CN116239893A - 一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料及其合成方法和应用 - Google Patents

一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料及其合成方法和应用。其中，一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料，具有如下结构通式I：
Figure DDA0004136437720000011
在传统五甲川菁染料结构基础上引入磺酸基团和季铵盐修饰后得到的新结构染料，具有更好的水溶性。水溶性的提升避免了染料的自淬灭发生，增加了染料的实用性，使得该染料展示出较好的水溶性、生物相容性和较小的生物毒性。该染料具有近红外吸收和高荧光量子产率，可用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记以及DNA测序等方面的应用。

Description

一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及一种菁染料，尤其涉及一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料及其合成方法和应用。
背景技术
荧光染料是指吸收某一波长的光后能发射出另一波长大于吸收光波长的光的物质。随着科技进步，荧光染料作为功能性色素已经广泛应用于多个领域，尤其是在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。目前，菲啶类、吖啶类、咪唑类和花菁家族类等商品化荧光染料在基因组学技术、核酸定量检测、细胞分析等领域中都起到了重要的作用。然而，大部分荧光染料的吸收和发射波长均在紫外-可见光区，使得这类染料在应用于生物样品检测时会存在组织损伤、组织穿透性差、自发荧光干扰、检测效率降低等问题。
近红外荧光探针避开了紫外-可见光区的干扰，具有无损原位连续监测生物体内各参数的潜能，在生物医学检测领域蕴藏巨大的应用前景。与罗丹明、荧光素等荧光染料相比，菁染料作为荧光探针，具有与生物分子结合后荧光较强、细胞毒性小等特点，而且其摩尔吸光系数大，最大吸收波长可调范围大，特别是五甲川菁染料Cy5的激发发射波长在600nm以上，是波长最短的近红外菁染料，以之作为母核开发新一代荧光试剂，在生物医药领域具有广阔的发展空间。
目前针对以五甲川菁染料母核，通过修饰阴离子磺酸基团或修饰阳离子季铵盐基团意图增加染料水溶性，从而增加应用场景功能性的策略已经多见报道，但是将磺酸基团和季铵盐基团共同修饰从而协同提高染料性质的尝试却很少见。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磺酸基团和季铵盐基团共同修饰的新的花菁类荧光染料及其合成方法和应用，以实现花菁荧光染料在DNA测序中应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料，其特征在于，具有如下结构通式I：
Figure BDA0004136437700000021
式I中，R1选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的一种；
R2选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的胺烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的一种；
X选自O、S、Se或CMe2中的一种；
Y选自具有1-18个碳的烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基中的一种；
Z选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-中的一种。
进一步地，当R1为磺酸根或磺酸盐时，R2选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的胺烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根或具有1-18个碳的烷基磺酸盐中的一种。
进一步地，所述Y选自具有1-18个碳的烷基、取代烷基、环烷基或取代环烷基中的任意一种。
为实现上述目的，本发明还提供了如下技术方案：一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的合成方法，包括以下步骤：
(1)在第一有机溶剂中，将含R1取代的苯肼N-1与磺酸修饰的3-甲基-2-己酮反应，反应温度90-120℃，反应时间4-24h，得到含R1取代和磺酸化修饰的化合物N-2，其中，化合物N-1与磺酸修饰的3-甲基-2-己酮的摩尔比为1:(1-1.5)；
Figure BDA0004136437700000031
