KR0177890B1

KR0177890B1 - 반응특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응용 튜브

Info

Publication number: KR0177890B1
Application number: KR1019960005650A
Authority: KR
Inventors: 조철만; 이운영; 김영환; 최건혁
Original assignee: 이병언; 주식회사중외제약
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1996-03-05
Publication date: 1999-04-01
Also published as: KR970065727A

Abstract

본 발명은 중합효소 연쇄반응용 튜브 또는 원심분리용 튜브의 내측면에 중합효소 연쇄반응에 필수 성분인 마그네슘클로라이드, 데옥시뉴클레오사이드트리포스페이트, 프라이머 및 열배 증폭 완충액에서 선택된 1종 이상을 적당한 농도의 비이온성 계면활성제와 혼합한 후, 튜브 내측면에 피페팅하고 미리 녹여둔 왁수로 코팅하여 제조된 반응 특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응에 사용되는 튜브에 관한 것이다.

Description

반응특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응용 튜브

제1도는 본 발명 튜브의 구조 및 그 사용방법을 나타낸 것이다.

제2도는 본 발명으로 제조한 튜브를 이용하여 PCR을 행한 결과와 일반적인 튜브를 이용하여 PCR을 행한 결과를 비교한 전기영동사진이다.

제3도는 본 발명으로 제조한 튜브를 이용하여 PCR을 행한 결과와 일반적인 튜브를 이용하여 PCR을 행한 결과를 비교한 전기영동사진이다.

제4도는 본 발명으로 제조한 튜브를 이용하여 PCR을 행한 결과와 일반적인 튜브를 이용하여 PCR을 행한 결과를 비교한 전기영동사진이다.

본 발명은 중합효소 연쇄반응을 수행하는데 사용되는 중합효소 연쇄반응의 특이성을 높이는 튜브에 관한 것이다. 더욱 상세히는, 왁스를 이용하여 하나 또는 둘 이상의 반응 필수 성분을 튜브의 벽면에 코팅함으로써 바람직하지 않은 부반응이 감소된 중합효소 연쇄반응에 사용되는 튜브에 관한 것이다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 반대편가닥에 하이브리다이즈되어 표적DNA의 원하는 영역을 효소적으로 합성해 나가는 인 비트로(in vito)방법이다. 주형의 변성, 프라이머 결합, DNA중합효소에 의해 결합된 프라이머가 연장되는 일련의 반복되는 과정이 일어나며, 프라이머의 5'말단에 의하여 중합이 끝난 특이 분절체가 기하급수적으로 축적된다. 한 주기에서 합성된 프라이머의 연장 산물은 다음 주기의 주형으로 작용하므로, 합성된 DNA의 카피수는 매주기마다 약 2배씩 증가한다. 이런 식으로 PCR이 30주기가 시행되면 약 10억배(2³⁰)의 증폭이 일어난다. PCR 기술과 시약에 대해서는 비합중국특허 제 4,800,159호, 제4,683,202호와 제4,683,195호에 잘 기술되어 있다.

PCR이 처음 개발되었을 때는 결합된 프라이머를 연장시키기 위하여 대장균 DNA중합효소의 클레나우 분절(Klenow fragment)을 사용하였다. 이 효소는 각 주기가 시작될 때 두개의 DNA 가닥이 분리되는데 필요한 온도에서는 불활성화되었다. 결과적으로 매 주기마다 새로운 효소를 첨가해야 했다. 더무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)에서 분리된 열안정성 DNA중합효소(미합중국특허 제5,079,352호)가 발견되면서 PCR은 열순환기구에 의해 간단하고 강력한 자동화반응으로 전환되었다. 반응 조성물(주형, 프라이머, 열안정성 중합효소, 데옥시뉴클레오사이드트리포스페이트, 증폭완충액)을 모두 합쳐 반응 시험관 내에서 단순하게 온도만을 변화시킴으로써 증폭반응을 수행할 수 있다. 주어진 올리고뉴클레오타이드프라이머에 대하여 최적조건이 설정이 되어야 하기는 하지만, 모든 가능한 반응에 최적인 단일 조건은 없다.

