NO301486B1 - Instrument for påvisning av mikroorganismer - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et instrument for overvåking av mikrobevekst i enn prøve og anvendelse derav.

Tilstedeværelse av mikrobiell kontaminasjon i en klinisk prøve bestemmes vanligvis ved at prøven dyrkes i nærvær av næringsmidler, og påvisning av mikrobiell aktivitet gjennom forandringer i prøven eller i atmosfæren over prøven etter et tidsrom. I US-patent 4 182 656 tilhørende Ahnel et al. anbringes prøven for eksempel i en beholder med et dyrkningsmedium som omfatter et fermenterbart karbon-13-sub-strat . Etter at beholderen er forseglet og prøven er utsatt for betingelser som bidrar til biologisk aktivitet, bestemmes forholdet mellom karbon 13 og kjent karbon 12 i gass-atmosfæren over prøven, og sammenliknes med begynnelsesfor-holdet. I US-patent 4 152 213 er det patentsøkt en fremgangsmåte ved hvilken tilstedeværelse av oksygenforbrukende bakterier i en prøve bestemmes i en forseglet beholder ved påvisning av en reduksjon i mengden oksygen i atmosfæren over prøven ved overvåkning av gassen i beholderen. US-patent 4 073 691 tilveiebringer en fremgangsmåte for bestemmelse av tilstedeværelsen av biologisk aktive midler, inn-befattende bakterier, i en forseglet beholder som inneholder et dyrkningsmedium, ved måling av forandringer i beskaffenheten av den gassformige atmosfære over prøven etter et tidsrom.

En fremgangsmåte for ikke-inntrengende påvisning av C02-forandringer i gass-atmosfæren er beskrevet av Suppman et al., som beskrevet i EPO-patentsøknad 83108468.6, publisert4. april 1984. Fremgangsmåtene og apparatet som er beskrevet i disse og andre publikasjoner, fordrer alle enten en radiometrisk metode eller inntrengning i den forseglede beholder for måling av forandringer i gass-atmosfæren etter dyrkning, eller det fordres at beholderen fremstilles av spesielle materialer som tillater uhindret passasje av infrarødt lys.

Andre kjente fremgangsmåter for måling av mikrobiell kontaminasjon av en prøve, spesielt blodkulturer, innbefatter måling av meget små forandringer i temperatur, pH, turbiditet, farge, bioluminescens og impedans. Disse metoder bestemmer generelt mikrobiell kontaminasjon ved påvisning av bakterielle metabolske biprodukter. Mikrobiell kontaminasjon kan også vurderes ved sub-dyrkning og/eller farging. Blant disse metoder tilveiebringer bare impedans, radiometri og infrarød spektrometri muligheten til automatisert bearbeidelse av en klinisk prøve. Bortsett fra impedans og infrarød-målinger, fordrer disse fremgangsmåter også inntrengning i beholderen for utførelse av måling på den flytende prøve eller gass-atmosfæren over prøven.

I tillegg til sannsynligheten for kontaminasjon og at det blir sannsynlighet for forandring av sammensetningen av atmosfæren over prøven hver gang bestemmelsen utføres, gir ikke disse metoder mulighet for at målinger kan utføres kontinuerlig eller lett med korttids-intervaller i et ut-strakt tidsrom. Dette er en betydelig ulempe, siden vekst-hastigheten for forurensende organismer er forskjellig, avhengig av organismen og antallet organismer i den opprin-nelige prøve, slik at det ikke kan forutsis når påviselige forandringer i atmosfæren eller fluidprøven vil fremkomme ved en forurenset prøve.

Ved et beslektet problem, når kontaminasjon bestemmes ved pH-forandringer i den flytende prøve, vil forskjellige metabolske produkter påvirke pH i prøven forskjellig. For eksempel vil dannelse av ammoniakk øke pH, mens dannelse av C02vil senke den. Forskjellige veksthastigheter for forskjellige forurensende organismer kan resultere i en pH-økning på ett tidspunkt og en reduksjon på et annet tidspunkt. Denne variable økning-reduksjon vil ikke påvises hvis pH måles med store tidsintervaller. En annen kilde til feil ved påvisning av forandringer ved pH-måling i helblod-prøver, spesielt når en indikator er hjelpemidlet for pH-bestemmelse, er sannsynligheten for at tilsynekomsten av indikatoren kan påvirkes eller skjules ved tilstedeværelsen av blodceller. Kolorimetriske indikatorer kan bare effek-tivt anvendes hvis feil bevirket ved beskaffenheten av prøven kan hindres fra å påvirke tilsynekomsten av farge-

stoffet.

Det er et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et instrument for kontinuerlig overvåkning av forandringer i pH- eller C02-nivåene i en prøve som inneholder en kultur for mikrobevekst.

Det er et annet formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et instrument for overvåkning av pH- eller C02-forandringer i en prøve i en forseglet beholder uten inntrengning i beholderen under overvåkningsprosessen.

Det er et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en pH- og/eller C02-indikator som tilveiebringer kontinuerlig påvisning av pH- eller C02-nivåer og er upåvirket av tilstedeværelsen av fargede bestanddeler i vekstmediet.

