KR101527766B1 - Pyp 단백질을 이용하는 목적 단백질의 분석 방법 및 이에 이용되는 pyp 변이체 - Google Patents
Pyp 단백질을 이용하는 목적 단백질의 분석 방법 및 이에 이용되는 pyp 변이체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 단백질 발현 또는 정량 분석용 PYP 단백질 및 PYP 단백질을 이용하는 단백질 발현 또는 정량 분석 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 단백질 발현 또는 정량 분석 방법은 빠르고 정확하게 목적 단백질의 발현을 알 수 있고 간편하게 정량 및 순도를 측정할 수 있다. 또한 본 발명은 태그 시스템을 혼용하여도 아무런 문제가 발생하지 않으며, 원핵생물 뿐만 아니라 진핵생물의 단백질 발현 시스템에서도 적용이 가능하다. 이러한 특성 때문에 초고속 단백질 발현 스크리닝에 최고의 유용성을 가진다. 따라서 본 발명의 단백질 발현 또는 정량 분석 방법은 단백질의 관련 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 PYP 단백질을 이용하는 목적 단백질의 분석방법, 및 이에 이용되는 PYP 변이체 단백질에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 PYP 또는 PYP 변이체를 이용하는 목적 단백질의 발현검출, 정량분석 및 순도분석 방법에 관한 것이며, 그리고 상기 목적 단백질의 발현검출, 정량분석 및 순도분석 방법에 이용되는 PYP 변이체에 관한 것이다.
단백질의 구조 또는 특성에 대해서 연구하려면 흔히 많은 양의 수용성(soluble) 단백질이 필요하다. 단백질 구조 분석, 생화학적 기능, 고분자(macromolecular) 상호작용 또는 친화성 시약의 생산과 같은 단백질 관련 연구에서 다량의 수용성 형태의 원하는 단백질을 만드는 것은 필수단계이다. 이러한 많은 양의 단백질을 얻기 위해서는 E.coli나 곤충 세포(insect cell) 혹은 포유동물 세포(mammalian cell)와 같은 특정 세포에서 재조합 단백질을 과량발현시켜 분리하는데, 이때 세포에서 목적 단백질(target protein)이 어느 정도 발현되고 수용성 형태로 되는지 확인하는 것은 필수불가결한 단계이다. 일반적으로 재조합 단백질의 발현양과 그 순도를 알기 위해서 PAGE-젤(gel)을 이용한다. 보통 단백질을 클로닝하고 발현 테스트를 한 후 정제하기까지 수차례의 PAGE 젤을 이용하게 된다. 그리고 이 경우 PAGE 젤을 만들고, 단백질을 전처리 후 PAGE 젤 런닝을 위한 셋팅을 하며, 런닝하고 염색(staning) 및 탈색(destaing)을 하게 되고 또한 젤 사진을 확인하는 과정을 거치게 되므로, 많은 기구가 필요하고 시간도 많이 소요된다. 한편 초고속 단백질 발현 스크리닝(high throughput protein expression screening)을 위해서 dot blot이라는 면역분석 방법이 종래 제시되어 있다. 그러나 상기 면역분석 방법 역시 PAGE 젤과 마찬가지로 시간이 많이 소요되거나 타겟 단백질의 양이나 순도를 정확히 알 수 없는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 상술한 종래 단백질 분석방법의 단점을 극복하기 위해 예의 노력한 결과, PYP 단백질을 융합 파트너로 목적 단백질과 함께 발현시킬 경우, 빠르고 정확하게 그리고 원스텝으로 목적 단백질의 발현 여부를 알 수 있고 간편하게 발현유무 확인, 정량 및 순도를 분석할 수 있음을 확인하고서 본 발명을 완성하였다.
Imamoto, Y., et al., Reconstitution photoactive yellow protein from apoprotein and p-coumaric acid derivatives. FEBS Lett, 1995. 374(2): p. 157-60.
Kumauchi, M., et al., Identification of six new photoactive yellow proteins-diversity and structure-function relationships in a bacterial blue light photoreceptor. Photochem Photobiol, Photochem Photobiol, 2008. 84(4): p. 956-69.
Losi, A., et al., Hydrogen-bond network probed by time-resolved optoacoustic spectroscopy: photoactive yellow protein and the effect of E46Q and E46A mutations. Physical Chemistry Chemical Physics, 2005. 7(10): p. 2229-2236.
본 발명의 목적은 종래 단백질 분석 방법보다 빠르고 간편한, 목적 단백질의 발현검출 방법, 정량분석 방법, 및 순도분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 목적 단백질의 발현검출, 정량분석, 순도분석에 사용되는 PYP 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 야생형 또는 PYP 변이체를 발현하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현검출 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 야생형 또는 PYP 변이체를 발현하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 정량분석 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 야생형 또는 PYP 변이체를 발현하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 순도분석 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 목적 단백질의 발현검출, 정량분석 또는 순도분석에 사용하기 위한 PYP 변이체를 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양상은 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 야생형 또는 PYP 변이체를 발현하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현 검출 방법에 관한 것이다.
일 구체예에 따르면, 상기 목적 단백질의 발현검출 방법은 목적 단백질의 유전자 양말단 중 하나 이상에 PYP 또는 PYP 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 준비하는 단계; 상기 재조합 벡터를 발현시켜 목적 단백질 및 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 단백질 또는 PYP 변이체 단백질을 발현하는 단계; 상기 발현된 단백질에 발색단을 반응시키는 단계; 및 발현된 단백질의 발현 여부를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적 단백질의 발현 검출 방법에 있어서, 상기 PYP 변이체는 PYP의 빛의 흡수도를 높인 변이체일 수 있으며, 또는 PYP 야생형 또는 PYP의 빛의 흡수도를 높인 변이체의 말단이 제거된 변이체 일 수 있다. 상기 말단의 제거는 N-말단으로부터 1 내지 41개 이하의 아미노산이 결실, C-말단으로부터 1 내지 53개 이하의 아미노산이 결실 및 이들의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 PYP 변이체는 PYP 야생형 또는 PYP의 빛의 흡수도를 높인 변이체의 N-말단으로부터 27개의 아미노산이 결실되고 C-말단의 18개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 상기 빛의 흡수도를 높인 변이체는 예를 들면 E46Q(46번째의 아미노산 글루타민(E)이 글루타믹산(Q)으로 변형), E46T(46번째의 아미노산 글루타민(E)이 트레오닌(T)으로의 변형), Y42F(42번째의 아미노산 티로신(Y)이 페닐알라닌(F)으로의 변형)일 수 있다.
