DE69024210T2

DE69024210T2 - Vorrichtung zum nachweis von mikroorganismen

Info

Publication number: DE69024210T2
Application number: DE69024210T
Authority: DE
Inventors: James Diguiseppi; Thurman Thorpe
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1989-05-15
Filing date: 1990-05-14
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2010-05-15
Also published as: IE70325B1; DK185891A; IE901660A1; DK176223B1; CA2016872C; CA2016872A1; DE69024210D1; ES2083454T3; KR920701473A; ZA903493B; ATE131525T1; NO914472D0; HUT60765A; AU638718B2; DK185891D0; JP3109740B2; WO1990014414A1; HU905125D0; GR3019111T3; KR0178397B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweisen von bakteriellem Wachstum in einer Probe. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein elektronisches Instrument zum Nachweisen von Mikroorganismenwachstum in einer Probe durch Ueberwachung eines dem Probenwachstum ausgesetzten Anzeigeelements.
Das Vorhandensein von mikrobieller Verunreinigung in einer klinischen Probe wird herkömmlicherweise durch Kultivieren der Probe in Gegenwart von Nährstoffen und Nachweisen von mikrobieller Aktivität durch Veränderungen in der Probe oder in der Atmosphäre über der Probe nach einem Zeitintervall bestimmt. Zum Beispiel wird im US-Patent 4 182 656, lautend auf Ahnel et al., die Probe in einem Behälter mit einem Nährmedium plaziert, umfassend ein fermentierbares Kohlenstoff-13-Substrat. Nach dem Versiegeln des Behälters und dem Aussetzen der Probe in biologische Aktivität fördernde Bedingungen, wird das Verhältnis von Kohlenstoff-13 zu Kohlenstoff-12 in der gasförmigen Atmosphäre über der Probe bestimmt und mit dem Anfangsverhältnis verglichen. Im US-Patent 4 152 213 wird ein Verfahren beansprucht, mit dem das Vorhandensein von sauerstoffkonsumierenden Bakterien in einer sich in einem versiegelten Behälter befindlichen Probe bestimmt wird, indem eine Abnahme der Sauerstoffmenge in der Atmosphäre über der Probe nachgewiesen wird durch Ueberwachen des Gases im Behälter. Das US-Patent 4 073 691 liefert ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von biologisch aktiven Agenzien, einschliesslich Bakterien, in einem versiegelten Behälter, der ein Nährmedium enthält, durch Messen der Veränderungen der Beschaffenheit der gasförmigen Atmosphäre über der Probe nach einem Zeitintervall.
Ein Verfahren für nichtinvasives Nachweisen von CO&sub2;-Veränderungen in der gasförmigen Atmosphäre wird von Suppman et al. gelehrt, wie dies durch die am 04. April 1984 publizierte EP-Anmeldung 0 104 463 offenbart wird. Die in diesen und andern Publikationen beschriebenen Verfahren und Instrumente benötigen alle entweder ein Radiometrieverfahren oder das Eindringen in den versiegelten Behälter, um nach dem Kultivieren die Veränderungen in der gasförmigen Atmosphäre zu messen, oder erfordern, dass der Behälter aus Spezialmaterialien hergestellt ist, die einen ungehinderten Durchlass von Infrarotlicht ermöglichen.
Die EP-A-0 301 699 bezieht sich auf das Nachweisen von mikrobiellem Wachstum in einer Probe in herkömmlichen Mikrotiterplatten. Das Nachweisen von metabolischer Aktivität basiert auf dem Messen der Farbveränderungen, oder anderer das Reflexionsvermogen der Probe beeinflussenden Eigenschaften, in der Probe selber.
Die US-A-4 456 380 offenbart ein Verfahren zum Identifizieren von Bakterien in einer Probe in herkömmlichen Kulturplatten, das auf spezifischen Farbreaktionen der Bakterien mit Reagenzien basiert, die in den einzelnen Zellen der Platten enthalten sind. Das Verfahren liefert kein quantitatives Signal.
Andere bekannte Verfahren zum Messen der mikrobiellen Verunreinigung einer Probe, insbesondere von Blutkulturen, schliessen das Messen von kleinsten Veränderungen bei Temperatur, pH, Trubung, Farbe, Bioluminiszenz und Impedanz mitein. Im allgemeinen bestimmen diese Verfahren mikrobielle Verunreinigung durch Nachweisen von bakteriellen Stoffwechselnebenprodukten. Mikrobielle Verunreinigung kann auch durch Subkultivieren und/oder Färben bestimmt werden. Von diesen Verfahren liefern nur Impedanz, Radiometrie und Infrarotspektrometrie Möglichkeiten zur automatischen Verarbeitung einer klinischen Probe. Ausser bei Impedanzund Infrarotmessungen benötigen diese Verfahren auch das Eindringen in den Behälter, um eine Messung an der flüssigen Probe oder an der gasförmigen Atmosphäre über der Probe vorzunehmen. Zusätzlich zur Wahrscheinlichkeit der Verunreinigung und dem Schaffen der Wahrscheinlichkeit, dass sich die Zusammensetzung der Atmosphäre über der Probe bei jeder Vornahme der Bestimmung verändert, gestatten diese Verfahren nicht, dass Messungen kontinuierlich oder leicht über kurzzeitige Intervalle über eine längere Zeitspanne durchgeführt werden. Dies ist ein bedeutender Nachteil, da sich die Wachstumsrate von verunreinigenden Organismen unterscheidet, und zwar je nach Organismus und Anzahl Organismen in der ursprünglichen Probe, so dass nicht vorausgesagt werden kann, wann eine verunreinigte Probe nachweisbare Veränderungen in der Atmosphäre oder in der Flüssigkeitsprobe aufweist. Bei einem verwandten Problem, wenn die Verunreinigung durch pH- Veränderungen in der flüssigen Probe bestimmt wird, beeinflussen verschiedenartige Stoffwechselprodukte den pH der Probe auf unterschiedliche Weise. Zum Beispiel hebt das Erzeugen von Ammoniak den pH an, während das Erzeugen von CO&sub2; diesen senkt. Verschiedene Wachstumsraten von unterschiedlich verunreinigenden Organismen könnten einmal eine Erhöhung des pH und ein anderes Mal eine Senkung bewirken. Diese variable Erhöhung-Senkung würde nicht nachgewiesen, wenn der pH in grossabständigen Intervallen gemessen würde. Eine andere Fehlerquelle beim Nachweisen von Veränderungen durch pH-Messungen in ganzen Blutproben, insbesondere wenn ein Indikator das Mittel zur pH-Bestimmung ist, besteht in der Wahrscheinlichkeit, dass das Aussehen des Indikators von der Anwesenheit der Blutzellen beeinträchtigt oder getrübt werden kann. Kolorimetrische Indikatoren können nur dann wirkungsvoll verwendet werden, wenn verhindert werden kann, dass die von der Natur der Probe verursachten Fehler das Aussehen der Farbe beeinflussen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Instrument zu liefern zum kontinuierlichen Ueberwachen von Veränderungen der pH- oder CO&sub2;-Niveaus in einer Probe, die eine Kultur für mikrobielles Wachstum enthält.