CN107129455B - 一种多功能化学交联剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种多功能化学交联剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多功能化学交联剂，所述多功能化学交联剂是由两条反应官能团臂和一条包含亲和官能团和切割位点的臂组成的三臂式结构。本发明进一步提供了所述多功能化学交联剂的制备方法。本发明提供的多功能交联剂水溶性以及稳定性均十分优异，且交联效率高；将其应用于蛋白质分析时，不仅在简单体系如BSA、十个标准蛋白混合物的样品中展现出较好的交联肽段鉴定能力，而且在复杂生物样品中，例如大肠杆菌70S核糖体、大肠杆菌全细胞裂解液以及秀丽隐杆线虫全细胞裂解液都可以鉴定到可观的交联位点，展现出很好的应用价值，为今后研究复杂生物体系蛋白相互作用提供一个强有力的工具。

Description

一种多功能化学交联剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及蛋白质及其功能研究领域，具体涉及一种多功能化学交联剂。
背景技术
蛋白质作为生命的物质基础和生命活动的主要承担者，研究蛋白质的功能对理解生命活动有重要意义。随着人类基因组计划的完成，过去十几年鉴定到的蛋白质数量急剧增加。然而，许多新发现的蛋白质的生理功能仍然不清楚，与研究蛋白质功能密切相关的是蛋白的三维结构以及蛋白-蛋白相互作用。传统的蛋白质结构解析方法X射线晶体学和核磁共振光谱学的分辨率可以达到原子水平。但是这两种方法都需要大量的蛋白质，而且对X射线晶体学而言获取质量很高的大分子量蛋白质或蛋白质复合体的晶体是非常困难的，核磁共振光谱学则要求蛋白质有较好的水溶性，且分子量一般低于30kDa。近年来兴起的一个完全不同的途径是化学交联－质谱鉴定技术。它在大约二十年前就已开辟，但近几年才发展成熟。该技术利用化学交联剂(chemical cross linker)在相互作用的蛋白之间形成依赖于某些类型的氨基酸残基及它们之间的空间距离的共价键，再通过质谱鉴定交联位点；所述整个流程包括(如图1所示)：1)蛋白质与交联剂发生特异性的交联反应；2)将蛋白酶切成肽段；3)质谱分析鉴定交联的肽段。新兴的单分子冷冻电镜－三维重构技术常常不能确定大分子量蛋白质或蛋白质复合体的局部构象，所以也往往与化学交联－质谱鉴定技术结合。
质谱技术的发展极大地推动了化学交联剂的应用，这使得它广泛应用于研究蛋白与蛋白的相互作用。这归功于质谱技术与化学交联剂的结合在研究蛋白与蛋白相互作用领域具有独特的优势，具体包括：1)化学交联剂与相互作用的蛋白质之间是通过不可逆的共价键连接的，理论上可以检测到其它方法很难捕获的瞬时相互作用；2)由于质谱直接分析的是蛋白质水解后的多肽，因此蛋白质或蛋白复合物的大小是不受限制的；3)分析速度快，对样品纯度要求低，而且需要的蛋白在微克级别，具有很高的灵敏度；4)可供选择的化学交联剂种类很多，根据两个反应官能团的差别可分为：氨基—氨基，氨基—巯基，巯基—巯基，巯基—羧基；同时两个反应官能团之间的臂长也可以改变。
尽管已经有很多商业化的化学交联剂，但是由于酶切产物大部分都是普通肽段，而交联肽段所占比例很低，因此在如此复杂的体系中去鉴定交联肽段是一项非常困难的任务。目前大部分交联剂仅仅停留在简单、纯化的蛋白样品分析，对复杂的生物样品并没能显现出太大的解决能力。通过使用生物素对样品进行纯化富集可以实现交联肽段与普通肽段的分离，这将大大减低样品的复杂程度，因此可富集型交联剂是当前发展的重点。同时，在交联剂中引入可切割位点有利于交联肽段在富集中从固相系统上释放，而同位素的引入不仅能帮助交联肽段的鉴定，更使得交联肽段的定量成为可能。然而，简单机械地将这些官能团拼凑在一起有时并不能实现它们自身的价值，不当的累加反而带来负面效果，导致交联剂水溶性降低、交联效率不高、稳定性不好等问题。因此，如何将这些官能团有机地融合在一起，使它们发挥出自身的功能，成为能解决复杂生物样品分析的化学交联剂仍是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种能解决复杂生物样品分析的多功能化学交联剂。本发明提供的多功能化学交联剂是由两条反应官能团臂和一条包含亲和官能团和切割位点的臂组成的三臂式结构，其交联效率高，水溶性以及稳定性均十分优异，尤其对于复杂生物样品进行分析时可以充分发挥其优异的交联效果。
具体而言，本发明提供的多功能化学交联剂具有如下通式的结构：
所述R1、R2基团可与氨基快速高效反应，各自独立地代表酚、α,β-不饱和醛、α-羰基醛、酮、酯、联烯取代酯、酰胺、联烯取代酰胺或活泼酯；所述活泼酯具体为N-羟基丁二酰亚胺或磺酸基取代的N-羟基丁二酰亚胺
本发明通过大量实验发现，与其它基团相比，磺酸基取代的N-羟基丁二酰亚胺(本发明简称为sulfo-NHS)可以显著提高交联剂的水溶性，同时确保其具有较高的交联效率；因此，本发明优选所述R1、R2基团为sulfo-NHS。
所述R3代表可切断基团，在所述交联剂上形成可切割位点，从而在温和的条件下实现高效地断裂。所述R3可选自或光切断基团，如优选为本发明通过大量实验发现，该化学切断基团的反应效率是其他切断基团如：光敏基团的6倍以上，因此作为优选结构；其中，所述代表与R4基团的连接位置。
所述R4代表富集官能团，可选自炔基、叠氮基、烯基硫醚、生物素或其衍生物。对于所述富集官能团而言(如图2所示)，可以直接在相应位置连接生物素或其衍生物从而获得一体式交联剂，也可以在相应位置连接炔基、叠氮基等基团从而获得分体式交联剂，所述分体式交联剂可通过特异性结合将生物素单体连接在交联剂上，最后通过链霉亲和素磁珠等将交联肽段纯化提取出来达到富集的目的。
所述R5代表氢或其同位素，如氘。当使用R5代表氘的交联剂或将R5代表氘的交联剂与R5代表氢的交联剂合用时，可以在质谱图中观察到有特色的同位素离子模式，有助于对低丰度交联的肽段的检测，同时也为交联剂在准确定量领域成为可能。
作为本发明的优选方案，当所述R1、R2基团为sulfo-NHS，且R3为时，可以获得高效率的赖氨酸靶向的可富集交联剂(Lysine-targeted enrichable cross-linker)，本发明将其命名为Leiker。
在此基础上，本发明进一步优选出分体式交联剂Leiker 1，以及一体式交联剂Leiker 2、Leiker 3和d6-Leiker 3，所述d6-Leiker 3是指Leiker 3中的6个氢原子被氘取代。上述各交联剂结构如下所示：