PCR의 특이성은 아가로스겔 전기영동을 하여 나타나는 표적절편을 다른 산물과 비료함으로써 전형적으로 분석할 수 있다. 초기의 PCR방법은 37℃에서 클네나 분절에 의한 DNA 합성을 기초로하여 DNA를 증폭하는 방법이었는데, 반응온도가 낮기 때문에 반응의 특이성은 그다지 좋지 않았다. 그리하여 특이 표적절편이 일억배 정도까지 증폭될 수는 있었지만, 사실 표적절편은 합성된 산물의 일부에 지나지 않았다. 따라서, 어떤 경우에는 증폭된 표적서열을 검출하고 특성을 밝히기 위하여 본래의 프라이머 안쪽에 위치하는 내부 프라이머(nested primers)를 사용하여 다시 PCR을 하거나 특이 하이브리디제이션 탐침을 이용하여 분석하는 과정이 필요하였다. 그러나 열안정성중합효소를 사용하면서 PCR 과정이 단순해질뿐 아니라 특이성과 반응산출양이 현저하게 증가되었다. 이는 열안정성중합효소의 최적온도(72℃)가 더 높아짐으로써 프라이머의 결합과 연장에 더 높은 온도를 사용할 수 있게 되었으며, 이로써 반응이 더 정확하게 일어나 주형과 미스매치된 프라이머의 연장을 최소화할 수 있게 되었기 때문이다. 더우기 PCR에서 특이성 증가는 효소와 프라이머에 대한 비표적 산물의 경쟁을 감소시켜 증폭된 산물의 생성양도 증가시킨다.

그러나 PCR반응은 주기의 후반에 가면, 효소양이 한 주기내에 형성된 프라이머와 주형의 복합체를 모두 연장시킬만큼 충분하지가 않아서 효율저하를 가져오고 증폭 반응에서의 고지(plateau)에 이르게 된다. 이 현상은 클레나우 분절을 사용할때 보다 열안정성중합효소를 사용하는 PCR에서 훨씬 나중에 (1마이크로그램의 주형 DNA를 사용하였을 때 20이 아닌 30주기 쯤에서)일어나게 된다. 이것은 열안정성 중합효소를 사용하는 PCR의 특이성이 훨씬 증가되었기 때문이다. 열안정성 중합효소에 의해 특이성 및 생성양 증가와 더불어,비록 효율이 떨어지기는 하지만 클레나우분절로 증폭 가능한 크기인 400염기쌍 보다는 더욱 긴 10,000염기쌍 크기의 긴 절편의 증폭도 가능하게 되었다.

일반적인 PCR을 이용하여 단일카피의 표적DNA를 증폭, 검출하는데 있어서 주요한 장애는 미스프라이밍(mis-priming)과 프라이머 다이머리제이션(primer dimerization)등과 같은 부반응이다. 대부분의 부반응은 PCR이 진행되기전 즉, 모든 반응성분이 혼합된 상태에서 반응의 사이클링이 진행되기전 실온에서 몇분 아니 몇십초 이내에 일어난다. 이 부반응을 최소화하기 위해 고안된 것이 핫스타트(hot start) PCR이다.

핫스타트 PCR에서는 프라이머가 비표적 서열에 결합하는 것을 억제할 수 있을 정도의 온도에 도달할 때까지는 모든 반응성분이 섞이지 않도록 고안한다. 수작업으로 이루어지는 핫스타트 방법에서는, 실온에서 열안정성중합효소 이외의 반응성분을 미네랄오일막 아래에 섞은 다음, 튜브를 PCR반응기에 옮겨져서 온도가 60-80℃에 이른 후에, 효소를 별도로 각각의 튜브에 첨가한다. 비록 이러한 수작업으로 핫스타트의 이행은 되지만, 한 실험에서라도 각각의 튜브는 다른 실험조건을 가지고 있기 때문에 근본적으로 부정확하며, 오류와 오염이 일어나기 쉽고 불편하다.