Et annet formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe analyse av variasjonen i pH og/eller C02på basis av kontinuerlig overvåkning.

Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse er å overvåke både den absolutte pH-verdi og hastigheten av pH-forandring. Disse og andre formål med den foreliggende oppfinnelse utføres ved at det tilveiebringes et apparat for påvisning av tilstedeværelse av mikroorganismer i kliniske prøver så som blod eller andre kroppsvæsker, ved at prøven dyrkes med et sterilt vekstmedium i en transparent, forseglet, steril beholder. Tilstedeværelse av mikroorganismer bestemmes ved påvisning eller måling av forandringer i prøvens pH eller dannelsen av C02i en prøve under anvendelse av en engangs-sensor festet til beholderens indre overflate. Ifølge denne oppfinnelse kan mikroorganismer påvises i nærvær av forstyrrende materialer så som store konsentrasjoner av røde blodlegemer, ved ikke-radiometriske og ikke-inntrengende hjelpemidler. Etter hver som nivået av pH og/eller C02i prøven forandres, vil lyset som reflekterer og/eller absorberer egenskaper hos engangs-sensoren, forandres tilsvarende. Størrelsen av forandringen av de reflek-tive egenskaper hos sensoren påvises ved en emisjons- og mottaksmekanisme som tilfører signaler til en innretning for overvåkning av mengden av synlig refleksjon/absorpsjon og forandringshastigheten. Hastigheten og mengden analyseres så for forutsigelse og bestemmelse av tilstedeværelsen av mikrobevekst i prøven. Sensoren kan prøves og/eller overvåkes kontinuerlig eller med hyppige tidsintervaller, hvilket gjør mulig oppsamling av detaljerte karakteregenskaper ved størrelsen og hastigheten for sensorforandring.

Det innledningsvis nevnte instrument er særpreget ved at det omfatter følgende: en forseglbar, steriliserbar beholder med et indre kammer hvor prøven dyrkes i et sterilt dyrkningsmedium, idet beholderen har minst én transparent del,

en steriliserbar indikatorinnretning anbrakt i beholderen i området for den transparente del, hvilken indikatorinnretning viser forandring i sine målbare egenskapersom respons på pH-forandring i omgivelsene som er påvisbare gjennom den transparente del ved utsettelse for metabolitter fra mikrobevekst, hvorved forandringer i indikatorinnretningen kan overvåkes fra utsiden av beholderen gjennom den transparente del, hvorved mikrobevekst overvåkes uten inntrengning i beholderen etter forsegling;

en emitterinnretning for utsendelse av et signal som påvirker minst én målbar egenskap hos indikatorinnretningen, som befinner seg i forhold til indikatorinnretningen slik at signalet treffer indikatorinnretningen gjennom den transparente del;

en detektorinnretning anbrakt i forhold til indikatorinnretningen for mottak av signalet fra indikatorinnretningen gjennom den transparente del og for dannelse av et andre signal som svarer til denne;

bearbeidelsesinnretning for mottak av det annet signal og for bearbeidelse av det annet signal for å evaluere størrelsen av den målbare egenskap hos indikatorinnretningen og derved overvåking av mikrobevekst i den forseglbare beholder etter at beholderen er blitt forseglet.

En mer fullstendig forståelse av oppfinnelsen og mange av de tilknyttede fordeler ved denne vil lett kunne fås etter hvert som den bedre forstås ved henvisning til den følgende detaljerte beskrivelse, når den betraktes i forbindelse med de medfølgende figurer.

Det henvises nå til tegningene.

Fig. 1 er et tverrsnitt av prøvebeholderen og foto-detektoranordningen. Fig. 2 er et diagram som viser den karakteristiske forbindelse mellom sensorens refleksjonskoeffisient og prøvens pH. Fig. 3 er et diagram som illustrerer en karakteregen-skap som er mønster for pH- og CO-forandringene i en prøve bevirket ved veksten av E. coli-bakterier. Fig. 4 er et diagram som illustrerer forandringen i refleksjonskoeffisient for forakjellige mikroorganismer over tid, målt ved den foreliggende oppfinnelse. Fig. 5 er et diagram som illustrerer terskelhastighets-dannelsesnivået sammenstilt med konstant helnings-over-våkende påvisningsmetoder. Fig. 6 er et skjematisk blokkdiagram som illustrerer hovedkomponentene i analyseapparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse. Fig. 7 er et perspektivriss av en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, som illustrerer åtte samtidig overvåkte prøver.

Instrumentet ifølge oppfinnelsen muliggjør en ikke-inntrengende metode for påvisning av tilstedeværelse av mikroorganismer i en klinisk prøve så som blodprøver eller andre kroppsvæsker, ved måling av en økning i metabolske produkter dannet av mikroorganismer. En prøve tilsettes til et spesielt utformet medium som forøker dannelsen av visse mikrobielle metabolske produkter. Som illustrert på fig. 1, oppbevares prøven og det utformede medium 3 i en dyrknings-flaske eller beholder 1 for inkubering. Beholderen 1 er forseglet ved et lokk som ikke er illustrert.