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Instrument zum Ueberwachen von pH- oder CO&sub2;-Veränderungen bei einer Probe in einem versiegelten Behälter zu liefern, ohne während dem Ueberwachungsvorgang in den Behälter einzudringen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, einen pH- und/oder CO&sub2;-Indikator zu liefern, der eine kontinuierliche Anzeige der pH- oder CO&sub2;-Niveaus liefert und vom Vorhandensein von farbigen Komponenten im Nährmedium nicht beeinflusst wird.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, eine Analyse der Veränderlichkeit von pH und/oder CO&sub2; auf einer kontinuierlich überwachten Basis zu liefern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, sowohl den absoluten pH-Wert als auch die Veränderungsgeschwindigkeit des pH zu überwachen. Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden erreicht, indem ein Instrument geliefert wird zum Nachweisen des Vorhandenseins von Mikroorganismen in klinischen Proben wie Blut oder anderen Körperflüssigkeiten durch Kultivieren der Probe mit einem sterilen Nährmedium in einem transparenten, versiegelten sterilen Behälter. Das Vorhandensein von Mikroorganismen wird durch Nachweisen oder Messen der Veränderungen des ph der Probe oder der CO&sub2;-Erzeugung in einer Probe bestimmt, indem ein auf der inneren Oberfläche des Behälters befestigter wegwerfbarer Sensor verwendet wird. Gemäss dieser Erfindung können Mikroorganismen in der Gegenwart von störenden Materialien wie grossen Konzentrationen an roten Blutzellen durch nichtradiometrische und nichtinvasive Mittel nachgewiesen werden. Da sich das pH- und/oder CO&sub2;-Niveau in der Probe verändert, verändern sich die lichtreflektierenden und/oder lichtabsorbierenden Eigenschaften des wegwerfbaren Sensors auf entsprechende Weise. Die Grösse der Veränderung der reflektiven Eigenschaften des Sensors wird durch einen Abgabe- und Aufnahmemechanismus nachgewiesen, der Signale an eine Vorrichtung zum Ueberwachen der Menge sichtbarer Reflexion/Absorption und der Veränderungsgeschwindigkeit liefert. Geschwindigkeit und Menge werden analysiert, um das Vorhandensein von mikrobiellem Wachstum in der Probe oder dem Muster vorauszusagen und zu bestimmen. Der Sensor kann kontinuierlich oder in häufigen Zeitintervallen bemustert und/oder überwacht werden, wodurch das Sammeln einer detaillierten Eigenschaft von Grösse und Geschwindigkeit der Sensorveränderung ermöglicht wird.
Eine vollständigere Einschätzung der Erfindung und deren mannigfaltigen begleitenden Vorteile wird leicht möglich, sobald diese mit Bezug auf die nachfolgende detaillierte Beschreibung verständlicher wird, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Figuren betrachtet wird.
Figur 1 ist eine Querschnittansicht des Probengefässes und der Lichtnachweisinstrument-Anordnung.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Eigenschaftsbeziehung zwischen dem Reflexionsvermögen des Sensors und dem pH der Probe zeigt.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die eine Eigenschaft illustriert, die beispielhaft ist für die pH- und CO&sub2;-Veränderungen in einer Probe, die durch das Wachstum von E. coli-Bakterien verursacht wurden.
Figur 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Veränderung des Reflexionsvermögens einer Vielfalt von Mikroorganismen im Zeitablauf zeigt wie sie durch die vorliegende Erfindung gemessen wurde.
Figur 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Schwellengeschwindigkeit des Erzeugungsniveaus in Abhängigkeit von konstanten steigungsüberwachenden Nachweisverfahren illustriert.
Figur 6 ist ein schematisches Blockdiagramm, das die Hauptkomponenten des Analyseinstruments der vorliegenden Erfindung zeigt.
Figur 7 ist eine perspektivische Ansicht einer Ausführung der vorliegenden Erfindung, welche die acht gleichzeitig überwachten Proben zeigt.
Das Instrument und die Vorrichtung der Erfindung liefern ein nichtinvasives Mittel zum Nachweisen des Vorhandeseins von Mikroorganismen in einer klinischen Probe wie Blutproben oder anderen Körperflüssigkeiten, indem eine Zunahme der von Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukte gemessen wird. Eine Probe wird einem speziell formulierten Medium zugefügt, das die Pröduktion von gewissen mikrobiellen Stoffwechselprodukten steigert. Wie in Figur 1 dargestellt, ist die Probe und das formulierte Medium 3 zur Inkubation in einer Kulturflasche oder einem Behälter 1 untergebracht. Der Behälter 1 ist durch einen nicht dargestellten Deckel versiegelt.
Ein einzigartiger wegwerfbarer Sensor oder Indikator 2 befindet sich innerhalb der Flasche 1 gegen eine derer Innenwände positioniert. Der Sensor 2 umfasst eine feste Zusammensetzung oder Membran, die als Befestigungs- oder Trägermedium bezeichnet wird, und ein Indikatormedium, das auf oder im Trägermedium befestigt ist. Auf diese Weise wird der Sensor 2 flach gegen die innere Oberfläche eines Behälters 1 plaziert, so dass das Indikatormedium von aussen sichtbar ist, und wird gegen Zellen, Proteine und andere feste oder lichtundurchlässige oder farbige Komponenten der Probe oder des Mediums versiegelt, damit diese nicht zwischen den Indikator 2 und die Oberfläche des Behälters gelangen können. Dies verhindert, dass irgendein Objekt zwischen den Indikator 2 und den Nachweisinstrument-Mechanismus 4 und 5 gelangt. In gewissen Ausführungen wird der Indikator 2 von der Probe und deren Wachstumsmedium 3 durch eine Membran oder feste Schicht getrennt, die den Durchgang von Gasmolekülen zulässt, aber den Durchgang von Ionen verhindert. Auf diese Weise ist der Indikator 2 wie gewünscht den pH- oder CO&sub2;-Veränderungen ausgesetzt, ist aber dem Medium 3 nicht direkt ausgesetzt.
