CN111593121A - G0s2基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种G0S2基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，属于基因诊断和生物制药技术领域，本发明提供了G0S2基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，可以作为一种新的心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点，利用G0S2基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂，具有重要的临床应用意义和开发价值。

Description

G0S2基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途
技术领域
本发明涉及基因诊断和生物制药技术领域，特别是涉及一种G0S2基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途。
背景技术
冠状动脉疾病，尤其是冠心病在全世界范围内已呈现出流行病的比例，并成为全世界人口的主要死亡原因。据估计，在未来20年内心血管疾病的患病率将增加约10％。而急性心肌梗死，是全世界医院入院和死亡的主要原因，在美国，每年有超过80万人次经历急性心肌梗死，其死亡率约为27％(大部分在到达医院之前)。一些流行病学研究证实，冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)的发生发展受环境因素和遗传变异的共同影响。通过对CAD的一级预防战略，急性心肌梗死发病率已显著降低，然而仍有许多个体有相当大的残余风险。因此，临床上需要有效的风险预测方法，对高危人群给予有效识别，从而更早的干预，来降低急性心血管事件的发生，改善病人预后。
基因组中编码的遗传信息是稳定的，大多数情况下是不可变的。然而研究表明，大约有25000个基因在RNA水平的表达是高度可变的，可以使反应机体短期内的生理和病例变化。近年来随着基因芯片技术的发展，基因表达分析已经广泛应用于疾病的研究。在其他医学领域的研究已经表明，外周全血或外周血单核细胞的基因表达对疾病具有显著的预测价值，外周全血或外周单个核细胞基因表达的改变已被证实对CAD有显著的预测价值。基因表达分析可以为疾病近期风险预测提供新的生物标志物。
G0/G1开关2(G0S2)基因，是在凝集素激活的人类淋巴细胞中被早期激活基因所表达的一种重要的基础蛋白质，并且被认为能调控细胞G0期至G1期的转换，从而调控细胞增殖；既往研究表明，G0S2与脂解、细胞增殖、细胞凋亡和氧化磷酸化以及多种肿瘤疾病等密切相关，在现有研究中未见GOS2与心肌梗死的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种G0S2基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，以解决上述现有技术存在的问题，通过对冠心病患者和稳定型冠心病患者外周血中G0S2基因表达量差异的分析，可以预测SCAD患者患急性心肌梗死的可能性，从而减少急性心肌梗死的发生。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种G0S2基因及其表达产物在制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂中的用途。
作为本发明的进一步改进，所述急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂采用基因芯片检测、外周血RNA提取试剂盒、常规PCR相对定量技术、实时荧光定量PCR技术检测基因芯片检测受试者或急性心肌梗死患者基因芯片或外周血中基因的表达水平。
作为本发明的进一步改进，所述GOS2基因和/或GOS2基因的表达产物在急性心肌梗死外周血中低表达。
本发明还提供一种急性心肌梗死风险预测和诊断的检测方法，以急性心肌梗死患者外周血提取基因组RNA为模板，进行逆转录，荧光定量检测G0S2基因mRNA表达水平。
作为本发明的进一步改进，所述荧光定量检测使用的引物对序列如下所示：
上游引物序列：5’-AGGAGATGATGGCCCAGAAG-3’
下游引物序列：5’-AGGGCTTGCTTCTGGAGAG-3’。
作为本发明的进一步改进，所述的荧光定量检测的反应体系为：
20ul反应体系，每个反应包括:10ul Fast qPCR Master Mix，上、下游引物各0.4ul(浓度为10umol/L)，无核酸酶的双蒸水6.2ul，DNA Buffer 2ul,cDNA模板1ul。
作为本发明的进一步改进，所述荧光定量检测的反应条件为：
反应条件为95℃预变性5分钟；40个循环：95℃变性3秒,60℃退火30秒,72℃延伸20秒；溶解曲线和扩增曲线95℃15秒，60℃1分钟,95℃15秒；以GAPDH基因(一个在体内恒定表达的基因，和G0S2基因作对照)为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。