所述Leiker(包括Leiker 1、Leiker 2、Leiker 3以及d6-Leiker 3)的结构特点是：1)含有两个与氨基快速高效反应的sulfo-NHS活性酯官能团；2)包含可用于富集的生物素功能团；3)在温和条件下可以快速高效切断的偶氮苯切割位点；4)还可以在间隔臂上实现同位素标记。与传统的只含有两个反应官能团的交联剂相比，Leiker是可富集、可切割、可同位素标记的新颖多功能交联剂。
本发明进一步提供了多功能化学交联剂的合成方法。
本发明通过大量筛选和实验，非常巧妙的选择了三羧酸化合物作为基本骨架，与可与氨基快速高效反应的基团生成同型三功能团交联剂，在此基础上，把所述同型三功能团交联剂中的一个与氨基快速高效反应的基团替换为含有切割位点并且能实现富集的官能团，从而得到多功能化学交联剂；
以上过程中，所述三羧酸化合物可选用
所述可与氨基快速高效反应的基团生成同型三功能团交联剂可选自酚、α,β-不饱和醛、α-羰基醛、酮、酯、联烯取代酯、酰胺、联烯取代酰胺或活泼酯，优选为
所述含有切割位点并且能实现富集的官能团可选自选自优选为其中，所述R4选自炔基、叠氮基、烯基硫醚、生物素或其衍生物。
作为一种优选方案，本发明以为原料，按照以下路线进行合成：
包括以下具体步骤：将三羧酸化合物1、sulfo-NHS和EDCI溶于DMSO，在室温下搅拌反应，得化合物2；所述化合物2与含有切割位点的富集官能团在DMSO中进行反应，即得多功能化学交联剂Leiker；
所述含有切割位点的富集官能团化合物优选为：
上述历程的逆合成分析图如图3所示。
作为一种优选方案，本发明以为原料，按照以下路线进行合成：
包括以下具体步骤：将三羧酸化合物28、sulfo-NHS和EDCI溶于DMSO，在室温下搅拌反应，得化合物29；所述化合物29与含有切割位点的富集官能团在DMSO中进行反应，即得多功能化学交联剂d6-Leiker；
所述含有切割位点的富集官能团化合物优选为：
本发明所述优选多功能化学交联剂Leiker 1的合成路线如下所示：
所述Leiker 1的合成具体步骤为：以对硝基苯酚3为原料，在碳酸钾无机碱的作用下，3-溴丙炔与酚羟基反应以定量的收率得到端炔化合物4，随后将硝基还原为氨基。苯胺在亚硝酸(通过浓盐酸和亚硝酸钠原位生成)的作用下，控制在低温0～5℃，发生标准的重氮化反应(diazo-reaction)生成重氮化物，之后在碱性条件下再与苯酚化物6发生亲电反应可以高效的构建偶氮苯结构7。三氟乙酸的作用下脱除Boc保护基团得到游离的氨基化合物8，最后化合物8的氨基与同型三功能团交联剂2反应得到9，即Leiker1。所述Leiker 1中不仅含有两个与氨基反应的sulfo-NHS活性酯，还有可富集的端炔以及可用连二亚硫酸钠还原切断的偶氮苯官能团。
由于上述过程需要反复置换缓冲液将叠氮生物素和TBTA除去，会导致大量蛋白质的损失。为了防止蛋白质的大量损失，简化实验操作步骤，本发明还提供了直接将生物素连在交联剂上的方案。直接将生物素连在交联剂上的确是会增加它的体积，对交联效率可能会有些影响，虽然可能存在一些不足，但这样的设计简化了实验步骤，减少了蛋白质的损失，有利于提高该技术的灵敏度。
本发明进一步提供了最直接高效的将生物素连在交联剂上的方法，即：用端炔化合物7与叠氮生物素10在有机合成的层面上，通过点击化学反应构建三唑五元杂环进行连接，随后通过之前采用的类似的方法得到了直接含有富集官能团生物素的一体式交联剂Leiker 2。具体而言，所述Leiker 2的合成路线如下所示：
由于Leiker 2中生物素是由一个五元杂环结构连在交联剂上的，而一般认为这种结构相对来说比较“硬”，柔韧度不高，这可能会影响蛋白质的交联。因此本发明还提供了直接用碳链的方式将生物素连接在交联剂上的方案，保证它具有更好的柔韧性，获得一体式交联剂Leiker 3。所述Leiker 3的合成路线如下所示：
所述Leiker 3的合成具体步骤为：以硝基苯酚14为原料，在DEAD和三苯基膦作用下，与羟基化合物15发生mitsunobu反应得到化合物16。硝基在Fe作为还原剂的条件下转化为氨基，随后通过重氮化反应及亲电反应生成偶氮苯化合物18。TBAF选择性的脱除Fmoc保护基得到游离氨基而保持Boc保护基不变。19可以很顺利的与五氟苯酚生物素活性酯20反应得到化合物21，最后通过脱保护、与化合物2反应得到含链式生物素一体式交联剂Leiker3。
本发明进一步提供了含有6个氘原子的交联剂d6-Leiker 3的合成方法。
所述d6-Leiker 3的合成路线如下所示：
所述d6-Leiker 3的合成具体步骤为：以d3-丙烯腈24为氘源，d3-丙烯腈与硝基甲烷在碱性条件下发生三次Michael加成，得到三氰基化合物25。由于硝基可能会对后续蛋白质的交联产生干扰，我们打算将硝基脱除，同时硝基的脱除可以增加三条臂的柔韧性。以AIBN作为引发剂，三正丁基氢化硒提供氢自由基与化合物25反应，得到脱硝基三氰基化合物26，在浓盐酸高温加热的条件下，氰基水解为羧基得到三羧酸化合物27。理论上应该可以得到含有9个氘代的27，但是高分辨结果显示并不是纯的含9个氘代化合物，有部分氘丢失的情况，这可能是在第一步d3-丙烯腈与硝基甲烷反应时，在碱性条件下氰基α位的碳-氢键表现出一定的酸性，因而该位置的氘可能会被氢置换下来。用第一步的反应产物去做高分辨，与我们分析一致，该化合物就已经不是纯的9个氘代了。定量分析必须保证氘代数目确定，混合物是不适合的，因此我们只能退一步，将化合物27羧基α位的3个氘原子全部替换为氢。在饱和氢氧化钾溶液中高温加热2天，我们可以得到纯的6个氘代的三羧酸28，之后与sulfo-NHS反应得到氘代的sulfo-NHS活性酯29，最后与22反应得到6个氘代的交联剂d6-Leiker 3。
本发明进一步保护所述多功能化学交联剂在蛋白质分析中的应用。所述用于分析的蛋白质可以为简单体系，如BSA等，也可以为复杂的混合蛋白质样品。所述复杂的混合蛋白质样品包括人工制备的复杂样品，如标准蛋白混合物，也包括真实的复杂样品，如酶处理的细胞器或全细胞裂解液(大肠杆菌70S核糖体、大肠杆菌全细胞裂解液以及秀丽隐杆线虫全细胞裂解液等)。
本发明提供的多功能交联剂水溶性以及稳定性均十分优异，且交联效率高；将其应用于蛋白质分析时，不仅在简单体系如BSA、十个标准蛋白混合物的样品中展现出较好的交联肽段鉴定能力，而且在复杂生物样品中，例如大肠杆菌70S核糖体、大肠杆菌全细胞裂解液以及秀丽隐杆线虫全细胞裂解液都可以鉴定到可观的交联位点，展现出很好的应用价值，为今后研究复杂生物体系蛋白相互作用提供一个强有力的工具。
附图说明
图1为化学交联剂在研究蛋白相互作用流程示意图；
图2为分体式交联剂与一体式交联剂结构示意图；
图3为多功能交联剂的逆合成分析图；
图4为偶氮苯切割效率的评估结果；
图5为RNA聚合酶Ⅱ免疫共沉淀蛋白在点击化学反应中损失结果示意图；
图6为点击化学反应所用试剂叠氮生物素和TBTA在质谱中的信号示意图；
