CN113214672A - 酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料，其合成方法及其应用 - Google Patents

酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料，其合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了酰胺取代的氮杂吲哚‑五甲川菁染料，其合成方法及其应用，主要涉及含酰胺取代的氮杂吲哚‑五甲川菁染料合成和其在生物识别成像和核酸标记及DNA测序等方面的应用。所述染料具有进一步酰胺反应的活性基团和水溶性基团。该染料具有近红外吸收、高荧光量子产率，可用于生物识别和具有氨基化合物的检测，应用于蛋白质标记，核酸检测，DNA测序等领域。

Description

酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料，其合成方法及其应用
技术领域
本发明属于生物识别试剂技术领域，涉及一类酰胺取代的氮杂吲哚- 五甲川菁染料的合成，及其在生物染色方面的应用。
背景技术
荧光染料是生物标记和识别的重要工具，在生物特异性蛋白、肿瘤标志物以及DNA识别基因测序中有重要意义。
近年来，随着激光技术和荧光染料的不断进步，荧光分析法具有的一些优点如设备简单、操作便捷、灵敏度高和响应快，相比于同位素标记法尤为突出，因此，荧光响应技术成为一种非常重要的研究手段。目前，荧光素、罗丹明、香豆素、7-硝基苯并呋咱氨基己酸(NBD)、四甲基罗丹明、德克萨斯红等商品化荧光染料在细胞分析、肿瘤标志物识别和基因组学分析等领域都起着相当重要的作用。然而，这些染料都各自存在着自身应用的局限性。一、有相当一部分荧光染料的激发光处在紫外光区，由于紫外光对细胞内的核酸、蛋白等组分会造成严重的损伤，因此这类荧光在荧光显微技术中的使用受到光激发时间的限制。此外，在紫外区进行荧光检测时，生物样品在这个区间的吸收使光进入生物组织内部变得困难，同时生物样品中某些成分的自发荧光形成很强的背景干扰，使检测效率大大降低。二、当荧光染料与标记物共轭或者共价键连接时，染料分子本身荧光是否受到影响，被标记物活性是否受到染料影响。三、荧光染料的荧光量子产率应该较高，这样才能在较低浓度下对标记物识别成像。四、荧光染料的摩尔消光系数尽可能大，这样才能保证染料分子对激发光的充分吸收。五、染料分子本身具有较高的稳定性。
因此，研究开发出具有良好荧光光谱性能、高荧光量子产率、更长的激发波长和发射波长，对特殊细胞具有选择性、毒性小的新型荧光染料仍然是推动荧光分析技术和生命科学等领域发展的关键和核心。
发明内容
本发明的目的是提供一种近红外的用于生物标记的酰胺取代的氮杂吲哚(花菁)菁染料及其合成方法。涉及在生物识别染色领域的近红外荧光探针。具体讲，本发明涉及用于生物特异性蛋白、肿瘤标志物以及DNA识别基因测序等的荧光检测染料。
对于生物特异性蛋白识别来说，即染料主体与客体(底物)通过分子间作用力的协同作用而特异性选择结合。本发明是通过染料分子的羧基作为活性基团，和蛋白质的氨基残基发生化学键合，从而达到标记蛋白的目的。对于DNA识别基因测序来说，同样是通过染料的羧基或活化后的羧基和具有氨基修饰的核酸碱基结合，来实现DNA测序。
本发明的设计方案是通过酰胺修饰的氮杂吲哚来合成不对称的花菁染料，以便于提高花菁染料的吸收和发射波长，另一方面，通过提高分子电子云流动性来增加染料分子的荧光量子产率，同时通过在染料分子上引入磺酸基或磺酸盐来提高分子水溶性避免自淬灭，增加染料的实用性。
本申请的技术方案如下：
本申请的第一方面在于保护一类酰胺取代的氮杂吲哚五甲川(花) 菁染料化合物，所述的染料具有通式I的结构：
Figure BDA0003017488040000021
通式I中，
R1和R2各自独立的选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；
R3和R4各自独立的选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；
R5选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的烷基羟基或具有1-18 个碳的卤代烷基
Y-选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，当R1为对羧基苯基， R2为磺酸根、磺酸基或磺酸盐时，R3为氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18 个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，R4为氢、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐或磺酸、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，R5为氢、具有1-18个碳的烷基羟基、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的卤代烷基、具有1-18个碳的羧烷基。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，Y-可选自卤素离子、ClO4 -、 BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-的任意一种。