En unik éngangs-sensor eller indikator 2 befinner seg i flasken 1 anbrakt mot en indre vegg i denne. Sensoren 2 omfatter et fast materiale eller membran som omtales som tilknytnings- eller bærermediet, og et indikatormedium montert på, eller i, bærermediet. På denne måte er sensoren 2 anbrakt i plan mot den indre overflate av en beholder 1 slik at indikatormediet er synlig fra utsiden, og er forseglet slik at ikke celler, proteiner eller andre faststoffer eller opake eller fargede komponenter i prøven eller mediet kommer mellom indikatoren 2 og overflaten av beholderen 1. Dette vil hindre at noen gjenstander kommer mellom indikatoren 2 og detektormekanismen 4 og 5. Ved visse utførelses-former er indikatoren 2 skilt fra prøven og dens vekstmedium 3 ved et membran- eller faststofflag som tillater passasje av gassmolekyler, men hindrer passering av ioner. På denne måte vil indikatoren 2 være blottlagt for mediet 3.

Prøver av kroppsfluider så som blod, som inneholder så lite som én organisme pr. milliliter, kan påvises ved anvendelse av denne oppfinnelse. Slike prøver fordrer opp til syv dagers inkubering før populasjonen av organismer når et avgjørende nivå, eller en økning i metabolske produkter kan måles. Det er blitt funnet ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse at en konsentrasjon på IO<6>CFU/ml for visse typer organismer ga målbare nivåer i pH eller C02. Alle organismer viste målbare resultater ved konsentrasjoner på fra IO<7>til IO<8>CFU/ml.

Oppfinnelsen er unik og fordelaktig på flere måter:

(1) de mikrobielle metabolske produkter måles i væske-fasen i dyrkningsflasken snarere enn i atmosfæren over prøven, (2) den unike éngangs-sensor 2 festes til den indre overflaten av flasken 1, målinger kan gjøres fra utsiden av den transparente vegg i flasken 1 uten at man må bryte inn i flasken l, (3) de eksterne målinger kan gjøres ved visuell inspeksjon eller med et instrument som måler ved måling av refleksjonskoeffisienten for sensoren 2, (4) opake eller fargede komponenter i prøven 3 innvir-ker ikke på evnen hos sensoren 2 til påvisning og angivelse av forandringer i pH- og/eller C02-nivåer, og (5) en høy konsentrasjon av indikatormolekyler opp-rettholdes i et lite volum, d.v.s. på membranen, slik at en fargeforandring lett kan observeres, (6) observasjon av sensoren 2 kan påvirkes hovedsake-lig kontinuerlig ved prøvetaking ved små tidsintervaller, siden det ikke trenges noen inntrengende prøvetaking eller beholdermanipulering, (7) en egenskap som er representativ for det absolutte nivå og hastighet for forandring av pH eller C02kan fås ut fra den kontinuerlige overvåkning.

Næringsmiddelkomponentene som utgjør et komplekst mikrobemedium, påvirker de metabolske veier som anvendes av mikroorganismer. Organiske syrer, baser og forskjellige gasser dannes i forhold som er avhengig av de tilgjengelige næringsstoffer. Disse produkter varierer også fra art til art for mikroorganismer. Tilstedeværelse av disse produkter i det flytende medium kan forandre dets pH. Sensorer an-vendt ved oppfinnelsen inneholder pH-følsomme indikatorer som gir målbar forandring som svar på en pH-forandring i omgivelsene. Ved utførelsesformen hvor pH-sensoren dekkes av en gassgjennomtrengelig, ione-ugjennomtrengelig membran måles tilstedeværelsen av gasser som påvirker indikatorens pH, så som C02eller ammoniakk. Mikrobevekst kan således påvises enten ved forandringer i pH i det flytende dyrkningsmedium, eller ved måling av gasser oppløst i et medium dannet av mikroorganismer. Karbondioksyd er en universell metabolitt som dannes av alle organismer, og er derfor den foretrukkede metabolitt for påvisning av mikrobevekst.

C02- og pH-sensorer som beskrevet ved den foreliggende oppfinnelse har to felles komponenter, et molekylært materiale som er egnet som pH-indikator, og et tilheftings/bærermedium. pH-indikatoren kan tilknyttes enten kovalent eller ikke-kovalent til bærermediet. Alternativt kan indikatoren innkapsles i en polymermatriks som er gassgjennomtrengelig, så som en pH-indikator emulgert i en polymermatriks, før herding. C02-sensoren har en tredje komponent, en halvgjen-nomtrengelig substans som fullstendig skiller indikator- membranen fra prøven og vekstmediet. Disse sensorer er festet inne i en egnet transparent beholder 1 med et hensiktsmessig klebemiddel.

Mange forskjellige fluorescerende og synlige pH-indikatorer kan anvendes som de aktive molekylære materialer i pH-eller C02-sensorer. Vanligvis er de eneste begrensninger når det gjelder valget av indikatorer, de fordringer at de har tilfredsstillende områder for dynamisk pH og viser bølge-lengdeforandringer som lett kan påvises ved eksisterende frontoverflatefluorescens- eller reflektansteknologier.