핫스타트를 수작업으로 수행하는 방법의 불편한점을 제거하기 위해서 사용되는 방법으로는 PCR 반응 혼합물 위에 왁스비드나 반응튜브에 왁스만을 붙여 둔 것을 사용하여 보호막을 형성하는 것이다. 생략된 시약은 왁스막의 위에 첨가시켜, 왁스가 녹는 온도에 이르는 즉시 반응물에 혼입된다. 왁스를 사용하는 이 방법은 고유의 녹는점을 가지는 왁스를 사용함으로써 더욱 정확한 PCR에서의 온도조절은 가능하게 되었지만, 여전히 불편하고 피펫팅이나 오염 등의 오류를 가져올 가능성이 잇다.

핫스타트 방법의 불편한점과 오류를 줄이기 위하여 개발된 또 하나의 방법은 PCR의 반응성분들 중 데옥시뉴클레오사이드트리포스페이트나 열안정성중합효소를 왁스메디움펠렛으로 제조하는 것이다. 반응시 PCR 반응성분과 함께 왁스펠렛을 첨가하여 왁스가 녹는 온도가 되어서야 왁스메디움에 섞여있는 반응 필수성분이 다른 성분과 혼합되어 PCR이 진행되게 함으로써 핫스타트 방법을 간편화하고 피펫팅의 오류를 줄일 수 있는 방법으로 제시되었다.(WO 제 95-11,315호). 그러나 왁스메디움 펠렛을 제조하는데는 왁스 메디움에 PCR 반응에 필요한 한개의 시약을 혼합시킨 후 에멀젼화 하고 냉각, 경화, 그라인딩시켜 펠렛을 제조하는 다섯단계의 제조공정이 요구되었다. 또한 연구용이나 진단 킷트등에 포함시켜 사용하기에 왁스 펠렛은 직접 다른 반응성분과 함께 반응튜브에 넣어야 함으로써 오염이나 분리 보관해야하는 문제점이 있었다.

따라서 본 발명의 목적은 중합효소 연쇄반응용 튜브 또는 원심분리용 튜브 내측면에 중합효소 연쇄반응에 필수 성분인 마그네슘클로라이드, 데옥시뉴클레오사이드프리포스페이트, 프라이머 및 열배 증폭 완충액에서 선택된 1종 이상을 적당한 농도에 비이온성 계면활성제와 혼합한 후, 튜브 내측면에 피페팅하고 미리 녹여둔 왁스로 코팅하여 제조된 반응의 특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응에 사용되는 튜브를 제공하는 것이다. 또한 이런한 튜브를 이용하여 DNA를 증폭시키고 핵산서열을 판독하기 위한 키트를 제조하는 것이다.

본 발명은 반응 튜브 벽면에 반응시 필수성분중 하나 또는 두가지 이상을 피펫팅한 후 그 위에 왁스로 코팅함으로써 반응에 필요한 나머지 성분을 반응튜브에 넣고 반응을 수행하면, 적어도 왁스가 녹는 온도가 되어야지만 정성적인 반응이 시작된다. 따라서 PCR에서 처럼 왁스가 녹는 온도이하에서 일어날 수 있는 미스 프라이밍(mis-priming)과 프라이머 다이머리제이션(primer dimeriztion)과 같은 부반응을 제거시킴으로써 반응의 특이성을 증가시킬 수 있는 방법이다. 그리고 반응 튜브의 벽면에 반응에 필수적인 성분 하나 또는 두가지 이상을 왁스로 코팅하는 방법에 관한 기술이다. 본 발명은 기조방법에서 해결할 수 없었던 오염과 분리보관 등의 문제가 완전히 제거되어 특히 진단킷트용으로 우수한 장점을 가진다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 몇몇 용어를 다음과 같이 정의한다.: 용어 성분(reagent)은 화학이나 생화학반응에 참여하는 물질로 정의하며, 여기에는 반응물과 촉매 등이 있다. 다시 말하지면, 화학이나 생화학반응에 들어가는 원자, 이온, 분자 등을 말한다. 여기서 반응물은 반응에 꼭 필요로 하거나 혹은 필요로하지 않은 물질을, 그리고 촉매는 반응의 속도를 바꿀수 있는 무기 혹은 유기물질을 정의 한다.

용어왁스는 지방산과 긴 사슬의 알콜이 에스테르 결합으로 연결된 비이온성 물질을 말하며, 더 자세히 말하면, 바라지 않는 부반응이 일어날 수 있는 온도보다는 높고 반응혼합물의 끊는 온도보다는 낮은 온도에서 녹는점을 가지는 왁스를 칭한다, 예를 들면, PCR용 왁스(Dynawax)와 파라핀왁스 등을 말한다.

