JPH08149982A - 鳥類のアロマターゼ関連ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 鳥類のアロマターゼ関連ＤＮＡに関し、より
詳細には、鳥類のアロマターゼ遺伝子の発現を制御する
ＤＮＡの塩基配列に関わる。 【構成】 配列番号１の配列もしくはその一部を含むＤ
ＮＡ（但し、その塩基配列が前記配列中の塩基番号１９
１４から２９７３までの塩基配列であるＤＮＡを除く）
またはその相補鎮；配列番号２の配列もしくはその一部
を含むＤＮＡまたはその相補鎮；前記ＤＮＡに対応する
ＲＮＡ；および、前記ＤＮＡの少なくとも一部を含むプ
ローブ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、鳥類のアロマターゼ関
連DNAに関し、より詳細には、鳥類のアロマターゼ遺伝
子の発現を制御するDNAの塩基配列に関わる。

【０００２】

【従来の技術】家禽の性を制御することは、その繁殖を
効率的に行うためには非常に有効な手段である。ヒヨコ
の性は総排泄孔の検査や羽毛色の遺伝的制御により判別
できるが、ヒヨコの性を制御する（すなわち、産み分け
る）方法については知られていない。鳥類の性の決定は
性染色体Wの上にある性決定因子（卵巣決定因子）によ
って制御されていると考えられ、ZWという性染色体を持
つ配偶子は雌に、ZZという性染色体をもつ配偶子は雄と
なる。しかし、現在のところその実体は不明のままであ
る。

【０００３】哺乳類ではY染色体上に存在する精巣決定
因子（ヒトではTDF、マウスではTdyとよばれ、その本体
はヒトではSRY、マウスではSry遺伝子であるとされる）
の作用により、XYという性染色体を持つ配偶子は雄に、
XXという性染色体をもつ配偶子は雌となる。SRY遺伝子
は46,XY女および46,XX男という異常個体のY染色体の追
求から同定された（A.H. Sinclair et al., Nature, 34
6, 240-244, 1990）。サザンブロット法によるとSRY/Sr
yに相似な遺伝子はニワトリやウズラにいくつか存在す
る（T.R. Tiersch et al., Human Genet., 87, 571-57
3, 1991）が、哺乳類と異なり性特異性のあるものは単
離されていない。したがって、たとえ鳥類にSRY/Sry遺
伝子はあっても、性決定の中心的役割は果たしていない
と考えられている。

【０００４】鳥類の性の分化においては性ホルモンの果
たす役割が大きく、雌性ホルモンを生合成するための鍵
酵素であるアロマターゼ遺伝子の発現を制御すること
は、性決定因子の遺伝子を直接制御するのと同様の効果
をもたらすと考えられる。実際、アロマターゼの酵素活
性を阻害することによってアンドロゲンのエストロゲン
への転換が阻害され、遺伝的に雌であるニワトリが雄化
した（A. Elbrecht andR.G. Smith, Science, 255, 467
-470, 1992）。この方法は特開平04-211315号公報およ
び特開平05-176659号公報に記載されている。しかし、
アロマターゼ遺伝子の発現を阻止して雄を作ったり、あ
るいは雌決定遺伝子を強制発現させて雌を作るようなト
ランスジェニック家禽を作る方がより効果的であると考
えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、鳥
類、特に家禽であるニワトリおよびウズラのアロマター
ゼ遺伝子の発現を制御すると考えられる塩基配列を含む
ＤＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、
上記のＤＮＡに対応するＲＮＡを提供することも目的と
する。さらに、本発明は、上記のＤＮＡの少なくとも一
部を含むプローブを提供することも目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意検討した結果、ニワトリのアロ
マターゼの構造遺伝子の一部をPCR法で増幅し、アイソ
トープでラベルし、これをプローブにしてニワトリおよ
びウズラのゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし
て、ニワトリおよびウズラのアロマターゼ遺伝子を含む
長いDNAを得、これらのDNAの塩基配列を決定することに
成功し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発
明は、配列番号１の配列もしくはその一部を含むＤＮＡ
（但し、その塩基配列が前記配列中の塩基番号1914から
2973までの塩基配列であるＤＮＡを除く）またはその相
補鎖を提供するものである。また、本発明は、配列番号
２の配列もしくはその一部を含むＤＮＡまたはその相補
鎖を提供するものである。さらに、本発明は、上記ＤＮ
Ａに対応するＲＮＡ、および、上記ＤＮＡの少なくとも
一部を含むプローブも提供するものである。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。 １．アロマターゼ関連DNAの単離および同定 ニワトリのアロマターゼ関連DNAの単離および同定につ
いて以下に説明するが、ウズラのアロマターゼ関連DNA
も同様の方法で単離および同定することができる。但
し、ゲノムDNAライブラリーの作製の際に使用されるウ
ズラ（ニホンウズラ Japanese quail)は、成鳥や幼鳥、
あるいは５日目以降の胚でもよく、WE、NIG-WQ、WP、D
B、PNN等の系統のものが使用できる。なお、アロマター
ゼ関連DNAとは、メッセンジャーRNAに転写されるアロマ
ターゼ遺伝子の本体のすべてあるいは一部、ならびにこ
れに直結した5'側の制御領域を含んだ一連のDNAをいう
ものとする。

【０００８】(1) ゲノムDNAライブラリーの作製 まず、成鳥ニワトリの肝臓を採取し、公知の方法(J. Sa
mbrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, pp. 9.16-9.19, 1989)
に従い、ゲノムDNAを得る。その際に使用される成鳥ニ
ワトリは、雌雄のいずれであってもよく、白色レグホ
ン、名古屋コーチン、プリマスロック等のいずれの品種
であってもよい。