Proben von Körperflüssigkeiten wie Blut, die so wenig wie ein Organismus pro Millimeter enthalten, können durch Verwendung dieser Erfindung nachgewiesen werden. Solche Proben benötigen eine Inkubation von bis zu sieben Tagen, bis die Organismuspopulation ein kritisches Niveau erreicht oder eine Zunahme der Stoffwechselprodukte gemessen werden kann. Durch die Benützung der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass eine Konzentration von 10&sup6; KBE/ml für gewisse Organismustypen messbare pH- oder CO&sub2;-Niveeaus lieferte. Alle Organismen zeigten bei Konzentrationen von 10&sup7; bis 10&sup8; KbE/ml messbare Resultate.
Die Erfindung ist in vieler Hinsicht einzigartig und vorteilhaft:
(1) die mikrobiellen Stoffwechselprodukte werden in der flüssigen Phase der Kulturflasche gemessen und nicht in der Atmosphäre über der Probe,
(2) da der einzigartige wegwerfbare Sensor 2 an der inneren Oberfläche der Flasche 1 befestigt ist, können Messungen von der Aussenseite der durchsichtigen Wand der Flasche 1 gemacht werden, ohne die Integrität der Flasche 1 zu verletzen,
(3) die Messungen von aussen können durch visuelle Prüfung oder mit einem Instrument durchgeführt werden, das misst, indem es das Reflexionsvermögen des Sensors 2 misst,
(4) undurchsichtige oder farbige Komponenten in der Probe 3 stören die Fähigkeit des Sensors 2 nicht, Veränderungen der pH- und/oder CO&sub2;-Niveaus nachzuweisen und anzuzeigen, und
(5) es wird eine hohe Konzentration an Indikatormolekülen in einem kleinen Volumen, das heisst auf der Membran, aufrechterhalten, so dass eine Veränderung der Farbe leicht beobachtet werden kann,
(6) die Beobachtung des Sensors 2 kann im wesentlichen kontinuierlich durch Bemusterung über kurzabständige Zeitintervalle durchgeführt werden, da keine invasive Bemusterung oder Gefässmanipulation erforderlich ist,
(7) ein Eigenschaftsrepräsentant des absoluten Niveaus und der Veränderungsgeschwindigkeit von ph oder CO&sub2; kann aus dieser kontinuierlichen Ueberwachung abgeleitet werden.
Die Nährstoffkomponenten, die ein komplexes mikrobielles Medium bilden, beeinflussen die Stoffwechselwege, welche die Mikroorganismen benutzen. Organische Säuren, Basen und verschiedene Gase werden in einem von den erhältlichen Nährstoffen abhängigen Verhältnis gebildet. Diese Produkte variieren ebenfalls je nach Art des Mikroorganismus. Das Vorhandensein dieser Produkte im flüssigen Medium kann dessen pH verändern. Die bei der Erfindung verwendeten Sensoren enthalten pH-empfindliche Indikatoren, die eine messbare Veränderung als Reaktion auf eine pH-Veränderung in der Umgebung anzeigen. In der Ausführung, bei der der pH-Sensor von einer gasdurchlässigen, ionendurchlässigen Membran zugedeckt ist, wird das Vorhandensein von Gasen wie CO&sub2; oder Ammoniak gemessen, welche den pH des Indikators beeinflussen. Somit kann mikrobielles Wachstum entweder durch Veränderungen des pH des flüssigen Nährmediums odere durch Messen der von Mikroorganismen in einem Medium gelösten Gase nachgewiesen werden. Kohlendioxid ist ein universelles Stoffwechselprodukt, das von allen Organismen produziert wird, und ist deshalb das bevorzugte Stoffwechselprodukt zum Nachweisen von mikrobiellem Wachstum.
Wie die vorliegende Erfindung lehrt, teilen CO&sub2;- und pH-Sensoren zwei gemeinsame Komponenten, eine als pH-Indikator nützliche Molekularart und ein Befestigungs-/Trägermedium. Der pH-Indikator kann entweder kovalent oder nichtkovalent am Trägermedium befestigt sein. Andererseits kann der Indikator in einer gaspermeablen Polymermatrix eingekapselt sein, beispielsweise ein vor dem Härten in eine Polymermatrix emulgierter pH-Indikator. Der CO&sub2;-Sensor weist eine dritte Komponente auf, eine semipermeable Substanz, welche die Indikatormembran vollständig von Probe und Wachstumsmedium trennt. Diese Sensoren werden im Innern eines geeigneten transparenten Gefässes 1 mit einem passenden Klebstoff befestigt.
Eine Vielfalt von verschiedenen fluoreszierenden und sichtbaren pH-Indikatoren können als aktive Molekulararten für pH- oder CO&sub2;-Sensoren verwendet werden. Im allgemeinen bestehen die einzigen Einschränkungen für die Auswahl der Indikatoren in den Bedingungen, dass sie akzeptierbare dynamische pH-Bereiche aufweisen und Wellenlängenveränderungen zeigen, die durch existierende Frontoberflächenfluoreszenz- oder Reflexionstechnologien nachgewiesen werden können.
Sensoren zum Nachweisen von pH-Veränderungen im Kulturmedium nach der Erfindung sollten eine Veränderung der Fluoreszenzintensität oder der sichtbaren Farbe über einen ph-Bereich von 5,0 bis ungefähr 8,0 zeigen.
Indikatoren für einen CO&sub2;-Sensor sollten eine Veränderung der Fluoreszenzintensität oder der sichtbaren Farbe in einem pH-Bereich zwischen ungefähr 10,0 und 6,0 zeigen, um Veränderungen der CO&sub2;-Konzentrationen nachzuweisen.
Nur gewisse pH-Indikatormoleküle können kovalent oder nichtkovalent an ein Trägermedium gebunden werden und behalten ihre pH- Anzeigeeigenschaften. Wir haben festgestellt, dass Indikatoren nützlich sind, die zu den Xanthen-, Phenolphtalein- und Phenolsulfonphtalein-Gruppen gehören.
Das Befestigungs-/Trägermedium kann eine Substanz wie Zellulose sein, an die ein pH-Indikator unter Verwendung organischer Reaktionen kovalent befestigt werden kann. Eine nichtkovalente Befestigung von pH-Indikatoren kann hergestellt werden, indem ionische Trägermaterialien wie Nylonmembranen verwendet werden, die ein positives oder negatives Zetapotential besitzen. Andere ionische Trägermaterialien, die verwendet werden können, sind positiv oder negativ geladene ionische Harze wie Diethylaminethyl(DEAE)-Harz oder (DEAE)-Zellulose. Eine Vorbehandlung des Trägermaterials mit einem Protein kann erforderlich sein, wenn die Indikatormembran in direkten Kontakt mit dem mikrobiellen Wachstumsmedium kommen soll.
