JP2017514519A - バイオマーカーとしての低分子のノンコーディングrna - Google Patents
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Abstract
Description
ncRNAについて、第1の参照個体から取得された第1の体液サンプル、および、第2の参照個体から取得された第2の体液サンプルにそれぞれ含まれる前記ノンコーディングRNAの2つの異なる変種の比率を決定するステップと、
第1の参照個体は、第2の参照個体から変えられた健康状態であり、
前記第1の体液サンプルからの比率と第2の体液サンプルからの比率とを比較するステップと、
前記第1の体液サンプルと第2の体液サンプルとの間で前記比率が変えられている場合、前記ノンコーディングRNAの2つの異なる変種をバイオマーカー対として同定するステップと
を含み、
第1の変種は、標準配列のncRNA、および、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAであり、
前記ncRNAがmiRNAである場合に、
前記第1の変種は、標準配列のncRNA、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
前記第2の変種は、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択されることを特徴とする方法を提供する。
第1の変種は、標準配列のncRNA、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
第2の変種は、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
ncRNAがmiRNAでない場合、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAである。
ncRNAがmiRNAでない場合、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAである。
前記個体に由来するサンプルと前記参照サンプルとの間の比率における差異の有無に基づいて、前記個体の健康状態を分類するのに役立ち、
前記バイオマーカー対は、ncRNAの2つの異なる変種からなり、
第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAであり、
ncRNAがmiRNAである場合に、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択される。
第1の変種は、標準配列のncRNA、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
第2の変種は、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
ncRNAがmiRNAでない場合に、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAである。
ncRNAがmiRNAでない場合に、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAである。
を含み、
前記個体に由来するサンプルと前記参照サンプルとの間の比率における差異の有無に基づいて前記個体の健康状態を分類し、
前記バイオマーカー対は、ncRNAの2つの異なる変種からなり、
第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAであり、
ncRNAがmiRNAである場合、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択される。
第1の変種は、標準配列のncRNA、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
第2の変種は、5’末端または3’末端でトリミングされたncRNA、5’末端または3’末端で任意にトリミングされた3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、
前記ncRNAがmiRNAでない場合に、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAである。
前記ncRNAがmiRNAでない場合、前記第1の変種は、標準配列のncRNA、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAから選択され、前記第2の変種は、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するncRNAである。
それぞれが、
標準配列および3’末端NTA−A、
標準配列および3’末端NTA−G、
標準配列および3’末端NTA−C、
標準配列および3’末端NTA−U、
3’末端NTA−Gおよび3’末端NTA−C、
3’末端NTA−Gおよび3’末端NTA−U、
3’末端NTA−Gおよび3’末端NTA−A、
3’末端NTA−Cおよび3’末端NTA−U、
3’末端NTA−Cおよび3’末端NTA−A、
3’末端NTA−Uおよび3’末端NTA−A、
標準配列および5’末端トリミングされた、
標準配列および3’末端トリミングされた、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−C、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−U、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−A、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−G、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−C、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−U、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−A、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−G、
3’末端トリミングされたおよび5’末端トリミングされた、
伸長されたおよび3’末端NTA−A、
伸長されたおよび3’末端NTA−G、
伸長されたおよび3’末端NTA−C、
伸長されたおよび3’末端NTA−U、
伸長されたおよび5’末端トリミングされた、