【０００９】得られたゲノムDNAを制限酵素MboIで部分
切断し、約15〜20 Kbpの断片をベクターのBamHI 部位に
組み込んだ後、このベクターで微生物、例えば大腸菌等
を形質転換することによりゲノムDNAライブラリーを作
製することができる。使用し得るベクターとしては、Ch
aron4A、λDASH、EMBL3 、λFIXII 等のバクテリオファ
ージベクターが挙げられる。ゲノムDNAを制限酵素MboI
で部分切断するには、公知の緩衝液中、例えば、20 mM
Tris-HCl (pH 8.5) 、10 mM MgCl₂ 、1 mM DTT、100 mM
KCl中でゲノムDNA 200 ｇについてMboIを6.25ユニット
用いて、３７℃で、１時間処理すればよい。得られたDN
A断片を蔗糖密度勾配超遠心にかけ、約15〜20 KbpのDNA
を回収する。このようにして得られる約15〜20 KbpのMb
oI断片はニワトリのアロマターゼ遺伝子を含み得る。次
いで、例えば、BamHI で切断したEMBL3 や、市販のBamH
I 処理済みEMBL3 、あるいは市販の処理済みλFIXII
（XhoI処理したGATCという切断点のGA部分を埋め、TCと
いう切断点をもつもの）に、上記のようにした得られた
ニワトリのアロマターゼ遺伝子を含む約15〜20 KbpのMb
oI断片を連結することにより（λFIX IIに連結するとき
は、MboI断片のGATCのうちGAを埋めTCとする）、ニワト
リのアロマターゼ遺伝子断片を含むファージベクターが
得られる。このファージベクターを微生物、例えば大腸
菌に導入し、得られた形質転換体を培養することによ
り、ゲノムDNAライブラリーが得られる。具体的には、
公知の方法、例えば、J. Sambrook et al (Eds.)，Mole
cular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, pp. 2.95-2.107, 1989に記載されたin vit
roパッケージング法により、大腸菌、例えば大腸菌SRB
(Stratagene 社製、東洋紡績（株）より入手）に上記の
ファージベクターを導入し、得られた形質転換体を、例
えば、NZY 培地（NZアミン 10 g 、イーストエキス 5
g、NaCl 5 g、MgSO₄・7H₂O 2g 、蒸留水で1 L とする(p
H 7.5)) 中で３７℃で8.５時間培養することにより、ゲ
ノムDNAライブラリーを得ることができる。

【００１０】(2) クローンの選択 上記のようにして得られたゲノムDNAライブラリーを、
公知の方法、例えば J.Sambrook et al., Molecular Cl
oning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, pp. 2.60-2.63, 1989 に記載の方法により、適当な
プローブ、例えば、H. Matsumine et al., J. Biol. Ch
em., 266, 19900-19907, 1991 に記載のニワトリのア
ロマターゼ遺伝子の塩基配列の一部を有するプローブを
用いたプラークハイブリダイゼーション法によりスクリ
ーニングすることにより、上記プローブにハイブリダイ
ズするクローン（陽性クローン）が得られる。必要に応
じて上記のスクリーニングを２〜３回繰り返すとよい。

【００１１】(3) ニワトリのアロマターゼ遺伝子を含む
DNAの塩基配列の決定 上記のようにして得られた陽性クローンの中から適当な
ものを選択し、そのDNAを公知の方法、例えば J. Sambr
ook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, pp. 2.60-2.81, 1989 に
記載の方法で単離精製する。このDNAを制限酵素EcoRI
で消化して得られる断片をプラスミドベクター、例えば
pGEM 3Zf(+) にサブクローニングした後、その塩基配列
を決定する（配列番号１参照）。これにより、アロマタ
ーゼの構造遺伝子と本発明のアロマターゼ関連DNAとの
位置関係を知ることができ、その結果、アロマターゼの
構造遺伝子の上流領域の塩基配列を知ることができる。
サブクローニングに使用できるプラスミドベクターとし
ては、pGEM 3Zf(+) の他、pUC119、pBR322、BlueScript
SK(+)などを挙げることができる。また、塩基配列の決
定方法としては、チェーンターミネーター法（サンガー
法）、マキサム・ギルバート法等を用いることができ
る。

【００１２】上記のようにして、配列番号１の配列もし
くはその一部を含むＤＮＡまたはその相補鎖、並びに、
配列番号２の配列もしくはその一部を含むＤＮＡまたは
その相補鎖が得られる。配列番号１および２の配列は、
それぞれ、ニワトリのアロマターゼ遺伝子の第１エクソ
ンを含むゲノムDNAの塩基配列およびウズラの第１、第
２エクソンを含むDNAの塩基配列であり、これらは長い
5'側領域を有するのでアロマターゼ遺伝子の制御部位を
含むはずである。相同組換え法などにより、配列番号１
または２の配列またはその一部を破壊することにより、
アロマターゼの発現を阻止すれば、遺伝子型に関係な
く、すべて雄の家禽となろう。また、配列番号１または
２の配列のいずれかの箇所を変異させ、たえずアロマタ
ーゼ遺伝子を発現させれば、すべて雌の家禽となる可能
性がある。さらに、配列番号１または２の配列またはそ
の一部を利用して、雌決定遺伝子の同定および単離がで
きれば、当該遺伝子を導入することによっても、雌の家
禽が得られよう。配列番号１および配列番号２の類似性
が極めて高いことから推察されるように、上述の方法は
他の鳥類一般へ応用できる可能性が高い。従って、本発
明のアロマターゼ関連DNAを利用して、鳥類の性を制御
することができる。さらに、配列番号１または２の配列
の下流に適当なリポーター遺伝子、例えばルシフェラー
ゼ遺伝子やクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を結合させることによって、アロマターゼ
遺伝子を支配している上流の遺伝子、おそらく鳥類の性
決定遺伝子を検索するのにも、有効に利用できるだろ
う。

【００１３】また、配列番号１または２の配列の一部を
プライマーとして使用して、逆転写酵素を利用したRT-P
CRにより、アロマターゼ遺伝子の発現を調べるのに利用
することができ、その他にも、上記の配列の一部をプロ
ーブとして用い、他の鳥類のアロマターゼ関連DNAの単
離やアロマターゼ遺伝子の発現を調べること等に利用す
ることができる。