Die ph-Indikatorsensoren weisen pH-Veränderungen aufgrund der ph-Umgebung des mikrobiellen Wachstumsmediums direkt nach. Diese Sensoren können jedoch so hergestellt werden, dass sie selektiv auf Gase (zum Beispiel Kohlendioxid oder Ammoniak) im flüssigen Wachstumsmedium reagieren, indem sie mit einer selektiv semipermeablen Zusammensetzung oder Membran wie Silicium, Latex, Teflon oder verschiedenen Kunststoffen zugedeckt werden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Fähigkeit besitzen, die Diffusion eines Gases selektiv zu ermöglichen und gleichzeitig den Durchgang von Ionen und Flüssigkeit zu verhindern. Für Sensoren, die einen in einer Polymermatrix eingekapselten Indikator umfassen, kann das matrixbildende Polymer als semipermeable Schranke wirken, die den Durchgang von Gasen zulässt, denjenigen von Ionen aber verhindert.
Bei der Ausführung mit eingekapseltem Indikator umfasst der CO&sub2;- Sensor einen sichtbaren oder fluoreszierenden pH-Indikator, der im pH-Bereich zwischen pH 6 und pH 10 reaktionsfreudig ist, ein Natriumhydroxid oder eine gleichwertige Base, die eine optimale ph-Umgebung zum Nachweisen von CO&sub2; aufrechterhält, ein Glycerol oder einen gleichwertigen Emulgator, der Mizellen bilden kann aus einer im ungehärteten Polymer emulgierten Indikatorlösung, und ein ungehärtetes Polymer wie RTV-Weissilicium bei Raumtemperatur, das die richtige Umgebung für den Indikator aufrechterhält. Jedes Polymer kann verwendet werden, das die chemische Aktivität des Indikators nicht beeinträchtigt, sei es durch seine eigenen chemischen oder physikalischen Eigenschaften oder seinen Erfordernissen zum Härten solange es noch für Gase aber nicht für Ionen permeabel ist, und das diese Eigenschaften nicht verändert, wenn es der Sterilisation im Autoklaven ausgesetzt wird. Eine Emulsion wird aus den vier oben erwähnten Komponenten hergestellt und das Polymer wird gehärtet, um eine semipermeable Matrix um die Mizellen des pH-Indikators zu bilden, was eine selektive Diffusion von CO&sub2; und anderen Gasen aus dem flüssigen Wachstumsmedium zulässt, wodurch eine messbare Exponierung des Indikators erfolgt, um eine messbare sichtbare Veränderung der Indikatorfarbe zu liefern. Der Sensor 2 kann separat hergestellt und auf der inneren Oberfläche der Kulturflasche angebracht werden, oder andererseits kann der Sensor 2 am Boden der Flasche gebildet und in situ gehärtet werden. Nach dem Härten wird die Flasche mit dem Sensor sterilisiert, beispielsweise durch Autoklavieren. Eine Anzahl spezifischer Beispiele von pH- und CO&sub2;- Sensoren sind im co-pendenten US-Patent Nr. 4 945 060 vorgesehen, das am 15. März 1988 eingereicht wurde. Spezifische pH- und CO&sub2;-Indikatoren werden hierin nicht über die obige Beschreibung hinausgehend beschrieben. Die Sensoren müssen eine sichtbar nachweisbare Indikation von ph- und/oder CO&sub2;-Veränderungen liefern, damit sie mit dem im folgenden beschriebenen Instrument und der Ausrüstung richtig zusammenzuwirken.
Auf ähnliche Weise sind Nährmediumformulierungen im US-Patent Nr. 4 945 060 beschrieben und werden deshalb hierin nicht näher erläutert.
Figur 1 illustriert eine Querschnittansicht eines Kulturbehälters 1 mit einer Probe und einem Medium 3 darin, und einen Sensor 2, der auf seiner Bodenoberfläche befestigt ist. Der Behälter 1 ist auf einer Plattform 7 angeordnet dargestellt, die eine Oeffnung 8 aufweist, in die ein Lichtnachweisinstrument 5 eingesetzt ist, sowie eine Oeffnung 9, in die ein Emitter 4 eingesetzt ist.
Sowohl der Emitter 4 und das Nachweisinstrument 5 sind mit dem Analysegerät 6 verbunden, das in Figur 6 detaillierter illustriert ist.
Behälter 1 weisen im allgemeinen eine zylindrische Form auf, wie dies in Figur 7 dargestellt ist, und passen in Oeffnungen 10 in der oberen Oberfläche des Substrats 7. Die Behälter 1 werden durch Verwendung eines elastischen Verpackungsmaterials 12 in den Oeffnungen 10 gut festsitzend gehalten. Die Innenseite der Oeffnungen 10 sind mit Verpackungsmaterial 12 ausgelegt, das elastisch gegen die Seitenwände des Behälters 1 drückt, wenn dieser in die Oeffnungen eingepasst wird. Diese Verpackung soll verhindern, dass der Behälter 1 aus den Oeffnungen 10 fällt, wenn das Substrat 7 wie unten beschrieben bewegt wird. Der Emitter 4 und das Nachweisinstrument 5 sind in einem gegenseitigen Winkel α montiert, um einen optimalen Empfang des vom Indikator 2 reflektierten Lichts zu liefern. Der Winkel α beträgt in der illustrierten bevorzugten Ausführung 45 Grad, andere gegenseitige Winkel nahe bei 45 Grad liefern jedoch annehmbare Resultate. Man hat herausgefunden, dass ein bevorzugter Bereich von 30 bis 60 Grad optimal ist und den besten Reflexionswirkungsgrad ergibt.
Der Emitter 4 und das Nachweisinstrument 5 müssen in einem geeigneten gegenseitigen Winkel und in einem geeigneten Winkel in bezug auf den Indikator 2 plaziert sein, so dass das Licht nicht von der Aussenseite des Behälters wegreflektiert, sondern den Indikator 2 erreicht, um von diesem wegzureflektieren. Weiter muss das Nachweisinstrument 5 gegen direkte Beleuchtung vom Emitter 4 abgeschirmt sein, damit eine ungenaue Ablesung verhindert wird.
Figur 7 illustriert die Gesamtkonfiguration einer beispielhaften Ausführung der vorliegenden Erfindung. Wie aus Figur 7 ersichtlich, weist das Basiselement 7 eine Anzahl zylindrischer Lochvertiefungen 10 auf, um die Probenflaschen 1 aufzunehmen. Jede Anzahl Flaschen 1 kann in die Vertiefungen 10 im Substrat oder Basis 7 plaziert werden. Die Basis 7 wird derart montiert, dass sie vom Rüttelmotor 26 und dem daran befestigten Rüttelmechanismus 28 gerüttelt werden kann. Das Rütteln ist notwendig, um das Gemisch in den Flaschen 1 richtig geschüttelt und gerührt zu halten, um richtiges mikrobielles Wachstum zu fördern. Die Basis wird ebenfalls beheizt durch Heizgeräte 30, die an der Basis befestigt sind, oder durch vollständiges Umschliessen der Basis in einem kontrollierten Inkubationsapparat. Jede der Vertiefungen 10 schliesst einen Emitter und ein Nachweisinstrument zum geeigneten Beleuchten der Sensoren und und zum Nachweisen der reflektierten Lumineszenz mitein.
Wie unten näher beschrieben, kann jede der Flaschen 1 durch selektives Ablesen der Ausgabe des Nachweisinstruments, das mit den Vertiefungen, in die jede der Flaschen eingesetzt worden sind, assoziiert ist, unabhängig überwacht werden. Auf diese Weise kann der Computer 20 eine Anzahl von Proben gleichzeitig überwachen, indem er in einem vorbestimmten gewünschten Bemusterungsintervall wie gewünscht eine Probenablesung von jeder Probe nimmt und den mikrobiellen Wachstumsfortschritt jeder Probe wie unten beschrieben evaluiert.