용어 프라이머는 핵산 스트랜드에 대해 상보적인 올리고뉴클레오타이드로 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하, 즉 적합한 온도 및 적당한 완충제와 4개의 상이한 데옥시리보뉴클레오사이드트리포스페이트 및 중합효소(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)의 존재하에서 DNA합성 개시점으로 작용할 수 있는 천연 또는 합성 물질을 칭한다.

용어열안정성중합효소는 열에 비교적 안정하고 뉴클레오사이드트리포스페이트의 중합화를 촉매하여 표적서열의 핵산 스트랜드 중 하나에 대해 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성하는 효소를 칭한다. 효소는 3' 말단에서 합성을 개시하고 합성이 종료될 때까지 5' 말단의 방향으로 진행한다. 정제된 열안정성 중합효소는 미합중국 특허 제4,889,818호에 더욱 상세하게 기재되어 있다.

용어 역전사효소는 뉴클오사이드 트리포스페이트의 중합을 촉매하여 리보핵산 주형에 대해 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성하는 효소를 정의한다. 이 효소는 프라이머의 3' 말단에서 합성을 개시하여 합성이 종료될때 까지 5' 말단의 방향으로 진행한다. RNA 표적서열을 상보적인 DNA (cDNA)서열로 전환 시키는데 적합한 중합효소의 예로서는 조루 골수아구종증 바이러스(avianmyoblastosis Virus) 역전사효소와 열안정성 DNA중합효소의 활성을 가지면서 더불어 역전사효소의 활성이 있는 더무스 더문필러스(Themus Thermophilus) DNA중합효소 등 있다.

본 발명은 미합중국 특허 제4,800,159호, 제4,683,202호, 그리고 제4,683,193호 에서 상세히 설명된 PCR 에 응용될 수 있는 기술이다. 구체적으로 왁스는 미네랄오일을 대신하는 역할을 할 수 있으며, Quin과 Will(Nucleic Acids Research, vol.20(7), pp 1717-1723(1992)), 그리고 Bassam과 Caetano-Anolles의 (bio/techniques, vol. 14, pp 31-33(1993))에 의해서 보고된 핫스타트(hot start) 기술 즉, PCR 성분들중 프라이머의 녹는점보다 높은 온도가 될때 까지 하나 혹은 그 이상의 필수성분을 첨가하지 않다가 프라이머의 녹는점 이상의 온도가 될때 첨가함으로써 작용하는 기술을 자동화하는데 사용할 수 있다. 따라서 이 기술을 낮은 온도에서 일어나는 잘못된 프라이밍을 제거하고 비특이적인 PCR 생성물의 합성을 감소시킨다.

본 발명은 PCR 혹은 원심분리용 튜브의 벽면에 반응 필수성분중 하나 혹은 그 이상을 왁스로 코팅하여 반응튜브를 제조하는 방법이다. PCR 필수성분중 튜브의 벽면에 코팅할 수 있는 성분으로는 PCR 의 성분에 포함되는 것들 중에서 마그네슘클로라이드, 데옥시뉴클레오사이드트리포스페이트, 프라이머, 그리고 열배증폭완충액 등이 될 수 있다. 안정성의 측면에서는 마그네슘클로라이드와 열배증폭완충액이 우수한 성분이 될 수 있으며, 반응에서 아주 고농도로 첨가됨으로써 농도에 제한을 받지 않는 데옥시뉴클레오사이드트리포스페이트와 프라이머도 좋은 성분이다.