(2)在第二有机溶剂中，以含有R2取代的卤代烷烃作为N烷基化试剂与步骤(1)制得的化合物N-2反应，反应温度60-120℃下，反应时间8-48h，得到含N-R2取代、侧链含R1取代的磺酸化修饰化合物N-3，其中，化合物N-2与N烷基化试剂的摩尔比为1:(1-10)；
Figure BDA0004136437700000032
(3)在第三有机溶剂中，将步骤(2)制得的化合物N-3与缩合剂S-1反应，反应温度80-125℃，反应时间1-4h，得到半菁化合物N-4，其中，化合物N-3和缩合剂S-1的摩尔比为1:(0.5-1.5)；
Figure BDA0004136437700000033
(4)在第四有机溶剂中，将步骤(3)制得的化合物N-4与含R1取代和含Y修饰的季铵盐化合物M-2在有机碱催化反应，反应时间1-24h，得到目标产物季铵盐修饰的花菁类荧光染料I，其中，化合物N-4和化合物M-2的摩尔比为1:(1-4)。
Figure BDA0004136437700000034
进一步地，在步骤(4)中，所述含R1取代和含Y修饰的季铵盐化合物M-2采用如下方法制备：在第五有机溶剂存在条件下，以含有Y的卤代烷烃作为N烷基化试剂与含R1取代的吲哚杂环M-1反应，反应温度60-120℃，反应时间8-48h，得到含R1取代和含Y修饰的季铵盐化合物M-2；其中，化合物M-1与N烷基化试剂的摩尔比为1:(1-10)；所述第五有机溶剂选自选自苯、甲苯、1,2-二氯苯或DMF中的任意一种。
Figure BDA0004136437700000041
进一步地，在步骤(1)中，所述第一有机溶剂选自有机溶剂选自乙酸、丁酸、甲基磺酸或多聚磷酸中的任意一种；
在步骤(2)中，所述第二有机溶剂选自苯、甲苯、1,2-二氯苯、DMF或环丁砜中的任意一种；
在步骤(3)中，所述第三有机溶剂选自乙醇、乙酸、乙酸酐或DMF中的任意一种；
在步骤(4)中，所述第四有机溶剂选自乙腈、DMSO或DMF中的任意一种。
进一步地，在步骤(2)中，化合物N-2先采用有机溶剂重结晶处理后与N烷基化试剂反应；
在步骤(3)中，化合物N-3先采用液相色谱分离纯化后与缩合剂S-1反应；
在步骤(4)中，在化合物M-2和化合物N-4反应前，将化合物M-2采用液相色谱分离纯化，将化合物N-4采用有机溶剂重结晶处理；
采用液相色谱分离纯化处理的方法为：千分之一三氟乙酸与乙腈的混合溶剂；
有机溶剂重结晶处理过程中，重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇或异丙醇中的至少一种。
进一步地，在步骤(4)中，所述有机碱选自三乙胺、吡啶或DIPEA中的任意一种。
为实现上述目的，本发明还提供了如下技术方案：一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的应用，其特征在于，将所述的季铵盐修饰的花菁类荧光染料制备成探针，所述探针用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记以及DNA测序方面的应用。
进一步地，所述花菁类荧光染料是DNA的组成单位四种脱氧核苷酸或氨基或羧基修饰的DNA的组成单位四种脱氧核苷酸特异性染色试剂。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、本发明提供的季铵盐修饰新型花菁类荧光染料，具有近红外光吸收，最大吸收波长为651nm，最大发射波长为671nm左右。
第二、本发明提供的季铵盐修饰新型花菁类荧光染料具有较好的水溶性，在水溶液中相比商业化染料Cy5具有更大的荧光量子产率。
第三、本发明提供的季铵盐修饰新型花菁类荧光染料可应用于DNA测序中，并且该类染料在蛋白标记、细胞染色等方向具有广阔的应用前景。
本发明的设计方案是在传统五甲川菁染料结构基础上引入磺酸基团修饰，同时从电荷平衡方面考虑引入季铵盐的修饰，设计合成出水溶性更好的新结构染料，水溶性的提升避免了染料的自淬灭发生，增加了染料的实用性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明公开的化合物I-1的高效液相色谱图；
图2为本发明公开的化合物I-1的核磁氢谱图；
图3为化合物在水中的吸收光谱图，其中3a是化合物I-C在水中的吸收光谱，3b是化合物I-1在水中的吸收光谱；
图4为化合物在水中的发射光谱图，其中4a是化合物I-C在水中的发射光谱，4b是化合物I-1在水中的发射光谱；
图5为化合物在水中的量子产率图，其中5a是化合物I-C在水中的量子产率，5b是化合物I-1在水中的量子产率；
图6为化合物荧光标记测序分子在水中的吸收光谱，其中6a是化合物I-C荧光标记测序分子在水中的吸收光谱，6b是化合物I-1荧光标记测序分子在水中的吸收光谱；
图7为化合物荧光标记测序分子在水中的荧光光谱，其中7a是化合物I-C荧光标记测序分子在水中的荧光光谱，7b是化合物I-1荧光标记测序分子在水中的荧光光谱；
图8为化合物荧光标记测序分子在水中的量子产率，其中8a是化合物I-C荧光标记测序分子在水中的量子产率，8b是化合物I-1荧光标记测序分子在水中的量子产率；