Figur 6 ist ein Schaltschema, das den Signalempfangs- und -verarbeitungsteil der Signalanalysevorrichtung 6 darstellt, die in den Figuren 1 und 7 illustriert ist. Die LED D11 bis D18 werden von einer Zener-stabilisierten konstanten Gleichstromquelle 14 gespeist. Die Stromquelle schliesst den Transistor Q1 der mit amp op17 arbeitet sowie die Zenerdiode D9 mit ein. Die Stromquelle 14 liefert eine stabile Beleuchtung für die LED D11 bis D18, welche die Diodenempfänger D1 bis D8 beleuchten.
Die LED D10 bis D18 stellen den Lichtemitter 4 dar, der in Figur 1 abgebildet ist, und die Photodioden D1 bis D8 stellen das in Figur 1 illustrierte Lichtnachweisinstrument 5 dar.
In den Figuren 6 und 7 gibt es acht Dioden, die auf dem Substrat 7 montiert sind, von denen vier dargestellt sind. Die beispielhafte Ausführung illustriert acht Lichtemitter, acht Nachweis instrumente und acht parallele Schaltwege, wobei dies nur als Beispiel dient und es kann irgendeine Anzahl Emitter- und Nachweisinstrument-Paare verwendet werden, je nach Anzahl der von einer einzigen Verarbeitungsvorrichtung 6 zu evaluierenden Proben.
Die illustrierten Photodioden D1 bis D8 können zum Beispiel VTP 5051-Photodioden von EGG Vactech, St. Louis, Missuri, USA, sein. Jede vergleichbare Photodiode, die zum sensitiven Nachweis in einem gegebenen Spektrumbereich geeignet ist, kann verwendet werden. Andere zum Nachweisen in anderen Bereichen des elektromagnetischen Spektrums geeignete Photodioden können verwendet werden, wenn die Lichtemitter 4 so gebaut sind, dass sie in diesem Teil des Spektrums emittieren, und wenn der Sensor 2 so gebaut ist, dass er in diesem anderen Teil des Spektrums reflexive Eigenschaften zeigt als Reaktion auf Veränderungen in der pH- oder CO&sub2;-Produktion.
Der Ausgang jeder Diode wird von einem Paar Nieder-Offset-Operationsverstärkern verstärkt, die in einer invertierten Nieder-Antrieb-Konfiguration angeordnet sind. Diese Konfiguration ist in Figur 6 durch den in der Schaltung mit 16 bezeichneten Teil illustriert.
Die Ausgänge der Operationsverstärker werden durch individuelle Eingangsleitungen 18 in den Multiplexer MUXOB multiplexiert. Auf diese Weise kann der Ausgang jeder dieser individuellen Dioden D1 bis D8 zum Ueberwachen oder Analysieren ausgewählt werden. Durch Vorsehen einer Drei-Bit-Adresse, die auf den Adressleitungen A0 bis A2 vorgesehen sind, kann der Computer 20 den gewünschten Diodenausgang auswählen, damit er auf der DRN-Leitung 8 des Multiplexers MUX08 abgelesen wird. Das vom Multiplexer ausgehende Signal wird dann passiv tiefpassgefiltert und verstärkt und dem Computer 20 als analoges Ausgangssignal zugeführt. Dieses analoge Signal am Ausgangsterminal 22 kann zuerst in ein digitales Signal umgewandelt und dann dem Eingabeterminal 24 des Computers zugeführt werden, oder es kann dem Computer direkt als analoges Signal zugeführt werden.
Im Computer 20 werden die Ausgaben der verschiedenen Nachweisinstrumente kompiliert, und es werden die für die Veränderungsgrösse und -geschwindigkeit der ph- oder CO&sub2;-Konzentration der verschiedenen in Figur 5 illustrierten Proben charakteristischen Kurven entwickelt. Der Computer führt ebenfalls die notwendige Analyse zum Evaluieren der entwickelten Eigenschaften und zum Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandensein von sich entwickelnden mikrobiellen Kulturen durch, wie dies hierin weiter unten beschrieben ist.
Mit Bezug auf die graphischen Darstellungen von Figur 5 werden im folgenden die Vorteile der durch die vorliegende Erfindung ermöglichten Analysetechniken gegenüber den durch den Stand der Technik zugänglichen Analysetechniken durch visuelle Prüfung beschrieben.
In der ersten graphischen Darstellung I von Figur 5 wurde das absolute CO&sub2;-Niveau in bezug zur Zeit aufgezeichnet, zusammen mit einem CO&sub2;-Schwellenniveau, das verwendet werden kann, um zu bestimmen, ob mikrobielle Verunreinigung vorhanden war.
Der absolute CO&sub2;-Konzentrationswert der Lösung wird durch Analyse der Farbveränderung des Indikators 2 im Behälter 1 bestimmt. Es sollte beachtet werden, dass Körperflüssigkeiten wie Blut eine eigene CO&sub2;-Produktion aufweisen, was aus den gleichförmig steigenden Niveaus aller drei Kurven ersichtlich ist. Die Grösse dieser Hintergrundproduktion variiert unter den Proben sehr stark. Die Kennlinien A, B und C stellen beispielhaftes mikrobielles Wachstum dar. Die Kennlinie A illustriert ein hohes Hintergrundproduktionsniveau, aber kein mikrobielles Wachstum.
Sie überschreitet die Schwelle und würde deshalb unter Verwendung der Analysetechniken des Standes der Technik als positiv betrachtet werden, wobei es sich aber um ein falsches Positiv handeln würde. Die Kennlinie B illustriert ein mittleres Hintergrundniveau und stark sichtbares Wachstum. Da die Kennlinie B das Schwellenniveau ebenfalls überschreitet, würde es als echtes Positiv nachgewiesen. Diese können durch periodische Bemusterungstechniken mit einem bedeutenden Zeitintervall zwischen den einzelnen Bemusterungen nachgewiesen werden, weil das CO&sub2;-Niveau für ein bedeutendes Zeitintervall über der Schwelle bleibt. Die Kennlinie C illustriert eine Kombination von geringer Hintergrundproduktion und schwachem Wachstum, wodurch unter früheren Nachweisanalysetechniken ein falsches Negativ resultiert.
Die zweite graphische Darstellung II illustriert die erste Ableitung der Daten der ersten graphischen Darstellung, oder die Geschwindigkeit der CO&sub2;-Produktion. Es ist ersichtlich, dass die Geschwindigkeit A hoch ist, aber konstant abnimmt; dass die Geschwindigkeit von B mittelmässig ist mit einer Zunahme zur Zeit des mikrobiellen Wachstums; und dass die Geschwindigkeit von C niedrig ist, aber wiederum mit einer Zunahme zur Zeit des mikrobiellen Wachstums.