图7为Leiker 1与Leiker 2交联效率的比较结果示意图；
图8为Leiker 2与Leiker 1鉴定到交联肽段数目的比较结果示意图；
图9为Leiker 2的富集功能效果示意图；
图10为Leiker 2和Leiker 3对用大肠杆菌肽段稀释的十个蛋白混合物的交联样品分析能力的比较结果示意图；
图11为Leiker 2和Leiker 3对大肠杆菌70s核糖体样品分析能力的比较结果示意图；
图12为Leiker在真实复杂样品中的应用效果示意图；
图13为Leiker用于定量分析流程示意图；
图14为K42交联肽段质谱图；
图15为L7Ae-RNA复合物晶体结构。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：Leiker 1的合成
(1)化合物2的合成
取化合物1(23.2mg,0.1mmol)、sulfo-NHS(71.6mg,0.33mmol)和EDCI(67.1mg,0.35mmol)溶解在无水DMSO(5mL)中，反应混合液在室温下搅拌24小时。之后再加入40mL无水THF，溶液变得浑浊，溶液静置12小时后粘稠的固体沉在圆底烧瓶底部而溶剂变得清澈。小心将上清液倒掉，再用5mL无水THF清洗粘稠的固体二次，最后得到白色粘稠的粗产品2，不需要进一步的纯化直接用于下一步反应；
(2)化合物4的合成
取化合物3(500mg,3.6mmol)溶解在无水DMF(7.5mL)中，然后加入无水碳酸钾(745mg,5.4mmol)，30℃下搅拌30分钟，之后再慢慢加入3-溴丙炔(462μL,5.4mmol)，反应混合液在80℃下搅拌8小时。加水(15mL)淬灭反应，用乙酸乙酯萃取三次(30mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水(10mL)洗涤，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用硅胶柱层析法进行纯化，得淡黄色固体4(636mg,quant.)；
(3)化合物5的合成
往硝基化合物4(636mg,3.59mmol)的乙醇/水溶液(20mL/6mL)中加入FeSO4·5H2O(200mg,0.72mmol)和铁粉(1.77g,31.6mmol)，反应混合液在80℃搅拌18小时。用一小段硅胶过滤除掉固体杂质，并用乙酸乙酯洗脱，滤液在减压下浓缩。残渣用乙酸乙酯(60mL)溶解，用水(10mL)清洗，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(40％的乙酸乙酯石油醚溶液)，得蜡状固体5(462mg,87％)；
(4)化合物6的合成
将3-氨甲基苯酚(100mg,0.81mmol)溶解在THF(5mL)中，在0℃下加入(Boc)2O(213mg,0.98mmol)，反应在室温下搅拌1小时。反应完后加水(5mL)淬灭，用二氯甲烷萃取三次(10mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(5mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(40％的乙酸乙酯石油醚溶液)，得到白色固体6(181mg,quant.)；
(5)化合物7的合成
在0～5℃温度下，往苯胺化合物5(131mg,0.89mmol)的水溶液(4mL)中加入浓盐酸(220μL,2.64mmol)，反应液搅拌20min。随后NaNO2(86mg,1.24mmol)的水溶液(3mL)，反应混合液在0～5℃搅拌1小时。之后将以上制得的溶液控制温度在0～5℃慢慢滴加到苯酚化合物6(207mg,0.89mmol)的NaOH水溶液(0.6M,4mL)中，反应液保持在0～5℃反应2小时。反应完后用0.25M的稀盐酸中和，用二氯甲烷萃取三次(20mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(10mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝3:7)，得亮黄色固体7(298mg,88％)；
所得化合物7的表征数据如下：
1H NMR(400MHz CDCl3):δ1.45(s,9H),2.57(t,J＝2.4Hz,1H),4.77(m,4H),5.22(br,1H),6.84(dd,J＝8.8Hz,2.8Hz,1H),7.01(s,1H),7.08(dd,J＝6.8Hz,2.0Hz,2H),7.72(d,J＝8.8Hz,1H),7.86(dd,J＝6.8Hz,2.0Hz,2H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ28.4,41.4,56.0,76.0,78.0,80.2,115.1,115.67,115.72,118.0,124.3,139.6,143.7,147.7,156.4,159.3,159.5；
IR(neat)νmax 3283,2974,1680,1598,1584,1500,1229,1162,1024,837,669cm-1；
HRMS(ESI):[M+H]+C21H24N3O4的理论值为:382.1761,实际检测值为:382.1768；
性状：亮黄色固体，mp＝133-135℃；
(6)化合物8的合成
室温下，往7(20.2mg,0.053mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)中慢慢加入三氟乙酸(0.5mL)。反应液搅拌2.5小时后，减压下除去溶剂得到粗产品8，不需纯化直接用于下一步反应；
(7)Leiker 1的合成
往粗产品2(用23.2mg的化合物1新鲜制备)的DMSO溶液(2mL)中加入粗产品8(用20.2mg的化合物7新鲜制备)DMSO溶液(0.5mL)。随后往反应液中加入三乙胺(50μL,0.36mmol)，混合液在室温下搅拌24小时。使用genevac HT-4X蒸发仪将DMSO除去，得到的粗产品再用高效液相色谱仪进行纯化分离(20-40％CH3CN水溶液，18分钟以上)；产物中的乙腈在减压下除去，而水使用冻干机除去，最终得到黄色固体Leiker 1(16.3mg,两步反应收率为35％)；
所得Leiker 1的表征数据如下：
1H NMR(400MHz DMSO):δ1.62(m,7H),2.17(m,2H),2.65(m,6H),2.86(m,2H),3.61(s,1H),3.94(s,2H),4.76(d,J＝4.8Hz,2H),4.90(s,2H),6.74(d,J＝8.4Hz,1H),6.85(s,1H),7.15(d,J＝8.8Hz,2H),7.58(d,J＝9.2Hz,1H),7.85(d,J＝8.8Hz,2.0Hz,2H),8.35(br,1H),10.17(s,1H)；