本发明公开了以下技术效果：
外周血中基因表达水平的高低反应了心血管疾病的变化和发展，是极具意义并且方便、性价比高的检验心血管疾病的生物标志物的手段。外周血心肌梗死患者差异基因表达谱分析结果显示：在心肌梗死患者和稳定型冠心病患者的外周血白细胞中存在着大量差异表达的基因。
本发明提供了G0S2基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，可以作为一种新的心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点，利用G0S2基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂，具有重要的临床应用意义和开发价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明G0S2基因荧光定量PCR的扩增曲线；
图2为本发明G0S2基因荧光定量PCR特异性引物的溶解曲线；
图3为本发明G0S2基因mRNA表达水平在急性心梗组和稳定冠心病组的比较图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
本发明主要采用G0S2基因荧光定量PCR筛选出稳定型冠心病患者发生急性心肌梗死的相关基因表达量，结合分子生物学实验和临床病例关联分析，证实了是急性心肌梗死诊治标志物。
实施例1
一、病例的收集
选取2018年3月-2018年7月于吉林大学中日联谊医院心血管内科住院治疗并行冠脉造影术的患者，依据2012年公布的心肌梗死全球统一定义，明确诊断为急性心肌梗死的病人92例为急性心肌梗死组，2013年ESC指南公布的稳定型冠心病定义诊断为稳定型冠心病的病人75例为冠状动脉粥样硬化组。并根据冠状动脉造影结果，按照Gensini评分系统对研究对象的冠状动脉血管病变严重程度进行评分，分值越高病变越严重。
二、排除标准
1.经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植术(CABG)相关的心肌梗死。
2.MI type II。继发于供血失衡相关的心梗：如儿茶酚胺水平升高或冠脉痉挛导致的心梗。
3.伴有心脏手术或非心脏手术的心梗。
4.合并多因素或不确定疾病的心肌损伤：严重心力衰竭、应激性心肌病、严重肺栓塞或肺动脉高压、败血症和危重病人、肾功能衰竭、严重的急性神经系统疾病，如卒中、蛛网膜下腔出血等。
5.患有免疫系统疾病和(或)正在服用激素。
6.(活动性或潜伏性)结核感染史或证据。
7.正在患有的、慢性的或复发性的传染性疾病史。
8.合并有严重感染性疾病、恶性肿瘤。怀疑或证实处于免疫缺陷状态的患者。
9.临床资料或者冠脉造影资料不全者。详细记录临床资料，包括：血脂水平、空腹血糖水平、静息血压、冠心病家族史、吸烟史、冠状动脉造影资料，以及合并其它临床疾病情况(如高血压、糖尿病)等。
三、急性心肌梗死患者组及对照组外周血中G0S2基因表达情况
方法：
1.1外周血采集、总RNA提取及cDNA合成
留取各研究对象晨起空腹外周静脉血5ml，利用血液总RNA提取试剂盒(BloodTotal RNA Kit,新景生物试剂开发有限公司，杭州)，依据试剂盒说明书对已获取的外周血进行总RNA提取，并利用1.0％琼脂糖电泳及酶标仪(Biotek Epoch)对RNA的质量及浓度进行检测。合格的RNA样本A260/A280值在1.8和2.0之间，且A260/A230值大于2。琼脂糖凝胶电泳可见明亮的28S和18S rRNA条带，且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA的两倍。采用反转录试剂盒(fastking一步法除基因组cDNA第一链合成预混剂，天根生化科技有限公司，北京)，取总量为1ug合格的总RNA进行反转录，得到cDNA样品保存于-20℃以便下一步进行实时荧光定量PCR。
1.2 G0S2基因实时荧光定量PCR检测
利用生工荧光定量试剂盒(Taq qpcr合成预混剂)进行PCR扩增。G0S2荧光定量PCR反应体系：20ul反应体系，每个反应包括:10ul Fast qPCR Master Mix，上、下游引物各0.4ul(浓度为10umol/L)，无核酸酶的双蒸水6.2ul，DNA Buffer 2ul,cDNA模板1ul。G0S2荧光定量PCR反应条件：应用实时荧光定量PCR系统扩增。反应条件为95℃预变性5分钟；40个循环：95℃变性3秒,60℃退火30秒,72℃延伸20秒；溶解曲线和扩增曲线95℃15秒，60℃1分钟,95℃15秒。以GAPDH基因(一个在体内恒定表达的基因，和G0S2基因作对照)为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。每个样本所得循环阈值(Ct)以相对表达量2-△Ct(△Ct＝目的基因Ct-内参基因Ct)表示，并进行比较。急性心肌梗死组对于对照组的相对表达量以2-△△Ct法进行统计分析，△△Ct＝急性心肌梗死组△Ct-对照组△Ct。所用PCR引物根据NCBI数据库提供的G0S2基因序列进行设计，并由江苏金唯智生物公司合成，引物序列见表1。