伸長されたおよび3’末端トリミングされた、
5’末端または3’末端トリミングされた、および、5’末端または3’末端伸長された、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−U、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−A、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−G、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−C、
(トリミング、および/または、伸長された)および標準配列、のいずれかから選択される。
標準配列:3’末端NTA−A、標準配列:3’末端NTA−G、標準配列:3’末端NTA−C、標準配列:3’末端NTA−U、3’末端NTA−G:3’末端NTA−C、3’末端NTA−G:3’末端NTA−U、3’末端NTA−G:3’末端NTA−A、3’末端NTA−C:3’末端NTA−U、3’末端NTA−C:3’末端NTA−A、3’末端NTA−U:3’末端NTA−A、標準配列:5’末端トリミング、標準配列:3’末端トリミング、5’末端トリミング:3’末端NTA−C、5’末端トリミング:3’末端NTA−U、5’末端トリミング:3’末端NTA−A、5’末端トリミング:3’末端NTA−G、3’末端トリミング:3’末端NTA−C、3’末端トリミング:3’末端NTA−U、3’末端トリミング:3’末端NTA−A、3’末端トリミング:3’末端NTA−G、3’末端トリミング:5’末端トリミング、伸長および3’末端NTA−A、伸長および3’末端NTA−G、伸長および3’末端NTA−C、伸長および3’末端NTA−U、伸長および5’末端トリミング、伸長および3’末端トリミング、5’末端または3’末端トリミングおよび5’末端または3’伸長、(トリミングおよび伸長)および3’末端NTA−U、(トリミングおよび伸長)および3’末端NTA−A、(トリミングおよび伸長)および3’末端NTA−G、(トリミングおよび伸長)および3’末端NTA−C、(トリミングおよび伸長)および標準配列から選択される。好ましくは、この比率は、標準配列:3’末端NTAまたは3’末端NTA:異なる3’末端NTAから選択される。比率における分子および分母が逆転され得ることは、当業者に明らかである。好ましくは、ncRNAはmiRNAである。
<実施例1>
エプスタイン・バーウイルス(EBV)によって形質転換したリンパ芽球様B細胞(LCL)は、大量の、ヒトおよびウイルスmiRNAが組み込まれたエキソソームと呼ばれるエンドソーム由来細胞外小胞(EV)を恒常的に分泌する。コピー数を測定することにより、エキソソームが、miRNAの細胞−細胞間伝達を媒介して、レシピエント細胞における蓄積、および標的mRNA抑制をもたらすことが実証されている(Pegtelら、2010)。in vitroおよびin vivoデータの増加は、エンドソーム膜におけるmiRNA選別が、細胞−細胞間伝達におけるエキソソームの機能を支持することを示唆している(van Balkomら、2013;Kosakaら、2010;Mittelbrunnら、2011;Montecalvoら、2012;Pegtelら、2010;Umezuら、2013;Zhangら、2010;Zhuangら、2012)。注目すべきことに、エンドソーム膜におけるエキソソーム形成を妨害することは、機能的miRNAの分泌を減少させる(Kosakaら、2013;Mittelbrunnら、2011)。EVを介したmiRNAの分泌は、非ランダム様式で生じるものの(Bellinghamら、2012;Guduric−Fuchsら、2012;Nolte−’t Hoenら、2012;Palmaら、2012)、精製されたエキソソーム集団および産生細胞における徹底的な比較分析は不十分であった。
200ヌクレオチド未満の低分子RNA変種が、エキソソーム中への取込みのための選択を受けるかどうかを決定するために、本発明者らは、EBV駆動性LCL(n=3)および3つのリンパ腫細胞株(n=3)のシーケンシングのために、細胞および対応するエキソソームの低分子RNAライブラリーを生成した。このアプローチは、定義された細胞のバックグラウンド内の細胞内RNAレパートリーおよび細胞外RNAレパートリーについて強力な統計分析を実施するための包括的データセットを提供した。RNA−Seqにより、ヒトおよびEBVの両方のゲノムに対してアラインさせた、1サンプル当たり100万を超えるゲノムマッピングされたリード(図1における個々のリードおよびアラインメント統計値)が得られた。RNA参照ライブラリーとの比較により、細胞およびエキソソームの低分子RNA画分は、多様なクラスのRNA由来の産物を含んでいることが明らかになった。低分子RNA配列の大きい多様性に加えて、いくつかのRNAクラスは、細胞において富化され(図1の黒い棒)、他はエキソソームにおいて過剰発現する(灰色の棒)ようである。全ての形質転換されたB細胞型において、miRNAのクラス(miRBase v19)は、低分子RNAプールのほぼ50%を占める。しかし、エキソソームでのこの割合はたった20%であり、これは、miRNAが細胞中に保持されていることを示している。他のncRNAクラス(すなわち、tRNA、piRNA、rRNA、Y RNA、ヴォールトRNA)由来のRNAエレメントは、一般に、クラス分布が細胞型の間で別個であっても、エキソソームにおいて濃縮されていた(図1B)。特に、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)(Mauteら、2013)および他の腫瘍組織(Leeら、2009b)においてtRNAおよびtRNA由来の断片の発現が調節解除されている。DLBCL由来のエキソソームでは、tRNA由来断片は、LCL由来エキソソームと比較して高度に濃縮されていた(図1Bに示す、24%対7.4%)。LCLエキソソームとリンパ腫エキソソームとの間の最も顕著な差異は、ヒトY RNA断片の極度の存在量であった(図1に示す、38%)。観察された低分子RNA断片のリードの存在量(図1)が、全長転写物の存在を反映しているかどうかを調査するために、本発明者らは、シーケンシングに供したエキソソームRNAに対する半定量ステム−ループRT−PCRを実施した。本発明者らは、エキソソーム中で、高レベルのインタクトなY RNA変種(すなわち、RNY1、RNY3、RNY4、RNY5)およびヴォールトRNA1−1を検出した(図1)。インタクトなY RNAおよびヴォールトRNAは、ヒト尿サンプルから単離された小胞画分においても検出された(I.V.B.、D.K−LおよびD.M.P.、未公開データ)。このデータは、低分子細胞質調節性RNAが非細胞自律的機能を有し得るという以前の示唆(Nolte−’t Hoenら、2012)を支持しているものである。全体的に、本発明者らは、形質転換されたB細胞について最も顕著であるように思われるRNAポリメラーゼIII誘導されたY RNA転写物およびそれらの断片のエキソソーム組み込みに対する一貫したバイアスを明らかにした。興味深いことに、ヒト低分子RNA、具体的には、Y RNAは、エンベロープおよび非エンベロープウイルス粒子にパッケージングされる(Garciaら、2009;Khanら、2007;Routhら、2012)。宿主細胞から(レトロ)ウイルス粒子およびエキソソーム中への低分子Pol III RNAの選択的な補充は、共通の分子機構がパッケージングプロセスを推進することを暗示している。この認識は、エキソソームの生合成および輸送選択を支配する細胞成分の今後の特徴付けを補助できる(Koppers−Lalicら、2012)。