图9为荧光标记测序分子在MGISEQ2000上进行PE150的测序信号值比较分析图。对照组为I-C荧光标记测序分子的测序结果，样品组为I-1荧光标记测序分子的测序结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-9，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘。
本发明中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。
本文中所述染料的盐形式可以直接用于生物样品染色。或者，通过衍生修饰以衍生物的形式使用。
本申请所涉及的仪器和设备：本发明柱层析过程中，采用购于烟台维启化工有限公司的200-300目、100-200目柱层析硅胶和采购于国药集团20-40目分析纯石英砂。反相纯化色谱仪为清博华的LC300快速纯化制备色谱。
染料吸收和发射光谱用岛津公司的RF6000荧光分光光度计测得。染料的绝对荧光量子产率使用岛津公司的ISR-100配套积分球测得。
原料和/或中间体的制备例
制备例1
化合物M-2a(2,3,3-三甲基-1-(5-(三甲基氨)戊基)-3H-吲哚-1-正离子-5-磺酸酯溴化)的合成
化学物M-2a的结构为：
Figure BDA0004136437700000071
(1)化合物1.1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸)的合成
Figure BDA0004136437700000072
将苯肼-4-磺酸(20.0g，106mmol)和甲基异丙基甲酮(35.0mL，320mmol)加入到250mL单口瓶中，随后加入60mL乙酸，将混合物进行温度在110℃的油浴上回流反应4h。反应完毕，将反应液冷却至室温，静止过夜，次日，将反应液过滤，除去乙酸，得到粉红色固体24.0g(LCMS purity:86％,yield:81％)。
(2)化合物1.2(2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾)的合成
Figure BDA0004136437700000073
取步骤(1)的粉红色固体(19.0g，79.0mmol)加到30mL甲醇和异丙醇的混合溶液(V/V＝1/1)中，然后加入KOH(4.80g，87.0mmol)，将混合物在70℃下搅拌2h。反应完毕，将反应液冷却至室温，析出固体，将反应液过滤，将滤饼干燥得到21.0g粉红色粉末化合物1.2粗品(LCMS purity:85％，yield:～75％)。
(3)化合物M-2a(2,3,3-三甲基-1-(5-(三甲基氨)戊基)-3H-吲哚-1-正离子-5-磺酸酯溴化)的合成
Figure BDA0004136437700000081
取步骤(2)合成的化合物(2.00g，7.30mmol)加到20mL的1，2-二氯苯中，然后加入5-溴戊基溴化铵(2.30g，8.10mmol)，在氮气的保护下加热到110℃反应12h。反应完毕，将反应液冷却至室温，固体结块，倒出二氯苯，加入石油醚洗涤固体3次(30mL x 3)，然后加入100mL的纯化水溶解固体，过滤，滤液经制备分离纯化得到2.60g淡红色油状化合物M-2a(LCMS purity:95％,yield:～96％)。
制备例2
化合物2.1(4-甲基-5-羰基己烷-1-磺酸)的合成
Figure BDA0004136437700000082
将NaH(2.70g，60wt％，70.0mmol)加到100mL的无水THF中，在氮气保护下，在0℃下慢慢滴加化合物2-甲基乙酰乙酸乙酯(10.0g，70.0mmol)的无水THF溶液，滴毕，室温条件下搅拌2h，随后向反应液中加入1,3-丙磺酸内酯(8.42g，70.0mmol)，加入完毕后，40℃油浴中继续搅拌2h。反应结束后，旋蒸浓缩除去溶剂，残留部分加入100mL纯化水，用乙酸乙酯(100mLx3)萃取，去掉有机相，水相加入100mL浓盐酸，回流搅拌2h。反应结束后，旋蒸浓缩除去溶剂，残留用MeOH溶解，过滤除去白色固体，滤液浓缩旋干得10.4g棕黄色油状液体化合物2.1(yield:78％)。
实施例
季铵盐修饰的花菁类荧光染料I的合成：
Figure BDA0004136437700000091
实施例1
化合物I-1的合成
化合物I-1的结构为
Figure BDA0004136437700000092
(1)化合物3.1(2,3-二甲基-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚-5-磺酸)的合成
Figure BDA0004136437700000093
将制备例2合成的化合物2.1(8.40g，43.3mmol)和苯肼-4-磺酸(8.50g，43.3mmol)加到40mL的醋酸中，加完后在氮气的保护下，加热到110℃搅拌4h。反应完毕，反应液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到15g棕黄色油状化合物3.1粗品。