【００１４】上記のようにして得られるニワトリまたは
ウズラのアロマターゼ関連DNAに対応するRNAは、T7ファ
ージあるいはT3ファージのRNAポリメラーゼのプロモー
ターをもつプラスミドベクター（例、BlueScript SK
(+)、pTZ18R、pKMN）に組み込み、T7ファージあるいはT
3ファージのRNAポリメラーゼを作用させることにより製
造することができる。このようなRNAは、製造時に化学
的あるいは放射線でラベルすることにより、ハイブリダ
イゼーションのプローブとして利用することができる。

【００１５】また、上記のニワトリまたはウズラのアロ
マターゼ関連DNAの少なくとも一部を含むプローブは、
適切な制限酵素で切断し、目的とする部分を再クローニ
ングするか、PCRで目的の部分を増幅し、再クローニン
グすることにより、あるいは必要に応じて5'側あるいは
3'側からエキソヌクレアーゼで欠損させることにより製
造することができる。このようなプローブは、他種にお
ける相同DNAの存否の検索、遺伝子発現の検索、あるい
は下流に適当なリポーター遺伝子（例、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ）
を結合することによりプロモーター活性を知ることに利
用することができる。

【００１６】２．微生物の寄託 本発明のニワトリのアロマターゼ関連DNA（その塩基配
列を配列番号１に示す。）を組み込んだプラスミドpGEM
3Zf(+)を導入した大腸菌DH5αは、工業技術院生命工学
工業技術研究所に下記のとおりに寄託されている。 寄託者が付した識別のための表示：pARMc 受託番号：FERM P-14627 受託日：平成６年１１月１１日 また、本発明のウズラのアロマターゼ関連DNA（その塩
基配列を配列番号２に示す。）を組み込んだプラスミド
pGEM3Zf(+)を導入した大腸菌DH5αは、工業技術院生命
工学工業技術研究所に下記のとおりに寄託されている。 寄託者が付した識別のための表示：pARMq 受託番号：FERM P-14628 受託日：平成６年１１月１１日

【００１７】

【実施例】以下、実施例により、本発明について具体的
に説明する。ただし、これらの実施例により本発明の範
囲が限定されるものではない。

【００１８】（実施例１） ニワトリのゲノムDNAの調
製 白色レグホン種の雌雄の成鳥を業者（武藤鶏肉店、北海
道市）より入手した。肝（雄 23.4 g 、雌 30.1 g)をと
り、公知の方法(J. Sambrook et al., Molecular Cloni
ng, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
pp. 9.16-9.19,1989)によりゲノムDNAを調製した。方法
の概略を以下に記載する。肝をハサミで細片化(3〜4 mm
角程度)し、緩衝液に懸濁し、ホモゲナイザーにかけ、
遠心後、ペレットをProteinase Kで処理した。50℃で一
夜振盪した後、同量のフェノール液で３回抽出を行っ
た。水層をフェノール：クロロホルムで1回抽出した。1
/10容の3 M の酢酸ナトリウム(pH 5.2)を加え、2.5容の
エタノールを加え、析出したDNAをガラス棒でとり、70%
エタノールで洗浄し、乾燥させ、適量のTE(10 mM Tris-
HCl, pH 8, 1 mM EDTA)に溶かした。OD₂₆₀ nmで吸光度
を測定し、DNA濃度を決定した（雄 3.70 mg/ml 、雌 3.
88 mg/ml; DNA総量 雄 77.6 mg、雌 96 mg)。

【００１９】（実施例２） ニワトリのアロマターゼ遺
伝子の増幅 既に発表されているニワトリのアロマターゼ遺伝子の塩
基配列(H. Matsumineet al., J. Biol. Chem., 266, 19
900-19907, 1991)をもとに、ニワトリのアロマターゼ遺
伝子の第１エクソンを含むゲノム領域に特異的な２つの
オリゴヌクレオチドを合成した。合成は全自動DNA合成
機（ABI社、Model 391）により、使用説明書にしたがっ
て行った。配列は以下のとおりである 5'-ATGCTGGAGATGAAGGTCTG-3'（H. Matsumine et alの上
記文献におけるFig. 5の配列中のNo.185〜No.166の配
列) 5'-CAAGTCTGGTACCAGGCTGG-3' (同書のFig. 5の配列中の
No.185〜No.204の配列の相補鎖)

【００２０】このオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連
鎖反応(PCR)法(K. Mullis et al.,Methods Enzymol.,15
5, 335-350, 1987)のプライマーとして用い、ニワトリ
ゲノムDNAの一部を増幅した。ここで行ったPCRの条件は
以下のとおりである。ニワトリゲノムDNA 5 ng、上記プ
ライマー各2 μM、DNA合成基質dNTP各2 mM、耐熱性DNA
合成酵素（Tth DNA ポリメラーゼ、東洋紡社製）2 U、
同酵素に添付された反応液5 μlを合わせて合計50μlと
し、反応を94℃1分、50℃1分、72℃1分で35サイクル行
った。さらに、同反応産物1 μlをとり、同様のPCRに供
した。PCR装置ははPerkin-Elmer Cetus社のDNAサーマル
サイクラーを使用した。

【００２１】PCR反応液を1%アガロース（Seakem社製、G
TG）で電気泳動（100 V、30分）し、エチジウムブロミ
ド溶液（EtBr溶液、0.5 μg/ml）で30分間染色したの
ち、DNAのバンドを切り出した。ウルトラフリーC3HV
（ミリポア社製）で、その説明書に従いDNAを抽出し
た。DNA液を同量のフェノール：クロロホルム、クロロ
ホルムで各１回処理し、2-ブタノールを用いてDNA液を5
0μlに濃縮し、２倍量のエタノールでDNAを沈澱させ、
これを80%エタノールで洗浄し、真空乾燥した後、15μl
のTEに溶解した。その１部をとり、DNAマーカーととも
に電気泳動にかけ、所定の390塩基対の単一バンドが検
出されることを確認した。観察されたバンドは、プラス
ミドベクターpGEM 3Zf(+)にサブクローニングした後、
その塩基配列を決定した。塩基配列は、Applied Biosys
tems社 373A DNAシークエンサーを用い、説明書に従
い、チェーンターミネーター法により決定した。こうし
てニワトリのアロマターゼ遺伝子の第１エクソンの一部
および5'上流域を含む390 bpのDNA断片を得た。