본 발명에서 PCR성분중 필수성분을 왁스로 코팅하는 위치는 튜브에서 왁스가 녹았을 때 나머지 반응성분의 윗부분을 자연스럽게 덮을수 있는 위치가 좋다. 상세히 말하면, 튜브를 바로 세웠을 때 왁스에 코팅되지 않은 성분이 있는 부분의 윗부분이 가장 적합하다. 그리고 증발을 막기 위해 사용하는 미네랄오일을 대신하는 코팅왁스의 부피는 중요한데, 왁스부피는 증폭에 사용하는 튜브의 크기 뿐만 아니라 증폭에 사용되는 반응성분의 부피에 따라 다양할 수 있다. 그러나 일반적으로 10-40㎕를 사용한다. 본 발명의 효과를 최적화하기 위하여 다양한 녹는점을 가지는 왁스를 사용할 수 있는데, 이때 왁스의 녹는점은 50∼80℃이고 일반적으로 낮은 녹는점이 요구될 때는 PCR용 왁스(예, Dynawax)를 그리고 높은 녹는점이 요구될 때는 파라핀왁스를 사용하며, 상기 두 왁스 성분을 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, PCR에서 왁스의 녹는점이 프라이머의 녹는점보다 높아야 하며 더불어 반응성분의 증발이 방지되는 60-70℃ 사이가 적절하므로 보통 PCR용 왁스(예, Dynawax)를 사용하면 된다.

본 발명의 특이사항으로 반응온도가 왁스 녹는점 이상이 되었을때 왁스가 녹으면서 왁스로 코팅된 필수성분이 반응의 나머지 성분이 있는 방향으로 미끌어져 내려온다. 그러나 왁스로 코팅된 필수성분은 수용성이라 왁스로 둘러 싸여져 에멀젼을 형성하게 된다. 이 에멀젼은 상당히 안정하여 반응이 진행될 때에도 왁스로 코팅되었던 필수성분이 반응의 나머지 성분과 섞이지 않아 PCR반응이 일어나지 않는 결과를 낳는 경우가 있다. 따라서 구성된 반응성분을 저해하지 않는 계면활성제를 왁스로 코팅되는 필수성분과 혼합하거나 반응의 나머지 성분과 혼합함으로써 이 문제를 해결할 수 있었다. 본 발명에서는 왁스로 코팅되는 필수성분에 계면활성제를 첨가하는 방법을 사용하였는데 이는 나머지 반응성분에 계면활성제를 첨가하는 것보다 효율적이라 판단되었기 때문이다.

이러한 목적에 사용되는 계면활성제로는 비이온성 디터전트인 트윈시리즈(Tween series), 트리톤엑스시리즈(Triton X-series), 예멀젼(Emulgens), 루브룰(Lubrol), 디지토닌(Digitonin), 그리고 옥틸글루코사이드(Octyl glucoside) 등이 적절한 디터전트로 확인되었다. 더욱 바람직한 비이온성 디터전트로는 DNA중합효소의 활성을 저해하지 않는 트윈시리즈(Tween series), 트리톤엑스시리즈 (Triton X-series)가 우수하였다. 가장 바람직한 경우는, 그 중에서도 트윈20과 트리톤엑스100을 왁스로 코팅하는 필수성분에 0.001%에서 2%의 농도로 첨가했을때 위에서 기술된 에멀젼의 문제는 해결되었다.

본 발명을 PCR 튜브나 원심분기용튜브에 포뮬레이션하는 방법은 다음과 같다. 먼저 왁스로 코팅할려는 필수성분을 선정한다. 예를 들면, PCR성분에서 마그네슘클로라이드 용액을 선정하였다면, 125밀리몰 마그네슘클로라이드용액에 1.2마이크로리터에 0.1% 트윈20 디터전트 0.2 마이트로리터를 섞은 뒤, 총 1.4마이크로리터를 PCR 튜브나 원심분리용 튜브의 벽면에 피펫팅한다. 그리고 미리 힛팅블락에 녹여둔 왁스를 그위에 피펫팅으로 코팅한다. 이러한 과정을 거쳐 제조되어진 튜브는 왁스로 코팅되어지는 필수성분의 종류에 따라 보관방법이 다양해질 수 있다. 예를들면, 마그네슘클로라이드용액 이나 열배증폭완충액(10 x amplification buffer)의 경우는 실온에서도 장기간 보존이 가능하다. 그러나 데옥시뉴클레오사이드트리포스페이트와 프라이머를 분리하는 필수성분으로 왁스코팅을 했을 경우는 4℃나 -20℃에서 보관하는 것이 바람직하다.