13C NMR(100MHz DMSO):δ27.2,27.6,28.1,30.9,32.4,35.4,37.9,55.8,56.3,78.6,78.9,114.5,114.7,115.4,116.6,124.1,141.0,142.1,147.2,159.0,160.5,165.4,168.8,172.2；
IR(neat)νmax3323,2947,1737,1618,1594,1217,1036,845,672cm-1；
HRMS(ESI):[M-Na]-C34H33N5NaO17S2的理论值为:870.1216,实际检测值为:870.1197；
性状：黄色固体，mp＝148-150℃。
实施例2：Leiker 2的合成
(1)化合物11的合成
取实施例1所得的化合物7(69.2mg,0.181mmol)溶解在DMF/DCM/H2O(2mL/2mL/2mL)中，随后依次加入叠氮生物素10(77mg,0.236mmol)、CuSO4·5H2O(2.3mg,0.009mmol)和抗坏血酸钠(5.4mg,0.027mmol)，反应混合液在室温下搅拌24小时。反应完后加入4mL水，用乙酸乙酯萃取三次(12mL×3)。合并有机相并用饱和食盐水洗涤(5mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(6％～10％甲醇二氯甲烷溶液)，得亮黄色固体11(117mg,91％)；
所得化合物11的表征数据如下：
1H NMR(400MHz Methanol-d4):δ1.44(m,2H),1.48(s,9H),1.64(m,4H),2.13(m,2H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.69(d,J＝12.4Hz,1H),2.90(dd,J＝12.8Hz,5.2Hz,1H),3.18(m,1H),3.23(t,J＝6.8Hz,2H),4.28(m,1H),4.47(m,3H),4.78(s,2H),5.26(s,2H),6.76(dd,J＝8.8Hz,2.8Hz,1H),6.91(d,J＝2.8Hz,1H),7.14(d,J＝9.2Hz,2H),7.66(d,J＝8.8Hz,1H),7.87(dd,J＝6.8Hz,2.0Hz,2H),8.13(s,1H)；
13C NMR(100MHz Methanol-d4):δ26.7,28.9,29.4,29.8,31.1,36.7,41.0,41.2,49.2,57.0,61.6,62.6,63.3,80.3,115.3,115.8,116.2,118.1,125.4,125.6,142.1,144.2,144.6,149.0,158.4,161.6,161.8,166.0,176.2；
IR(neat)νmax3299,2930,1694,1582,1597,1500,1243,1147,838cm-1；
HRMS(ESI):[M+H]+C34H46N9O6S的理论值为:708.3286,实际检测值为:708.3277；
性状：亮黄色固体，mp＝120-122℃。
(2)化合物12的合成
室温下，往11(37.5mg,0.053mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)中慢慢加入三氟乙酸(0.5mL)。反应液搅拌2.5小时后，减压下除去溶剂得到粗产品12，不需纯化直接用于下一步反应；
(3)Leiker 2的合成
往粗产品2(采用实施例1所述化合物2的合成方法，用23.2mg的化合物1新鲜制备)的DMSO溶液(2mL)中加入粗产品12(用37.5mg的化合物11新鲜制备)DMSO溶液(0.5mL)。随后往反应液中加入三乙胺(50μL,0.36mmol)，混合液在室温下搅拌24小时。使用genevac HT-4X蒸发仪将DMSO除去，得到的粗产品再用高效液相色谱仪进行纯化分离(20-40％CH3CN水溶液，18分钟以上)。产物中的乙腈在减压下除去，而水使用冻干机除去，最终得到黄色固体Leiker 2(23.8mg,两步反应的收率为37％)；
所得Leiker 2的表征数据如下：
1H NMR(400MHz DMSO):δ1.30(m,2H),1.57(m,11H),1.96(m,2H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.17(m,2H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.65(m,4H),2.74(s,2H),2.81(m,3H),3.00(m,3H),3.95(d,J＝6.4Hz,2H),4.12(m,1H),4.30(m,1H),4.38(t,J＝7.2Hz,2H),4.76(d,J＝5.6Hz,2H),5.24(s,2H),6.35(s,1H),6.42(s,1H),6.74(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.84(d,J＝8.8Hz,2H),7.90(t,J＝5.6Hz,1H),8.29(s,1H),8.36(t,J＝5.6Hz,1H),10.16(s,1H)；
13C NMR(100MHz DMSO):δ15.6,25.3,25.5,27.2,27.6,28.0,28.2,30.0,30.9,32.4,34.2,35.2,35.4,35.7,36.1,37.9,42.3,47.3,54.7,55.4,56.2,56.3,59.2,61.0,61.5,114.5,114.7,115.2,116.6,124.2,124.8,140.9,142.1,142.3,146.9,158.5,160.0,160.5,162.7,165.3,168.8,172.18,172.25；
IR(neat)νmax3321,2939,1717,1685,1601,1524,1257,1174,1142,840cm-1；
HRMS(ESI):[M-2Na]2-C47H55N11O19S3的理论值为:586.6424,实际检测值为:586.6413；
性状：亮黄色固体，mp＝158-161℃。
实施例3：Leiker 3的合成
(1)化合物15的合成
3-氨基-1-丙醇(300mg,4mmol)溶解在无水二氯甲烷(15mL)中，将反应液置于冰浴，FmocCl(528mg,2mmol)的二氯甲烷溶液(12mL)滴加至反应液，持续30分钟。将温度升至室温，继续搅拌1.5小时。用0.5M的HCl溶液洗涤三次(5mL×3)，有机相合再用饱和食盐水洗涤(5mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(50％的乙酸乙酯石油醚溶液)，得白色固体15(585mg,98％)；