(2)化合物3.2(2,3-二甲基-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚-5-磺酸钾)的合成
Figure BDA0004136437700000094
将步骤(1)制得的化合物3.1(15.0g，43.3mmol)和KOH(5.02g，86.6mmol)加到甲醇和异丙醇混合溶剂中(50mL,V/V＝1/1)，加完后在氮气的保护下，加热到70℃反应1h。反应完毕，反应液冷却至室温，抽滤后得16g土灰色固体化合物3.2粗品。
(3)化合物3.3(1-(5-羧基戊基)-2,3-二甲基-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚-1-正离子-5-磺酸酯)的合成
Figure BDA0004136437700000101
将步骤(2)合成的化合物3.2(5.00g，14.4mmol)、溴己酸(4.25g，21.6mmol)和NaI(3.25g，21.6mmol)加到30mL环丁砜溶剂中，加完后在氮气的保护下，加热到110℃搅拌12h。反应完毕，反应液冷却至室温，将反应液慢慢加入到300mL乙酸乙酯中，搅拌使固体析出，随后抽滤，旋蒸除去固体中残留溶剂，得棕黄色固体10g，固体经制备分离纯化后得到1.6g黄色固体化合物3.3(HPLCpurity:95％,yield:24％)。
(4)化合物3.4(1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E)-4-(N-N-苯乙酰氨基)丁-1,3-二烯-1-基)-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚-1-正离子-5-磺酸酯)的合成
Figure BDA0004136437700000102
将步骤(3)合成的化合物3.3(600mg，1.30mmol)和丙二醛双苯亚胺单盐酸盐(370mg，1.43mmol)加到5mL醋酸酐和5mL醋酸混合溶剂中，加完后在氮气的保护下，加热到110℃反应4h。反应完毕，反应液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，残留固体用乙酸乙酯(50mL)析晶，抽滤后得到800mg棕黄色固体粉末化合物3.4粗品。
(5)化合物I-1的合成
Figure BDA0004136437700000103
将步骤(4)合成的化合物3.4(700mg，1.10mmol)加入到10mL乙腈中充分溶解，随即冰浴，将制备例1制得的化合物M-2a(560mg,1.50mmol)加入到乙酸和醋酸混合溶剂(5mL,V/V＝1/1)中充分溶解，两者混合后，冰浴条件下，慢慢滴加DIPEA(800mg，6.05mmol)，滴加完毕后撤去冰浴，室温搅拌1h。反应完毕，反应液直接加入100mL的纯化水稀释，过滤后滤液经分离纯化得到300mg蓝色固体化合物I-1(HPLCpurity:99％,yield:23％)。LRMS(ESI)：[C41H58N3O11S3]+，测量值864.5,计算值864.3。
实施例2
和实施例1的区别仅在于，在步骤(5)中，所述化合物M-2b采用制备例1的方法合成，得到蓝色固体化合物I-2。
实施例3
化合物I-1荧光标记测序分子的合成
Figure BDA0004136437700000111
化合物I-1(200mg)溶解于DMF(3mL)中，氮气保护下加入TNTU(1.1eq)和TEA(3.0eq)，室温搅拌2小时,再加入Linker-Azide dNTP(1.1eq)，室温搅拌16小时，反应完毕，反应液制备纯化得到蓝色固体260mg(HPLCpurity:99％)。
实施例4
和应用例1的区别在于，采用化合物I-2溶解于DMF(3mL)中，反应液制备纯化得到蓝色固体(HPLCpurity:99％)。
实施例5
化合物I-C荧光标记测序分子的合成
Figure BDA0004136437700000112
将商业化染料Cy5(化合物I-C)(200mg)溶解于DMF(3mL)中，氮气保护下加入TNTU(1.1eq)和TEA(3.0eq)，室温搅拌2小时,再加入Linker-Azide dNTP(1.1eq)，室温搅拌16小时，反应完毕，反应液制备纯化得到蓝色固体188mg(HPLCpurity:99％)。
实施例6
化合物I-1以及化合物I-C的紫外可见光谱、荧光光谱以及量子产率测定：
用万分之一天平精确称量干燥后的染料，配制5mmol/L的水溶液染料母液于棕色样品瓶中，在4℃冰箱中保存备用。
测试紫外可见吸收光谱和荧光光谱时，用移液枪量取10μL的染料母液，并将其溶于水稀释成含浓度为2.0μmol/L的25mL的待测溶液，转移2mL待测溶液至石英比色皿中，用于吸收光谱和荧光发射光谱以及量子产率的测试。
以商业化染料Cy5(化合物I-C)作为对照，所有测试均在25℃下完成，测试结果如图3-5，测试数据如表1-3展示。
表1各种化合物的最大吸收波长与吸光度值
化合物名称 波长(nm) Abs.