상기 목적 단백질의 발현여부 분석은 시각으로 확인 또는 흡광도의 측정을 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 야생형 또는 PYP 변이체를 발현하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 정량분석 방법에 관한 것이다.
일 구체예에 따르면, 상기 목적 단백질의 정량분석 방법은 목적 단백질의 유전자의 양말단 중 어느 하나 이상에 PYP 또는 PYP 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 준비하는 단계; 상기 재조합 벡터를 발현시켜 목적 단백질 및 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 단백질 또는 PYP 변이체 단백질을 발현하는 단계; 상기 발현된 단백질에 발색단을 반응시키는 단계; 및 목적 단백질의 양(농도)을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적 단백질의 정량분석 방법에 있어서, 상기 PYP 변이체는 PYP의 빛 흡수도를 높인 변이체일 수 있으며, 또는 PYP 야생형 또는 PYP의 빛 흡수도를 높인 변이체의 말단이 제거된 변이체 일 수 있다. 상기 말단의 제거는 N-말단으로부터 1 내지 41개 이하의 아미노산이 결실, C-말단으로부터 1 내지 53개 이하의 아미노산이 결실 및 이들의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 PYP 변이체는 PYP 야생형 또는 PYP의 빛 흡수도를 높인 변이체의 N-말단으로부터 27개의 아미노산이 결실되고 C-말단의 18개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
그리고 상기 목적 단백질의 양(농도)의 분석은 시각으로 확인 또는 흡광도의 측정을 통해 확인할 수 있다. 상기 정량분석에 있어서 목적 단백질의 농도를 흡광도의 측정을 통해 분석할 경우, 하기식을 사용하여 농도를 분석할 수 있다.
농도(concentration) = AK / L (mM)
상기 농도 계산 식에서, AK 는 K nm에서의 흡광도 값을 나타낸다. PYP가 야생형일 경우, K는 445 이고, L은 45.5 이며, PYP가 빛 흡수도를 높인 변이체일 경우, K는 460 이고, L은 53.8 이다. 이때 측정을 위한 샘플 큐벳의 길이는 1cm이다
PYP(광활성화 노랑 단백질, photoactive yellow protein)는 Halorhodospirahalophila(H.halophila)종에서만 발현되는 단백질로 파란색의 빛을 흡수한 후 구조가 변화하여 H.halophila의 빛에 의한 신호전달에 관여하는 단백질이다[Kim, T.W., et al.,Journal of the American Chemical Society, 2012. 134(6): p. 3145-3153. Kumauchi, M., et al. Photochem Photobiol, 2008. 84(4): p. 956-69. McRee, D.E., et al., J Biol Chem, 1986. 261(29): p. 13850-1.]. PYP 단백질은 크기가 작고(14.4kD 이하), 매우 수용성인 단백질이며, 특정 종을 제외한 다른 종에서는 발견되지 않아서 PYP가 결핍된 세포를 만들지 않아도 되므로 태깅(Tagging)을 위한 단백질로 적합하다.
PYP 단백질은 파라-쿠마린산(p-coumaric acid)을 발색단(chromophore)으로 가지는데 유리(free) 발색단과 발색단이 붙지 않은 아포(apo) 상태의 단백질에서는 가시광선 영역에서의 흡수가 없지만, PYP 단백질과 발색단 두개가 결합되어 있는 전(holo) PYP 는 가시광선 영역에서 강한 흡수를 하게 된다. 즉 오프-온(OFF-ON) 시스템으로 적합하다[Imamoto, Y., et al., FEBS Lett, 1995. 374(2):p. 157-60.]. 따라서 PYP가 발현된 후 발색단이 결합하게 되면 가시광선 영역에서(주로 파란색) 강한 흡수가 일어나 PYP가 발현된 용액이 노란색을 띄며, 이는 시각으로 확인이 가능하다. 가시광선 영역에서 흡수대를 가지는 다른 단백질과는 다르게 크기가 작고, 발현율 및 용해도가 좋기 때문에 목적 단백질의 발현과 용해도에 전혀 문제를 주지 않는다. 심지어는 목적 단백질과 함께 발현될 경우 목적 단백질의 발현과 용해도의 증가를 도와주기도 한다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이 목적 단백에 PYP가 융합되어 있을 때 PYP가 융합되어 있지 않은 것에 비해서 좋은 발현율을 보인다. 따라서 본 발명에 따른 PYP를 융합하는 단백질의 분석 방법이 목적 단백질에 발현율과 용해도를 향상시켜 단백질의 분석에 더욱 유리한 것임을 알 수 있다.
상술한 PYP의 장점을 이용하여 본 발명에서는 목적 단백질의 양 말단에 PYP 단백질을 융합하여 함께 발현시키는 것에 의해 목적 단백질의 발현여부, 정량분석 또는 순도분석 등의 단백질 분석방법에 PYP를 사용한다.
상기 목적 단백질의 발현검출, 정량분석 또는 하기 순도분석에 사용되는 PYP는 PYP 야생형일 수 있으며, PYP 변이체일 수 있다. 상기 PYP 변이체는 야생형 PYP 단백질의 말단의 일부가 제거된 PYP 변이체일 수 있으며, 빛의 흡수도를 높인 PYP 변이체, 예를 들면 E46Q(46번째의 아미노산 글루타민(E)이 글루타믹산(Q)으로 변형), E46T(46번째의 아미노산 글루타민(E)이 트레오닌(T)으로의 변형), Y42F(42번째의 아미노산 티로신(Y)이 페닐알라닌(F)으로의 변형), 또는 상기 빛의 흡수도를 높인 PYP 변이체의 말단의 일부가 제거된 변이체일 수 있다. 또한 본 발명의 목적을 달성하기 위해 당업자가 용이하게 도출가능한 빛의 흡수도를 높인 PYP 변이체들을 사용한 단백질 분석방법이 본 발명의 권리범위에 포함되는 것은 자명하다.
상기 말단의 일부가 제거된 PYP 변이체에서 상기 말단의 일부의 제거는 바람직하게는 PYP 야생형 또는 상기 빛의 흡수도를 높인 PYP 변이체의 N-말단으로부터 1 내지 41개 이하의 아미노산의 결실, C-말단으로부터 1 내지 53개 이하의 아미노산의 결실 및 이들의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있다. N- 말단의 42개 이상의 아미노산이 결실되거나 또는 C 말단 54개 이상의 아미노산이 결실되는 경우에는 발색단을 첨가하더라도 색의 변화가 극히 짧아서 발현양이나 순도 분석용으로는 부적합하다.