【００２２】（実施例３） ニワトリのゲノムDNAライ
ブラリーの作製 実施例１で調製したニワトリのゲノムDNA100μgを制限
酵素MboI（宝酒造社製）6.25ユニットで部分分解後、15
-20 Kbpの長さの部分を公知の方法(J. Sambrook et al.
(Eds.), Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Har
bor LaboratoryPress, pp. 9.24-9.28, 1989) により分
取し、切断点GATCのうちGA部分をうめ、切断点TCをもつ
DNA断片とした。一方、市販の処理済みバクテリオファ
ージベクターλFIX（登録商標）IIを購入し、XhoI部位
(XhoIで分解し、切断点GATCのうちGA部分をうめ、切断
点TCをもつファージDNA、東洋紡績（株）より入手）に
導入した。導入されたDNAの平均長は15 kbで、独立クロ
ーン数は1.05×10⁶個であった。このファージライブラ
リーはファージの状態で凍結保存し、用時、大腸菌SRB
（λFIX IIに添付されていたもの) に感染させ、増殖さ
せた。

【００２３】（実施例４） ニワトリのアロマターゼ遺
伝子のクローニング 実施例２でサブクローニングしたニワトリのアロマター
ゼ遺伝子のゲノムDNA断片をプローブとして用い、実施
例３で作製したニワトリゲノムDNAライブラリーをスク
リーニングした。³²Ｐ標識プローブは市販のキット(Meg
aprime DNA labelling system、Amersham社製)を使用
し、説明書の指示に従って作製した。スクリーニングは
公知のプラークハイブリダイゼーション法(J. Sambrook
et al, supra, pp 2.60-2.63)によった。すなわち、約1
0⁶のバクテリオファージを平板培養し、プラークをHybo
nd（登録商標） Nフィルター(Amersham社製)に移し、説
明書に従い、アルカリ変性、中和処理を施したのち乾燥
した。ハイブリッド形成の前に、フィルターを、0.9 M
NaCl 、0.09 Mクエン酸ナトリウム、0.2%フィコール、
0.2%ポリビニル−ピロリドン、0.2%ウシ血清アルブミ
ン、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、100 μg/ml熱変性サ
ケ精子DNA（ハイブイダイゼーション溶液）中で65℃で3
時間インキュベートした。その後、同溶液に³²Ｐ標識プ
ローブを添加、65℃で16時間ハイブリダイズした。次い
でフィルターを0.3 M NaCl 、0.03 Mクエン酸ナトリウ
ム、0.2%ドデシル硫酸ナトリウム中65℃で5分間の洗浄
を２回行った後、0.15 M NaCl 、0.015 M クエン酸ナト
リウム、0.2%ドデシル硫酸ナトリウム中65℃で5分間の
洗浄を1回行った。オートラジオグラム上の放射能スポ
ットに対応するプレートの領域から32個のバクテリオフ
ァージクローンを採取した。上記の方法を繰り返し、明
らかにプローブにハイブリダイズするクローンを４個得
た。

【００２４】（実施例５） 塩基配列の決定 実施例４で得られた陽性クローン4個を選び、制限酵素E
coRI（宝酒造社）で消化し、アガロースゲル電気泳動を
行い、³²Ｐ標識プローブを用いてサザンブロット法を行
った。プラスミドベクターに再クローニングするのに適
切な長さ（通常、数百bp〜数Kbp)のEcoRI断片をもつ１
個のクローンを選び、EcoRI断片をpGEM 3Zf(+)中にサブ
クローニングし、次いで実施例２で述べたように塩基配
列を決定した。その塩基配列を配列番号１に示す。この
配列は同じ白色レグホン由来でありながら、H. Masumin
e et al.(supra)のFig. 5に示された配列(No. 1914 〜
No. 2696に対応)と比較すると、783塩基中以下の８か所
で差異がみられた（H. Masumine et al.らの配列は括弧
内に示す）。

【００２５】 No. 2073 C (G) No. 2135 C (A) No. 2139 C (A) No. 2208 G (A) No. 2212 A (T) No. 2269 G (欠失) No. 2280 C (欠失) No. 2437 T (G)

【００２６】また、同論文のFig. 2に示されたエクソン
１の配列のうち、上述に含まれない部分(No. 2697〜No.
2848に対応)を比較すると、152塩基中以下の12か所で
差異が見られた。

【００２７】 No. 2794 A (欠失) No. 2810 T (欠失) No. 2811 T (欠失) No. 2815 A (欠失) No. 2816 T (欠失) No. 2821 A (欠失) No. 2830 G (欠失) No. 2831 A (欠失) No. 2839 A (欠失) No. 2842 A (欠失) No. 2845 A (欠失) No. 2846 C (欠失)

【００２８】（実施例６） ウズラのゲノムDNAライブ
ラリーの作製 実施例１と同様の方法で、ウズラ（NIBS line WE、仙台
市の仙台ウズラより入手）の６日目胚からDNAを精製し
た。これを実施例３と同様の方法で制限酵素Sau3AIで部
分分解し、BamHIで完全に分解したバクテリオファージ
λベクターEMBL3に導入した。導入されたDNAの平均長は
15 kbで、ライブラリーは独立クローンを1.0×10⁶個含
んでいた。このファージライブラリーはファージの状態
で凍結保存し、用時大腸菌P2392(東洋紡績（株）より入
手）に感染させ、増殖させた。

