RS54891B1 - Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom - Google Patents

Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom

Info

Publication number
RS54891B1
RS54891B1 RS20160483A RSP20160483A RS54891B1 RS 54891 B1 RS54891 B1 RS 54891B1 RS 20160483 A RS20160483 A RS 20160483A RS P20160483 A RSP20160483 A RS P20160483A RS 54891 B1 RS54891 B1 RS 54891B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
gene
human
light chain
endogenous
Prior art date
Application number
RS20160483A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Cagan Gurer
Andrew J Murphy
Karolina A Hosiawa
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS54891B1 publication Critical patent/RS54891B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Position Input By Displaying (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Electrochromic Elements, Electrophoresis, Or Variable Reflection Or Absorption Elements (AREA)

Abstract

Miš koji obuhvata endogeni λ (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVλ) i nepreraspoređeni ljudski spojni (hJλ) segment gena, pri čemu miš obuhvata brisanje prve Vλ-Jλ-Cλ skupine gena pomenutog endogenog mišjeg λ alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, Vλ-Jλ, segmente gena druge Vλ-Jλ-Cλ skupine gena pomenutog alela sa Ijudskim VAi JX segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji lambda konstantni (Cλ) region gena pomenute druge Vλ-Jλ-Cλ skupine gena tako da miš ispoljava laki lanac izveden izhVλ hJλ i mišji Cλ gen, pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišjeg lambda 3' pojačivača (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedimuti u pomenutom λ alelu lakog lanca.Prijava sadrži još 16 patentnih zahteva.