더욱 바람직하게는 상기 말단의 일부가 제거된 PYP 변이체는 PYP 야생형 또는 상기 빛의 흡수도를 높인 PYP 변이체, 예를 들면, E46Q 의 N-말단으로부터 27개의 아미노산이 결실되고 C-말단의 18개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
양 말단이 모두 결실된 변이체는 단지 수초 이내로만 노란색을 유지할 정도로 색의 변화가 불안정하다. 그러나 이 중 유일하게 N-말단으로부터 27개 이하의 아미노산이 결실되고 C-말단으로부터 18개 이하의 아미노산이 결실된 변이체 만이 수분 동안 노란색을 유지한다. 따라서 PYP 야생형 또는 상기 빛의 흡수도를 높인 PYP 변이체의 N-말단으로부터 27개의 아미노산이 결실되고 C-말단으로부터 18개의 아미노산이 결실된 PYP 변이체는 파라- 쿠마린 산을 발색단으로 가질 수 있는 가장 작은 단위의 PYP 변이체이다.
그러나 정확한 농도와 순도를 알기 위해서는 N-말단으로부터 18개 이하의 아미노산이 결실된 변이체를 사용하는 것이 바람직하다. 다른 결실 변이체들은 색이 몇분 내로 없어지는 반면, N-말단으로부터 18개 이하의 아미노산을 제거한 PYP 변이체는 색변화가 계속 유지되었다(도 7 참조).
본 발명의 또 다른 양상은 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 또는 PYP 변이체를 발현하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 순도분석 방법에 관한 것이다.
일 구체예에 따르면 상기 목적단백질의 순도분석 방법은 목적 단백질의 유전자의 양말단 중 어느 하나 이상에 PYP 또는 PYP 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하고 있는 재조합 벡터를 준비하는 단계; 상기 재조합 벡터를 발현시켜 목적 단백질 및 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 단백질 또는 PYP 변이체 단백질을 발현하는 단계; 상기 발현된 단백질에 발색단을 반응시키는 단계; 발현된 단백질의 흡광도를 측정하여 분석하는 단계; 및 하기식을 사용하여 순도를 계산하는 단계;를 포함할 수 있다.
순도 = target protein 발현양 / 전체 protein 양
상기 식에서, Ax 는 X nm 에서의 흡광도, A280은 280 nm 에서의 흡광도이며, M 은 목적 단백질의 질량을 나타낸고; Z는 PYP의 분자량을 가리킨다(PYP 야생형의 경우, Z는 14400이며, PYP 변이체 (돌연변이 및/또는 결실)이 일어날 경우, 그 PYP 변이체의 분자량이다).
여기서, PYP 야생형을 사용할 경우, X는 445이며, Y는 44.5 이고;
빛 흡수도를 높인 PYP 변이체를 사용할 경우, X는 460 이며, Y는 53.8 이다.
또한 순도 계산식은 DNA가 샘플과 같이 있을 경우 다음의 식에 의해서도 계산 될 수 있다.
순도 = 발색단을 넣은 후 분획의 (AX/ Y)*(Z + target protein molecular weight)mg/ml / 발색단을 넣기 전 분획의 (1.55*A280-0.76*A260) mg/ml*
Ax 는 X nm 에서의 흡광도, A280은 280 nm 에서의 흡광도, A260은 260nm에서의흡광도이며, MW는 목적 단백질의 질량을 나타낸다. Z는 PYP의 분자량을 가리킨다. (PYP 야생형의 경우, Z는 14400이며, PYP 변이체 (돌연변이 및/또는 결실)이 일어날 경우, 그 PYP 변이체의 분자량이다)
여기서, PYP 야생형을 사용할 경우, X는 445 이며, Y는 44.5 이고; 흡수도를 높인 PYP 변이체를 사용할 경우, X는 460 이며, Y는 53.8 이다.
또한 상기 식에서 유리 발색단은 280nM 흡광도에 영향을 미치므로 정확한 280nm 대의 흡광도를 알기 위해서는 여분의 발색단이 없는 분획을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 목적 단백질의 발현검출, 정량분석, 순도분석 방법에 있어서, 상기 발색단은 파라-쿠마린산, 파라-쿠마린산무수물, 및 파라-쿠마릴 씨오페닐에스테르로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 최종 산물로 파라-쿠마린산이 되게하는 화합물은 모두 상기 발색단으로 사용가능하다.
본 발명에 따라 목적 단백질(target protein)의 말단에 PYP를 융합하여 발현시, PYP는 발색단이 없는 상태로 동시 발현이 된다. 이때 발현 여부 및 정량을 원하는 경우 발색단을 넣어 주면 색을 띄게 되고 이는 시각적으로 확인이 가능하다. 처음부터 색이 있는 태그가 발현되면 그 색이 오염 또는 어떤 다른 원인이나 혹은 세포 자체의 같은 색을 가지는 단백질 혹은 피그먼트에 의한 것인지 목적 단백질에 의한 것인지 알기 어려우나, 본 발명에 따라 단백질을 발현시킨 후에 발색단을 넣어주는 턴 오프/온(turn off/on)시스템에 의한 단백질 발현 또는 정량 분석방법은 오염 등에 의한 것과 진짜 목적 단백질과 융합된 PYP에 의한 색변화 혹은 흡광도 변화인지를 정확한 구분이 가능하게 한다. 따라서 이하 본 발명의 명세서 내에서 목적 단백질에 PYP가 융합된 것을 PYP Off/On Tag Label이라는 뜻으로 POOL이라 지칭할 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법은 PAGE gel runnung 키트, western blotting 키트, visualizer 및 gel picturing machines 등의 여러 기구가 필요 없이 단순히 색 변화를 관찰함으로써 목적 단백질의 발현여부 또는 대략적인 발현양을 알 수 있다. 또한, 분광광도계(spectrophotometer) 예를 들면, UV-VIS 분광광도계 또는 가시분광광도계(visible spectrophotometer) 를 사용하면 정확하게 정량 및 순도 분석이 가능하다. 정제시 원하는 단백질이 가시광선 영역에서 눈에 보이기 때문에 단지 색을 보고 비색대조법을 이용해서 목적 단백질이 원하는 농도 이상이 있다고 예상되는 분획을 선별 후 정밀한 정량과 순도를 측정하기 위해서 UV-VIS 스펙트럼을 측정할 수 있다. 또는 각각의 분획을 24-웰 플레이트, 96-웰 플레이트 등에 옮겨서 마이크로플레이트 흡수도 측정기를 이용하여 측정하면 한번에 모든 분획의 목적 단백질의 양과 순도가 측정가능하다.