miRNAの転写および生合成については、十分に報告されているが(EbertおよびSharp、2012)、エキソソームを介したmiRNAのターンオーバー、細胞内輸送および放出を制御する機構、ならびに、これらの種々の因子が遺伝子調節活性にどのように影響を与えるかについては、いまだ完全には解明されていない(AmeresおよびZamore、2013)。
EBV−miRNAは、EBV感染した増殖性B細胞およびEBV駆動性リンパ腫に、重要な成長利益を提供する(Feederleら、2011;Setoら、2010;Vereideら、2013)。本発明者らは、内因性の腫瘍サプレッサーmiRNAとは対照的に、EBV−miRNAが、エキソソームにおいて優先的に保持され、および、過小発現されると仮定した。本発明者らは、形質転換されたB細胞およびリンパ腫細胞におけるEBVによってコードされる44のmiRNAの分布をグループ化し、分析した(Qiuら、2011)。本発明者らは、EBV感染B細胞株に対する以前のRNA−seq研究(Rileyら、2012;Skalskyら、2012)と一致して、EBV−miRNAの存在量が広く変動し、最も豊富に存在するものがBART−クラスターmiRNAに属したことを確認した。本発明者らは、細胞から放出された全てのmiRNAの量とそれらの分布の頻度に基づいて、リードを正規化した後に、細胞中に保持された量との間の比率を計算した(図4A)。宿主miRNAは放出される傾向がある(17%が細胞保持される)が、ウイルスmiRNAの大部分は、分泌を妨げられる(54%が強く保持される)。これは、図4B中に示され、図中、EBVによってコードされるウイルスmiRNAは、赤色で示される。この観察は、豊富なEBV BARTクラスターmiRNAが132のアポトーシス関連細胞性mRNAを標的化することを見出したRileyらからの結果(Rileyら、2012)と相違なく、EBV miRNAが細胞死を防止することを示唆する。遺伝子オントロジー分析は、MAPK/PI3K生存経路を抑圧することが知られている多くの宿主miRNAが優先的に放出されることを示した。生理学的に関連するmiRNAの一貫性のある非ランダム分布の観察は、エキソソーム中への選別を媒介するメカニズムと一致する。
pre−miRNAヘアピン由来の最も豊富なmiRNA配列は、通常、成熟miRNA(miRBase)と一般に称される、対応するmiRNAを定義するために使用される。しかし、個々のmiRNAのリードの分析およびそれに対応するpre−miRNA配列へのマッピングは、細胞およびエキソソームRNA画分中のmiRNAの3’末端において広範な配列変異を示した。pre−miRNAの不十分なドローシャまたはダイサー媒介性のプロセシングは、3’末端長さバリアント(例えば、トランケーションおよび延長)を生じる。さらに、miRNAアイソフォームは、非テンプレート型末端ヌクレオチド付加(NTA)とも呼ばれるヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性の転写後修飾によって活発に生成される(Burroughsら、2010;Morinら、2008;Wymanら、2011)(図5A)。miRNAの3’末端変異の網羅的な分析は、3’末端長さアイソフォームが細胞とエキソソームとの間で等しく分布する一方で、3’末端NTAを有するmiRNAは異なる分布を示したことを示した。NTAを有する全てのリードの合計と個々のNTA型(即ち、A、U、CまたはG)との比較は、細胞画分におけるアデニル化miRNAアイソフォームの濃縮を示した。対照的に、分析された全てのLCLサンプルのエキソソームにおいて、3’末端ウリジル化miRNAが過剰発現された(図5C)。NTA修飾されたリード(A、U、C、G)の割合が、細胞サンプルとエキソソームサンプルとの間で有意に変化するかどうかを分析するために、3’末端NTAを有する各miRNA配列を、12全てのサンプル(LCL n=6、BL n=4、DLBCL n=2)から抽出し、(対応のある設計を構成する)細胞株効果についても補正するロジスティックモデルにフィッティングさせた。これらの結果は、3’末端アデニル化miRNAアイソフォームが優先的に保持され(カイ二乗検定、p<0.05)、全ての他のNTAが優先的に放出される(3’末端−Uはカイ二乗検定でp=0.02、3’末端−C、はフィッシャー直接検定でp=0.04、3’末端−Gはフィッシャー直接検定でp=0.02)ことを示唆している。
本発明者らによる結果は、NTAが、細胞とエキソソームとの間のmiRNA分布を規定することを示している。しかし、個々のmiRNAに対するNTAの影響は、異なるものでありうる。例えば、エキソソーム富化されたmiRNA 486−5p、143−3pおよび101−3pの3’末端ウリジル化リードの存在量は、エキソソーム画分中に存在する全てのウリジル化アイソフォームの平均を上回る百分率(38%)を示す。しかし、miR−486−5pは、外見上、成熟miRNAレベルでは等しく分布する(図7Cの灰色)。特に、成熟miR−486−5p配列に位置する全てのリードの50%は、アデニル化アイソフォームまたはウリジル化アイソフォームのいずれかである(図7C)。LCLサンプル中の全てのmiRNAの加重平均を使用すると、本発明者らは、トリ−ウリジル化されたリードが、細胞内容物と比較して、LCLエキソソームにおいて9倍高頻度であることを観察した(p=0.01、対応のないt検定)。この分布の違いを確認するために、本発明者らは、標準的な(成熟した)miRBaseベースの配列よりも3ヌクレオチド長いmiR−486−5p 3’末端トリ−アデニル化および3’末端トリ−ウリジル化アイソフォームを識別するように設計したステム−ループベースのプライマーを開発した。予測されるように、3’末端ヌクレオチド付加を有さない成熟miR−486−5pの検出は、細胞とエキソソームとの間で事実上、等しい分布を示し、3’末端トリ−アデニル化アイソフォームは、細胞において濃縮され(10倍)、3’末端トリ−ウリジル化アイソフォームは、エキソソームにおいて濃縮された(5倍)(図7D)。この独立したアプローチは、以前のRNAseqデータ(図6)を支持し、異なる型の3’末端の転写後修飾が、RT−PCRによって検出可能であり、細胞保持およびエキソソーム選別プロセスを反映することを実証している。従って、豊富なmiRNAおよびそれらのアイソフォームは、3’末端転写後修飾の型および程度に依存する独自の分布特性を有する下位集団を示す。