I-C 646.5 0.485
I-1 651.0 0.493
I-C荧光标记测序分子 650.0 0.610
I-1荧光标记测序分子 654.5 0.369
表2各种化合物的最大发射波长与荧光强度值
化合物名称 波长(nm) 荧光强度
I-C 667.0 1867344.5
I-1 671.0 1592477.5
I-C荧光标记测序分子 670.0 1264422.9
I-1荧光标记测序分子 675.0 1494479.7
表3各种化合物的各项量子产率参数
化合物名称 AF QEin QEex Sem
I-C 0.3397 0.2329 0.0791 468794
I-1 0.2067 0.2763 0.0571 329693
I-C荧光标记测序分子 0.3440 0.2047 0.0704 470653
I-1荧光标记测序分子 0.3612 0.2232 0.0806 487758
从图3-5及表1-3可以看出，化合物I-1的最大吸收波长为651nm，与商业化染料Cy5的最大吸收波长646.5nm相差仅4.5nm，该数值在光学检测设备误差范围内。化合物I-1在651nm波长激发光的激发下检测荧光发射光谱，其最大发射波长为671nm，与商业化染料Cy5的最大发射波长为667nm相差仅4nm。在水溶液中，化合物I-1的量子产率27.6％，而商业化染料Cy5的量子产率约为23.3％。因此，从最大吸收波长和最大发射波长来看，化合物I-1相比于商业化染料Cy5略有红移；从量子产率来看，化合物I-1的表现稍优于商业化染料Cy5。
实施例7
化合物I-1以及化合物I-C的荧光标记测序分子的紫外可见光谱、荧光光谱以及量子产率测定：
用万分之一天平精确称量干燥后的染料，配制5mmol/L的水溶液染料母液于棕色样品瓶中，在4℃冰箱中保存备用。
测试紫外可见吸收光谱和荧光光谱时，用移液枪量取10μL的染料母液，并将其溶于水稀释成含浓度为2.0μmol/L的25mL的待测溶液，转移2mL待测溶液至石英比色皿中，用于吸收光谱和荧光发射光谱以及量子产率的测试。以商业化染料Cy5(化合物I-C)标记的测序分子作为对照，所有测试均在25℃下完成，测试结果如图6-8，测试数据如表1-3展示。
从图6-8可以看出，化合物I-1荧光标记测序分子的最大吸收波长为654.5nm，与商业化染料Cy5标记的测序分子的最大吸收波长650nm相差近4.5nm，该数值在光学检测设备误差范围内。化合物I-1荧光标记测序分子在655nm波长激发光的激发下检测荧光发射光谱，其最大发射波长为675nm，与商业化染料Cy5标记的测序分子的最大发射波长为670nm相差仅5nm。在水溶液中，化合物I-1荧光标记测序分子的量子产率22.3％，而商业化染料Cy5标记的测序分子的量子产率约为20.5％。因此，从最大吸收波长和最大发射波长来看，化合物I-1荧光标记测序分子相比于商业化染料Cy5标记的测序分子略有红移；从量子产率来看，化合物I-1的标记测序分子的表现稍优于商业化染料Cy5标记的测序分子，但相比染料本身较差。
实施例8
化合物I-1与商业化染料Cy5标记测序分子的高通量测序：
华大智造的高通量测序仪的测序原理是在建库完成后，通过酶促的滚环扩增反应以环状文库为模板合成长单链缠绕的DNA纳米球，接着将纳米球加载至规则矩阵式的测序芯片上后，使用边合成边测序的方法利用测序分子的光学信号对碱基的序列进行解码。用化合物I-1作为信号分子，与边合成边测序基因测序体系的对应分子进行偶联，选用商业化染料Cy5作为化合物I-1的对照信号分子同样进行测序修饰，使用华大智造测序仪MGISEQ2000进行300个碱基配对聚合循环的信号采集，其结果见表4。
表4
Figure BDA0004136437700000141
表4中Control栏为Cy5对照栏，Sample栏为化合物I-1的测试栏，各4个平行run。
结合表4和图9的上机结果表明，化合物I-1可以适用于MGISEQ2000基因测序平台，各项关键指标如Q30、Runon、Lag值等均满足测序参数要求，且在稳定性、精准度和错误率的表现上都不劣于商业化染料Cy5。此外，虽然在上机测试时化合物I-1的亮度表现约为商业化染料Cy5的八成左右，但并未显著影响化合物I-1的测序性能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料，其特征在于，具有如下结构通式I：
Figure FDA0004136437690000011
式I中，R1选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的一种；
R2选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的胺烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐、芳基、芳基羧酸基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的一种；
X选自O、S、Se或CMe2中的一种；
Y选自具有1-18个碳的烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基中的一种；