表1 G0S2RT-PCR引物序列
Figure BDA0002572816430000071
Fa,上游引物；
Rb,上游引物；
GAPDH：一个在体内恒定表达的基因，作用是与G0S2基因作对照。
四、G0S2基因相对表达量与急性心肌梗死患者血脂、血糖等性状的相关性分析
2.1方法统计学分析
数据使用SPSS 24.0软件进行统计学分析，计量资料服从正态分布使用X±S进行统计描述，组间差异比较使用独立T检验分析，不服从正态分布的使用中位数和四分位数间距进行统计分析描述，组间差异使用秩和检验；计数资料采用频数进行统计分析描述，组间差异使用x2检验分析；AMI相关危险因素采用二元logistic回归分析。
2.2临床资料分析
研究对象的临床资料分析结果表明：在性别、高血压病史、吸烟史、血清甘油三酯水平(TG)、血清总胆固醇水平(TC)、低密度脂蛋白胆固醇水平(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等方面，两组未见明显统计学差异,如表2所示。
表2研究对象基线资料
Figure BDA0002572816430000081
2.3 G0S2基因实时荧光定量PCR扩增产物鉴定
外周血RNA实时荧光定量PCR检测结果显示：G0S2基因扩增曲线为显著平滑的“S”型，如图1所示；溶解曲线呈现单一的溶解峰，扩增产物特异性较高，如图2所示。
2.4外周血白细胞中G0S2基因的mRNA表达水平结果分析
G0S2基因mRNA水平相对表达量在AMI组和SCAD组间比较分析q-PCR所得每个样本的ΔCt值均为单个样本重复3次测量所得均值。结果显示，AMI组2-△Ct为2.04(0.85-15.08)，SCAD组2-△Ct为4.94(1.14-27.98)，两组差别有显著统计学差异(p＜0.05)。AMI患者外周血中G0S2基因mRNA相对表达量明显低于SCAD患者，且其相对表达量为SCAD组的0.41倍，如图3所示。
2.5外周血白细胞G0S2基因mRNA水平表达量与AMI的单因素Logistic回归分析
采用Logistic回归分析G0S2基因mRNA水平表达量与急性心肌梗死的关系，按G0S2基因的相对表达量cut off值将所有研究对象分为高表达组(2-△Ct≥4.30)和低表达组(2-△Ct＜4.30)，进一步采用逐步二元Logistic回归分析G0S2基因mRNA水平表达量与AMI的相关性。
结果表明：G0S2基因低表达是AMI的独立危险因素，与G0S2高表达相比，G0S2基因低表达组AMI的风险增加2.1倍，如表3所示。
表3 AMI独立危险因素Logistic回归分析结果
Figure BDA0002572816430000091
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.G0S2基因及其表达产物在制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂采用基因芯片检测、外周血RNA提取试剂盒、常规PCR相对定量技术、实时荧光定量PCR技术检测基因芯片检测受试者或急性心肌梗死患者基因芯片或外周血中基因的表达水平。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述GOS2基因和/或GOS2基因的表达产物在急性心肌梗死外周血中低表达。
4.急性心肌梗死风险预测和诊断的检测方法，其特征在于，以急性心肌梗死患者外周血提取基因组RNA为模板，进行逆转录，荧光定量检测G0S2基因mRNA表达水平。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量检测使用的引物对序列如下所示：
上游引物序列：5’-AGGAGATGATGGCCCAGAAG-3’
下游引物序列：5’-AGGGCTTGCTTCTGGAGAG-3’。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的荧光定量检测的反应体系为：
20ul反应体系，每个反应包括:10ul Fast qPCR Master Mix，上、下游引物各0.4ul(浓度为10umol/L)，无核酸酶的双蒸水6.2ul，DNA Buffer 2ul,cDNA模板1ul。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量检测的反应条件为：
反应条件为95℃预变性5分钟；40个循环：95℃变性3秒,60℃退火30秒,72℃20延伸秒；溶解曲线和扩增曲线95℃15秒，60℃1分钟,95℃15秒；以GAPDH基因为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。
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