PYP의 흡광도는 매우 잘 정량화되어있다(야생형 PYP의 흡광계수는 445nm에서 45,500M-1/cm-1을 가진다. E46Q 돌연변이의 경우는 460nm에서 53,800M-1/cm-1을 가진다)[Losi, A., et al., 2005. 7(10): p. 2229-2236.]. 가시광선 영역에서 충분한 흡수 피크를 가지므로 적은 양이라도 UV-VIS 분광기를 사용하면 검출이 가능하며, 정확한 양을 알 수 있다. 흡광도 0.001까지의 감도를 보면 288ng/ml의 PYP 농도변화까지 확인이 가능하다. 분자량으로는 22.5nM 정도의 민감도를 가진다. 이는 SDS-PAGE gel의 최저 검출 기준이 2mg/L 인 것에 비해 거의 10배에 해당하는 높은 민감도를 갖는 것이다. 또한 단백질의 정제 단계에서 각각의 분획(fraction)의 색과 280nm와 445nm 흡광도비를 이용해서 다른 오염물질 및 단백질 대비 목적 단백질의 정확한 순도와 함량을 알 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 목적 단백질의 분석방법에 따르면, 용액 상의 목적 단백질의 농도 및 순도를 간편히 알 수 있어서 단백질 분리시 PAGE gel running 없이 빠르게 원하는 분획을 골라낼 수 있다. 도 9는 분리 단계별로 순수해지는 목적 단백질의 농도 및 순도를 각각 PAGE 젤과 비색대비관찰(colorimetric), UV-VIS 스펙트럼으로 비교해서 나타낸 것이다. 즉 본 발명에 따른 단백질 발현 검출, 정량 분석 방법, 단백질 순도 분석 방법에 의하면 목적 단백질에 대하여 PAGE -젤보다도 더 효율적으로 짧은 시간에 분석이 가능하다.
상기 목적 단백질의 발현 검출, 정량 분석 방법, 단백질 순도 분석 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 PYP 유전자와 목적 단백질 유전자의 사이에 프로테아제 인식 부위를 포함할 수 있다. 프로테아제 인식 부위를 포함함으로써 이후에 PYP 단백질을 쉽게 제거가 가능하다. 또한 친화성 태그, 예를 들면 His 태그가 있는 프로테아제를 사용하면 이후에 단백질을 His 태그로 분리할 때 프로테아제도 한번에 분리가 가능해진다. 뿐만 아니라 비오틴화된 트롬빈(Biotinylated Thrombin)을 사용하여 스트렙트아비딘 아가로즈(streptavidin agarose)로 제거할 수도 있다. 더욱 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 도 2에 도시된 개열 지도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 목적 단백질의 발현 검출, 정량 분석, 순도 분석에 이용되는 PYP 변이체에 관한 것이다.
상기 본 발명의 또 다른 양상인 PYP 변이체는 PYP 야생형 또는 PYP의 빛 흡수도를 높인 변이체의 말단이 제거된 것으로, 상기 말단의 제거는 N-말단으로부터 1 내지 41개 이하의 아미노산이 결실, C-말단으로부터 1 내지 53개 이하의 아미노산이 결실, 및 이들의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 PYP 변이체는 PYP 야생형 또는 PYP의 흡수도를 높인 변이체의 N-말단의 27개의 아미노산이 결실되고 C-말단의 18개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 PYP 변이체는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 PYP 빛 흡수도를 높인 변이체는 하나 이상의 아미노산에서 치환이 일어난 것일 수 있으며, 바람직하게는 E46Q, E46T, Y42F 로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 발현검출 또는 정량분석, 순도분석에 사용되는 PYP 변이체는 단백질 정제시 용이하게 이용할 수 있는 태그(Tag)가 결합될 수 있다. 상기 태그는 친화성 태그일수 있으며, 바람직하게는 His-태그 일 수 있다. 그러나 이에 한정하지 않으며, 당업자가 자명하게 사용할 수 있는 태그는 모두 포함된다.
또한 본 발명은 상기 PYP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어질 수 있다.
또한 본 발명은 상기 PYP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열을 가질 수 있다. 또한 상기 재조합 벡터는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 이외에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 PYP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 융합되어 함께 발현될 수 있도록 상기 재조합 벡터에 포함되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 도 2에 도시된 개열지도로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 목적단백질에 PYP 단백질이 융합되어 발현시킬 수 있도록 함에 따라 목적단백질의 생산 및 분석 등에 있어서 매우 유용하다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 분석방법들은 발색단 첨가만으로 단백질의 발현 유무와 정량이 가능하며, 이는 E.Coli 뿐만 아니라 곤충세포, 포유동물 단백질 발현 시스템에서도 동일하게 적용될 수 있다. 또한 단백질을 분리시 오로지 색을 보고 단백질이 포함된 분획을 선택할 수 있어서 빠르게 정제할 수 있게 도와준다. 더 나아가서 본 발명의 단백질 분석방법을 이용하면 초고속 단백질 발현 스크리닝시 많은 수의 샘플에 대한 단백질 발현량, 순도 등을 아주 간단하게 확인할 수 있다. 또한 본 발명은 다른 태그 시스템하고 상보적으로 같이 써도 아무런 문제가 없으므로, 단백질연구를 위한 단백질 준비에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 단백질 발현 또는 정량 분석의 원리를 나타내는 모식도이다.
도 2는 PYP 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 발현 벡터를 나타낸 것으로, a)는 PYP가 목적 단백질의 N- 말단에 위치하고, b)는 PYP가 목적 단백질의 C-말단에 위치한다. PYP는 PYP의 야생형 또는 PYP 변이체일 수 있다.
도 3은 발색단(chromophore)을 넣기 전 후의 용액 색상 비교 및 UV-VIS 분광기 데이터를 나타낸다. A는 PYP의 유무에 따른 발색단 첨가시 색의 변화를 나타낸 것이며, B는 A 용액 ① 내지 ③의 UV-VIS 스펙트럼을 나타낸 것이다. C는 비색검정(colorimetric) 방법을 할 때 농도를 비교하기 위한 표준용액이다.