【００２９】（実施例７） ウズラのアロマターゼ遺伝
子のクローニング 実施例５に示した配列をもつニワトリのアロマターゼ遺
伝子のゲノムDNA断片をプローブとして用い、実施例６
で作製したウズラゲノムDNAライブラリーをスクリーニ
ングした。プローブは実施例４に記載したように³²Pで
標識した。約10⁶のバクテリオファージをSambrookら(su
pra)よって記載されたように、NZY 培地で３７℃で８時
間平板培養した。プラークをAmersham社のHybond（登録
商標） Nフィルターに移し、説明書の記載に従いアルカ
リ変性、中和し、乾燥した。ハイブリッド形成の前に、
フィルターを、0.9 M NaCl 、0.09 Mクエン酸ナトリウ
ム、0.2%フィコール、0.2%ポリビニル−ピロリドン、0.
2%ウシ血清アルブミン、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、
100μg/ml熱変性サケ精子DNA（ハイブイダイゼーション
溶液）中で、65℃で3時間インキュベートした。³²P標識
プローブをさらに添加した同じ溶液中で、50℃で16時間
ハイブリダイズした。次いでフィルターを0.3 M NaCl
、0.03 Mクエン酸ナトリウム、0.2%ドデシル硫酸ナト
リウム中50℃で10分間の条件で２回、0.15 M NaCl 、0.
015 M クエン酸ナトリウム、0.2%ドデシル硫酸ナトリウ
ム中50℃で15分間の条件で１回、0.015 M NaCl 、0.001
5 Mクエン酸ナトリウム、0.2%ドデシル硫酸ナトリウム
中50℃で15分間の条件で１回洗浄した。オートラジオグ
ラム上の放射能スポットに対応するプレートの領域から
バクテリオファージクローンを採取し、³²P標識プロー
ブで再スクリーニングした。

【００３０】得られたクローンから一個を選択し、DNA
を制限酵素EcoRI（宝酒造社）で消化し、得られた断片
をpGEM 3Zf(+)中にサブクローニングし、実施例５に記
載したように塩基配列を決定した。その塩基配列を配列
番号２に示す。

【００３１】（実施例８） ニワトリとウズラの塩基配
列の比較 塩基配列１と塩基配列２とをDNA検索システム（DNASI
S、日立ソフトウエア）で分析した。全塩基配列につ
き、10塩基中9塩基が一致している部分をプロットした
ものを図１に示す。縦軸および横軸の数字は、それぞ
れ、ニワトリおよびウズラの塩基配列の塩基番号であ
る。ニワトリのNo. 1000近傍にウズラに対応しない欠損
部分が見られるが、概して、両者の塩基配列は類似して
いることがわかる。

【００３２】

【発明の効果】本発明により、ニワトリおよびウズラの
アロマターゼ関連DNA、それに対応するRNAおよび少なく
ともその一部を含むプローブが提供された。本発明のア
ロマターゼ関連DNAを利用して、鳥類のアロマターゼ遺
伝子の発現を制御することができる。その結果、鳥類の
性を制御することが可能となる。また、本発明のアロマ
ターゼ関連DNAは、鳥類の性決定遺伝子の検索に利用す
ることもできる。

【００３３】さらに、本発明のアロマターゼ関連DNAに
対応するRNAを利用して、ハイブリダイゼーションのプ
ローブとして利用することができる。さらにまた、本発
明のアロマターゼ関連DNAの少なくとも一部を含むプロ
ーブを利用して、他の鳥類あるいは相同のアロマターゼ
関連DNAを有する他種の動物から、アロマターゼ関連DNA
を単離するプローブとして利用すること、さらに遺伝子
発現を知るためのプローブとして利用することができ
る。