Sensorer for påvisning av pH-forandringer i dyrk-ningsmediet ifølge oppfinnelsen bør vise forandring i fluorescensintensitet eller synlig farge over et pH-område på fra ca. 5,0 til ca. 8,0.

Indikatorer for en C02-sensor bør vise forandring i fluorescensintensitet eller synlig farge i et pH-område mellom ca. 10,0 og 6,0 for påvisning av forandringer i C02-konsentrasj oner.

Bare visse pH-indikatormolekyler kan bindes kovalent eller ikke-kovalent til et bærermedium og beholde sine pH-indikasjonsegenskaper. Vi fant at indikatorer som hørte til xanten-, fenolftalein- og fenolsulfonftaleingruppene, var egnet.

Tilheftings/bærermediet kan være en substans så som cellulose, til hvilken en pH-indikator kan bindes kovalent under anvendelse av organiske reaksjoner. Ikke-kovalent tilhefting av pH-indikatorer kan oppnås ved anvendelse av ioniske bærermaterialer så som nylonmembraner som har et positivt eller negativt zeta-potensiale. Andre ioniske bærermaterialer som kan anvendes, er positivt eller negativt ladede ioniske harpikser, så som dietylaminoetyl-(DEAE)-harpiks eller (DEAE)-cellulose. For-behandling av bærer-materialet med et protein kan være nødvendig hvis indikator-membranen skal være i direkte kontakt med mikrobevekstmediet .

pH-indikatorsensorene påviser direkte pH-forandringer på grunn av pH-miljøet i mikrobevekstmediet. Disse sensorer

kan imidlertid lages slik at de selektivt reagerer overfor gasser (f.eks. karbondioksyd eller ammoniakk) i det flytende vekstmedium ved at de dekkes med et selektivt halvgjennom-trengelig materiale eller membran så som silisium, lateks, teflon eller forskjellige plastmaterialerkarakterisert vedkapasiteten til selektiv tillatelse av diffusjon av en gass mens passasje av ioner og væske forhindres. For sensorer som omfatter en indikator innkapslet i en polymermatriks, kan polymeren som utgjør matriksen, virke som den halvgjen-nomtrengelige barriere som tillater passasje av gasser, men ikke ioner.

I den innkapslede indikatorutførelse består C02-sensoren av en visuell eller fluorescerende pH-indikator som er reaktiv i pH-området mellom pH 6 og pH 10, en natriumhydrok-syd- eller ekvivalent base som opprettholder et optimalt pH-miljø for påvisning av C02, en glycerol- eller ekvivalent emulgator som kan danne miceller av indikatorløsning emulgert i den uherdede polymer og en uherdet polymer så som romtemperatur-RTV-hvitt silisium som opprettholder det riktige miljø for indikatoren. Hvilken som helst polymer kan anvendes som ikke påvirker indikatorens kjemiske aktivitet, enten ved sine egne kjemiske eller fysiske egenskaper eller sine fordringer for herding så lenge den er gjennom-trengelig for gasser, men ikke for ioner, og ikke har disse egenskaper forandret ved sterilisering ved autoklavering.

En emulsjon fremstilles av de fire komponenter ovenfor, og polymeren herdes under dannelse av en halvgjennomtren-gelig matriks rundt micellene av pH-indikator, som tillater selektiv diffusjon av C02og andre gasser fra det flytende mikrobevekstmedium, hvilket resulterer i en målbar blottleg-ging av indikatoren under tilveiebringelse av en målbar visuell forandring i indikatorfargen. Sensoren 2 kan fremstilles separat og festes til den indre overflate av dyrkningsflasken, eller alternativt kan sensoren 2 dannes på bunnen av flasken og herdes in situ. Etter herding steri-liseres flasken med sensoren så som ved autoklavering. En rekke spesifikke eksempler på pH- og C02-sensorer er tilveie brakt i US-patentsøknad 07/168 291, inngitt 15. mars 1988, hvis beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referan-se. Spesifikke pH- og C02-indikatorer er ikke beskrevet detaljert i det foreliggende ut over ovennevnte beskrivelse. Sensorene må tilveiebringe visuelt påvisbar indikasjon av pH- og/eller C02-forandringer for riktig vekselvirkning med instrumentet og utstyret beskrevet nedenfor.

Likeledes er dyrkningsmediumutformninger beskrevet i US-patentsøknad nr. 07/168 291 og er derfor ikke beskrevet detaljert i det foreliggende.

Fig. 1 illustrerer et tverrsnitt av en dyrkningsbehol-der 1 med en prøve og medium 3 i denne og en sensor 2 festet til bunnoverflaten av den. Beholderen 1 er illustrert anbrakt på en plattform 7, som har en åpning 8 i hvilken det er innsatt fotodetektor 5, og en åpning 9, i hvilken emitter 4 er innsatt.

Både emitteren 4 og detektoren 5 er forbundet med analyseapparatet 6 illustrert mer detaljert på fig. 6.