도 4는 PYP 단백질을 융합한 목적단백질을 순수 분리할 때 Q-column work 수행 후 받은 분획의 PAGE 젤 결과(A), 분획의 색(b) 및 UV-VIS 분광계 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 5는 진핵생물(eukaryote)인 곤충세포(A)와 포유동물 293 세포(B)에서 TLR3과 CD40에 본 발명의 PYP 단백질을 융합시켜 발현한 후, 발색단을 첨가하여 TLR3와 CD40의 존재 유무를 확인한 사진이다.
도 6은 인간 칼모듈린(calmodulin) 단백질의 고성능 단백질 발현 스크리닝 결과를 나타낸 것으로, 발색단을 첨가 전(A) 및 첨가 후(b)의 사진이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 각각의 PYP 변이체에 대해 발색단 첨가한 후 그 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 PYP 단백질이 존재 유무에 따른 인간 칼모듈린에서의 용해성 단백질의 발현량 차이를 나타낸 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 9는 정제과정에서 타겟 단백질의 순도를 각 단계별로 분획의 색변화(A), PAGE 젤(B)과 UV-VIS 스펙트라 데이터(C)를 비교한 결과이다.
도 2는 PYP 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 발현 벡터를 나타낸 것으로, a)는 PYP가 목적 단백질의 N- 말단에 위치하고, b)는 PYP가 목적 단백질의 C-말단에 위치한다. PYP는 PYP의 야생형 또는 PYP 변이체일 수 있다.
도 3은 발색단(chromophore)을 넣기 전 후의 용액 색상 비교 및 UV-VIS 분광기 데이터를 나타낸다. A는 PYP의 유무에 따른 발색단 첨가시 색의 변화를 나타낸 것이며, B는 A 용액 ① 내지 ③의 UV-VIS 스펙트럼을 나타낸 것이다. C는 비색검정(colorimetric) 방법을 할 때 농도를 비교하기 위한 표준용액이다.
도 4는 PYP 단백질을 융합한 목적단백질을 순수 분리할 때 Q-column work 수행 후 받은 분획의 PAGE 젤 결과(A), 분획의 색(b) 및 UV-VIS 분광계 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 5는 진핵생물(eukaryote)인 곤충세포(A)와 포유동물 293 세포(B)에서 TLR3과 CD40에 본 발명의 PYP 단백질을 융합시켜 발현한 후, 발색단을 첨가하여 TLR3와 CD40의 존재 유무를 확인한 사진이다.
도 6은 인간 칼모듈린(calmodulin) 단백질의 고성능 단백질 발현 스크리닝 결과를 나타낸 것으로, 발색단을 첨가 전(A) 및 첨가 후(b)의 사진이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 각각의 PYP 변이체에 대해 발색단 첨가한 후 그 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 PYP 단백질이 존재 유무에 따른 인간 칼모듈린에서의 용해성 단백질의 발현량 차이를 나타낸 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 9는 정제과정에서 타겟 단백질의 순도를 각 단계별로 분획의 색변화(A), PAGE 젤(B)과 UV-VIS 스펙트라 데이터(C)를 비교한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
<
실시예
1>
PYP
단백질과 목적 단백질의 융합을 위한
클로닝
목적 단백질과 PYP 단백질을 클로닝하기 위한 벡터로 pQE 벡터 시스템(pQE80, pQE30)을 사용하였다. 그 각각의 벡터에 PYP 유전자를 삽입하고 정지코돈없이 SalⅠ제한 효소 인식 사이트를 넣었다. 여기에 프로테아제 인식 사이트와 목적 단백질을 클로닝하였다. 목적 단백질은 칼모듈린(calmodulin)과 SUMO(small ubiquitin-related modifier), 말 미오글로빈(horse Myoglobin), MerP(mercury binding peptide)을 사용하였으며, 각각을 pQE80, pQE30 vector에 삽입하였다.
1)
POOL
-
칼모듈린
클로닝
POOL-calmodulin cloning pQE80L vector을 BamHⅠ과 SalⅠ으로 잘라내 다음 PYP 유전자를 PCR을 이용해서 증폭하였다. 이때 PYP다음에 정지 코돈은 넣지 않았다. BamHⅠ과 SalⅠ사이트를 포함하는 프라이머로 정방향 프라이머는 5'-CACCATCACGGATCCATGGAACACGTAGCCTTCGG-3＇ 역방향 프라이머는 5'-TGGCTGCAGGTCGACGACGCGCTTGACGAAGACCC-3 을 사용하였다. 그리고 PYP를 EZ-Cloning kit(enzynomicsTM)을 이용하여 서브클로닝(Subcloning)하였다. 다음 칼모듈린 염기서열을 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이때 프라이머에 트롬빈 사이트(thrombin site)가 들어가게 디자인하였다. 각각의 프라이머는 정방향 프라이머인 5'-AAGCGCGTCGTCGACGGCAGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCATGGCTGATCAGCTGACCGA-3'와 역방향 프라이머인 5'-TGGCTGCAGGTCGACCTATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAA -3'을 사용하였다. PYP를 서브클로닝한 플라스미드를 다시 SalⅠ으로 처리하여 자른 후 다시 EZ cloning kit을 이용하여 위의 트롬빈-칼모듈린을 서브클로닝하였다.
pQE30 벡터에도 같은방법으로 클로닝하였다. 단 이때는 SalⅠ대신 BglⅡ을 이용하였다.
2) POOL -말 미오글로빈( horse Myoglobin ) 클로닝
pQE30-his-EK-pyp를 BamH I과 Bgl II로 컷팅하였다. 그리고 PYP을 마지막 정지코돈(TAG)없이 PCR을 이용하여 증폭하였다. BaHⅠ을 포함하는 정방향 프라이머로5'-CACCATCACGGATCCGATGACGATGACAAAATGGAACACGTAGCCTTCGG -3'를 사용하였고, 역방향 프라이머로 5'-GCTGCCGCGCGGCACCAGGACGCGCTTGACGAAGACCC-3'를 사용하였다. 역방향 프라이머는 트롬빈 사이트를 포함하였다. 동시에 horse Mb 유전자를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이때 앞부분에 트롬빈 사이트가 들어가게 하였다. Primer는 정방향 프라이머로 5'-CTGGTGCCGCGCGGCAGCGGCCTGAGCGATGGCGAATG-3' 사용하였고, 여기에는 Bgl2 site가 포함된다. 위 3개의 단편(fragment)을 EZ-Cloning kit (EnzynomicsTM)을이용 3 단편(fragment) 클로닝을 하였다.
