期性别鉴定具有重要意义。随着我国火鸡产业的快速发展，亟需开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别雉科动物性别的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种对雉科动物进行早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对。
本发明提供了一种鉴定雉科动物性别的方法，包括如下步骤：
以待测雉科动物的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，如果得到一种扩增产物、待测雉科动物为或候选为雄性雉科动物，如果得到两种扩增产物、待测雉科动物为或候选为雌性雉科动物；
所述特异引物对由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成。
所述雉科动物为火鸡属动物。
所述一种扩增产物为一种特征性扩增产物，大小为485bp；
所述两种扩增产物为两种特征性扩增产物，大小分别为906bp和485bp。
所述雉科动物为雉属动物。
所述一种扩增产物为一种特征性扩增产物，大小为483bp；
所述两种扩增产物为两种特征性扩增产物，大小分别为904bp和483bp。
所述雉科动物为鹧鸪属动物。
所述一种扩增产物为一种特征性扩增产物，大小为481bp；
所述两种扩增产物为两种特征性扩增产物，大小分别为893bp和481bp。
本发明还保护特异引物对，由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成。所述特异引物对用于鉴定或辅助鉴定雉科动物性别。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定或辅助鉴定雉科动物性别中的应用。
本发明还保护所述特异引物对在制备鉴定或辅助鉴定雉科动物性别的试剂盒中的应用。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定雉科动物性别的试剂盒，包括所述特异引物对。
本发明还保护所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定雉科动物性别中的应用。
所述基因组DNA可提取自雉科动物的羽毛或血液。
所述基因组DNA可提取自雉科动物的组织。
所述基因组DNA可提取自雉科动物的器官。
SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子称为正向引物F。
SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子称为反向引物R。
所述PCR扩增的反应体系具体可为：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物F1μL，10μmol/L反向引物R1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
所述PCR扩增的反应程序具体可为：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35循环；72℃10min。
以上任一所述雉科动物为火鸡属动物或雉属动物或鹧鸪属动物。
所述雉科动物为火鸡属动物。
所述火鸡属动物为火鸡，例如青铜火鸡或贝蒂纳火鸡。
所述雉科动物为雉属动物。
所述雉属动物为雉鸡，例如中国山鸡或申鸿七彩雉。
所述雉科动物为鹧鸪属动物。
所述鹧鸪属动物为鹧鸪，例如中华鹧鸪或美国鹧鸪。
本发明所要解决的技术问题在于提供一种可用于雉科动物早期性别快速鉴定的PCR引物对，并提供了应用所述引物对通过PCR鉴定雉科动物性别的试剂盒和方法。
本发明与现有技术相比具有以下优点：雄性雉科动物和雌性雉科动物具有条带数量的区别，并且特征带的差异约为400bp，可通过琼脂糖电泳检测，操作简单方便，不容易误判，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
图1为实施例2的步骤一的电泳图。
图2为实施例2的步骤二的电泳图。
图3为实施例3的步骤一的电泳图。
图4为实施例3的步骤二的电泳图。
图5为实施例4的步骤一的电泳图。
图6为实施例4的步骤二的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、引物的设计和制备
从数据库和采集样本中获取大量序列，基于序列分析选择多种靶标片段并设计多种引物对，通过对各个引物对进行效果验证，筛选得到一个引物对，其可用于对雉科动物进行性别鉴定，具有鉴定准确、特异性强、普适性高的优点。
引物对如下：
正向引物F(SEQ ID NO：1)：5'-TTGTGGGACCTGGAGGACTT-3'；
反向引物R(SEQ ID NO：2)：5'-CCTGGATTGAAGCATCTGGA-3'。
分别人工合成正向引物F和反向引物R。
实施例2、应用引物对进行火鸡的性别鉴定
一、方法的建立
供试样本：10只已知性别的成年青铜火鸡，编号1-5的为5只雄火鸡，编号6-10的为5只雌火鸡。
1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，采用正向引物F和反向引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物F1μL，10μmol/L反向引物R1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图1。图1中，泳道1至10依次对应供试样本的编号为1至10。所有雄火鸡均显示单一特征带(经测序，均为485bp)。所有雌火鸡均显示两条特征带(经测序，一条均为906bp，另一条均为485bp)。
二、方法的应用
供试样本：17只未知性别的贝蒂纳火鸡雏火鸡。
1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，采用正向引物F和反向引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物F1μL，10μmol/L反向引物R1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图2。图2中，泳道1至17依次代表17个供试样本。其中，部分供试样本显示485bp的单一特征带(泳道1、3、6、8、11、12、13、16)、判断为雄火鸡，部分供试样本显示906bp和485bp的两条特征带(泳道2、4、5、7、9、10、14、15、17)、判断为雌火鸡。特征带大小已进行测序验证。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
本实施例表明，本发明的引物对以及相应的PCR检测方法能够快速准确对火鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例3、应用引物对进行雉鸡的性别鉴定
一、方法的建立
供试样本：10只已知性别的成年中国山鸡，编号1-5的为5只雄中国山鸡，编号6-10的为5只雌中国山鸡。
1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，采用正向引物F和反向引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物F1μL，10μmol/L反向引物R1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图3。图3中，泳道1至10依次对应供试样本的编号为1至10。所有雄中国山鸡均显示单一特征带(经测序，均为483bp)。所有雌中国山鸡均显示两条特征带(经测序，一条均为904bp，另一条均为483bp)。