Beholdere 1 har generelt sylindrisk form, som illustrert på fig. 7, og passer i åpninger 10 i den øvre overflate av underlag 7. Beholderne 1 slutter tett i åpningene 10 ved anvendelse av elastisk fyllmateriale 12. Det indre av åpninger 10 er foret med fyllmaterialet 12, som presser elastisk mot sideveggene i beholder 1, når den settes i åpningene. Dette fyllstoff er tilveiebrakt for å forhindre at beholderne 1 faller ut av åpningene 10 under bevegelse av underlaget 7 som beskrevet nedenfor. Emitter 4 og detektor 5 er montert i en relativ vinkel a under tilveiebringelse av optimalt mottak av reflektert lys fra indikator 2. Vinkel a ved den illustrerte foretrukkede utførelsesform er 45 grader, men andre relative vinkler nær 45 grader gir tilfredsstillende resultater. Et foretrukket område på 30-60 grader er blitt funnet optimalt for å gi den beste refleksjonsef-fektivitet.

Emitteren 4 og detektoren 5 må være anbrakt ved en hensiktsmessig relativ vinkel og ved en hensiktsmessig vinkel i forhold til indikatoren 2, slik at lyset ikke vil reflektere bort det indre av beholder 1, men vil nå indikator 2 under reflektering fra denne. Videre må detektoren 5 være beskyttet mot direkte belysning fra emitteren 4 for forhindring av unøyaktig avlesning.

Fig. 7 illustrerer den totale utforming av én møns-terutformning av den foreliggende oppfinnelse. Som det vil kunne sees på fig. 7, har bunnelementet 7 en rekke sylin-driske spalteåpninger 10 for tilpassing av prøveflaskene 1. Hvilket som helst antall av flasker 1 kan anbringes i spaltene 10 i underlaget eller bunnen 7. Bunnen 7 er montert på en slik måte at den kan vugges ved hjelp av vuggemotor 26 og vuggemekanisme 28 festet til denne. Vuggingen er nødvendig for å holde blandingen riktig agitert og omrørt i flaskene 1 for befordring av riktig mikrobakterievekst. Bunnen opp-varmes også ved hjelp av varmeanordninger 30, som er festet til bunnen eller ved total innelukking av bunnen i et regu-lert inkubasjonsapparat. Hver av spaltene 10 innbefatter en emitter og en detektor for riktig belysning av sensorene og påvisning av den reflekterte luminescens.

Som beskrevet detaljert nedenfor, kan hver av flaskene 1 uavhengig av hverandre overvåkes ved utvalgt avlesning av utgangssignalene fra detektorene knyttet til spaltene i hvilke hver av flaskene er blitt innsatt. På denne måte kan computer 20 overvåke en rekke prøver samtidig, idet en prøveavlesning for hver prøve utføres etter ønske ved en for-bestemt ønsket prøvetakingshastighet, og mikrobakterievekst -utviklingen for hver prøve vurderes som beskrevet detaljert nedenfor.

Fig. 6 er et kretsdiagram som illustrerer signalmotta-kings- og bearbeidelsesdelen av signal-analyseinnretningen 6 illustrert på fig. 1 og 7. LED'ene Dll - D18 drives ved en Zener-stabilisert konstant strømkilde 14. Strømkilden innbefatter transistor Ql, operasjons-amp opl7 og Zener-diode D9. Strømkilden 14 tilveiebringer en stabil bestråling for LED'ene 11-18 under bestråling av diodereseptorer D1-D8.

LED D10-D18 er representative for lys-emitteren 4 illustrert på fig. 1, og fotodioder D1-D8 er illustrerende for lysdetektoren 5 illustrert på fig. 1.

På fig. 6 og 7 er det åtte dioder montert på underlag 7, hvorav fire er illustrert. Mønsterutførelsesformen illustrerer åtte lys-emittere, åtte detektorer og åtte parallelle kretsveier; dette er kun som eksempel, og hvilket som helst antall emittere og detektor-par kan anvendes, avhengig av antallet prøver som skal vurderes ved et enkelt bearbeidelsesapparat 6.

De illustrerte fotodioder D1-D8 kan for eksempel være VTP 5051-fotodioder fra EGG Vactech, St. Louis, Missouri. Hvilken som helst sammenliknbar fotodiode som kan gi følsom deteksjon i et gitt område av spektret, kan anvendes. Andre fotodioder som kan detektere i andre området av det elektro-magnetiske spektrum, kan anvendes hvis fotoemitterne 4 er utformet slik at belysning skjer i denne del av spektret, og sensoren 2 er utformet slik at den har refleksjonsegenskaper i denne annerledes del av spektret som svar på forandringer i pH eller C02-dannelse.

Utgangssignalet ved hver diode forsterkes av et par lavdrifts-operasjonsforsterkere anordnet i en inverterende lavkjørings-("low drive")-utformning. Denne utformning er illustrert ved den del av kretsen som er identifisert som 16 på fig. 6.