3)
SUMO
-
PYP
cloning
보유하고 있었던 SUMO-swMb가 clone된 pQE30 벡터를 이용하여, 이것을 site direct mutagenesis로 swMbgene을 제거하였다. 이때 PYP 클로닝을 위해서 Kpn1 site을 넣었다. 정방향 프라이머는 5'-GGTACCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAG-3' 를 사용하였고, 역방향 프라이머로는 5'-CCACCAATCTGTTCTCTGTGAGCCTCAATAATATCG-3' 를 사용하였다. 이후 완성된 clone을 KpnⅠ로 처리하여 EZ-Cloning 용 벡터를 제작하였다. 이와 동시에 PYP 유전자를 PCR을 통해서 증폭하였다. 이때 프라이머는 정방향 프라이머 5'-GAACAGATTGGTGGGATGGAACACGTAGCCTTCGG-3' 와 역방향 프라이머 5'-GCAGGTCGACGGTACCTAGACGCGCTTGACGAAGAC-3' 을 이용하여 PYP 유전자와 위의 KpnⅠ처리된 벡터를 EZ-Cloning kit으로 클로닝하였다.
<
실시예
2>
PYP
를 이용한 단백질 발현 여부 확인
상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드로 E.coli BL21( SUMO-PYP, 도 3 A), insect cell (TLR-PYP, 도 5 A)및 mammalian 293 cell(CD40-PYP, 도 5B)를 형질 전환하여 PYP가 라벨된(융합된) 목적 단백질을 발현시켰다.
PYP와 목적 단백질이 융합되어서 발현된 용액에 발색단 용액[Imamoto, Y., et al., Reconstitution photoactive yellow protein from apoprotein and p-coumaric acid derivatives . FEBS Lett, 1995. 374(2): p. 157-60 에 공지됨]을 최종 농도 2~10%로 넣어 주어서 목적 단백질의 존재 유무와 대략적인 정량을 비색대조법을 이용하여 시각으로 관찰하였다.
그 결과는 도 3A, 및 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 발색단을 넣기 전 후의 용액의 색상 변화가 확연히 차이남에 따라 목적 단백질의 발현 여부를 확인할 수 있었다. 또한 이는 원핵생물 뿐만 아니라 진핵생물인 insect cell 및 mammalian cell 에서도 안정적으로 본 발명의 PYP를 이용하여 단백질 발현 여부 확인이 가능함을 나타낸다. 특히 mammalian 293 cell에서 발현시킨 CD40 수용체 단백질은 막 단백질로 일반적으로 발현양이 작은데도 불구하고 색변화를 이용하여 발현 여부를 관찰할 수 있었다.
<
실시예
3> 단백질 정량 분석 및 순도 분석
본 발명에 따른 목적 단백질의 정량 분석을 위해 실시예 1에서 제조한 SUMO-PYP 플라스미드를 발현시킨 후, 그 발현 용액에 발색단을 넣어서 색의 변화를 관측하고 UV-VIS 스펙트럼을 측정하였다(도 2). 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, PYP 융합 단백질을 발현시킨 용액은 발색단을 넣어주기 전에는 아무런 색이 없었고 또한 UV-VIS 스펙트럼에서 445nm 지역 근처에서 어느 피크도 보이지 않았다. 여기에 발색단을 넣어 주었을 때 샘플의 색이 노란색을 띄었고, UV-VIS 스펙트럼 상에서도 450nm 근처에서 확실한 피크가 나타났다. 그러나 대조군으로 엔테로카이네이즈만 발현된 용액은 발색단을 넣더라도 색의 변화가 없었고, UV-VIS 스펙트럼 상에 445nm부분에 어떤 흡수 피크도 관찰되지 않았다.
색 변화만을 이용하여 목적 단백질의 대략적인 정량을 하였다. 먼저 표준 용액을 만들어서 그 표준 용액과 용액의 색을 비교하였다(도 3C). 도 3C의 표준용액과 발색단을 첨가한 발현된 SUMP-PYP를 비교해보면 10㎛과 60㎛사이에 있는 것으로 확인되었다. 정확한 정량을 위해서 UV-VIS 스펙트럼의 결과로 계산해 보았을 때, SUMO-POOL은 445nm에서 0.022를 가지므로 희석배수 20을 곱하여 계산하면 목적 단백질 양은 0.03mm이었다. 이는 비색대조법과 비슷한 결과로 본 발명에 따른 단백질 정량방법은 비색대조만으로도 대략적인 정량이 가능하다는 것을 보여주는 것이다.
또한 발현된 단백질을 정제 후 목적 단백질의 순도를 알기 위해서 실시예 1에서 제조한 PYP가 융합된 목적 단백질 SUMO를 발현시킨 후 Q-column 으로 정제 과정을 수행한 다음, 수득한 분획들 중 임의분획을 선별하여 UV-VIS 스펙트럼을 이용하여 280nm와 445nm의 흡광도를 측정하였다(도 4). 460nm(maximum peak이target protein fusion에의해 shift되었다)에서의 흡광도는 0.187이고 280에서의 흡광도는 0.275이었다. 이후 하기의 공식을 사용하여 목적 단백질의 정확한 순도를 계산하였다. UV-VIS 스펙트럼을 찍을 시 발색단을 넣은 분획의 정확한 측정을 위하여 발색단만 넣은 버퍼로 베이스 라인을 잡았다.