<ディープシーケンシングのためのRNAサンプルの調製>
各細胞またはエキソソームサンプルについて、製造業者の指示(Illumina San Diego CA USA)に従って、TruSeq small RNA sample prepを使用してシーケンシングするために等量のインプットRNA(600ngのRNA)を調製した。Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent、Santa Clara CA USA)で、配列ライブラリーを測定し、1回の実行につき最大12サンプルを等モルで合わせた。シーケンシングを、HiSeq 2000(Illumina San Diego CA USA)ペアードエンド100サイクル(PE100)実行で実施した。
miRNAアイソフォームまたはisomiRを、逐次、分析によって読み出す。簡潔に述べると、本発明者らは、マッピングされたRNAエレメントの3’末端におけるNTAの検出のために、リードのヌクレオチド18位において開始するアラインされたpre−miRNA配列に対して、読み出された配列を比較した。アルゴリズムが、リードと18位との後のpre−microRNAとの間でミスマッチ位置を見出す場合、このリードは、ミスマッチ位置からリードの最後までさらに分析されるが、全ての後続のヌクレオチドは、ミスマッチ位置におけるものと等しい必要がある。異なるヌクレオチドに出くわすと、検索が、次のミスマッチ位置において継続されるか、またはリードが、非NTAとしてタグ付けされる。全てのNTAリードを検出した後、本発明者らは、所与の核酸塩基(A、U、C、G)のNTAで終わるリードの数を、miRNAにマッピングされたリードの総数によって除算することによって、1サンプル当たりの加重平均を計算する。miRNA毎、およびサンプル毎に、本発明者らは、そのmiRNAにマッピングされたリードの総数に加えて、所与の核酸塩基のNTAで終わるリードの総数を計算した。そうして、各核酸塩基について、本発明者らは、サンプル型(細胞またはエキソソーム)ならびに細胞株(対応のある設計を構成する)もまた含んだロジスティック回帰モデルにおいて、総数に関連したリードの数を使用できた。このモデルに基づいて、本発明者らは、細胞とエキソソームとの間での所与のヌクレオチドのNTAを有するmiRNAカウントの割合間の差異についてのp値を抽出した。miRNA毎にこのモデルをフィッティングさせた後で、複数の試験について補正するためにBenjamini−Hochberg偽発見率(FDR)を、p値に適用する。
細胞とエキソソームとの間で、転写後修飾されたリード(NTA)の分布の評価を以下のように実施した。miRNA関連のリードが、エキソソーム中に取り込まれる傾向または細胞内に保持される傾向のいずれを有するかを試験するために、本発明者らは、それらを、所与のmiRNAのベースライン分布傾向(解析されたisomiR型に属するものを除く、全ての他のリードによって規定される)と比較した。本発明者らは、特定の型の非テンプレート型ヌクレオチド(NTAとして規定される)で終わるリードおよび末端修飾を有さないリード(noNTAとして規定される)について、エキソソームと細胞との間の変化倍数の比率を計算することによって、排出係数(EC)を定義する。この係数は、0に近く、低分子ncRNA配列のNTAリードおよび非NTAリードが放出または保持される同じ傾向を有する。NTAリードが、非NTAリードと比較して、放出される傾向がより強い場合、この係数は正である。最後に、負の係数は、NTAリードが、非NTAリードと比較して、細胞内に留まる傾向がより強いことを示す。
エキソソームを収集するために、各細胞株を、10%エキソソーム枯渇FBSを補充したRPMI−1640中で3連続ラウンド培養し、その後、エキソソーム含有上清を回収した(1回の収集ラウンドは、1つのエキソソーム含有調製物を示す。培地200ml中に100×106細胞である。)。トリパン−ブルー排除によって細胞死を慣用的に分析し、生存率が90%以下の培養物は、エキソソーム収集について考慮しなかった。エキソソームを、記載されたような分画遠心分離プロトコール(Verweijら、2013)を使用して、上清から単離および精製した。簡潔に述べると、最終ステップは、エキソソームを70,000×g、1時間でペレット化させ、最後の超遠心分離ステップ(70,000×g)の前にPBSを用いてペレット洗浄を行った。ペレット化されたエキソソームを、100μLのPBS中に溶解させ、−80℃で貯蔵した。全てのエキソソーム調製物を、以前に記載されたように(Pegtelら、2010、Verweijら、2011)、イムノブロッティングによって分析し、エキソソームの存在および純度を確認した(データ示さず)。インフォームドコンセントにサインした後に、尿エキソソームの抽出のために、健康な男性(n=6)から新鮮な尿サンプル(50ml体積)を収集した。これらの健康な男性は、泌尿器科(VU University Medical Center、Amsterdam、The Netherlands)におけるこのプロジェクトと無関係の研究に参加している対象群の患者である。エキソソームを、分画遠心分離によって単離した。最初に、尿を、500×gで20分間、2000×gで20分間、10,000×gで30分間および100,000×gで1.5時間遠心分離し、PBSでさらに1回洗浄した。インタクトなエキソソームをPBS中に収集し、RNA単離前にRNAse A(400ng/ml、Sigma−Aldrich Chemicals、Zwijndrecht、The Netherlands)で処理した。