【００３４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：3229 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 起源 生物名：Gallus gallus domesticus 株名：White leghorn 配列の特徴：アロマターゼ遺伝子のエクソン1を含む5'
上流領域 配列： GAATTCTTTA CTGTGGAGCC CTGATCTCGT TCACTGAAAC ACCTTTTGCA GAGAAAAGTG 60 CTTAACAGGA CCCAGAATTT TCTCACAGTA TTTCAGTCAA GTCTTAAAGA ACCATGATCT 120 ATAGGTCCCT CTGCTGGCAG GTGCTTCACA GCTGTTAAAC TCTAAAATTA CCTGTATGCG 180 TATCCAATTA ATTTATGTCA CAAAAGCATT TCCTTGTAAG CTTCTTTCCT CCACTCTCTG 240 ACTTTAAAAG CTTCCTTCCA CCCCCTTCTC CCCATATAAG CAACAGTCAG AACCAACAAA 300 ACCTTCTTAT CAGTCTTATA CCTCATCCAG CTGCAAGGGA AAGAAAACCA CCCACAGAAG 360 ATTTCAAGAT CAAAGAGGCA AGAATAGTGA AAAAGCTTCT TCCATGCACC TCAGCTGTGT 420 TCCATTTCTG CTTACTATCA AAGTTTACTT ACTGAATTTT TAGTTTTTCT TGAGTGATTT 480 TCTTCATAGG AAATGAGTAT AAGCAGGACA AGTAGTTCAG CTGAAGTATT TGCAAGATGG 540 TTTTTCCATC ACCAAGCTGA CTTTTCCAAC AAAAAAACAT TTGGAAATTT CAAACCTGGA 600 AGTGTTCTTG GATCATGTTT ATCAAAATGG GGCAAAGAAT TTCTCAGTAC AAGTAGTGTC 660 AATCGCTTGT TTTAAATTCT AAGGGAGCCA CATTTCCTAA TGCTTTGTGT GCTTCAGACA 720 GGTGCCAGAG TATAAAATGG ATCCAAATAA AAGACAGTAC CTTCACTACA TTTCATTTAC 780 ATGACAGTTA GGTGCAGGAT ATAAGAACAA AGAAAGATCT AACAGTAAGG TGCACGCTGA 840 TGTAGCTGTC ATATTATGGA GGGAAAAAAT GATAAGACCA TACTCTCACT AAGAAATTGT 900 AAAATGAAGT CAGATCCAGA AAGAAAGTAA TAAGGAAGTG ACTTTATGTG CCTGAAGCAT 960 AGTCATTTCC ATATGCTGTA AGCTCAGTGA ACGGAACTGG ATTAAATAAG ACCACTCTAT 1020 GATTCTGTCT ACATATATAC GTAAATAGTA ACGAATAGTA TTCCGTGCAA TTTAAAGCTA 1080 GCATTTTCAT TTGTATCATC ATGGAAACAT TACCATTAGT GTGTAGCAGT ATTTATTAGT 1140 GGAAGTTACA TACAGTTATG TGATTTTAAA GTGTTTCTGA TTACAAGATC CTTCTTCAGG 1200 ACATGCATGA CAGTACAACA GCTGGACACA TACAGACTAT GTACATATCA TCACTAGAGG 1260 GATAGTGCTA GCTATTGGAA TTGTGTGCAC ATTTCTGTCA CCTGGCATAC CATGTCTTGG 1320 TCAATGTGGG CCATAAAAAT ACACAGACTT TCATTACAAT TATCCAGAAT ACAGGAACAT 1380 TACATACGCC TGCAAGGTTT TGAGCCACTG CTGCTCCTTT CAGCATGGTT TGGTCTGTAC 1440 TGTAAACATT TTGCTTGAAA ACACCAATTT CTCACTGTCT AGAAAGCACC TATCACATTC 1500 TTGGCATAGT TTAATATGAA GATAGCACCC AGAGTTACTA CAAAGTTAGC TGTTCTTTCA 1560 TCTGCGAGAC CAAATCACAA GATAAAAGAG AGAACATTTG CTGAAAGTAA GCCCAACAAA 1620 AAACTTCCTA TAAAGGAACT GCATCGCTGC CGGGAGGAAC AAAGAAAACA TTTTCCTTTT 1680 TCTTTGTTAG AGCAGAATTA AGAAAATGTT TTACCTTATT ACAGAACAGA CGAAAGCTGC 1740 ATCTTTCTGT GGTTATGCAA GATTTTCTCA CTCACATCAT CACATCCTCC TTCTTAGATG 1800 TTGTGATTTA AAATAAAAAA TTGGCAAAAT ATTTTCAATG CAATCCTTCT GTGCCTGCCA 1860 TACATCCCAG AGCTGTCCAC ATGCTTCTGC TTGCTCTTCC ATGCTACTAC CTGAAGGACC 1920 AGATAGTCCA TGGTCACGTT TGTTACAGTA GAAACTAATT TTCTCCAAGT ATTCACCAAC 1980 AGAATCACCA TAATTAAATG CTATATATAT ATATATATAA AAATAATAGA ATGAATATAT 2040 ATACATATGT TCCTTCAAAC AAACTCCTGT ATCTATAGCA TGAAAAACTA ATGTAAGCTT 2100 TCTGGAAATT CAAGTACTAA CACTAGAGGC ATGCCGGACG GAAGGAGGCT AAGAAACAGA 2160 GATAAAAGCC CATGGGTGAA CTCATTCAAT GCTGCCATGT GTGGTGTGCT GAGAGTTTAA 2220 TTTCTTGTGT TTTGGTTAGC AATTTGCAAG GAGTAACCCT CAGTACTGGC CAGCCAAGCC 2280 AATGCTGGAG ATGAAAGGTC TGACAGCCAA AGCATCCAAA AGCATGCTTC CATATCAAGG 2340 TCAGAGAAGC TTTGTTATTT CCAGCCAAAG AGTGTCTGCT GCACATCTCT TTCAACTTGT 2400 GATGTAACCT GTCCTGGCAA GCAGTCCAGG TCACTCTCAT TATAAAACAC AGCTACCTCA 2460 GAGGTAATTT GCTCATTTAC AGGGCCTCCA GCAGGTTGAA AGGTACCAAG CAGATCTGAA 2520 CAGAACTTTG AGCTCTAAAA AACTCTGCCT CTTTTCCCCT TCTCTCTCTC TCCCTCTCTC 2580 TCTCTCTAAA GCAAAGCAGA ATCATTTGGA AAAG ATG ATA CCA GAA ACT TTG AAT 2635 Met Ile Pro Glu Thr Leu Asn CCA CTG AAC TAC TTC ACC AGC CTG GTA CCA GAC TTG ATG CCA GTT GCC 2683 Pro Leu Asn Tyr Phe Thr Ser Leu Val Pro Asp Leu Met Pro Val Ala ACA GTG CCT ATC ATC ATT CTC ATC TGC TTT CTG TTT CTA ATA TGG AAT 2731 Thr Val Pro Ile Ile Ile Leu Ile Cys Phe Leu Phe Leu Ile Trp Asn CAT GAA GAA ACA TCA TCA ATA CCA GGTAAGGTAA CTCCACAGTA TTGCCTAACA 2785 His Glu Glu Thr Ser Ser Ile Pro G GCTGCCAAAG TACTTCTGTT GTTTTTCAAA TTTAAATGAG GAGGGAATGC TGAATAATAA 2845 CTGTACACAG CAAAATTTTC TAATAATAAT GTAGACATTA AAGTAATCAA TGAAAGAAAT 2905 CAGGCTCTAT TTAGCCTTAC CCACTTCCCT AACAAACCTG GTCTAACCAT ACAAATACAT 2965 CATTTTGTTT TGCTTCTATT GTGTATATGC TAGAAAGATA AAACATCATC TGACAAATTC 3025 TACACATTCA TATTTTCATG TGCATTATAA ATTCCTACTT TTTACGTGTT GCATGCTTAA 3085 AGCTCACTGA ACTATCTACA CTGGAAACAA GCAGTACTAT CAGGCAAATT ACTTCAATTT 3145 TAGCAGATTT TTGTCTTTTA CAGACATTGT AGAGGCAGGT TGAGGTTTTT CTTCTTCACA 3205 GTATCCTTCT TTTAGAAAGA ATTC 3229