(2)化合物16的合成
对硝基苯酚(211mg,1.52mmol)溶解在无水THF(37mL)中，随后在0℃下加入化合物15(519mg,1.75mmol)、PPh3(344mg,1.97mmol)和DEAD(518mg,1.97mmol)，反应混合液在0℃下继续搅拌1.5小时。用饱和氯化铵溶液(10mL)淬灭反应，再用二氯甲烷萃取三次(15mL×3)。合并有机相并用饱和食盐水洗涤(10mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得白色固体16(615mg,97％)；
所得化合物16的表征数据如下：
1H NMR(400MHz CDCl3):δ2.04(m,2H),3.41(m,2H),4.09(t,J＝6.0Hz,2H),4.21(t,J＝6.4Hz,1H),4.44(d,J＝6.8Hz,2H),4.94(br,1H),6.93(m,2H),7.31(m,2H),7.40(m,2H),7.58(m,2H),7.77(m,2H),8.19(m,2H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ29.3,38.1,47.2,66.3,66.5,114.4,120.0,124.9,125.9,127.0,127.7,141.3,141.6,143.8,156.4,163.7；
IR(neat)νmax3325,2951,1702,1592,1509,1448,1335,1256,1109,844,741cm-1；
HRMS(ESI):[M+Na]+C24H22N2NaO5的理论值为:441.1421,实际检测值为:441.1424；
性状：白色固体，mp＝128-130℃；
(3)化合物17的合成
往硝基化合物16(598mg,1.43mmol)的乙醇/水溶液(15mL/4.5mL)中加入FeSO4·5H2O(80mg,0.286mmol)和铁粉(705mg,12.6mmol)，反应混合液在80℃搅拌18小时。用一小段硅胶过滤除掉固体杂质，并用乙酸乙酯洗脱，滤液在减压下浓缩。残渣用乙酸乙酯(50mL)溶解，用水(10mL)清洗，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝3:7)，得蜡状固体17(471mg,85％)；
所得化合物17的表征数据如下：
1H NMR(400MHz CDCl3):δ1.96(m,2H),3.40(m,4H),3.96(t,J＝6.0Hz,2H),4.22(t,J＝7.2Hz,1H),4.40(d,J＝6.8Hz,2H),5.14(br,1H),6.64(m,2H),6.70(m,2H),7.31(m,2H),7.40(m,2H),7.60(m,2H),7.76(m,2H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ29.3,38.8,47.3,66.5,66.6,115.6,116.4,119.9,125.0,127.0,127.6,140.2,141.3,144.0,151.8,156.4；
IR(neat)νmax3348,2950,1704,1510,1449,1233,1044,825,741cm-1；
HRMS(ESI):[M+H]+C24H25N2O3的理论值为:389.1860,实际检测值为:389.1866；
性状：蜡状固体；
(4)化合物18的合成
在0～5℃温度下，往苯胺化合物17(345mg,0.89mmol)的水溶液(4mL)中加入浓盐酸(220μL,2.64mmol)，反应液搅拌20min。随后NaNO2(86mg,1.24mmol)的水溶液(3mL)，反应混合液在0～5℃搅拌1小时。之后将以上制得的溶液控制温度在0～5℃慢慢滴加到苯酚化合物6(207mg,0.89mmol)的NaOH水溶液(0.6M,4mL)中，反应液保持在0～5℃反应2小时。反应完后用0.25M的稀盐酸中和，用二氯甲烷萃取三次(20mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(10mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝3:7)，得亮黄色固体18(520mg,94％)；
所得化合物18的表征数据如下：
1H NMR(400MHz CDCl3):δ1.44(s,9H),2.05(m,2H),3.44(m,2H),4.10(m,2H),4.22(t,J＝6.8Hz,1H),4.44(d,J＝6.8Hz,2H),4.76(d,J＝6.4Hz,2H),5.03(br,1H),5.17(br,1H),6.83(dd,J＝8.8Hz,2.8Hz,1H),6.70(m,3H),7.31(m,2H),7.40(m,2H),7.60(m,2H),7.72(d,J＝8.8Hz,1H),7.77(d,J＝7.2Hz,2H),7.84(d,J＝8.8Hz,2H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ28.4,29.3,38.4,41.3,47.2,65.9,66.6,79.9,114.6,115.6,115.7,117.8,119.9,124.4,124.9,127.0,127.7,139.6,141.3,143.8,147.3,156.3,156.6,159.3,160.6；
IR(neat)νmax3298,2928,1686,1597,1501,1467,1240,1144,837,741cm-1；
HRMS(ESI):[M+H]+C36H39N4O6的理论值为:623.2864,实际检测值为:623.2855；
性状：亮黄色固体，mp＝79-81℃；
(5)化合物19的合成
往化合物18(494mg,0.79mmol)的iPrOH/DMF溶液(1.5mL/15mL)中慢慢滴加TBAF的DMF溶液(0.04M,30mL,1.2mmol)，反应液在常温下搅拌2小时。反应完后用饱和氯化铵溶液(15mL)淬灭，用乙酸乙酯萃取三次(40mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(20mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩。残余物用快速硅胶色谱柱纯化(6％～10％甲醇二氯甲烷溶液)，得亮黄色固体19(317mg,95％)；