RNAを、細胞および対になるエキソソームのペレットから抽出した。エキソソーム調製物を、400ng/μlのRNase A(Sigma)で37℃、1時間、事前処理した。全てのエキソソーム調製物から、TRIzol試薬(Life Technologies)によって、全RNAを抽出した。低い収量が予測される場合、イソプロパノール沈殿ステップの前に、5μlのグリコーゲン(Roche)を添加した。細胞サンプルと、対になったエキソソーム(サイズが200nt未満の低分子RNA変種の大部分を含むことが知られている)との間での低分子RNAプロファイル比較を可能にするために、細胞RNAを、ガラス繊維フィルターベースの方法(mirVana miRNA単離キット、Life Technologies)を使用して抽出し、細胞サンプル中に存在する低分子RNA変種を濃縮した。抽出後、全ての細胞RNAサンプルは、低分子RNA変種(200nt未満)を含んでいた。低分子細胞およびエキソソームRNAプロファイルは、サイズ分布において類似のパターンを示した。抽出された低分子RNA(細胞およびエキソソーム)の品質および量を、低分子RNAチップのプラットフォーム(Agilent 2100 Bioanalyzer)を使用してアッセイした。
低分子RNAの発現プロファイリングを、miRanalyzerプログラム(Hackenbergら、2011)に基づくパイプラインを用いて、さらなる分析ステップおよびカスタム化スクリプトを含めて実施した。簡潔に述べると、fastqフォーマットでのリードの事前処理は、i)アダプタートリミング(アダプターの少なくとも10ntが検出され、リードとアダプター配列との間で1ミスマッチを可能にする必要がある)、ii)15ntよりも短いクリーニングされたリードを削除する、iii)同一の配列を有する全てのリードを1つのエントリー(独自のリード)へと折り畳む、ことを含む。独自のリードのリード数は、対応するRNA分子が何回シーケンシングされたかを示す数である。
RNA−seqライブラリーは、細胞全体に由来するRNAまたはエキソソームのみに由来するRNAのいずれかに対応する、細胞株当たり1対のライブラリーを含んでいた。各miRNAの存在量を、細胞とエキソソームとのサンプルの間で比較するために、観察されたカウントを、RパッケージedgeR(Robinsonら、2010)を使用する一般化線形モデルにフィッティングさせた。これには、対応のある設計を含む細胞株、ならびにサンプル型(細胞またはエキソソームのいずれか)を含んだ。このモデルは、共通分散および傾向分散(common and trend dispersion)だけでなく、タグワイズ分散(tagwise dispersion)推定も含み、したがって、ライブラリー間の変動による余分な変動が許容される。複数の試験のために、サンプル型効果についての尤度比検定統計量に対応するp値を、Benjamini−Hochberg偽発見率(Benjamini、2010)を使用して補正した。さらに、本発明者らは、6つのサンプル間で観察された交差を、ランダムな予測と比較した。簡潔に述べると、本発明者らは、i)6つ全てのサンプルについて、エキソソームと細胞との間の発現値のlog2比率を計算し、ii)全ての排出された(log2>=2)miRNAを抽出し、iii)所与の群について共有されたmiRNA、すなわち、この群の全てのサンプルにおいて排出されるものを抽出し、iv)各条件についてXのmiRNAをランダムに10,000回抽出する(Xは、観察された、すなわち、排出されたmiRNAの数である)、v)10,000回のランダムな実行の各々について、本発明者らは、共有されたmiRNAの数を検出し、vi)10,000回のランダムな実行から、本発明者らは、ランダムな仮定の下で予測値およびその変動として与えられるランダムに共有されたRNAの平均および標準偏差を計算する、vii)共有されたRNAの観察された数ならびにランダムな平均および標準偏差によって、本発明者らは、統計的有意性を評価するためにz−スコアを計算する。本発明者らは、1.645またはそれよりも高いz−スコアがp≦0.05に相当し、を、有意とみなす。
本発明者らは、健康な(非腫瘍性腎皮質−NRC)11、および腎明細胞癌の22のサンプルからなる腎明細胞癌(ccRCC)(Osanto,S.ら、PLoS One 2012)に対する実験を選択した。さらに、22人のccRCC患者は、3つの予後下位群、即ち、疾患の再発を伴わない群、再発を伴う群、および診断時に転移性の疾患を伴う群(ステージIV)に属した。SRAアクセッションSRP012546を有するデータを、Short Read Archiveからダウンロードした。miRNA発現パターンをプロファイリングするためおよびisomiRの程度を決定するために、本発明者らは、複雑な(低分子の)RNAseqデータをアノテーションする、本発明者らが以前に開発した広く使用されるプログラムmiRanalyzer(Hackenberg,M.ら、Nucleic Acid Res.2009 & 2011)を拡張させた。アダプタートリミング後、独自のリードを、ヒトゲノムにマッピングする。全ての配列のバリアントを検出するために、本発明者らは、5’末端における3nt変動および3’末端における5ntにおいて、標準配列と比較した変動を許容する。
1.miR−210−3pを含む個別のmiRNAが、アデニル化頻度と発現レベルとの間の強い相関を示し、これは、成熟miRNA配列の安定化に対応する(D’Ambrogioら、Cell Reports 2012)。miR−210−3pのレベルはRCC進行中に増加するが、これは、3’末端アデニル化の形態での転写後修飾を介したmiRNA安定化の結果であり得る。
<生物流体中のisomiRは、がんサブタイプおよび健康な患者を識別する>
4人の健康なボランティアおよび前立腺がんと診断された9人の患者から、尿を収集した。エキソソームを収集し、実施例1に記載したようにしてRNAを抽出した。低分子ncRNAの発現プロファイリングおよびデータ分析を、実施例1および実施例2と同様に実施した。
<ヒト血漿から小胞を一段階に単離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)>
循環する血液中のncRNA、例えば(miRNA)を測定することは、早期がん検出、予後およびモニタリングのために有用であり得る。組織および培養細胞に対する徹底的なRNAシーケンシングは、ncRNAの複雑かつダイナミックなレパートリーを明らかにする。2000以上の成熟miRNA種が同定されており、その多くは、循環および他の生物流体、例えば、唾液および尿において検出されている。しかし、単一のゲノム遺伝子座が、多くの機能的に異なるncRNAバリアントを産生することができる。
・ビーカー中に20mLのセファロースCL−2B(1カラム当たり)を注ぎ、セファロースCL−2Bを少なくとも15分間沈降させる。
・上清を廃棄する
・15mLの緩衝液を添加し、穏やかに旋回させ混合する
・セファロースを少なくとも15分間沈殿させる
・2回洗浄を行う
・上清を廃棄し、10mLの緩衝液を添加する。
・10mLシリンジを使用する