Utgangssignalene av operasjonsforsterkerne multiplekses i multiplekser MUX08 på individuelle innføringsledninger 18. På denne måte kan utgangssignalet av hvilken som helst av de individuelle dioder D1-D8 velges for overvåking og/eller analyse. Ved tilveiebringelse av en trebit-adresse tilveiebrakt på adresselinjer A0-A2 kan computeren 20 velge det ønskede diode-utgangssignal som skal avleses på DRN-linje 8 fra multiplekser MUX08. Signalet ut fra multiplekseren blir så passivt lavpasseringsfiltret og forsterket og tilveiebrakt som en analogsignal-utgangssignal for computer 20. Dette analogsignal ved utgangssignal-terminalen 22 kan først omdannes til et digitalsignal og deretter ledes til inn-gangssignal-terminalen 24 for computeren, eller det kan

ledes direkte til computeren som et analogsignal.

I computeren 2 0 kompileres utgangssignalene for de forskjellige detektorer, og kurvene som er karakteristiske for mengden og hastigheten av forandring av pH eller C02-konsentrasjon for de forskjellige prøver og illustrert på fig. 5, utvikles. Computeren foretar også den nødvendige analyse for vurdering av de utviklede karakteregenskaper og for bestemmelse av tilstedeværelse eller ikke tilstedeværelse av mikrobekulturer under utvikling, som beskrevet nedenfor .

Under henvisning til diagrammene på fig. 5, er fordele-ne ved analyseteknikken som er tilgjengelig ved den foreliggende oppfinnelse, fremfor de analyseteknikker som er tilgjengelige på fagområdet eller ved visuell inspeksjon, beskrevet nedenfor.

På det første diagram I på fig. 5 er det absolutte C02- nivå blitt inntegnet sammenstilt med tiden, sammen med et terskel-C02-nivå som kan anvendes for bestemmelse av om mikrobiell kontaminasjon var tilstede. Den absolutte C02-konsentrasjonsverdi for løsningen bestemmes ved analyse av fargeforandringen av indikatoren 2 i beholderen 1. Det skal bemerkes at kroppsfluider så som blod viser en dannelse av C02i seg selv, som sees i de stadig økende nivåer i alle tre kurver. Størrelsen av denne bakgrunnsdannelse varierer i stor grad for forskjellige prøver. Egenskaper A, B og C representerer mønster-mikrobevekst. Egenskap A illustrerer et høyt nivå av bakgrunnsdannelse, men ingen mikrobevekst. Den krysser terskelen og vil derfor anses som positiv under analyseteknikker på området, men vil være falsk positiv. Egenskap B illustrerer et moderat bakgrunnsnivå og sterkt synlig vekst. Siden egenskap B også krysser terskelnivået, vil den påvises som sann positiv. Disse kan påvises ved periodiske prøvetakingsteknikker med et betydelig tidsrom mellom prøvetakingene, på grunn av at C02-nivået er over terskelen for et betydelig tidsrom. Egenskap C illustrerer en kombinasjon av lav bakgrunnsdannelse og dårlig vekst, hvilket resulterer i falskt negativt resultat under tid-

ligere påvisningsanalyse.

Det annet diagram II illustrerer den første deriverte av dataene i det første diagram, eller hastigheten av C02-dannelse. Det kan sees at hastigheten av A er høy men stadig minskende; av B moderat med en økning i tiden for mikrobevekst; og C lav, men igjen med en økning i tiden for mikrobevekst.

Det tredje diagram III illustrerer den annen deriverte, eller vekstakselerasjonen, av dataene i det første diagram. Her illustrerer egenskap A en konstant negativ akselerering, mens B og C viser perioder med sterkt positiv akselerering. Ved sammenlikning av diagrammene kan det sees at selv om C02-verdien for prøve A stiger over terskelverdien i diagram I, viser den ikke noen betydelig helningsforandring i diagram II og derfor ingen akselerering i diagram III. Det kan sees at i diagram III viser de to sanne positive prøver B og C positive karakteregenskaper som ikke finnes i prøve A.

Egenskapen C illustrerer en mikrobevekst som viser en mer langsom C02-dannelseshastighet som kan skyldes forskjellige faktorer. Ved anvendelse av prøvetakingsteknikkene ifølge teknikkens stand eller ved visuell inspeksjon av indikatoren 2 ifølge den foreliggende oppfinnelse, ville denne prøve i dette tilfelle bestemmes som negativ, hvilket ville være en falsk negativ. Dette skyldes det faktum at den absolutte C02-verdi for prøve C aldri stiger over terskelverdien som er nødvendig for å gi positiv avlesning.

Hvis imidlertid prøvetakings-, analyse- og vurderingsteknik-ken ifølge den foreliggende oppfinnelse beskrevet nedenfor, anvendes, vil denne faktiske mikrobakterievekst bli påvist som en positiv bakteriell tilstedeværelse og derfor som en sann positiv verdi, selv om den ikke er tilstrekkelig til at C02-innholdet i prøven økes til over terskelnivået i diagram

I.

Computeren 2 0 i den foreliggende oppfinnelse kan in-nstilles på avlesning av den angitte C02-verdi ved hvilket som helst gitt tidsintervall. Når vi for eksempel anvender et prøvetakings-intervall på 10 minutter mellom avlesninge- ne, vil computeren instruere multiplekseren MUX08 til å gi en utgangsavlesning fra det hensiktsmessige sensor-inngangs-signal med ti minutters mellomrom. Avlesningen vil gjøres og noteres av computeren. Computeren tar så en ytterligere avlesning etter ti minutter og noterer verdien.