所述化合物19的表征数据如下：
1H NMR(400MHz DMSO):δ1.41(s,9H),1.93(t,J＝6.4Hz,2H),2.85(t,J＝6.4Hz,2H),3.33(br,2H),4.14(t,J＝6.4Hz,2H),4.65(d,J＝6.0Hz,2H),6.73(dd,J＝8.8Hz,2.8Hz,1H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),7.09(dd,J＝6.8Hz,2.0Hz,2H),7.37(t,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(dd,J＝6.8Hz,2.0Hz,2H)；
13C NMR(100MHz DMSO):δ28.3,29.6,37.2,65.5,77.8,114.0,114.6,114.9,116.4,124.1,141.3,141.8,146.7,155.8,160.4,160.7；
IR(neat)νmax3468,2975,1682,1598,1583,1502,1248,1165,836cm-1；
HRMS(ESI):[M+H]+C21H29N4O4的理论值为:401.2183,实际检测值为:401.2187；
性状：亮黄色固体，mp＝182-184℃；
(6)化合物21的合成
往五氟苯酚生物素酯(46mg,0.11mmol)的无水DMF溶液(1mL)中滴加化合物19(37mg,0.093mmol)的无水DMF溶液(1.5mL)，随后再滴加三乙胺(26μL,0.187mmol)，反应液在室温下搅拌2.5小时。溶剂减压下浓缩，残余物用快速硅胶色谱柱纯化(3％～9％甲醇二氯甲烷溶液)，得亮黄色固体21(52mg,90％)；
所述化合物21的表征数据如下：
1H NMR(400MHz DMSO):δ1.30(m,2H),1.41(s,9H),1.54(m,4H),1.88(t,J＝6.4Hz,2H),2.08(t,J＝7.6Hz,2H),2.59(d,J＝12.4Hz,1H),2.79(dd,J＝12.4Hz,4.8Hz,1H),3.07(m,1H),3.23(m,2H),4.09(m,3H),4.28(m,1H),4.66(d,J＝5.6Hz,2H),6.37(s,1H),6.44(s,1H),6.74(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),6.86(d,J＝2.0Hz,1H),7.07(d,J＝8.8Hz,2H),7.34(t,J＝6.0Hz,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(d,J＝8.8Hz,2H),7.90(t,J＝5.6Hz,1H),10.13(s,1H)；
13C NMR(100MHz DMSO):δ25.3,28.0,28.2,28.3,28.9,35.2,35.3,39.9,55.4,59.2,61.0,65.7,77.8,114.0,114.5,114.9,116.5,124.2,141.3,141.9,146.7,155.8,160.4,160.5,162.7,172.1；
IR(neat)νmax3287,2930,1692,1596,1581,1501,1243,1163,838cm-1；
HRMS(ESI):[M+H]+C31H43N6O6S的理论值为:627.2959,实际检测值为:627.2951；
性状：亮黄色固体，mp＝124-126℃；
(7)化合物22的合成
室温下，往21(33.3mg,0.053mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)中慢慢加入三氟乙酸(0.5mL)。反应液搅拌2.5小时后，减压下除去溶剂得到粗产品22，不需纯化直接用于下一步反应；
(8)Leiker 3的合成
往粗产品2(采用实施例1所述化合物2的合成方法，用23.2mg的化合物1新鲜制备)的DMSO溶液(2mL)中加入粗产品22(用33.3mg的化合物21新鲜制备)DMSO溶液(0.5mL)。随后往反应液中加入三乙胺(50μL,0.36mmol)，混合液在室温下搅拌24小时。使用genevac HT-4X蒸发仪将DMSO除去，得到的粗产品再用高效液相色谱仪进行纯化分离(20-40％CH3CN水溶液，18分钟以上)。产物中的乙腈在减压下除去，而水使用冻干机除去，最终得到黄色固体Leiker 3(26.5mg,两步反应的收率为44％)；
所得Leiker 3的表征数据如下：
1H NMR(400MHz DMSO):δ1.31(m,2H),1.57(m,11H),1.88(m,2H),2.07(t,J＝7.2Hz,2H),2.18(m,2H),2.56(d,J＝12.8Hz,1H),2.65(m,4H),2.76(s,2H),2.83(m,3H),3.00(m,1H),3.20(m,2H),3.95(d,J＝7.2Hz,2H),4.09(m,3H),4.28(m,1H),4.76(d,J＝5.6Hz,2H),6.34(s,1H),6.41(s,1H),6.74(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),7.08(d,J＝8.8Hz,2H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(d,J＝8.8Hz,2H),7.89(t,J＝5.6Hz,1H),8.36(t,J＝5.6Hz,1H),10.14(s,1H)；
13C NMR(100MHz DMSO):δ15.6,25.3,25.5,27.2,27.6,28.0,28.2,28.9,30.9,32.4,34.2,35.2,35.3,36.0,37.9,42.3,54.6,55.4,56.3,59.2,61.0,65.7,114.4,114.7,114.9,124.2,140.8,142.1,146.7,158.5,160.4,160.6,162.7,165.3,168.8,172.1,172.2；
IR(neat)νmax3328,2937,1737,1714,1650,1597,1234,1040,631cm-1；
HRMS(ESI):[M-2Na]2-C44H52N8O19S3的理论值为:546.1261,实际检测值为:546.1265；
性状：黄色固体，mp＝152-154℃。
实施例4：d6-Leiker 3的合成
(1)化合物28的合成