【００３５】配列番号：２ 配列の長さ：4351 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 起源 生物名：Coturnix coturnix japonica 株名：NIBS line WE 配列の特徴：アロマターゼ遺伝子のエクソン1およびエ
クソン2を含む5'上流領域（ただし、No. 2339は決定
中） 配列： GAATTCTTTA CTGTGAAATC CTGTTATCAT TCACTAAAAC ACCTTTTGCA GAGAAAAGTG 60 CTTAACAGAA TCCTGAACTT TCTCAGTGTT TCAGTCTCAA AGATCTGTGA TCTATAGGTC 120 CCTCTGCTGG CGGGTGCTTC ACAGCCGTTA AGCTCTAAAA TTACCTGTAT GTGCTTCCAA 180 TTAATTTATG TCACAAAAGC ATTTCCTTCT AAGCTTCTTT CCTCCCATTC TCTGGCTTTG 240 AAAGCTTCCT TCCATCCCCT GCTCCCGTAT AAGCAACAAG CAGAACCAGC AAAACCCTCT 300 TATCAGACAA ATACCTCATC CAGCTGCAAG GGGAAGAAAA TGACCCAGAG AAGATTTCAA 360 GATTAAATAG GCAAGAATAG TGAAAGCTTC TTCCGTGCAC CTCAGATGTG TTCCATTTCT 420 GCTTACTATC AAAGTTTACT TACTGAATTT TTAGTTTTTC TTGAGGGATT TTCTTCATAG 480 GAAATGAATA TAGGCAGGAC AAATAGTTCA GCTCAAGTAT TTGCAAGATG ATTTTCCCAT 540 TGCCAAGCTG ACTTTCCCAA CAAAAAAAAT ATTTGGAAAT TCCAAACCTG GAAGTGTTCT 600 TGGATTGTAT TTATCAAACC GAGGCTAAGA ATTTCTCAGT GCAAGTACTG TCAATTGCTT 660 GTTTTCAAAA CTAATGGAGC CACATTTCCT AATGCTTCAT GTGCTTCAAA TAGGTTCCAG 720 AGTATAAAAT GGATTAAAAA AGAAAGTAGT AAGGAAAGTA GTAAGGAAGC AAACTTATGT 780 GCCTTAAGCA CAGCCATTTC TACAAAGCTC AGTAAAAGGA ATTGGATTAG ATAAGACCAC 840 CCTATGATTC TAGCTACATA CGCACATAAG TGGTAACAAA AATAGTACTC CATACCATTT 900 AAAGCTAACA TTTTCGCTTG TATTATTATG GAAACATTAC CATTAGTGTG TAGCAGTATT 960 TATTGTTGAA AGTAGCACAC AGTTACGTGA TTTTAAAATC TTTCTGATGA CAAAATTCTT 1020 TTTCAGATCA TGCATGACAG CACAACAGCT GAACACATAC AGAGTATGTA CATATCACAA 1080 GAGGGATGCT GGTAGCTATT GGAACTTTGT GCACACTTCT GTCACTTGGT ACACCATGTC 1140 TTGGTTAACA TGGACTATAA AAATGGAAAG ACTTTCATAG CAATTATCCA GAATACAGCA 1200 ATGTTACAAA CACCTACAGG GTTTTGAGCC ACTGCTGCTC CCTTCAGCAT GGTTTGGTCT 1260 GTACTGCAAA CATTTTGACT GAAAATACCA GTTTCTCTCT GTCTAGAAAG CACCTATCGC 1320 ATTCTTGGCA TAGTTTAATG TGATGATAGC ACCCAGGGTT ACTACAAAGT TAGCTGTTCT 1380 TTCATCTGTG AGACCAAATC ACAAGATAAA AGAGAACGCT TGCTGAAAGT AAGGCAACAG 1440 AAAGCTTCCT ATTAAGGAAC TACATTTCTC CTGGGAGGAA CAAAGAAAAC ATTTTTCTTT 1500 TTAGAGCAGA ATTAAGAAAA TGCTTTATTA CCTCATTACA GAGCAGATGC AGGTAGCATC 1560 TTTCTCAAAT CTTATGCAAA ATTTTCTCAC TTATATCATC ACATCCTCCT TCTAATACGT 1620 TGTGATTTAA AATCAAAAAC TGGCAAAATA TTTTCAAAGC AATCCTTCTG CTCCCACTGT 1680 ACATCCCAGT GCTGTCCACC TGATTACTTT TCCATGCTGC TCAAAGTGCT GGCCACTACC 1740 TGTAGGACCA GATAATCCAT AGTCGTGTTT GTTATAGCAG AAACTAATTT TCTCAAAGCA 1800 TTCACCAATA GAATCACCAC AAAGAAATGC AATACTCTGT ACTCCACTCA AAGGTTGACT 1860 ATAAAATTTA TATATGTTAC TTCAAACTCC TGGATCTACA ACGTGAAAAA CTAATATAAG 1920 CTTTCTGGAA ATTCAAGTAT TAATACAGGC ATTATAGAGG CATTCAGTAA GGCAGGAGGC 1980 TAAGAAACAG AGGTAAAAGC CCATGGATGA ACTCATTCAA TGCTTCCACG TGTGCTGAGA 2040 GTTTAATTTC TTGTGTTTTG GTTAGCAATT TGCAAGGGGT AACCCTCAGT ACTGACCAGC 2100 CAAGCTAATG CTGGAGATGA AAGACCTGAC AGCCAAAGCA TCCAAAAGCA AGCTTCCATA 2160 TCAAGGTCAG AGAAGTTTTG TTATTTCCAG CCAAAGAGAG TGTTTGCTGC ATGTCTCTTT 2220 CAGCGTGTGA TATAGCCTGA CCTGGCAAGC AGTCCAAGTC AGTCTCGTTA TAAAACACAG 2280 CTACCTCAGA GGTAATTTGC TCATTTACAG GGCCTCCAGC AGGTTGAAAG GTACCAAGCA 2340 GATCTGAATA GAGCTTTGAG CTTTTAAAAA AAAAAAACCT CTGCCTCTTT TCCCATTCTC 2400 TCTCTCCCTC TGTCTAAAGC AAAGCAGAAT CATTTGGAAA AG ATG ATA CCA GAA 2454 Met Ile Pro Glu ACT TTG AAT CCA CTG AAC TAC TAC ACC