本申请的第二方面在于保护一种酰胺取代的氮杂吲哚五甲川(花菁)菁染料化合物的合成方法，包括以下步骤：
(1)在-10到0℃下，在无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的N-1溶液中，加入TBTU和DIPEA，搅拌0.5-2h，至室温，加入R5取代的胺，反应1-4 h，过滤，去除杂质盐，在硅胶柱上纯化，得到中间体5-含R5取代的酰胺-2,3,3- 三甲基-3H-吡咯并[2,3-b]吡啶N-2。
(2)在有机溶剂中，在60-90℃下，含R5取代的5-酰胺-2,3,3-三甲基-3H- 吡咯并[2,3-b]吡啶N-2与N烷基化试剂R4取代的卤代烷烃反应，反应3-24h，转变为含N-R4取代侧链的5-含R5取代的酰胺-2,3,3-三甲基-3H-吡咯并[2,3-b] 吡啶季铵盐N-4。化合物N-3和N烷基化试剂的摩尔比为1:1-10。化合物N-3 经有机溶剂重结晶得纯品。
(3)在有机溶剂中，在60-120℃下，含R1和R2取代的-2,3-二甲基-3H- 吲哚Y-1与N烷基化试剂R3取代的卤代烷烃反应，反应8-48h，转变为含N-R3取代侧链的-含R1和R2取代的-2,3-二甲基-3H-吲哚季铵盐Y-2。化合物Y-1和 N烷基化试剂的摩尔比为1:1-10。化合物Y-2经有机溶剂重结晶得纯品。
(4)在有机溶剂中，在78-125℃下，化合物Y-2和缩合剂S-1反应，反应30-60min，停止反应，得到半菁Y-3。化合物Y-2和缩合剂S-1的摩尔比为 1：0.5-1.5，化合物Y-3经有机溶剂重结晶得到纯品。
(5)在有机溶剂中，在室温下，化合物Y-3和化合物N-3在有机碱催化下，反应8-24h，得到产品含酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料化合物I。化合物Y-3和化合物N-4的摩尔比为1:1-4。
Figure BDA0003017488040000041
在上述步骤(2)中，有机溶剂为乙醇、苯、甲苯、邻二氯苯的任意一种。重结晶溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂。
在上述步骤(3)中，有机溶剂为苯、甲苯、邻二氯苯、DMF的任意一种。重结晶溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂。
在上述步骤(4)中，有机溶剂为乙醇、乙酸、乙酸酐、DMF的任意一种。重结晶溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、水、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂。
在上述步骤(5)中，有机溶剂为乙腈、DMSO、DMF的任意一种。反应催化剂有机碱为三乙胺、吡啶和DIPEA的任意一种。
本发明包括所述的花菁染料的活化产物，其特征在于，染料的羧基由活泼酰亚胺基活化，或由多肽试剂TNTU活化的产物。
本申请的第三方面在于保护酰胺取代的氮杂吲哚五甲川(花菁)菁染料化合物的应用，所述花菁染料应用于细胞成像、氨基酸标记、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记及DNA测序等方面的应用。
本发明所述的染料是DNA的组成单位四种脱氧核苷酸或氨基修饰的 DNA的组成单位四种脱氧核苷酸特异性染色试剂。
本发明所述的染料是RNA的组成单位四种核苷酸或氨基修饰的RNA 的组成单位四种核苷酸特异性染色试剂。
在检测应用时荧光成像发射波长为600-950nm。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述的酰胺取代的氮杂吲哚五甲川菁染料，具有近红外光吸收，最大吸收波长较无酰胺取代的染料红移20nm，最大吸收波长到达 680nm，最大发射波长实现710nm左右。
(2)本发明所述染料具有较好的水溶性，并在水溶液中具有较大的荧光量子产率。
(3)本发明所述染料具有较强的适用性，可以实现多种类型物种的标记，标记方法灵活。
附图说明
图1是化合物1-3在甲醇中归一化的吸收光谱；
图2是化合物1-3在甲醇中归一化的荧光光谱；
图3是化合物1及其活化产物在甲醇中归一化的吸收光谱；
图4是化合物1及其活化产物在甲醇中归一化的荧光光谱；
图5是化合物1及其活化产物的HPLC谱图；
图6是化合物1及其活化产物与L-赖氨酸反应后的HPLC谱图。
具体实施方式
以下，进一步对本发明进行详细说明。
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本发明中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。