Die dritte graphische Darstellung III illustriert die zweite Ableitung, oder Wachstumsbeschleunigung, der Daten der ersten graphischen Darstellung. Hier illustriert die Kennlinie A eine konstant negative Beschleunigung, während B und C Intervalle mit stark positiver Beschleunigung zeigen. Durch Vergleichen der graphischen Darstellungen ist ersichtlich, dass, obwohl der CO&sub2;- Wert der Probe A in der graphischen Darstellung I über einen Schwellenwert steigt, er in der graphischen Darstellung II keine bedeutende Steigungsveränderung und deshalb keine Beschleunigung in der graphischen Darstellung III zeigt. Es ist ersichtlich, dass in der graphischen Darstellung III die zwei echt positiven Proben B und C positive Kennlinien zeigen, die bei der Probe A nicht vorhanden sind.
Die Kennlinie C illustriert ein mikrobielles Wachstum, das eine langsamere CO&sub2;-Erzeugungsgeschwindigkeit zeigt, was von verschiedenen Faktoren abhängen kann. Bei diesem Beispiel würde diese Probe unter Verwendung der Bemusterungstechniken des Standes der Technik oder durch visuelle Prüfung des Indikators 2 der vorliegenden Erfindung als negativ bestimmt, was ein falsches Negativ sein würde. Dies aufgrund der Tatsache, dass der absolute CO&sub2;-Wert der Probe C nie über einen Schwellenwert steigt, der notwendig ist, um eine positive Ablesung anzuzeigen. Wenn jedoch die Bemusterungs-, Analyse- und Evaluationstechnik der vorliegenden Erfindung, welche im folgenden beschrieben wird, verwendet wird, würde dieses tatsächliche mikrobielle Wachstum, obwohl es ungenügend ist, um das CO&sub2; der Probe über das Schwellenniveau in der graphischen Darstellung I ansteigen zu lassen, als ein positives bakterielles Vorhandensein und somit als ein echtes Positiv aufgefasst.
Der Computer 20 der vorliegenden Erfindung kann eingestellt werden, um den angezeigten CO&sub2;-Wert in jedem gegebenen Intervall abzulesen. Wenn man zum Beispiel ein Bemusterungsintervall von 10 Minuten zwischen zwei Ablesungen verwendet, meldet der Computer dem Multiplexer MUXOB, dass er eine Ablesung des geeigneten Sensoreingangs in 10-Minuten-Intervallen ausgeben soll. Die Ablesung wird vom Computer gelesen und gespeichert. Der Computer nimmt dann nach zehn Minuten eine weitere Ablesung vor und speichert den Wert.
Nachdem sechs Intervalle gewonnen worden sind, wird ein siebentes Intervall genommen und das erste Intervall fallengelassen. Der Computer fährt dann auf diese Weise mit dem Update fort, indem er die älteste Probe fallenlässt und die neueste dazunimmt, so dass der Computer jederzeit eine einstündige Datenperiode zur Hand hat.
Der Computer 20 verwendet diese Proben, um auf kontinuierliche Art die Steigung der Kurve zu bestimmen, die alle nebeneinanderliegenden ph-Paar-Ablesungen miteinander verbindet, und bestimmt somit zwischen jedem Paar nebeneinanderliegender Zehnminutenintervallablesungen einen "momentanen" Steigungswert. Diese Steigung wird mit der vorhergehenden Intervallsteigung verglichen und mit den Steigungen der vorhergehenden Intervalle bis zurück zu einem Total von sechs Intervallen oder einer Stunde. Dies liefert dem Computer die Geschwindigkeits- und Beschleunigungswerte, welche in den graphischen Darstellungen I und III dargestellt sind.
Die Steigung des vorliegenden Zehn-Minuten-Bemusterungsintervalls kann einzig mit der Steigung des letzten Intervalls oder mit der Steigung der letzten fünf Intervalle auf einer ausgewogenen Basis verglichen werden. Der Computer sucht nach positiver Beschleunigung wie diejenigen, die durch die Kurven B und C der graphischen Darstellung III von Figur 5 illustriert sind. Die Zeitdauer der positiven Beschleunigung wird überwacht, und die Beschleunigung muss für ein Zeitintervall positiv sein, das grösser ist als dasjenige, das man Instrumentfluktuationen oder einer anderen Hintergrundstörung zuschreiben könnte. Zum Beispiel ist das Zeitintervall t&sub1; in der graphischen Darstellung III ungenügend, während das Zeitintervall t&sub2; genügend ist.
Dieses Analyseverfahren ist vorteilhaft, weil beide Beispiele B und C, die positives bakterielles Wachstum betreffen, von der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Dieses Analyseschema ist nicht vom absoluten in der Probe entwickelten CO&sub2;-Wert abhängig, sondern hängt nur von einer Veränderung der Geschwindigkeit der CO&sub2;-Zunahme ab, was sich als ein zuverlässigerer Indikator von positiven biologischen Proben herausgestellt hat als das überschreiten einer Schwelle durch den absoluten CO&sub2;-Wert.
Dieses Analyseverfahren ist nur erreichbar durch das Instrument und die Lehre der vorliegenden Erfindung, die kontinuierliche Ueberwachung und kurzabständige Bemusterung ermöglicht, und die einen Indikator 2 liefert, der genügend empfindlich ist, um hochpräzise CO&sub2;-Ablesungen zu erhalten.
Die von diesem Instrument überwachten Sensoren enthalten Indikatoren, welche die Farbe verändern, wenn wachsende oder metabolisierende Mikroben vorhanden sind und entweder eine pH- oder eine CO&sub2;-Veränderung erzeugen. Obwohl die Farbveränderungen für das blosse Auge sichtbar sein können, liefert die Verwendung des Instrumentariums 6 den Vorteil der Objektivität, Empfindlichkeit und Kontinuität der Messung. Bei einer bevorzugten Ausführung ist für jeden Sensor ein Lichtemitter und -nachweisinstrument vorgesehen. Es sind jedoch auch Alternativen möglich, um eine kontinuierliche Ueberwachung aller Proben zu ermöglichen. Diese Alternativen schliessen das Verwenden von Mitteln ein, jede Probenflasche an einem oder mehreren stationären Nachweisinstrumenten vorbeizubewegen, oder ein oder mehrere Nachweisinstrumente an den stationären Flaschen vorbeizubewegen.
Bei der oben beschriebenen bevorzugten Ausführung werden feste Illuminatoren und Nachweisinstrumente verwendet; es könnten aber auch Glüh- und Bogenlampenquellen als Beleuchtung verwendet werden und Spiegel, Linsen, optische Fasern und andere Mittel können ebenfalls verwendet werden, um das Licht zum Indikator in der Flasche zu führen zwecks Reflexion zu einem Nachweismittel, wie dies dem Fachmann auf diesem Gebiet nach der Offenbarung der vorliegenden Erfindung klar wird.