Z选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料，其特征在于，当R1为磺酸根或磺酸盐时，R2选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的胺烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根或具有1-18个碳的烷基磺酸盐中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料，其特征在于，所述Y选自具有1-18个碳的烷基、取代烷基、环烷基或取代环烷基中的任意一种。
4.如权利要求1-3任意一项所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在第一有机溶剂中，将含R1取代的苯肼N-1与磺酸修饰的3-甲基-2-己酮反应，反应温度90-120℃，反应时间4-24h，得到含R1取代和磺酸化修饰的化合物N-2，其中，含R1取代的苯肼N-1与磺酸修饰的3-甲基-2-己酮的摩尔比为1:(1-1.5)；
Figure FDA0004136437690000021
(2)在第二有机溶剂中，以含有R2取代的卤代烷烃作为N烷基化试剂与步骤(1)制得的化合物N-2反应，反应温度60-120℃下，反应时间8-48h，得到含N-R2取代、侧链含R1取代的磺酸化修饰化合物N-3，其中，化合物N-2与N烷基化试剂的摩尔比为1:(1-10)；
Figure FDA0004136437690000022
(3)在第三有机溶剂中，将步骤(2)制得的化合物N-3与缩合剂S-1反应，反应温度80-125℃，反应时间1-4h，得到半菁化合物N-4，其中，化合物N-3和缩合剂S-1的摩尔比为1:(0.5-1.5)；
Figure FDA0004136437690000023
(4)在第四有机溶剂中，将步骤(3)制得的化合物N-4与含R1取代和含Y修饰的季铵盐化合物M-2在有机碱催化反应，反应时间1-24h，得到目标产物季铵盐修饰的花菁类荧光染料I，其中，化合物N-4和化合物M-2的摩尔比为1:(1-4)。
Figure FDA0004136437690000024
5.根据权利要求4所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述含R1取代和含Y修饰的季铵盐化合物M-2采用如下方法制备：在第五有机溶剂存在条件下，以含有Y的卤代烷烃作为N烷基化试剂与含R1取代的吲哚杂环M-1反应，反应温度60-120℃，反应时间8-48h，得到含R1取代和含Y修饰的季铵盐化合物M-2；其中，化合物M-1与N烷基化试剂的摩尔比为1:(1-10)；所述第五有机溶剂选自选自苯、甲苯、1,2-二氯苯或DMF中的任意一种。
Figure FDA0004136437690000031
6.根据权利要求4所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述第一有机溶剂选自有机溶剂选自乙酸、丁酸、甲基磺酸或多聚磷酸中的任意一种；
在步骤(2)中，所述第二有机溶剂选自苯、甲苯、1,2-二氯苯、DMF或环丁砜中的任意一种；
在步骤(3)中，所述第三有机溶剂选自乙醇、乙酸、乙酸酐或DMF中的任意一种；
在步骤(4)中，所述第四有机溶剂选自乙腈、DMSO或DMF中的任意一种。
7.根据权利要求4所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，在步骤(2)中，化合物N-2先采用有机溶剂重结晶处理后与N烷基化试剂反应；
在步骤(3)中，化合物N-3先采用液相色谱分离纯化后与缩合剂S-1反应；
在步骤(4)中，在化合物M-2和化合物N-4反应前，将化合物M-2采用液相色谱分离纯化，将化合物N-4采用有机溶剂重结晶处理；
采用液相色谱分离纯化处理的方法为：千分之一三氟乙酸与乙腈的混合溶剂；
有机溶剂重结晶处理过程中，重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇或异丙醇中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述有机碱选自三乙胺、吡啶或DIPEA中的任意一种。
9.一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的应用，其特征在于，将权利要求1-3任意一项所述的季铵盐修饰的花菁类荧光染料制备成探针，所述探针用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记以及DNA测序方面的应用。
10.根据权利要求9所述的一种季铵盐修饰的花菁类荧光染料的应用，其特征在于，所述花菁类荧光染料是DNA的组成单位四种脱氧核苷酸或氨基或羧基修饰的DNA的组成单位四种脱氧核苷酸特异性染色试剂。
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