本文中使用Y-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括无机负离子和有机负离子，可举例但不限于卤素离子、ClO4-、PF6-、BF4-、CH3COO-、CF3COO-或OTs-。
本文中所述的染料的盐形式可直接用于生物样品的染色。或者，在一个实施方案中，本发明化合物可作为式Ⅰ化合物的衍生物的形式使用。
实施例中所采用的仪器和设备：
本发明柱层析过程中，采用购于青岛美高集团有限公司的200～300目、 100～200目柱色谱硅胶和购于天大化学试剂厂的20～40目分析纯石英砂。低温反应用磁力搅拌低温恒温反应器实现。反相纯化色谱仪为博纳艾杰尔科技公司产的CHEETAH快速纯化制备色谱。
染料吸收和发射光谱用Agilent公司的Cary 60紫外可见分光光度计和 CaryEclipse荧光分光光度计测得。染料的绝对荧光量子产率使用滨松光子学商贸(中国)有限公司的C11347绝对荧光量子产率仪测得。
实施例1制造化合物1
Figure BDA0003017488040000071
化合物1的结构式
实施例1.1
Figure BDA0003017488040000072
室温下，向在乙酸中的对肼基苯磺酸(5.00g，26.6mmol，1.0eq)的溶液中，加入3-甲基-2-丁酮(5.70mL，53.1mmol，2.0eq)，回流4h后，停止反应，过滤，用乙酸乙酯洗涤3次，固体溶于30mL甲醇中，向溶解在30mL 丙醇的氢氧化钾(1.50g，26.6mmol，1.0eq)溶液中缓慢滴加，室温搅拌24h。过滤，得目标化合物1.1(6.04g，21.8mmol，Y＝82％)。
实施例1.2
Figure BDA0003017488040000073
将实施例1.1的化合物(1.00g，3.6mmol，1.0eq)和6-溴正己酸(1.40g， 7.2mmol，2.0eq)溶于10mL邻二氯苯中，氮气条件下回流反应24h，停止反应。加入异丙醇过滤，得目标化合物1.2(1.14g，2.4mmol，Y＝67％)。
实施例1.3
Figure BDA0003017488040000081
将实施例1.2的化合物(1.00g，2.1mmol，1.0eq)和丙二醛二苯胺盐酸盐(0.60g，2.3mmol，1.1eq)加入到5mL乙酸和5mL乙酸酐的混合溶液中，在120℃下反应1h，停止反应，冷却至室温，加入50mL乙酸乙酯，过滤，得目标化合物1.3(0.76g，1.1mmol，Y＝55％)。
实施例1.4
Figure BDA0003017488040000082
在室温下，向在甲苯中的2-肼基-5-溴吡啶(9.40g,50.0mmol,1.0eq)的溶液(150mL)中添加3-甲基-2-丁酮(8.61g,100.0mmol,2.0eq)。全程在磁子搅拌和氮气保护下进行加热回流，反应12h后即可停止反应。冷却至室温。除去大部分甲苯，在残留物中加入多聚磷酸(30ml)，在140℃下加热并搅拌，反应45min 后，将该混合物倒入冰水中(500mL)。添加NaOH(5N)以中和该溶液至pH＝8.0，随后用乙酸乙酯(500mL)进行萃取。用Na2SO4干燥后，在硅胶柱上纯化残余物，得一种黄色固体化合物实施例1.4(3.9g，16.0mmol，Y＝33％)。
实施例1.5
Figure BDA0003017488040000083
在-78℃下，向无水THF(四氢呋喃)中的化合物实施例1.4(1.0g，4.2 mmol，1.0eq)的溶液(20mL)中缓慢滴加n-BuLi(2.5M己烷溶液，3.7mL， 9.2mmol，2.2eq)。反应1h后，继续向反应液中通入CO2气体，鼓泡1h，停止反应，升至室温，加入25mL冰水淬灭反应，并用HPLC纯化，得化合物实施例1.5(0.584g，2.86mmol，Y＝68％)。
实施例1.6
Figure BDA0003017488040000091
在0℃下，向无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的化合物实施例1.5(0.400g，1.96mmol，1.0eq)溶液(5mL)中，加入TBTU(0.818g，2.55mmol，1.3eq) 和DIPEA(0.329g，2.55mmol，1.3eq)，搅拌0.5h，至室温，加入乙醇胺(0.239 g，3.92mmol，2.0eq)，反应1.5h，过滤，去除杂质盐，在硅胶柱上纯化，得到化合物实施例1.6(0.363g，1.47mmol，Y＝75％)。
实施例1.7
Figure BDA0003017488040000092
在室温下，向邻二氯苯中的化合物实施例1.6(0.300g，1.21mmol，1.0 eq)溶液(3mL)中，加入1,3-丙磺酸内酯(0.295g，2.42mmol，2.0eq)，加热至65℃，反应6h，停止反应，冷却至室温，加入乙醚(30mL)，收集沉淀，得到化合物实施例1.7(0.358g，0.968mmol，Y＝80％)
制造化合物1