27(102mg,0.42mmol)溶解在饱和KOH溶液(2mL)中，反应加热到105℃搅拌2天。反应完后冷却到室温，用浓盐酸对溶液进行酸化，用二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(5mL)，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在减压下浓缩得到白色目标产物28(85mg,84％)；
所得化合物28的表征数据如下：
1H NMR(400MHz DMSO):δ1.28(s,1H),2.16(s,6H),12.02(s,3H)；
13C NMR(100MHz DMSO):δ30.7,35.0,174.6；
IR(neat)νmax2925,1696,1413,1283,1217,911cm-1；
HRMS(ESI):[M+K]+C10H10D6KO6的理论值为:277.0955,实际检测值为:277.0956；
性状：黄色固体，mp＝107-109℃；
(2)d6-Leiker 3的合成
往粗产品29(用23.8mg的化合物28新鲜制备)的DMSO溶液(2mL)中加入粗产品22(采用实施例3所述化合物22的合成方法，用33.3mg的化合物21新鲜制备)DMSO溶液(0.5mL)。随后往反应液中加入三乙胺(50μL,0.36mmol)，混合液在室温下搅拌24小时。使用genevac HT-4X蒸发仪将DMSO除去，得到的粗产品再用高效液相色谱仪进行纯化分离(20-40％CH3CN水溶液，18分钟以上)。产物中的乙腈在减压下除去，而水使用冻干机除去，最终得到黄色固体d6-Leiker 3(18.8mg,两步反应收率31％)；
所得d6-Leiker 3的表征数据如下：
1H NMR(400MHz DMSO):δ1.30(m,2H),1.50(m,5H),1.88(m,2H),2.07(t,J＝7.2Hz,2H),2.16(m,2H),2.56(d,J＝12.4Hz,1H),2.63(m,4H),2.69(s,2H),2.81(m,3H),3.05(m,1H),3.21(m,2H),3.95(d,J＝6.8Hz,2H),4.09(m,3H),4.28(m,1H),4.76(d,J＝5.6Hz,2H),6.34(s,1H),6.41(s,1H),6.74(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),7.08(d,J＝9.2Hz,2H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(d,J＝8.8Hz,2H),7.90(t,J＝5.6Hz,1H),8.36(t,J＝5.6Hz,1H),10.16(s,1H)；
13C NMR(100MHz DMSO):δ25.3,27.4,28.1,28.2,28.9,30.9,34.9,35.2,35.4,37.9,54.9,55.4,56.2,56.3,59.2,61.1,65.7,114.5,114.7,114.9,116.6,124.2,140.8,142.1,146.7,160.4,160.6,162.7,165.4,168.8,172.1,172.3；
IR(neat)νmax3325,2932,1738,1712,1647,1587,1236,1042,636cm-1；
HRMS(ESI):[M-2Na]2-C44H46D6N8O19S3的理论值为:549.1449,实际检测值为:549.1449；
性状：黄色固体，mp＝154-156℃。
实验例1：Leiker切割效率的检测
本实验例评估实施例1所得Leiker 1中偶氮苯切割的效率，以BSA作为实验样品，结果如图4所示，采用连二亚硫酸钠条件进行切割鉴定到的交联肽段都要比用传统的乙腈洗脱鉴定到的交联肽段要多。同时我们发现未切割前，体系呈现的是黄色状态，当使用连二亚硫酸钠完成切割后，黄色会褪去变为无色，这在一定程度上有利于对切割过程的检测。综上可以看到，偶氮苯是一个非常好的切割位点，它能在短时间内(30min)快速完成高效切割，并且通过与传统的乙腈洗脱方法相比，展示了切割位点的设计对鉴定到更多交联肽段是非常具有意义的。
实验例2：Leiker在检测人工制备的复杂生物样品中的应用
本实验例将Leiker 1用于复杂生物样品RNA聚合酶的免疫共沉淀复合物的研究时，鉴定到的交联肽段很少。通过比较点击化学反应前、后体系里面普通肽段的数目来反应蛋白质的含量，结果如图5所示，可见，点击化学反应后的普通肽段较之前有非常严重的损失。由于置换缓冲液，导致与端炔反应的叠氮生物素Bio-azide及其反应中使用的稳定一价铜离子的化学试剂TBTA在质谱中有很强的信号(如图6所示)，它们的存在会大大影响交联丰度较低的肽段的鉴定，因此点击化学反应之后我们需要反复置换缓冲液将叠氮生物素和TBTA除去，这过程就会导致大量蛋白质的损失。
本实验例应用十个标准蛋白混合物(如表1所示)，通过比较鉴定到的交联肽段的数目来正面研究实施例1提供的分体式交联剂Leiker 1和实施例2提供的一体式交联剂Leiker 2的实用价值。由图7可知，无论是Leiker 1还是Leiker 2，当蛋白质与交联剂的质量比是2:1时，单个蛋白质的条带都基本消失，这说明它们两者之间的交联效率差别不大，并且与阳性对照交联剂BS3相当。
表1：十个标准蛋白及其大小
本实验例进一步将分体式交联剂Leiker 1和一体式交联剂Leiker 2按照各自的富集方式进行富集操作：Leiker 1需要先与叠氮生物素反应，再通过置换缓冲液除去过量的交联剂、叠氮生物素和TBTA。而Leiker 2只需要用丙酮沉淀除去过量的交联剂。结果如图8所示，Leiker 2鉴定到的交联肽段比Leiker 1要多，特别是Inter交联的肽段数目是分体式的两倍多。以上实验结果表明分体式交联剂的使用效果并没有一体式交联剂好，这与分体式交联剂涉及到的操作步骤多，导致样品损失有关。生物体内蛋白质的含量本身就很低，如果再有大量蛋白质的损失，对交联位点的鉴定是非常不利的。
本实验例进一步将Leiker 2与表1所述十个标准蛋白混合物交联并酶切后，与大肠杆菌裂解液酶切产物按照质量比1:0、1:1、1:10和1:100进行混合，这在一定程度上可以达到模拟复杂生物样品的目的。富集后鉴定交联肽段数目，同时用商业化氨基交联剂BS3作为阳性对照。结果如图9所示，在没有混入大肠杆菌裂解液酶切产物的样品(1:0)中，BS3可以鉴定到109对Inter交联的肽段，而Leiker 2可以鉴定到164对Inter交联的肽段。随着大肠杆菌裂解液酶切产物的增加，BS3鉴定到的交联肽段的数目急剧下降，这说明了它对复杂生物样品表现出很弱的鉴定能力，不适合复杂生物样品的分析。而Leiker 2具有非常强的富集功能，鉴定到的Inter交联的肽段几乎不受样品复杂程度的影响，即使加入100倍的大肠杆菌裂解液酶切产物，依然可以鉴定到167对Inter交联的肽段，这与不加大肠杆菌裂解液酶切产物的效果相当，而相同条件下BS3几乎没有展现出能力，仅能鉴定到1对Inter交联的肽段。通过这个实验的直接比较，我们可以看到BS3对复杂生物样品表现出无能为力的状态，而Leiker 2由于它的超强富集功能，对复杂程度很高的样品仍表现出很强的应用性。