・ナイロン製パンティーストッキングをシリンジの出口に押し付ける
・洗浄したセファロースをカラム中にピペッティングする(プラスチックパスツールピペットを使用する)
・セファロースを静置させ、カラムが実行中に乾燥するのを防ぐ。使用の際、カラムは、垂直で、角度なしであるべきである
・セファロースが10mL積み重なるまで、セファロースを添加する
・使用まで緩衝液を添加するか、またはシリンジ出口を栓で塞ぎ、カラムが実行中に乾燥するのを防ぐ。調製したカラムは数時間以内に使用する。
緩衝液を、セファロースカラム中にほぼ完全に入れる(ただし、カラムが実行中に乾燥するのを防ぐ)
・1.5mLの血漿をカラム上にロードする
・ただちに0.5mLのサンプルの収集を開始する
・血漿サンプルがセファロースにほぼ完全に入ったら、シリンジが完全に満たされるまで、緩衝液を注意深く添加する
・全ての画分を収集するまで(最大26画分)、緩衝液の添加を反復する。
・Trizol単離法を使用して、単一画分から総RNAを単離する
・バイオアナライザーでRNAを測定し、品質制御のためにRT−PCRを使用する
・製造業者のガイドライン(Illumina Truseq)を使用して低分子RNAライブラリーを調製する
・製造業者の指示(Illumina HiSeq)を使用して、ライブラリーをシーケンシングする。
<ホジキンリンパ腫の血漿から単離されたEV>
ホジキンリンパ腫の患者から取得した血漿を、実施例4に記載されるようにSECに供した。結果を、図16〜図18に示す。
生物流体中のisomiRは、ホジキンリンパ腫患者から健康な個体を識別する。細胞外小胞およびタンパク質結合RNA画分の単離は、実施例4および実施例5に記載されるように実施した。低分子ncRNAの発現プロファイリングおよびデータ分析を、実施例1および実施例2と同様に実施した。
生物流体中のisomiRは、乳がんステージIIと疾患のステージIIIとを識別し、疾患が再発した乳がん患者を再発していないの乳がん患者から識別する。
<組織中のisomiRは、精巣胚細胞腫瘍から非腫瘍隣接組織を識別する>
データ供給源および実験手順は、公に入手可能であり、以下においてアクセス可能である。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP007946およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/154993。公に入手可能な血清中のncRNAの配列データを分析して、ncRNAバリアントの比率が健康状態を分類するために使用できるかどうかを決定した。
<組織中のisomiRは、結腸直腸腫瘍組織から、および、結腸直腸がん関連転移組織から結腸直腸正常組織を識別する>
データ供給源および実験手順は、公に入手可能であり、以下においてアクセス可能である。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP022054およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA201245およびRohr Cら、「High−throughput miRNA and mRNA sequencing of paired colorectal normal,tumor and metastasis tissues and bioinformatic modeling of miRNA−1 therapeutic applications.」、PLoS One、2013 Jul 2;8(7):e67461。公に入手可能な血清中のncRNAの配列データを分析して、ncRNAバリアントの比率が健康状態を分類するために使用できるかどうかを決定した。
<生物流体中のisomiRは、アルツハイマー病と診断された患者から健康な個体を識別する>
データ供給源および実験手順は、公に入手可能であり、以下においてアクセス可能である。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP022043およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject?LinkName=sra_bioproject&from_uid=387967およびLeidinger Pら、「A blood based 12−miRNA signature of Alzheimer disease patients.」、Genome Biol、2013 Jul 29;14(7):R78。
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Claims (31)
- 低分子のノンコーディングRNAのバイオマーカー対を同定するための方法であって、
第1の参照個体から取得された第1の体液サンプル、および、第2の参照個体から取得された第2の体液サンプルのそれぞれに含まれる前記ノンコーディングRNAの2つの異なる変種の量を決定するステップと、
前記第1の参照個体は、前記第2の参照個体から変えられた健康状態であり、
前記第1の体液サンプル中の前記2つの異なる変種の比率を決定するステップと、
前記第2の体液サンプル中の前記2つの異なる変種の比率を決定するステップと、
前記第1の体液サンプルからの比率と前記第2の体液サンプルからの比率とを比較するステップと、
前記第1の体液サンプルと前記第2の体液サンプルとの間で前記比率が変えられている場合に、前記ノンコーディングRNAの2つの異なる変種をバイオマーカー対として同定するステップと
を含み、
第1の変種および第2の変種は、標準配列の5’末端または3’末端においてトリミングされた、および/または、5’末端または3’末端において伸長されたノンコーディングRNA、ならびに、任意選択で5’末端または3’末端においてトリミングされた、または、5’末端または3’末端において伸長された、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAから選択され、
前記ノンコーディングRNAがmiRNAでない場合に、
第1の変種は、前記標準配列のノンコーディングRNA、および、前記3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAから選択され、
第2の変種は、前記3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAであることを特徴とする方法。 - 前記第1の参照個体は、1または複数の健康な個体に由来するものであり、
前記第2の参照個体は、障害を有する1または複数の個体に由来するものであり、
前記障害は、好ましくは、前立腺がんである