在室温下，向DMF中的化合物实施例1.3(0.325g，0.54mmol，1.0eq) 溶液(3mL)中，加入化合物实施例1.7(0.200g，0.54mmol，1.0eq)，随后加入三乙胺(0.273g，2.70mmol，5.0eq)，反应12h，停止反应，加入乙醚(30mL)，收集沉淀，经HPLC纯化得化合物1(0.129g，0.162mmol，Y＝ 32％)
制造活化的化合物1
Figure BDA0003017488040000101
在室温下，向DMF中的化合物1(0.050g，0.06mmol，1eq)溶液(2mL) 中，加入N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.021g， 0.07mmol，1.2eq)，随后加入三乙胺(0.160mL)，反应1-2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯(50mL×3)、乙醚(50mL×2)，9000转/min，离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物1(0.047g，0.05mmol，Y＝89％)。
实施例2制造化合物2
化合物2的结构式
Figure BDA0003017488040000102
实施例2.1
Figure BDA0003017488040000103
将4-[(2,3-二甲基-5-磺基-3H-吲哚-3-基)甲基]苯甲酸(2.000g，5.56mmol，1.0eq)和碘甲烷(0.947g，6.67mmol，1.2eq)溶于10mL乙腈中，氮气条件下回流反应24h，停止反应。加入乙酸乙酯50mL，过滤，得目标化合物2.1 (1.614g，3.22mmol，Y＝58％)。
实施例2.2
Figure BDA0003017488040000111
将实施例2.1的化合物(1.000g，2.0mmol，1.0eq)和丙二醛二苯胺盐酸盐(0.569g，2.2mmol，1.1eq)加入到4mL乙酸和4mL乙酸酐的混合溶液中，在120℃下反应1h，停止反应，冷却至室温，加入50mL乙酸乙酯，过滤，得目标化合物2.2(1.008g，1.6mmol，Y＝80％)。
实施例2.3
Figure BDA0003017488040000112
在室温下，向在甲苯中的2-肼基吡啶(2.182g,20mmol)的溶液(60mL)中添加3-甲基-2-丁酮(3.445g,40mmol)。全程在磁子搅拌和氮气保护下进行加热回流，反应12h后即可停止反应。冷却至室温。除去大部分甲苯，在残留物中加入多聚磷酸(12ml)，在140℃下加热并搅拌，反应45min后，将该混合物倒入冰水中(200mL)。添加NaOH(5N)以中和该溶液至pH＝8.0，随后用乙酸乙酯(300 mL)进行萃取。用Na2SO4干燥后，在硅胶柱上纯化残余物，得一种氮黄色固体化合物实施例2.3(1.280g，8mmol，Y＝40％)。
实施例2.4
Figure BDA0003017488040000113
在室温下，向邻二氯苯中的化合物实施例2.3(0.640g，4mmol，1.0eq) 溶液(12mL)中，加入1,3-丙磺酸内酯(0.977g，8mmol，2.0eq)，加热至65℃，反应6h，停止反应，冷却至室温，加入乙醚(100mL)，收集沉淀，得到化合物实施例2.4(0.960g，3.4mmol，Y＝85％)
制造化合物2
Figure BDA0003017488040000121
在室温下，向DMF中的化合物实施例2.2(0.400g，0.63mmol，1.0eq) 溶液(5mL)中，加入化合物实施例2.4(0.211g，0.75mmol，1.2eq)，随后加入三乙胺(0.318g，437μL，3.15mmol，5.0eq)，反应12h，停止反应，加入乙酸乙酯(50mL)，收集沉淀，经HPLC纯化得化合物1(0.109g，0.16 mmol，Y＝25％)
活化的化合物2
Figure BDA0003017488040000122
在室温下，向DMF中的化合物2(0.100g，0.14mmol，1eq)溶液(3mL) 中，加入N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.050g，0.17mmol，1.2eq)，随后加入三乙胺(0.18mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯(50mL×3)、乙醚(50mL×2)，9000转/min，离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物1(0.100g，0.13mmol，Y＝91％)
实施例3制造化合物3
Figure BDA0003017488040000131
化合物3的结构式
制造化合物3
在室温下，向DMF中的化合物实施例1.3(0.325g，0.54mmol，1.0eq) 溶液(3mL)中，加入化合物实施例2.4(0.211g，0.75mmol，1.2eq)，随后加入三乙胺(0.273g，2.70mmol，5.0eq)，反应12h，停止反应，加入乙醚(30mL)，收集沉淀，经HPLC纯化得化合物1(0.142g，0.200mmol，Y＝ 37％)