本实验例进一步将实施例2提供的一体式交联剂Leiker 2和实施例3提供的一体式交联剂Leiker 3进行比较，考察它们对复杂样品的分析能力。选取两个复杂生物样品进行交联肽段的鉴定：一个是十个标准蛋白混合物交联后与大肠杆菌裂解液酶切产物按照质量比1:10混合得到的样品；另外一个是大肠杆菌全细胞裂解液。实验结果如图10所示，可以看出Leiker 2和Leiker 3都有很强的富集效果，鉴定到交联肽段(Inter+Mono+Loop)数目超过总肽段数目的95％。同时它们二者在这两个复杂的生物样品中都鉴定到了相近的交联肽段数目，说明了它们两者对复杂样品的分析能力相当。
实验例3：Leiker在检测真实的复杂生物样品中的应用
对复杂生物样品的鉴定能力决定Leiker成为强有力工具的硬性指标。将Leiker 2和Leiker 3应用于大肠杆菌70S核糖体的研究，它是一个2.7MDa包含超过50个蛋白的核糖核蛋白。运用Leiker，鉴定到222对交联位点，这是之前报道的鉴定数目的三倍(结果如图11所示)。
同时Leiker在更为复杂的大肠杆菌全细胞裂解液(E.coli lysates)中鉴定到3656对交联位点。目前这个样品中最成功的是2012年Meng-Qiu Dong课题组运用BS3鉴定到394对交联位点；2013年，James Bruce实验室运用他们自己开发的Protein InteractionReporter(PIR)交联剂在活体大肠杆菌细胞内进行交联，鉴定到708对交联位点，这两个是目前大肠杆菌细胞裂解液和体内鉴定交联位点的最高记录。而运用Leiker鉴定到的交联位点是PIR交联剂的5倍多，BS3交联剂的9倍多。
秀丽隐杆线虫全细胞裂解液(C.elegan lysates)比大肠杆菌全细胞裂解液要复杂得多，运用Leiker鉴定到898对交联位点，这是之间报道最高记录20倍。
以上结果如图12所示。由以上结果可以看出，由于Leiker具有超强的富集功能，并且包含高效切割位点，对复杂的生物样品展现出很高的实用价值。
基于交联肽段的相对定量可以反映蛋白质构象的变化或者是蛋白质与其他分子(如核酸、蛋白质等)的结合。结合实施例3所得的Leiker 3(又称d0-Leiker 3)以及实施例4所得的d6-Leiker 3，我们希望Leiker在定量分析中也具有使用价值。为此，我们使用Leiker检测了Pyrococcus furiosus核糖核蛋白中L7Ae和它的伴侣RNA(H/ACA RNA)的自主装。我们用d0-Leiker 3去处理L7Ae蛋白，同时用d6-Leiker 3去处理L7Ae-RNA复合物作为正向标记。另一方面改变同位素标记方式，用d6-Leiker 3去处理L7Ae蛋白，再用d0-Leiker 3去处理L7Ae-RNA复合物作为反向向标记(如图13所示)。
将两份样品1:1混合，在非L7Ae与RNA的结合区域内的赖氨酸交联肽段在质谱图中会呈现相同的丰度，而结合区域内的赖氨酸交联肽段在质谱图中会呈现丰度差异，通过质谱丰度的差异来揭示L7Ae与RNA的结合位点。L7Ae本身是有15个赖氨酸反应位点和一个氮端的氨基，我们在正向标记和反向标记中都鉴定到了这16个交联位点，并且发现有三个位置的赖氨酸K35,K42和K84在L7Ae样品中的丰度要强于L7Ae-RNA复合物，图14为K42交联肽段质谱图。这说明这三个赖氨酸是处于L7Ae-RNA的结合位点处。这与L7Ae-RNA复合物晶体结构是完美匹配的，晶体结构显示K35,K42和K84都位于L7Ae与RNA结合区域内(如图15所示)。这些结果证明了结合d0-Leiker 3和d6-Leiker 3，可以用来定量分析。
综上可知，最终我们开发了分体式交联剂Leiker 1和一体式交联剂Leiker 2、Leiker 3以及d6-Leiker 3。Leiker在复杂生物样品中，例如大肠杆菌70S核糖体、大肠杆菌全细胞裂解液以及秀丽隐杆线虫全细胞裂解液都可以鉴定到可观的交联位点，展现出很好的应用价值，为今后研究复杂生物体系蛋白相互作用提供一个强有力的工具。同时，我们很容易的将同位素引入到Leiker 3中，得到了d6-Leiker 3，使Leiker用于定量分析成为可能。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种多功能化学交联剂，其特征在于，具有如下通式的结构：
所述R1、R2均代表
R3代表切断基团，选自所述代表与R4基团的连接位置；
R4代表富集基团，选自乙炔基、
R5代表氢或其同位素。
2.根据权利要求1所述的多功能化学交联剂，其特征在于，所述交联剂为分体式交联剂，所述R4代表乙炔基；
或为一体式交联剂，所述R4代表
3.根据权利要求1或2任意一项所述的多功能化学交联剂，其特征在于，所述R5代表氢或氘。
4.一种多功能化学交联剂，其特征在于，具有以下任意一种结构：
5.权利要求1～4任意一项所述多功能化学交联剂的制备方法，其特征在于，以三羧酸化合物作为基本骨架，与可与氨基快速高效反应的基团生成同型三功能团交联剂，把所述同型三功能团交联剂中的一个可与氨基快速高效反应的基团替换为含有切割位点并能实现富集的官能团，即得多功能化学交联剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
三羧酸化合物1与sulfo-NHS反应，得化合物2；所述化合物2与含有切割位点的富集官能团反应，即得多功能化学交联剂Leiker；
所述R4代表乙炔基、
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
三羧酸化合物28与sulfo-NHS反应，得化合物29；所述化合物29与含有切割位点的富集官能团反应，即得多功能化学交联剂d6-Leiker；
所述R4代表乙炔基、
8.权利要求1～4任意一项所述的多功能化学交联剂或权利要求5～7任意一项所述方法制备而成的多功能化学交联剂在蛋白质分析中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述用于分析的样品是多种蛋白质的混合物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述用于分析的样品是酶处理的细胞器或全细胞裂解液。
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