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記第1の参照個体は、障害を有する個体に由来するものであり、
前記第2の参照個体は、前記障害に対して処置が行われた後の前記個体に由来するものである
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 低分子のノンコーディングRNAのバイオマーカー対を使用して、個体の健康状態を分類するための方法であって、
前記個体に由来する体液サンプル中のバイオマーカー対の量を決定するステップと、
前記体液サンプル中のバイオマーカー対の比率を決定するステップと、
前記比率と、参照サンプルに由来する体液中のバイオマーカー対の比率とを比較するステップと、
を含み、
前記個体に由来するサンプルと前記参照サンプルとの間の比率における差異の有無に基づいて、前記個体の健康状態を分類し、
前記バイオマーカー対は、ノンコーディングRNAの2つの異なる変種からなり、
第1の変種および第2の変種は、標準配列の5’末端または3’末端においてトリミングされた、および/または、5’末端または3’末端において伸長されたノンコーディングRNAであるノンコーディングRNA、ならびに、任意選択で5’末端または3’末端においてトリミングされた、または、5’末端または3’末端において伸長された、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAから選択され、
前記ノンコーディングRNAがmiRNAでない場合に、
前記第1の変種は、前記標準配列のノンコーディングRNA、および、前記3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAから選択され、
前記第2の変種は、前記3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAであることを特徴とする方法。 - 低分子のノンコーディングRNAのバイオマーカー対を使用して、個体の健康状態に関するデータを収集するための方法であって、
前記個体に由来する体液サンプル中のバイオマーカー対の量を決定するステップと、
前記体液サンプル中のバイオマーカー対の比率を決定するステップと、
を含み、
前記バイオマーカー対は、ノンコーディングRNAの2つの異なる変種からなり、
第1の変種および第2の変種は、標準配列のノンコーディングRNA、5’末端または3’末端においてトリミングされた、および/または、5’末端または3’末端において伸長されたノンコーディングRNA、ならびに、任意選択で5’末端または3’末端においてトリミングされた、または、5’末端または3’末端において伸長された、3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAから選択され、
前記ノンコーディングRNAがmiRNAでない場合に、
前記第1の変種は、前記標準配列のノンコーディングRNA、および、前記3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAから選択され、
前記第2の変種は、前記3’末端非テンプレート型ヌクレオチド付加を有するノンコーディングRNAであることを特徴とする方法。 - 前記参照サンプルは、1または複数の健康な個体に由来するものであることを特徴とする請求項4または請求項5に記載の方法。
- 前記参照サンプルは、障害を有する1または複数の個体に由来するものであることを特徴とする請求項4または請求項5に記載の方法。
- 前記参照サンプルは、障害に対する処置における良好な反応を有する1または複数の個体に由来するものである
ことを特徴とする請求項4または請求項5に記載の方法。 - 前記ノンコーディングRNAは、トランスファーRNA、リボソームRNA、snoRNA、microRNA、siRNA、核内低分子、Y RNA、ヴォールトRNA、アンチセンスRNA、piwiRNAから選択され、好ましくは、ノンコーディングRNAは、miRNAから選択される
ことを特徴とする請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の変種および前記第2の変種は、
それぞれが、
標準配列および3’末端NTA−A、
標準配列および3’末端NTA−G、
標準配列および3’末端NTA−C、
標準配列および3’末端NTA−U、
3’末端NTA−Gおよび3’末端NTA−C、
3’末端NTA−Gおよび3’末端NTA−U、
3’末端NTA−Gおよび3’末端NTA−A、
3’末端NTA−Cおよび3’末端NTA−U、
3’末端NTA−Cおよび3’末端NTA−A、
3’末端NTA−Uおよび3’末端NTA−A、
標準配列および5’末端トリミングされた、
標準配列および3’末端トリミングされた、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−C、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−U、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−A、
5’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−G、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−C、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−U、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−A、
3’末端トリミングされたおよび3’末端NTA−G、
3’末端トリミングされたおよび5’末端トリミングされた、
伸長されたおよび3’末端NTA−A、
伸長されたおよび3’末端NTA−G、
伸長されたおよび3’末端NTA−C、
伸長されたおよび3’末端NTA−U、
伸長されたおよび5’末端トリミングされた、
伸長されたおよび3’末端トリミングされた、
5’末端または3’末端トリミングされたおよび5’末端または3’末端伸長された、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−U、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−A、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−G、
(トリミング、および/または、伸長された)および3’末端NTA−C、
(トリミング、および/または、伸長された)および標準配列、
のいずれかから選択される