AGC CTG GTA CCA GAC TTG ATA 2502 Thr Leu Asn Pro Leu Asn Tyr Tyr Thr Ser Leu Val Pro Asp Leu Ile CCA GCT GCC ACA GTG CCT ATC ATC ATT CTC ATC TGC GTT CTG TTT CTA 2550 Pro Ala Ala Thr Val Pro Ile Ile Ile Leu Ile Cys Val Leu Phe Leu ATA TGG AAT CAT GAA GGA ACA TCA TCA ATA CCA GGTAAGGTAA CTCCATGGCA 2603 Ile Trp Asn His Glu Gly Thr Ser Ser Ile Pro G TTGCCTAACA GCTGCCAAAG TATTTTTGTT GTTTTTCAAA TTTAAATAAG GAGGGAATGC 2663 TGAATAATAA TTATACACAG CAAAGTTTTC TAATAATAAT GTAGATGTTA AAGGAACTGA 2723 TGAAAGAAAT CAGGCTCTAT TTAACCTTAC CACTTCCCAA CAAACCTGGC CTAGCCATGT 2783 AAATACATCA TTTTGTTTTG CTTCTATTGT TTATCTGCTA GAAATATACA GTGTCACCTG 2843 ACAAATTCTA CATGTTCATA TTTTCACGTG CATTACAAAT TCCTACTTTT TACGTATTGC 2903 ATGCTTAAAG CTCACTGAAT TATCTGCACT AGAATCAGGC AATACTATCT GGCAATTAGA 2963 TTTGAGCAGA TTTTTGTTTT TTACAGACAT TGTAGAGGCA AGTTAAACAT CCTGTGAAGA 3023 AGAAAACCCT CCTTTTATAA AGGATTCAAT AGCCATGTTA ATTCTGTAAT GTTCACTCCA 3083 CTTTCTCCTT TTTGTTGTTA GGACATTCAG TGCTGAGTTA CTGTAGGTTC TAGCTGATAT 3143 CTTTAAGTGC TCTTTAATCC TTTCTCAGCT CCTATTTCAG CACTAAAATA CTCTTTCCTC 3203 TAAATATCTA TTTCCTTATT CTAGTATTAA TGACTAAGAC AAATATATTA AGAGATTAAA 3263 TTAATTATAT TTTATTATAT CATGATGATA TACAACTTTA CAGGTGCTAC TGCCAAGGTC 3323 ACTCAAATGA TTCATTAGAA TCACAGATAA ATAAGTTATT ACCACCACTT CCTTCTGGTG 3383 TCTAGCCATT GTTCATCCAA TTGTAAGCAA TCTCAAAGCA ACAGTTTGAA GTCACGTATA 3443 GAAATACTGA ATTAAATTTG CTGTATTCAC ACTGAATGGC TTGTAGGTTT TCAGAGATAC 3503 TAAATGAGAT TCCAGCAATG TAGATGCAAG TTTCTGTAAG ACAAAACTTC AAAATGGGAT 3563 TTTATGTGGT GCCCAGTGCA AACCTTGACC ATAATTGCAA AAACAGTTTC CAAAGGGGTG 3623 AAGTTTGGTG GCATATTCTT GTCCATGAAC TCTGACAAGA GAAATATTTC TTACTTTTCC 3683 CTTA GGG CCA GGA TAC TGT ATG GGA ATT GGG CCT CTC ATT TCA CAT GGG 3732 ly Pro Gly Tyr Cys Met Gly Ile Gly Pro Leu Ile Ser His Gly AGA TTT CTC TGG ATG GGA GTA GGT AAC GCC TGC AAC TAC TAC AAC AAG 3780 Arg Phe Leu Trp Met Gly Val Gly Asn Ala Cys Asn Tyr Tyr Asn Lys ACA TAT GGA GAA TTT GTG AGA GTT TGG TTC AGC GGT GAA GAA ACA TTT 3828 Thr Tyr Gly Glu Phe Val Arg Val Trp Phe Ser Gly Glu Glu Thr Phe ATA ATT AGC AAGTAAATCC TTATTTTCTA TCTTCAATTA TATGAAAAAG 3877 Ile Ile Ser TGGTTTCATA GATTTAACAG CATTTTTGCT ACATTTTTTC TGATGTAGAA TTGAAATAAC 3937 TGCTTTACAA AATTATCATA ACATAATCCT TTTATTCCCT GTTGCTCACC GATCTTTTTC 3997 TAATCTTTTG GTTTTTTAGA GACTGTTATT GAGGTCTCTA CTAGAGACTA CCACTGGATG 4057 GAGTCTCTCG TTTTCTAAGA GGAAAGGAAC AGAAAGTTTT ATAACCCAAA CCTAAAAGAT 4117 GCTTACAGCT TACTATTGCA TTTAATATTA GGATGACACA TTACACATGA TTGCTGATTG 4177 ATCGACTGCC ACACAGCTTT AAACCAAACT TTAGTTTCCC GTGTTAAGAT TCTCCTTAAA 4237 ATGAGAGTAA TGCTTGAAGA TTATGGCTCC AGTTCAGCAA GGTAATTAAG CAAAAGCAGC 4297 ATTACAGGAT CATGAGTAAT TCCACTGCAA TTACTGAGAT TACTCCTAGA ATTC 4351

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ニワトリとウズラのアロマターゼ遺
伝子の塩基配列の類似性を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の配列もしくはその一部を含
   むＤＮＡ（但し、その塩基配列が前記配列中の塩基番号
   1914から2973までの塩基配列であるＤＮＡを除く）また
   はその相補鎖。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡに対応するＲＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡの少なくとも一部
   を含むプローブ。
4. 【請求項４】 配列番号２の配列もしくはその一部を含
   むＤＮＡまたはその相補鎖。
5. 【請求項５】 請求項４記載のＤＮＡに対応するＲＮ
   Ａ。
6. 【請求項６】 請求項４記載のＤＮＡの少なくとも一部
   を含むプローブ。