순도 = target protein 발현양 / 전체 protein 양
= 발색단을 넣은 후 fraction의 (A445/44.5)*(14.400+target protein molecular weight)mg/ml / 발색단을 넣기 전 fraction의 (1.55*A280-0.76*A260) mg/ml*
* free chromophore는 280nm 흡광도에 영향을 미치므로 정확히 280nm대의 흡광도을 알기 위해서는 여분의 발색단이 없는 분획(fraction)을 써야한다
<
실시예
4> 초고속 단백질 발현 스크리닝
초고속 단백질 발현 스크리닝을 수행하기 위하여 24 웰 플레이트를 이용해서 작은 규모(small scale)로 세포 배양을 수행하였다. 각각의 웰은 각각 다른 배지, 다른 ITPG 농도, 다른 벡터가 사용되었다. 구체적으로 POOL-calmodulin과 POOL이 없는 calmodulin의 최적 발현 조건을 확인할 목적으로 pQE80, pQE30 vector에 POOL-calmodulin, Calmodulin을 각각 서브클로닝한 플라스미드를 사용하였고 ((pQE80-POOL-calmodulin, pQE80-calmodulin, pQE30-POOL-calmodulin, pQE30-calmodulin), 1mM, 0.2mM IPTG 농도를 적용하였다. 또 37도와 18도의 성장 조건을 적용하기 위해 동일한 플레이트를 두개 만들었다. 세포 배양 후 각각의 웰을 초음파처리(sonication)하였다. 그후 플레이트를 원심분리하였다 (HANIL science industrial Co. Ltd, Combi-514R). 이후 상등액을 새로운 플레이트에 옮긴 후, 흡광 마이크로 플레이트 리더(microplate absorbance reader)기 (BIO-RAD Laboratories, Inc. xMarkTM)에서 280nm와 445nm을 측정한 다음 발색단을 넣은 후 다시 microplate absorbance reader기를 이용하여 445nm의 흡광도를 측정하여 정량을 하였다.
그 결과 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 POOL system이 없는 웰에서는 색 변화가 없으며, POOL system이 있는 플라스미드를 발현시킨 웰에서는 pQE80-POOL-Calmodulin의 18도, 0.2mM에서 가장 좋은 발현율을 보인다는 것을 눈으로 간편하게 확인할 수 있었다. 또한 정확한 정량을 위해 445nm에서 흡광도를 측정한 결과 역시 색비교와 일치함을 알 수 있었다(도 6B).
<
실시예
5> 단백질 발현 또는 분석에 이용되는
PYP
변이체
제조
PYP의 N-말단과 C-말단을 삭제하여 크기가 가장 작고, 발현 및 용해도가 좋은 mini-PYP를 만들었다. 즉 chromophore region이 천연형(native form)과 유사한 구조를 가져서 활성 사이트에 발색단의 결합에 의한 탈 양성자화된 파라-쿠마린산(p-cumaric acid)을 형성할 수 있는 최소 구조를 찾았다. 이를 위해 전체 PYP를 12부분으로 나눠서 각부분의 결실 변이체를 만들었다. 구체적으로 N-말단 결실 변이체인 del1~5, del1~10, del1~18, del1~26(F27S), del1~31, del1~40과 또 C-말단 결실 변이체인 del70~125, del107~125, del117~125을 만들었다. 이들은 각각 실시예 1-3의 Sumo-PYP 플라스미드를 PCR을 이용하여 결실 돌연변이를 유발 (EZchangeT Site-directed Mutagenesis kit 사용(EnzynomicsTM ))하였다. 결실 돌연변이 유발할 때 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
| 프라이머 명칭 | Sequence |
| Reverse primer for all deletion N-term mutant | 5＇-CCCACCAATCTGTTCTCTGTGAGCCTCAATAATATC-3＇ |
| Forward primer for del 1~5 mutant | 5＇-TTCGGTAGCGAGGACATCGAGAACACCC-3＇ |
| Forward primer for del 1~10 mutant | 5＇-ATCGAGAACACCCTCGCCAAGATGGAC-3＇ |
| Forward primer for del 1~18 mutant | 5＇-GACGACGGCCAGCTCGACGGC-3＇ |
| Forward primer for del 1~27 mutant | 5＇-TCCGGCGCCATCCAGCTCGACG-3＇ |
| Forward primer for del 1~31 mutant | 5＇-CAGCTCGACGGCGACGGCAACATC-3＇ |
| Forward primer for del 1~40 mutant | 5＇-CAGTACAACGCCGCGCAGGGCG-3＇ |
| Forward primer for del 1~42 mutant | 5＇-AACGCCGCGCAGGGCGACAT-3＇ |
| Forward primer for del 1~46 mutant | 5＇-GGCGACATCACCGGCCGCGA-3＇ |
| Forward primer for del 70~125 mutant | 5＇-GTCTAGGTACCGTCGACCTGCAGCCAAG-3＇ |
| Reverse primer for del 70~125 mutant | 5＇-GCTGTCAGTGCACGGGGCCACG-3＇ |
| Forward primer for del 107~125 mutant | 5＇-GTCTAGGTACCGTCGACCTGCAGCCAAG-3＇ |
| Reverse primer for del 107~125 mutant | 5＇-CTTCACCTTCGTGGGCGTCATTTGGTAAT-3＇ |
| Forward primer for del 118~125 mutant | 5＇-TAGGTACCGTCGACCTGCAGCCAAGC-3＇ |
| Reverse primer for del 118~125 mutant | 5＇-GCTGTCGCCGGAGAGGGCCTTC-3＇ |
각각의 변이체 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 E.Coli BL21(De3)에 형질전환시킨 후 동일한 조건에서 각각의 변이체를 발현시켰다. 동시에 대조군으로서 del 1~42, del 1~46 가 결실된 변이체를 만들었다. 이후 실시예 4의 초고속 단백질 발현 스크리닝 방법을 이용해서 목적 단백질의 발현에 의한 POOL 시스템의 시각에 의한 색변화를 측정하여 가장 발현율이 좋은 변이체를 선별하였다.
그 결과 N-말단 결실 변이체는 del1~31까지 색변화가 확실히 생겼고, C-말단 결실 변이체는 del102~125가 가장 색변화가 뚜렷한 것을 확인할 수 있었다. 또한 다른 변이체들 역시 색변화가 뚜렷이 보임을 확인할 수 있었다. 이와 대조적으로 대조군인 42번과 46번 아미노산이 결실된 변이체(del1~42 및 del1~46)는 색변화가 거의 없었다. 그러나 1~18 아미노산을 제거한 PYP 변이체는 색변화가 계속 유지되는 반면, 나머지 결실 변이체들은 색이 몇분 내로 없어졌으나(도 7), 몇분 간은 색이 유지가 되었기 때문에 단백질 발현 여부 확인용으로 사용이 가능함을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 바탕으로 최소 크기를 가지는 mini-PYP을 만들기 위해서 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 양쪽이 둘 다 제거된 결실 변이체(원래 pyp의 28~106 residue)를 만들었다. 이 mini-PYP는 파라-쿠마린산을 발색단으로 가지는 가장 작은 단위의 단백질로, 발현을 확인하기 위해서 이 mini-PYP을 쓰는 것이 바람직하다. 그러나 정확한 농도 및 순도까지 알기 위해서는 최소 N- 말단의 1~18 아미노산이 결실된 변이체를 사용하는 것이 바람직하다.