본 발명은 PCR에서 특이산물을 생성하기위해 사용될 수 있음으로써 연구분야에서 예를들면, 비대칭PCR(asymetric PCR)을 이용하여 단일 스트랜드의 핵산을 디디옥시핵산 서열분석법(Sanger, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74 : 5463-5467(1977))으로 핵산의 서열분석(Current Protocol in Molecular Biology, Green Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 15-6,1(1991))에 이용될 수 있고, RNA 표적서열의 상보적인 DNA(cDNA)를 증폭(Current Protocol in Molecular Biology, Green Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 15-6,1(1991))하는 데에도 적용가능 할 뿐 아니라 클로닝을 목적하는 유전자는 증폭에도 이용할 수 있다. 또 다른 측면으로 병의 진단이나 킷트화에 이용할 수 있는데, 예를 들면, 병원성 세균인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 엠알에스에이균(Methicillin resistance Staphylococcus aureus), 위궤양을 야기시키는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 그리고 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 진단에 그리고 병원성 바이러스인 에이즈바이러스(HIV), 간염바이러스(HBV, HCV), 감기바이러스(influenza virus) 등의 진단킷트의 구성성분으로 도입될 수 있다. 더불어 법의학(Nature, 332:543(1988))분야에서도 도입 가능한 기술이다.

다음에 제시된 본 발명의 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

[실시예 1]

[PCR튜브 별면에 MgCl₂용액의 코팅]

PCR반응의 최적조건에서 설정된 MgCl₂최적농도가 1.5밀리몰이라면, 125밀리몰의 MgCl₂용액과 0.1% 트윈20 계면활성제를 6:1의 비로 섞은 뒤, 1.4마이크로리터의 용액을 각 PCR튜브의 벽면에 마이크로 파이펫을 이용하여 피펫팅한다. 그리고 70-80℃로 달구어진 힛팅블락(heating block)에서 미리 녹여진 왁스(Dynawax) 25마이크로리터를 덮어씌운다. 이 튜브를 PCR에 이용할 경우 MgCl₂을 제외한 나머지 반응성분을 각각 최적의 농도로 첨가, 총 98.6마이크로리터가 되게하여 반응을 실시한다.

[실시예 2]

[PCR튜브 벽면에 dNTP용액의 코팅]

PCR반응의 최적조건에서 설정된 dNTP의 최적농도가 200마이크로몰이라면, 20미리몰의 dNTP용액과 0.1% 트윈20 계면활성제를 5:1의 비로 섞은 뒤, 1.2마이크로리터의 용액을 각 PCR튜브의 벽면에 마이크로 파이펫을 이용하여 피펫팅한다.

그리고 70-80℃로 달구어진 힛팅블록(heating block)에서 미리 녹여진 왁스(Dynawax) 25마이크로리터를 덮어씌운다. 이 튜브를 PCR에 이용할 경우 dNTP을 제외한 나머지 반응성분을 각각 최적의 농도로 첨가, 총 98.8마이크로리터가 되게하여 반응을 실시한다.

[실시예 3]

[PCR튜브 벽면에 프라이머의 코팅]

PCR반응의 최적조건에서 설정된 각 프라이머의 최적농도가 2마이크로몰이라면, 400마이크로몰 농도의 각 프라이머를 1:1비로 섞은 뒤 이 프라이머 믹스용액과 0.1% 트윈20 계면활성제를 5:1의 비로 섞은 뒤, 1.2마이크로리터의 용액을 각 PCR튜브의 벽면에 마이크로 파이펫을 이용하여 피펫팅한다. 그리고 70-80℃로 달구어진 힛팅블락(heating block)에서 미리 녹여진 왁스(Dynawas) 25마이크로리터를 덮어씌운다. 이 튜브를 PCR에 이용할 경우 프라이머를 제외한 나머지 반응성분을 각각 최적의 농도로 첨가, 총 98.8마이크로리터가 되게하여 반응을 실시한다.