活化的化合物3
Figure BDA0003017488040000132
在室温下，向DMF中的化合物3(0.050g，0.070mmol，1.0eq)溶液(2 mL)中，加入N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g， 0.084mmol，1.2eq)，随后加入三乙胺(0.160mL)，反应1-2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯(50mL×3)、乙醚(50mL×2)，9000转/min，离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物3(0.052g，0.064mmol，Y＝92％)。
实施例4化合物1-3的紫外可见吸收光谱和荧光光谱测定
用万分之一天平精确称量经过真空干燥后的染料，配制5mmol/L的DMSO 染料母液于棕色样品瓶中，在冰箱中(0-4℃)保存备用。
测试紫外可见吸收光谱和荧光光谱时，用微量移液枪量取1.2μL的探针母液，并将其溶于含有3mL待测溶剂的石英比色皿中，混合均匀，得到探针的浓度为2.0μmol/L，用于吸收光谱和荧光发射光谱的测试。所有测试均在25℃下完成。
如图1所示，化合物1的最大吸收波长较化合物2、化合物3分别红移21nm、 23nm，证明化合物1可以实现近红外吸收。如图2所示，化合物1的最大发射波长相比于化合物2、3也有10nm的红移，证明化合物1可以实现710nm发射波长。
实施例5化合物1-3的绝对荧光量子产率的测定
用由实施例4中的母液，配制2umol/L的1-3化合物的不同溶剂的溶液，经绝对荧光量子产率仪(Hamamatsu,C11347)Ex：650nm下测得对应的绝对荧光量子产率，见表1。
表1
乙醇 甲醇 水
化合物1 0.425 0.421 0.231
化合物2 0.405 0.406 0.258
化合物3 0.471 0.392 0.262
吲哚菁绿 0.076 0.059 0.019
由表1的数据分析，证明化合物1-3在极性有机溶剂中的荧光量子产率高达 40％以上，与商业化的吲哚菁绿相比在水中化合物1也表现出极大提升。说明引入的磺酸基增加了染料的水溶性，降低染料在水中的自淬灭。
实施例6活化的化合物1对赖氨酸的荧光标记
用PBS(pH＝7.4)配制10mmol/L的L-赖氨酸母液于5mL棕色样品瓶中，取50μL浓度为10mmol/L的L-赖氨酸母液于0.5mL离心管，再加入100 μL浓度为5mmol/L的化合物3的母液或活化的化合物3的母液，在台式恒温摇床反应6h后，经高效液相色谱仪(Agilent 1100反相)对染料-赖氨酸键合物分离检测。
理论上分析，在HPLC分离中，物质的出峰位置与被分离化合物的极性和分子量有关。如图5所示，在680nm检测下化合物1在23.6min处出峰，活化的化合物1出峰位置为24.4min比化合物1晚，说明活化后的化合物1极性比未活化的化合物1小。图6是化合物1及其活化产物与L-赖氨酸反应后的HPLC 谱图。从图中可以看出，未活化的化合物1对L-赖氨酸无标记能力，而活化的化合物1与L-赖氨酸的HPLC分离谱在21.4min有一个较大的峰，说明活化的化合物 1对L-赖氨酸有标记能力，且标记后由于化合物1上引入了赖氨酸，使其极性增大，所以其出峰位置较早。通过数据分析，证明活化的化合物1可以用于分子中含有氨基的赖氨酸或者分子中至少含有一个赖氨酸结构的蛋白质的衍生化荧光标记。
以上内容是结合本发明具体的优选实施例对本发明做的进一步阐述，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的技术范围内，做出些许变动或者修饰，均将被视为涵盖在本发明的权利要求之内。

Claims (12)

1.一类含酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料，所述的染料具有通式I的结构：
Figure FDA0003017488030000011
通式I中，
R1和R2各自独立的选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；
R3和R4各自独立的选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；
R5选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的烷基羟基或具有1-18个碳的卤代烷基；
Y-选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-。
2.根据权利要求1所述的染料，其特征在于：当R1为对羧基苯基，R2为磺酸根、磺酸基或磺酸盐时，R3选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根或具有1-18个碳的烷基磺酸盐。