Claims

1. Instrument zum Ueberwachen von mikrobiellem Wachstum in einer Probe, umfassend:

einen versiegelbaren, sterilisierbaren Behälter mit einem Innenraum, in dem die Probe in einem sterilen Nährmedium kultiviert wird, wobei der Behälter mindestens einen transparentan Abschnitt aufweist;

ein sterilisierbares Indikatormittel, das sich im Behälter im Bereich des transparenten Abschnitts befindet, wobei dieses Indikatormittel eine messbare Veränderung anzeigt als Reaktion auf eine ph-Veränderung in seiner Umgebung, welche durch diesen transparenten Abschnitt nachweisbar ist nachdem es Stoffwechselprodukten von mikrobiellem Wachstum ausgesetzt worden ist, wobei Veränderungen im Indikatormittel von ausserhalb des Behälters durch diesen transparenten Abschnitt überwacht werden können, wodurch mikrobielles Wachstum überwacht werden kann, ohne nach dem Versiegeln in den Behälter einzudringen;

ein Emittermittel zum Emittieren eines Emittersignals, das mit mindestens einer messbaren Eigenschaft dieses Indikatormittels interagiert, wodurch ein Indikatorsignal erzeugt wird, wobei dieses Emittermittel in bezug zu diesem Indikatormittel derart positioniert ist, dass dieses Emittersignal durch den transparenten Abschnitt auf dieses Indikatormittel auftrifft;

ein Nachweismittel, das in bezug auf dieses Indikatormittel derart positioniert ist, um dieses Indikatorsignal von diesem Indikatormittel durch den transparenten Abschnitt zu empfangen, und um ein dementsprechendes Nachweissignal zu erzeugen;

Verarbeitungsmittel zum Empfangen dieses Nachweissignals und zum Verarbeiten dieses Nachweissignals, um die Grösse der messbaren Eigenschaft dieses Indikatormittels zu jeder gegebenen Zeit zu evaluieren, und um die Grösse dieses Signals mit der Grösse zu einer anderen Zeit zu vergleichen und dabei mikrobielles Wachstum in diesem versiegelbaren Behälter zu überwachen, nachdem dieser Behälter versiegelt worden ist.

2. Instrument nach Anspruch 1, worin dieses Verarbeitungsmittel zum Empfangen dieses Nachweissignals ein Schaltmittel ist.

3. Instrument nach Anspruch 1, wobei dieses Emittermittel eine lichtemittierende Diode umfasst.

4. Instrument nach Anspruch 3, wobei dieses Nachweismittel eine Photodiode umfasst, die Reflexionen der Emission dieser lichtemittierenden Diode empfangen kann.

5. Instrument nach Anspruch 3, wobei dieses Verarbeitungsmittel zum Empfangen dieses Nachweissignals eine stabilisierte Stromw quelle für diese lichtemittierende Diode umfasst.