[실시예 4]

[PCR튜브 벽면에 MgCl₂와 dNTP 용액의 동시코팅]

PCR반응의 최적조건에서 설정된 MgCl₂의 최적농도가 1.5밀리몰이고 dNTP의 최적농도가 200마이크로몰이라면, 300밀리몰의 MgCl₂용액과 40밀리몰의 dNTP용액을 1:1의 비로 섞은 뒤 이 혼합용액과 0.1% 트윈20 계면활성제를 5:1의 비로 섞는다. 1.2마이크로리터의 용액을 각 PCR튜브의 벽면에 마이크로 파이펫을 이용하여 피펫팅한다. 그리고 70-80℃로 달구어진 힛팅블락(heating block)에서 미리 녹여진 왁스(Dynawax) 25마이크로리터를 덮어씌운다. 이 튜브를 PCR에 이용할 경우 MgCl₂을 제외한 나머지 반응성분을 각각 최적의 농도로 첨가, 총 98.7마이크로리터가 되게하여 반응을 실시한다.

[실시예 5]

[MgCl₂용액이 코팅된 튜브를 이용한 PCR]

각 반응의 반응성분은 다음과 같은 시약조성으로 100마이크로리터의 부피로 PCR을 수행한다. 시약의 조성은 다음과 같다. 10x증폭완충액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 8.3), 0.1% 젤라틴) 10㎕, 2.5mM dNTP 8㎕, 20pmol 프라이머 각각 1㎕, 5U/㎕ Taq폴리머라아제 1㎕, 1U/㎕ UNG 1㎕. 이 반응혼합물을 실시예 1에서와 같은 방법으로 조제되어진 핫스타트 튜브에 가하여 증폭시킬 DNA샘플과 증류수에 가하여 98.6마이크로리터가 되게 한다.

증폭반응은 퍼킨엘머더말사이클러(Perkin Elmer Thermal Cycler)에서 실시하는데, 이 더말사이클러는 증폭DNA의 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 연장을 총38주기 진행되도록 프로그램한다. 첫주기는 UNG를 이용하여 캐리오브 컨타미내이션(carry-over contamination)을 제거하는 반응으로 25℃에서 20분간 유지하고, 다음 한주기는 95℃에서 5분간 방치하여 증폭DNA가 완전히 변성되도록 한다. 그리고 35주기는 95℃, 60℃, 72℃로 온도를 반복시켜 증폭반응이 진행되게 한 후 프라이머의 최종연장의 완료를 보장하고 UNG효소의 불활성화를 유지하기 위하여 최종주기 후 불확실한 동안 72℃에서 샘플을 침거하도록 프로그램한다. 이어서 아가로스겔 전기영동법이나 또는 반점블롯 하이브리화하여 증폭생성물을 분석할 수 있다. 아가로스겔 전기영동법에 의한 분석은 반응이 끝난 튜브의 왁스층을 파괴한 뒤 5마이크로리터의 증폭산물을 취하여 1마이크로리터의 6x샘플색소(0.25%크실렌시아놀, 0.25%브로모페놀블루, 30%글라이세롤)와 섞은 뒤 겔의 웰에 로딩하고 100볼트에서 20분간 전기영동 후 에티디움브로마이드(EtBr)로 염색한 뒤 유브이트랜스일루미네이터(UV transilluminat or)를 이용하여 확인할 수 있다.

제2도의 스탠다드 PCR은 일반적인 PCR 튜브로 PCR 반응을 수행한 경우이고, 핫스타트 PCR 사진은 실시예 1에서 제조된 튜브를 사용하여 실시예 5의 방법에 따라 PCR반응을 실시하였을 경우 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

제3도의 스탠다드 PCR은 일반적인 PCR 반응을 수행한 경우이고, 핫스타트 PCR 사진은 실시예 2에서 제조된 튜브를 사용하여 실시예 5의 방법에 따라 PCR 반응을 실시하였을 경우 전기영동 사진을 나타낸 것이다. 이때 스탠다드 PCR의 전기영동 밴드가 핫스타트 PCR과 상이하게 나타난 것은 스탠다드 PCR의 경우 다이머리제이션에 의한 부반응이 발생되었기 때문이다.

제4도의 스탠다드 PCR은 일반적인 PCR 튜브로 PCR 반응을 수행한 경우이고, 핫스타트 PCR 사진은 실시예 3에서 제조된 튜브를 사용하여 실시예 5의 방법에 따라 PCR 반응을 실시하였을 경우 전기 영동 사진을 나타낸 것이다. 이때 스탠다드 PCR이 전기영동 밴드가 핫스타트 PCR과 상이하게 나타난 것은 스탠다드 PCR의 경우 다이머리제이션에 의한 부반응이 발생되었기 때문이다.