3.根据权利要求1所述的染料，其特征在于，所述R4选自氢、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐或磺酸、具有1-18个碳的烷基或具有1-18个碳的羧烷基。
4.根据权利要求1所述的染料，其特征在于，所述R5选自氢、具有1-18个碳的烷基羟基、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的卤代烷基或具有1-18个碳的羧烷基。
5.根据权利要求1所述的染料，其特征在于，n选自1、2或3。
6.根据权利要求1所述的染料，其特征在于，Y-选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-的任意一种。
7.如权利要求1所述的一类含酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
Figure FDA0003017488030000021
(1)在-10到0℃下，在无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的N-1溶液中，加入TBTU和DIPEA，搅拌0.5-2h，至室温，加入R5取代的胺，反应1-4h，过滤，去除杂质盐，纯化，得到中间体5-含R5取代的酰胺-2,3,3-三甲基-3H-吡咯并[2,3-b]吡啶N-2；
(2)在有机溶剂中，在60-90℃下，含R5取代的5-酰胺-2,3,3-三甲基-3H-吡咯并[2,3-b]吡啶N-2与N烷基化试剂R4取代的卤代烷烃反应，反应3-24h，转变为含N-R4取代侧链的5-含R5取代的酰胺-2,3,3-三甲基-3H-吡咯并[2,3-b]吡啶季铵盐N-4；其中，化合物N-3和N烷基化试剂的摩尔比为1:1-10；化合物N-3经有机溶剂重结晶的纯品；
(3)在有机溶剂中，在60-120℃下，含R1和R2取代的-2,3-二甲基-3H-吲哚Y-1与N烷基化试剂R3取代的卤代烷烃反应，反应8-48h，转变为含N-R3取代侧链的-含R1和R2取代的-2,3-二甲基-3H-吲哚季铵盐Y-2；化合物Y-1和N烷基化试剂的摩尔比为1:1-10；所述化合物Y-2为经有机溶剂重结晶的纯品；
(4)在有机溶剂中，在78-125℃下，所述化合物Y-2和缩合剂S-1反应，反应30-60min，停止反应，得到半菁Y-3；化合物Y-2和缩合剂S-1的摩尔比为1：0.5-1.5，所述化合物Y-3为经有机溶剂重结晶得到纯品；
(5)在有机溶剂中，在室温下，化合物Y-3和化合物N-3在有机碱催化下，反应8-24h，得到产品含酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料化合物I；其中，化合物Y-3和化合物N-4的摩尔比为1:1-4。
其中，在上述步骤(2)中，有机溶剂选自乙醇、苯、甲苯、邻二氯苯的任意一种；重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂；
在上述步骤(3)中，有机溶剂选自苯、甲苯、邻二氯苯、DMF的任意一种；重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂；
在上述步骤(4)中，有机溶剂选自乙醇、乙酸、乙酸酐、DMF的任意一种；重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、水、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂；
在上述步骤(5)中，有机溶剂选自乙腈、DMSO、DMF的任意一种；反应催化剂有机碱选自三乙胺、吡啶和DIPEA中的任意一种。
8.如权利要求1所述的染料的活化产物，其特征在于，所述权利要求1的一类含酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料的羧基由活泼酰亚胺基活化，或由多肽试剂TNTU活化的产物。
9.如权利要求1所述的染料的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的含酰胺取代的氮杂吲哚-五甲川菁染料制备的探针，用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记及DNA测序方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的染料是DNA的组成单位四种脱氧核苷酸或氨基修饰的DNA的组成单位四种脱氧核苷酸特异性染色试剂。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的染料是RNA的组成单位四种核苷酸或氨基修饰的RNA的组成单位四种核苷酸特异性染色试剂。
12.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：在检测应用时荧光成像发射波长为600-950nm。
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