<110> Koream Advanced Institute of Science and Technologies
<120> Methods for anylysising target protein using PYP proteins and PYP
mutants therefor
<130> P12110791446
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> Halorhodospira halophila
<400> 1
Met Glu His Val Ala Phe Gly Ser Glu Asp Ile Glu Asn Thr Leu Ala
1 5 10 15
Lys Met Asp Asp Gly Gln Leu Asp Gly Leu Ala Phe Gly Ala Ile Gln
20 25 30
Leu Asp Gly Asp Gly Asn Ile Leu Gln Tyr Asn Ala Ala Glu Gly Asp
35 40 45
Ile Thr Gly Arg Asp Pro Lys Gln Val Ile Gly Lys Asn Phe Phe Lys
50 55 60
Asp Val Ala Pro Cys Thr Asp Ser Pro Glu Phe Tyr Gly Lys Phe Lys
65 70 75 80
Glu Gly Val Ala Ser Gly Asn Leu Asn Thr Met Phe Glu Tyr Thr Phe
85 90 95
Asp Tyr Gln Met Thr Pro Thr Lys Val Lys Val His Met Lys Lys Ala
100 105 110
Leu Ser Gly Asp Ser Tyr Trp Val Phe Val Lys Arg Val
115 120 125
<210> 2
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PYP mutant-1
<400> 2
Phe Gly Ala Ile Gln Leu Asp Gly Asp Gly Asn Ile Leu Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Ala Ala Glu Gly Asp Ile Thr Gly Arg Asp Pro Lys Gln Val Ile Gly
20 25 30
Lys Asn Phe Phe Lys Asp Val Ala Pro Cys Thr Asp Ser Pro Glu Phe
35 40 45
Tyr Gly Lys Phe Lys Glu Gly Val Ala Ser Gly Asn Leu Asn Thr Met
50 55 60
Phe Glu Tyr Thr Phe Asp Tyr Gln Met Thr Pro Thr Lys Val Lys Val
65 70 75 80
<210> 3
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PYP mutant-2
<400> 3
Phe Gly Ala Ile Gln Leu Asp Gly Asp Gly Asn Ile Leu Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Ala Ala Gln Gly Asp Ile Thr Gly Arg Asp Pro Lys Gln Val Ile Gly
20 25 30
Lys Asn Phe Phe Lys Asp Val Ala Pro Cys Thr Asp Ser Pro Glu Phe
35 40 45
Tyr Gly Lys Phe Lys Glu Gly Val Ala Ser Gly Asn Leu Asn Thr Met
50 55 60
Phe Glu Tyr Thr Phe Asp Tyr Gln Met Thr Pro Thr Lys Val Lys Val
65 70 75 80
<210> 4
<211> 243
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PYP mutant-1
<400> 4
ttcggcgcca tccagctcga cggcgacggc aacatccttc agtacaacgc cgcggagggc 60
gacatcaccg gccgcgaccc gaagcaggtc atcggcaaga acttcttcaa ggacgtggcc 120
ccgtgcactg acagcccgga gttctacggc aagttcaagg aaggggtggc ctcgggcaac 180
ctgaacacga tgttcgagta caccttcgat taccaaatga cgcccacgaa ggtgaaggtg 240
cac 243
<210> 5
<211> 243
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PYP mutant-2
<400> 5
ttcggcgcca tccagctcga cggcgacggc aacatccttc agtacaacgc cgcgcagggc 60
gacatcaccg gccgcgaccc gaagcaggtc atcggcaaga acttcttcaa ggacgtggcc 120
ccgtgcactg acagcccgga gttctacggc aagttcaagg aaggggtggc ctcgggcaac 180
ctgaacacga tgttcgagta caccttcgat taccaaatga cgcccacgaa ggtgaaggtg 240
cac 243
Claims (22)
- 삭제
- 목적 단백질의 유전자의 양말단 중 어느 하나 이상에PYP(photoactive yellow protein) 야생형의 말단이 제거된 것으로, 상기 말단의 제거는 N-말단으로부터 18개의 아미노산이 결실, C-말단으로부터 1 내지 53개 이하의 아미노산이 결실된 PYP 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 준비하는 단계;
상기 재조합 벡터를 발현시켜 목적 단백질 및 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 변이체 단백질을 발현하는 단계;
상기 발현된 단백질에 파라-쿠마린산 발색단을 반응시키는 단계;및
상기 발현된 단백질의 발현 여부를 흡광도의 측정을 통해 분석하는 단계;를 포함하는 목적 단백질의 발현검출 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 목적 단백질의 유전자의 양말단 중 어느 하나 이상에 PYP를 코딩하는 유전자를 포함하고 있는 재조합 벡터를 준비하는 단계;
상기 재조합 벡터를 발현시켜 목적 단백질 및 목적 단백질의 융합 파트너로 PYP 단백질을 발현하는 단계;
상기 발현된 단백질에 발색단을 반응시키는 단계;
발현된 단백질의 흡광도를 측정하여 분석하는 단계; 및
하기식을 사용하여 순도를 계산하는 단계;를 포함하는 목적 단백질의 순도 분석 방법.
상기 식에서, Ax 는 X nm 에서의 흡광도, A280은 280 nm 에서의 흡광도이며, M은 목적단백질의 질량을 가리킨다. Z는 PYP의 분자량을 가리킨다(PYP 야생형의 경우, Z는 14400이다).
여기서, PYP 야생형을 사용할 경우, X는 445이며, Y는 44.5 이다. - 삭제
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Applications Claiming Priority (1)
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US20110319603A1 (en) * | 2009-03-10 | 2011-12-29 | Osaka University | Method for fluorescently labeling protein |
-
2013
- 2013-02-27 KR KR1020130021003A patent/KR101527766B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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| US20110319603A1 (en) * | 2009-03-10 | 2011-12-29 | Osaka University | Method for fluorescently labeling protein |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| J. Biochem. 1997, Vol. 121, pp876-880. * |
| J. Biochem. 1997, Vol. 121, pp876-880.* |
| JACS. 2009, Vol. 131, pp. 16610-16611. * |
| JACS. 2009, Vol. 131, pp. 16610-16611.* |
| Phys Chem Chem Phys. 2005, Vol.7, pp.2229-2236. * |
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