[실시예 6]

[MgCl₂용액이 코팅된 튜브를 이용한 RNA증폭]

역전사효소를 이용하여 먼저 cDNA를 생성시키고 cDNA를 증폭시킴으로써 RNA를 증폭시킬 수 있다. 본 실시예에서는 cDNA합성을 위해서는 조류 골수아구종증 바이러스(avian myoblastosis virus) 역전사효소를 그리고 cDNA증폭을 위해서는 Taq폴리머라아제를 사용한다.

역전사는 하기성분을 함유하는 20마이크로리터 용액으로 수행한다: 10xRT반응완충액(500mM KCl, 200mM Tris-HCl(pH 8.3)) 2.0㎕, 2.5mM MgCl₂4,0㎕, dNTP 2.0㎕, 프라이머(올리고-p(dT)₁₅, 16㎕/20㎕) 2.0㎕, AMV역전사효소 0.8㎕, 0.5ng/ml젤라틴 0.4㎕, 주형RNA 5.0㎕, 증류슈 2.8㎕. cDNA 합성을 위해서는 20㎕용액을 25℃에서 프라이머 어닐링 반응을 시킨 뒤 42℃에서 1시간동안 역전사 반응을 실시한다. 그리고 마지막으로 AMV역전사효소를 불활성화시키기 위해 95℃에서 5분간 끓인 뒤 5℃에서 5분간 냉각시킨 다음 Mg²이온이 없는 cDNA를 얻기 위하여 Millipore's ultra free-MC를 이용 정제하여 cDNA로 이용한다.

cDNA를 증폭시키는 PCR을 수행하기 위해서, 하기의 성분들을 실시예 1에서 제조한 PCR튜브에 가하여 증폭을 수행한다: 10xPCR완충액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 8.3)) 10㎕, 10mM dNTP 2.0㎕, 20uM 프라이머 1.0㎕, 5U/㎕, Taq폴리머라아제 0.5㎕, 주형cDNA 5.0㎕, 증류수 79.1㎕,. 실시예5에서 UNG의 오염제거 반응인 25℃ 20분간 반응을 시키는 것을 제외한 동일 열변환 조작을 사용하여 퍼킨엘머더말사이클러속에서 핵산을 증폭시킨다. 증폭된 생성물은 상기의 실시예5와 같이 분석한다.

Claims

중합효소 연쇄반응용 튜브 또는 원심분리용 튜브의 내측면에 종합효소 연쇄반응에 필수 성분인 마그네슘클로라이드, 데옥시뉴클레오사이드트리포스페이트, 프라이머 및 열배 증폭 완충액에서 선택된 1종 이상을 적당한 농도의 비이온성 계면성활성제와 혼합한 후, 튜브 내측면에 피페팅하고 미리 녹여둔 왁스로 코팅하여 제조된 반응 특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응에 사용되는 튜브.
제1항에 있어서, 비이온성 계면활성제는 트윈시리즈(Tween series), 트리톤엑스시리즈(Triton X-series), 에멀젼(Emulgens), 루브롤(Lubrol), 디지토닌(Digitonin) 및 옥틸글루코사이드(Octyl glucoside)중에서 선택된 1종 이상을 사용하여 제조함을 특징으로 하는 반응 특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응용튜브.
제2항에 있어서, 비이온성 계면활성제는 트윈시리즈 또는 트리톤엑스시리중 트윈20 또는 트리톤엑스 100을 사용하여 제조함을 특징으로 하는 반응 특이성이 향상된 종합효소 연쇄반응용 튜브.
제1항에 있어서, 왁스는 녹는점 50∼80℃를 지닌 Dynawax과 같은 PCR용 왁스, 파라핀 왁스 또는 이들 혼합물을 사용함을 특징으로 하는 반응 특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응용 튜브.
제1항의 튜브를 사용하여 검체 DNA를 증푹시키고 특정 핵산서열의 존재 또는 부재 여부를 판독하기 위한 키트.
제1항의 튜브를 사용하여 검체 RNA로부터 합성된 cDNA를 증폭시키고 특정핵산서열의 존재 또는 부재 여부를 판독하기 위한 키트.