6. Instrument nach Anspruch 2, wobei dieses Schaltmittel Rechenmittel umfasst, um dieses Nachweissignal in ausgewählten Zeitintervallen zu empfangen, und um alle Veränderungen der Eigenschaften dieses Nachweissignals während jedem dieser Zeitintervalle zu vergleichen.

7. Instrument nach Anspruch 2, wobei dieses Schaltmittel Rechenmittel umfasst zum periodischen Bemustern dieses Nachweissignals, zum Vergleichen von Proben dieses Nachweissignals, und zum Berechnen der Veränderungsgeschwindigkeit dieser Proben.

8. Instrument nach Anspruch 1, weiter umfassend Mittel zum Nachweisen einer Veränderungsgeschwindigkeit in diesem Nachweissignal, und zum Messen der Dauer dieser Veränderungsgeschwindigkeit.

9. Verfahren zu Nachweisen von mikrobiellem Wachstum in einer Probe, umfassend folgende Schritte:

Vorsehen eines sterilisierbaren Behälters, wobei der Behälter in einer seiner Wände mindestens einen transparenten Abschnitt aufweist, und ein Indikatormittel, das eine messbare Veränderung anzeiat als Reaktion auf eine pH-Veränderung in seiner Umgebung, die sich im Behälter im Bereich des transparenten Abschnitts befindet;

Vorsehen eines Emittermittels zum Emittieren eines Emittersignals, das mit mindestens einer messbaren Eigenschaft dieses Indikatormittels interagiert, wodurch ein Indikatorsignal erzeugt wird, wobei dieses Emittermittel in bezug zu diesem Indikatormittel derart positioniert ist, dass dieses Emittersignal durch den transparenten Abschnitt auf dieses Indikatormittel auftrifft;

Vorsehen eines Nachweismittels, das in bezug zu diesem Indikatormittel derart positioniert ist, um dieses Indikatorsignal von diesem Indikatormittel zu empfangen, und um ein dementsprechendes Nachweissignal zu erzeugen;

Vorsehen von Verarbeitungsmitteln zum Empfangen dieses Nachweissignals und zum Verarbeiten dieses Nachweissignals, um die Grösse der messbaren Eigenschaft dieses Indikatormittels zu evaluieren;

Einführen der Probe in den Behälter unter sterilen Bedingungen; Inkubieren der Probe im Behälter; und

Nachweisen einer Veränderung im oder der Grösse des Nachweissignals, wodurch mikrobielles Wachstum in der versiegelbaren Flasche nachgewiesen wird, nachdem der Behälter versiegelt worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend folgende Schritte:

Empfangen dieses Nachweissignals in ausgewählten Zeitintervallen;

Vergleichen aller Veränderungen in den Eigenschaften dieses Nachweissignals während dieses Zeitintervalls.

11. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend folgende Schritte:

Bemustern dieses Nachweissignals;

Vergleichen von aufeinanderfolgenden Proben dieses Nachweissignals; und

Berechnen der Veränderung der Veränderungsgeschwindigkeit zwischen aufeinanderfolgenden Proben.

12. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend folgende Schritte:

Nachweisen einer Zunahme der messbaren Eigenschaft; und Messen der Dauer dieser messbaren Eigenschaft, die sich auf diesem erhöhten Niveau befindet.

13. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins von Mikroben in einer Probe, umfassend folgende Schritte:

Vorsehen des Instruments von Anspruch 1;

Einführen der Proben in den sterilen Behälter;

Inkubieren der Proben im Behälter;

Ueberwachen des Indikatormittels mit dem Nachweismittel bezüglich einer Veränderung einer messbaren Eigenschaft des Indikatormittels in mindestens einem Zeitintervall;

Berechnen der Veränderungsgeschwindigkeit der messbaren Eigenschaft, wobei eine erste Ableitung der Messung der Eigenschaft bestimmt wird; und

Analysieren der Grösse der ersten Ableitung der messbaren Eigenschaft, um das Vorhandensein von Mikroben in der Probe zu ermitteln.

14. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von Mikroben in einer Probe, umfassend folgende Schritte:

Vorsehen des Instruments von Anspruch 1;

Einführen der Probe in den sterilen Behälter;

Inkubieren der Probe im Behälter;

Ueberwachen des Indikatormittels mit dem Nachweismittel bezüglich einer Veränderung in einer messbaren Eigenschaft des Indikatormittels während mindestens einem Zeitintervall; und Messen der Grösse der messbaren Eigenschaft, um das Vorhandesein von Mikroben nachzuweisen.

15. Verfahren nach Anspruch 13, weiter umfassend folgende Schritte:

Berechnen der zweiten Ableitung der Messung der messbaren Eigenschaft; und

Analysieren der Grösse der zweiten Ableitung der messbaren Eigenschaft, wodurch das Vorhandensein von Mikroben in der Probe nachgewiesen wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, weiter umfassend folgende Schritte:

Messen der Dauer dieser zweiten Ableitung, wenn diese eine gewisse Grösse aufweist.

17. Instrument nach Anspruch 1, worin das Indikatormittel eine Membran und ein Indikatormedium umfasst, wobei das Indikatormedium eine nachweisbare Veränderung anzeigt als Reaktion auf eine ph-Veränderung in seiner Umgebung.

18. Instrument nach Anspruch 1, worin die Membran an eine Innenwand des Behälters geklebt ist.

19. Instrument nach Anspruch 17, worin das Indikatormittel gegen eine Innenwand des Behälters anliegend angeordnet ist und die Membran des Indikatormittels das Indikatormedium vom Kulturmedium trennt.

20. Instrument nach Anspruch 1, worin das Stoffwechselprodukt CO&sub2; ist.

21. Instrument nach Anspruch 1, worin das Indikatormedium eine Chemikalie ist, die auf pH reagiert.

22. Instrument nach Anspruch 1, weiter umfassend Mittel zum Nachweisen einer Veränderung der Veränderungsgschwindigkeit.

23. Instrument nach Anspruch 22, das ebenfalls die Dauer dieser Veränderung der Veränderungsgeschwindigkeit misst.

24. Instrument nach Anspruch 1, das ebenfalls die Dauer misst, wobei dieses Nachweissignal eine gegebene Grösse aufweist.