二、方法的应用
供试样本：17只未知性别的申鸿七彩雉雏雉。
1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，采用正向引物F和反向引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物F1μL，10μmol/L反向引物R1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图4。图4中，泳道1至17依次代表17个供试样本。其中，部分供试样本显示483bp的单一特征带(泳道2、3、7、8、11、12、13、15)、判断为雄申鸿七彩雉，部分供试样本显示904bp和483bp的两条特征带(泳道1、4、5、6、9、10、14、16、17)判断为雌申鸿七彩雉。特征带大小已进行测序验证。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
本实施例表明，本发明的引物对以及相应的PCR检测方法能够快速准确对雉鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例4、应用引物对进行鹧鸪的性别鉴定
一、方法的建立
供试样本：10只已知性别的成年中华鹧鸪，编号1-5的为5只雄鹧鸪，编号6-10的为5只雌鹧鸪。
1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，采用正向引物F和反向引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物F1μL，10μmol/L反向引物R1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图1。图1中，泳道1至10依次对应供试样本的编号为1至10。所有雄鹧鸪均显示单一特征带(经测序，均为481bp)。所有雌鹧鸪均显示两条特征带(经测序，一条均为893bp，另一条均为481bp)。
二、方法的应用
供试样本：17只未知性别的美国鹧鸪雏鹧鸪。
1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，采用正向引物F和反向引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物F1μL，10μmol/L反向引物R1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图2。图2中，泳道1至17依次代表17个供试样本。其中，部分供试样本显示481bp的单一特征带(泳道1、4、7、10、11、12、15、17)、判断为雄鹧鸪，部分供试样本显示893bp和481bp的两条特征带(泳道2、3、5、6、8、9、13、14、16)、判断为雌鹧鸪。特征带大小已进行测序验证。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
本实施例表明，本发明的引物对以及相应的PCR检测方法能够快速准确对鹧鸪进行性别鉴定，并且简单易于操作。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种对雉科动物进行早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对
<130> GNCYX212759
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgtgggacc tggaggactt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctggattga agcatctgga 20
Claims (4)
1.一种鉴定鹧鸪属动物性别的方法，包括如下步骤：
以待测鹧鸪属动物的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，如果得到一种扩增产物、待测鹧鸪属动物为或候选为雄性鹧鸪属动物，如果得到两种扩增产物、待测鹧鸪属动物为或候选为雌性鹧鸪属动物；
所述特异引物对由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成；
所述一种扩增产物为一种特征性扩增产物，大小为481 bp；
所述两种扩增产物为两种特征性扩增产物，大小分别为893 bp和481 bp。
2.特异引物对的应用，为如下（a）或（b）：
（a）在鉴定或辅助鉴定鹧鸪属动物性别中的应用；
（b）在制备鉴定或辅助鉴定鹧鸪属动物性别的试剂盒中的应用；
所述特异引物对由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成。
3.一种鉴定或辅助鉴定鹧鸪属动物性别的试剂盒，包括特异引物对；
所述特异引物对由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成。
4.权利要求3所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定鹧鸪属动物性别中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202111303936.8A CN113981106B (zh) | 2021-11-05 | 2021-11-05 | 一种对雉科动物进行早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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| CN113981106A CN113981106A (zh) | 2022-01-28 |
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Family
ID=79746635
Family Applications (1)
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Citations (3)
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| CN112746070A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-05-04 | 江苏省家禽科学研究所 | 用于鸡早期性别鉴定的引物对、试剂盒以及它们的应用 |
-
2021
- 2021-11-05 CN CN202111303936.8A patent/CN113981106B/zh active Active
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Widely Applicable PCR Markers for Sex Identification in Birds;Michael N. Romanov et al.;《Russian Journal of Genetics》;摘要部分及第10 页最后1 段 * |
| 利用PCR鉴定四川雉鹑性别;周鑫;杨楠;岳碧松;冉江洪;李静;;四川动物(第04期);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113981106A (zh) | 2022-01-28 |
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