Description

OBLAST
[0001]Genetski modifikovani miševi koji obuhvataju nepreraspoređeni segment gena promenljivog Mlakog lanca imunoglobulina čoveka (hVA) iAspojni segment gena (hJA) čoveka funkcionalno povezane sa konstantnim regionom mišjeg lambda (CA) lakog lanca Genetski modifikovani miševi koji ispoljavaju antitela koja obuhvataju laki lanac imunoglobulina izveden iz hVA, hJA i mišjeg CAgena.
PRETHODNO STANJE TEHNIKE
[0002]Miševi koji ispoljavaju antitela koja su potpuno ljudski, iii delimično ljudski i delimično mišji, su poznati u ovoj oblasti. Na primer, transgenski miševi koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz transgena koji sadrže ljudske gene promenljivog regiona imunoglobulina lakog i teškog lanca. Genetski modifikovani miševi koji sadrže zamenu endogenih mišjih segmenata gena promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) i promenljivog regiona kapa (k) lakog lanca (LCVR) segmente gena sa ljudskim HCVR i LCVR segmente gena i koji prave himerna antitela s himenim ljudskim/mišjim kapa lancem, takođe su poznati.
[0003]Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (k) i lambda (A). Laki lanci mišjeg antitela su primarnoktipa. Odnoskprema A upotrebe lakog lanca kod ljudi je oko 60:40, dok je kod miševa oko 95:5. Preferirana upotrebaklakih lanaca kod miševa je prema izveštajima zadržana kod genetski modifikovanih miševa sposobnih da ispolje potpuno ili delimično ljudska antitela. Dakle, izgleda da su miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela ograničeni za upotrebu promenljivog lambda lanca.
[0004]Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da se generišu promenljivi regioni lambda lanca, bilo mišjeg ili ljudskog, za upotrebu za pravljenje proteina za vezivanje epitopa. Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike za miševima koji ispoljavaju potpuno iii delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu promenljivu upotrebu lambda (VA) lanca.
[0005]Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu upotrebuApromenljivog (VA.). WO 00/26373 se odnosi na ispoljavanje ljudskog Ig A lokusa od strane miševa.
[0006]WO 2010/039900 se odnosi na nokin (knock-in) nehumane ćelije i sisare koji imaju genom koji kodira himerne Ig lance i antitela i postupke za proizvodnju nokin ćelija i sisara. Opisuje se nokin miš koji ima genom koji obuhvata ljudski VH segment, ljudski JH segment gena i ljudski DH segment gena i deo sinergijskog Ig lokusa teškog lanca, gde ljudski lokus teškog lanca zamenjuje sve ili deo endogenog lokusa teškog lanca tako da životinja može da proizvodi himerne teške lance. Kod specifičnih izvođenja mišji genom još obuvhata ljudski IgA lokus lakog lanca, ili njegov deo, i IgA. 3'LCR, gde ljudski IgA lokus lakog lanca zamenjuje sve ili deo endogenog Ig lokusa lakog lanca
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0007]Ovaj pronalazak u svom najširem smislu jeste kako je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima Opisuju se genetski modifikovani miševi, embrioni, ćelije, tkiva, kao i konstrukti nukleinske kiseline za modifikovanje miševa, i postupci i jedinjenja za pravljenje i korišćenje istih. Miševi i ćelije koje generišu ljudske A. promenljive regione u ovom kontekstuA lakog lanca, od endogenog mišjeg lokusa lakog lanca, su takođe obezbeđeni kako je formulisano u patentnim zahtevima Takođe su opisani postupci za pravljenje antitela koja obuhvataju lambda promenljive regione. Postupci za odabrt teških lanaca koji se ispoljavaju sa poznatim lambda promenljivim regionima se takođe opisuju 0008]Opisuju se himerni i ljudski proteini za vezivanje antigena (npr., antitela), i nukleinske kiseline koje ih kodiraju, koji obuhvata somatski mutirane promenljive regione, uključujući antitela koja imaju lake lance koji obuhvataju promenljivi domen izveden iz ljudskog VA. i ljudskog JA segmenta gena spojenog na mišji konstantni domen lambda lakog lanca.
[0009] Ovaj pronalazak dajemiša koji obuhvata endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVA) i nepreraspoređeni ljudski spojni (hJA) segment gena, pri čemu miš obuhvata brisanje prveVA-JA-CAskupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmente gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa ljudskimVA iJA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji lambda konstantni (CA) region gena pomenute druge VA-JA-CA skupine gena tako da miš ispoljava laki lanac izveden iz hVA hJA i mišjeg CAgena, pri čemu se endogeni pojačivači Enh 2.4, mišjeg lambda 3' pojačivača (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alel u lakog lanca.
[0010]Ovaj pronalazak još obezbeđuje: izolovanu ćeliju koja ispoljava laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena, pri čemu je ćelije iz, ili može se dobiti od, miša prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i pri čemu ćelija obuhvata preraspoređeni ljudski VA i preraspoređeni ljudski JA segment gena. i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegAalela lakog lanca i zamenu. u celini ili delimično, VA-Ja segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA gen konstantnog regiona pomenute druge VA-JA-CA. skupine gena, i pri čemu endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca.
izolovanu mišju embrionsku matičnu ćeliju koja obuhvata endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski promenljivi lambda VA i nepreraspoređeni ljudski JA segment gena, pri čemu ćelija obuhvata brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute drugeVA-JA-CAskupine gena i pri čemu se endogeni pojačivači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačivač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca;
mišji embrion koji obuhvata, napravljen od, ili koji se može dobiti iz, mišje ES ćelije prema ovom pronalasku, pri čemu mišji embrion obuhvata endogeni (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski VA i nepreraspoređeni ljudski JA segment gena, gde ćelija obuhvata brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegAalelalakog lanca i zamenu, u celini ili delimično VA-JA. segmenata gena druge VA-JA-Ca skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute drugeVA.-JA-CA skupinegena. i pri čemu se endogeni pojačivači Enh 2.4, mišji lambda 3<:>pojačivač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutomA alelu lakog lanca.