Etter at seks intervaller er blitt oppsamlet, tas et syvende intervall og det første tidsintervall sløyfes. Computeren vil fortsette å oppdatere på denne måte ved sløyfing av den eldste prøve og tilføyning av den siste, slik at computeren på alle tidspunkt har data fra et én-times-tidsrom for hånden.

Computeren 2 0 anvender disse prøver til kontinuerlig bestemmelse av helningen på kurven som binder sammen hvert tilgrensende par av pH-avlesninger, og oppretter derfor en "øyeblikks"-helningsverdi mellom hvert par av tilgrensende ti minutters intervall-avlesninger. Denne helning sammenliknes med den tidligere intervallhelning og med helningene for de intervaller som går forut for dette, tilbake til totalt seks tidsintervaller eller en time, Dette forsyner computeren med tidshastighets- og akselereringsverdiene representert i diagrammene II og III.

Helningen i det foreliggende ti minutters prøvetakings-tidsrom kan bare sammenliknes med helningen i det siste tidsrom, eller den kan sammenliknes med helningen i de siste fem tidsrom på avveid basis. Computeren ser etter positiv akselerering, så som dem som er illustrert ved kurvene B og C på diagram III på fig. 5. Tidsvarigheten for den positive akselerering overvåkes, og akselereringen må forbli positiv i et tidsrom som er større enn det som kunne tilskrives instrumentvariasjoner eller annen bakgrunnsinnvirkning. For eksempel er tidsrom txi diagram III utilstrekkelig, mens tidsrommet t2er tilstrekkelig.

Denne analysemetode er fordelaktig på den måte at både eksempel B og C, som er positiv bakterievekst, vil påvises ved den foreliggende oppfinnelse. Dette analyseskjerna er ikke avhengig av den absolutte verdi av C02utviklet i prø-ven, men avhenger bare av en forandring i hastigheten av C02- økning som er blitt funnet å være en mer pålitelig indikator for positive biologiske prøver enn kryssingen av en terskel ved den absolutte C02-verdi.

Denne analysemetode kan bare oppnås med apparatet og læren ifølge den foreliggende oppfinnelse, som gir mulighet for kontinuerlig overvåking og prøvetaking med korte mellomrom, og som tilveiebringer en indikator 2 med tilstrekkelig følsomhet til å gi mulighet for at høypresisjons-C02-avlesninger kan oppnås.

Sensorene som overvåkes med dette instrument, inneholder indikatorer som forandrer farge når voksende eller metaboliserende mikrober er tilstede og frembringer enten en pH- eller C02-forandring. Skjønt fargeforandringene kan være tydelige for det blotte øye, gir anvendelse av instrumente-ringen 6 fordelen med objektivitet, følsomhet og kontinuitet ved målingene. Ved en foretrukket utførelsesform er en lysemitter og -detektor tilveiebrakt for hver sensor. Imidlertid er andre alternativer tilgjengelige for å gjøre mulig kontinuerlig overvåking av alle prøvene. Disse alternativer innbefatter anvendelse av hjelpemidler for bevegelse av hver prøveflaske forbi én eller flere stasjonære detektorer, eller bevegelse av én eller flere detektorer forbi de stasjonære flasker.

Ved den foretrukkede utførelsesform beskrevet ovenfor anvendes belysningsinnretninger og detektorer i fast til-stand; imidlertid kan glødelampe- og lysbuelampe-belysnings-kilder også anvendes, og speil, linser, optiske fibre og andre midler for styring av lyset til indikatoren i flasken for refleksjon til en påvisningsinnretning kan også anvendes, hvilket vil være åpenbart for en fagmann på området ut fra beskrivelsen av den foreliggende oppfinnelse.

Andre formål, fordeler og trekk ved den foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbare for fagfolk på området ut fra denne omtale.

Claims (25)

1. Instrument for overvåking av mikrobevekst i en prøve,karakterisert vedat det omfatter følgende: en forseglbar, steriliserbar beholder med et indre kammer hvor prøven dyrkes i et sterilt dyrkningsmedium, idet beholderen har minst én transparent del, en steriliserbar indikatorinnretning anbrakt i beholderen i området for den transparente del, hvilken indikatorinnretning viser forandring i sine målbare egenskapersom respons på pH-forandring i omgivelsene som er påvisbare gjennom den transparente del ved utsettelse for metabolitter fra mikrobevekst, hvorved forandringer i indikatorinnretningen kan overvåkes fra utsiden av beholderen gjennom den transparente del, hvorved mikrobevekst overvåkes uten inntrengning i beholderen etter forsegling; en emitterinnretning for utsendelse av et signal som påvirker minst én målbar egenskap hos indikatorinnretningen, som befinner seg i forhold til indikatorinnretningen slik at signalet treffer indikatorinnretningen gjennom den transparente del; en detektorinnretning anbrakt i forhold til indikatorinnretningen for mottak av signalet fra indikatorinnretningen gjennom den transparente del og for dannelse av et andre signal som svarer til denne; bearbeidelsesinnretning for mottak av det annet signal og for bearbeidelse av det annet signal for å evaluere størrelsen av den målbare egenskap hos indikatorinnretningen og derved overvåking av mikrobevekst i den forseglbare beholder etter at beholderen er blitt forseglet.

2. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat bearbeidelsesinnretnin-gen for mottak av det annet signal er en kretsinnretning.

3. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat emitterinnretningen innbefatter en lysutstrålende diode.

4. Instrument ifølge krav 3, karakterisert vedat detektorinnretningen innbefatter en fotodiode som er mottakelig for utstrålingen fra den lysutstrålende diode.

5. Instrument ifølge krav 3,karakterisert vedat bearbeidelsesinnretnin-gen for mottak av det annet signal innbefatter en stabilisert strømkilde for den lysutstrålende diode.

6. Instrument ifølge krav 2, karakterisert ved. at kretsinnretningen innbefatter: en computeranordning for mottak av det annet signal ved valgte tidsintervaller og for sammenlikning av eventuelle forandringer i karakteregenskapene hos det annet signal under hvert av tidsintervallene.

7. Instrument ifølge krav 2, karakterisert vedat kretsinnretningen innbefatter utregningsinnretning for periodisk prøvetaking av det annet signal, for sammenlikning av prøver av det annet signal, og for beregning av forandringshastigheten av prøvene.

8. Instrument ifølge krav 1, karakterisert ved. at det videre omfatter en innretning for påvisning av en forandringshastighet og for måling av varigheten av forandringshastigheten.

9. Anvendelse av et instrument ifølge krav 1 i en fremgangsmåte for påvisning av mikrobevekst i en prøve, hvori prøven innføres under sterile betingelser i beholderen; prøven inkuberes i beholderen; og det påvises en forandring i, eller størrelsen av, det annet signal fra detektoren, hvorved det påvises mikrobevekst i den forseglbare flaske etter at beholderen er blitt forseglet.

10. Anvendelse ifølge krav 9, som omfatter følgende ytterligere trinn: det annet signal mottas med valgte tidsintervaller; og alle forandringer i karakteregenskapene hos det annet signal i løpet av tidsintervallene sammenliknes.

11. Anvendelse ifølge krav 9, som omfatter følgende ytterligere trinn: prøvetaking av det annet signal, sammenlikning av suksessive prøver av det annet signal og beregning av hastighetsøkningen i forandringshastigheten mellom suksessive prøver.

12. Anvendelse ifølge krav 9, som innbefatter følgende ytterligere trinn: en hastighetsøkning påvises og hastighetens varighet måles.

13. Anvendelse av instrument ifølge krav 1 for bestemmelse av tilstedeværelse av mikrober i en prøve, hvorunder: prøven innføres i den sterile beholder, prøven inkuberes i beholderen, det overvåkes med hensyn til forandring i en målbar egenskap for indikatorinnretningen med detektorinnretningen i minst ett tidsintervall, forandringshastigheten for den målbare egenskap beregnes, hvorved en første deriverte av egenskapen bestemmes, og størrelsen av den første deriverte av den målbare egenskap analyseres for bestemmelse av tilstedeværelsen av mikrober i prøven.

14. Anvendelse av instrumentet ifølge krav 1 for bestem- meise av tilstedeværelsen av mikrober i en prøve, hvorunder: prøven innføres i den sterile beholder, prøven inkuberes i beholderen, det overvåkes med hensyn til forandring i en målbar egenskap hos indikatorinnretningen med detektorinnretningen ved minst ett tidsintervall og størrelsen av de målbare egenskaper måles for bestemmelse av tilstedeværelsen av mikrober i prøven.

15. Anvendelse ifølge krav 13, hvori dertil den annen deriverte av den målbare egenskap beregnes og størrelsen av den annen deriverte av den målbare egenskap analyseres, hvorved tilstedeværelsen av mikrober i prøven fastslåes.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvori dertil varigheten av den annen deriverte måles.

17. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat indikatorinnretningen omfatter en membran og et indikatormedium, idet indikatormediet viser påvisbar forandring når den utsettes for mik-robemetabolitter.

18. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat membranen er forseglet til en indre vegg i flasken.

19. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat indikatormediet er anbrakt mot en indre vegg i beholderen og membranen i indikatorinnretningen skiller indikatormediet fra dyrknings-mediet.

20. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat metabolitten er C02.

21. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat indikatormediet er et kjemikalium som reagerer på pH.

22. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat det videre omfatter en innretning for påvisning av forandringshastigheten og for påvisning av akselerasjon av forandringshastigheten.

23. Instrument ifølge krav 22, karakterisert vedat det også måler varigheten av nevnte akselerasjon.

24. Instrument ifølge krav 1, karakterisert vedat det videre omfatter en innretning for måling av størrelsen av det annet signal.

25. Instrument ifølge krav 24, karakterisert vedat det også måler varigheten av størrelsen til det annet signal.