ことを特徴とする請求項1から請求項9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記バイオマーカー対に含まれるそれぞれのノンコーディングRNAの変種は、少なくとも、16ヌクレオチドを含む
ことを特徴とする請求項1から請求項10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記バイオマーカー対は、表1、表2、表4、表5、表6、表9において示されるバイオマーカー対から選択されたひとつである
ことを特徴とする請求項1から請求項11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記変種は、ディープシーケンシング(RNA−seq)を使用して定量化されていることを特徴とする請求項1から請求項12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液サンプルからエキソソーム小胞を単離するステップと、
単離された前記エキソソーム小胞と関連する前記ノンコーディングRNAの2つの異なる変種の量を決定するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項1から請求項13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記体液サンプルからタンパク質画分を単離するステップと、
前記タンパク質画分と関連する前記ノンコーディングRNAの2つの異なる変種の量を決定するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項1から請求項14のいずれか一項に記載の方法。 - エキソソーム小胞またはタンパク質画分は、
前記体液サンプルをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で単離されることを特徴とする請求項14または請求項15に記載の方法。 - 個体における古典的ホジキンリンパ腫の状態を特徴付けるための方法であって、
前記個体に由来する体液サンプルに由来する1または複数のmiRNAの量を決定するステップと、
前記1または複数のmiRNAの量を参照サンプルと比較するステップと、
を含み、
前記1または複数のmiRNAの存在の差異、または、前記1または複数のmiRNAの量の差異は、前記個体の状態を特徴付け、
前記1または複数のmiRNAは、let−7a−5p、miR−1908−5p、miR−5189−5p、miR−92b−3p、miR−425−3p、miR−625−3p、miR−7706、miR−125b−5p、miR−760、miR−21−5p、miR−122−5p、miR−891a−5p、miR−155−5p、miR−129−5p、miR−182−5p、miR−1246、miR−320b、miR−127−3p、miR−9−5p、miR−769−5p、miR−193b−3pおよびmiR−146b−3pから選択されることを特徴とする方法。 - 前記1または複数のmiRNAは、let−7a−5p、miR−1908−5p、miR−5189−5p、miR−92b−3p、miR−425−3p、miR−625−3p、miR−7706、miR−125b−5p、miR−760、miR−21−5p、miR−122−5pから選択されることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 前記1または複数のmiRNAは、miR−21−5p、let−7a−5p、miR−127−3pおよびmiR−155−5pから選択されることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 前記個体が古典的ホジキンリンパ腫に罹患しているかどうかを前記古典的ホジキンリンパ腫の状態を特徴付けることで決定するステップを含む
ことを特徴とする請求項17から請求項19のいずれか一項に記載の方法。 - 前記参照サンプルは、1または複数の健康な個体に由来するものであることを特徴とする請求項17から請求項20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記参照サンプルは、古典的ホジキンリンパ腫を有する1または複数の個体に由来するものであることを特徴とする請求項17から請求項20のいずれか一項に記載の方法。
- 古典的ホジキンリンパ腫に対する処置を受けている個体において処置効力を古典的ホジキンリンパ腫の状態を特徴付けることで決定するステップを含むことを特徴とする請求項17から請求項20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記参照サンプルは、古典的ホジキンリンパ腫に対する処置を受ける前と同じ個体に由来するものであることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 古典的ホジキンリンパ腫に罹患している個体の予後を古典的ホジキンリンパ腫の状態を特徴付けることで決定するステップを含むことを特徴とする請求項17から請求項20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記参照サンプルは、障害に対する処置における良好な反応を有する1または複数の個体に由来するものであり、または、障害に対する処置における不十分な反応を有する1または複数の個体に由来するものであることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 前記体液サンプルからエキソソーム小胞を精製するステップと、
精製された前記エキソソーム小胞と関連する1または複数のmiRNAの量を決定するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項17から請求項26のいずれか一項に記載の方法。 - 前記エキソソーム小胞は、
前記体液サンプルをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で精製されていることを特徴とする請求項27に記載の方法。 - 前記エキソソーム小胞は、
空隙容量画分を取得することによって単離されていることを特徴とする請求項28に記載の方法。 - 前記体液は血液であることを特徴とする請求項1から請求項29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が尿であることを特徴とする請求項1から請求項29のいずれか一項に記載の方法。
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