hibridom koji ispoljava laki lanac izveden iz hVA. hJA i mišjeg CAgena pri čemu je hibridom iz, ili se
može dobiti iz, miša rema ovom pronalasku, pri čemu ćelija obuhvata preraspoređeni ljudski V?. i preraspoređeni ljudski JA segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, V?.-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute mišje VA-JA-CA skupine gena, pri čemu se endogeni pojačivači Enh 2.4. mišji lambda 3' pojačivač (Enh) i Enh 3,1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca.
upotreba B ćelije prema ovom pronalasku da se napravi hibridom koji ispoljava laki lanac izveden izliV^A. hJA i mišjeg CAgena, pri čemu je hibridom iz, ili može da se dobije iz, miša prema ovom pronalasku, pri čemu ćelija obuhvata preraspoređeni ljudski VA i preraspoređeni ljudski JA segment gena, i brisanje prve VA- JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegAalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišjiCXkonstantni region gena pomenute druge V-JA-CA.skupine gena i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2 4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca.
[0011]Ovaj pronalazak još obuhvata postupak za pravljenje antitela u mišu obuhvata: (a) izlaganje miša prema ovom pronalasku antigenu; (b) dozvoljavanje omogućavanje mišu da razvije odgovor imunog sistema na taj anigen; i (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, ili izolovanje iz miša (b) ćelije koja obuhvata gomen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, ili identifikovanje kod miša (b) sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje ovaj antigen, pri čemu ovo antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena.
[0012]Opisana su antitela koja obuhvataju (a) promenljivi domen ljudskog teškog lanca (hVn) spojen na mišji konstantni region teškog lanca, i (b) ljudski VA spojen na mišji Cldomen; uključujući gde su jedan ili više promenljivih domena somatski mutirani, npr tokom antitela ili odabira imune ćelije kod miša prema ovom pronalasku. Ovi nepreraspoređeni hVA i nepreraspoređeni hJA su funkcionalno povezani sa nedirnutim mišjimXkonstantnim regionom (CA)
[0013]Takođe je opisan i miš koji sadrži svoju klicmu liniju, na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca, pri čemu se ljudska lambda sekvenca promenljivog regiona ispoljava u lakom lancu koji obuhvata mišju sekvencu gena konstantnog lambda regiona imunoglobulina.
[0014]Endogeni mišji lokus lakog lanca jeAlokus.
[0015]U jednom varijantnom rešenju, mišu nedostaje endogena sekvenca promenljivog lakog lanca na endogenom mišjem lokusu lakog lanca
[0016]U jednom varijantnom rešenju, svi ili pretežno svi endogeni mišji segmenti gena promenljivog regiona lakog lanca se zamene jednim ili više ljudskih A segmenata gena promenljivog regiona.
[0017]U jednom varijantnom rešenju, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata ljudsku JA. sekvencu. U jednom varijantnom rešenju, ljudska JA sekvenca se bira iz grupe koja se sastoji od JA.1 JA.2, JA3, JA7, i njihove kombinacije.
[0018]U jednom varijantnom rešenju, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine A ljudskog lokusa lakog lanca. U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne A ljudskogXlokusa lakog lanca se proteže se od hVA3-27 kroz hVA3-1.
[0019]U jednom varijantnom rešenju, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine B ljudskog llokusa lakog lanca. U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne B ljudskog A lokusa lakog lanca se proteže se od hVA5-52 kroz hVA1-40
[0020]U jednom varijantnom rešenju, ljudska/.sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata genomski fragment skupine A i genomski fragment skupine B U jednom varijantnom rešenju, ljudskaAsekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata najmanje jedan segment gena skupine A i najmanje jedan segment gena skupine B.
[0021]U jednom varijantnom rešenju, više od 10% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje dva hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23. 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 20% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje tri hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23. 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 30% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje četiri hVA, segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49.
[0022]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata nepreraspoređeni VA i JA segment gena imunoglobulina funkcionalno povezan na mišji lokus lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CAgen.
[0023]VA i JA segmenti gena su segmenti ljudskog gena
[0024]Endogeni mišji lokus lakog lanca je A lokus lakog lanca
[0025]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata i zamenu jednog ili više teških lanaca, V, D, i/ili J segmenata gena sa jednim ili više ljudskih V, D. i/ili J segmenata gena na encdgenom mišjem lolkusu imunoglobulina teškog lanca.
[0026]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata nepreraspoređen ljudski A segment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (VA) iAspojni segment gena (JA) na endogenom mišjem
>^lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CA gen
[0027]Lokus promenljivog gena lakog lanca A ("A lokus") obuhvata najmanje jedan hVA segment gena i najmanje jedan ljudski JA(hJ?0 segment gena. U još jednom varijantnom rešenju, A lokus obuhvata najviše četiri hJA. segmenta gena.
[0028]U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata više hVA. U jednom varijantnom rešenju, više hVA se bira tako da kao rezultat da ispoljavanjeArepertoara promenljivog regiona lakog lanca koji odražava oko 10%, oko 20%, oko 30%. oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, ili oko 90% ili više, upotrebe VA.primećene kod čoveka U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata segmente gena hVA 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, i njihovu kombinaciju
[0029]U jednom varijantnom rešenju, hVA obuhvata 3-1, 4-3. 2-8. 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12 U specifičnom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskogAlakog lanca koja se prostire od VA3-12 do VA3-1. U jednom varijantnom rešenju. VA lokus obuhvata najmanje 2, 3. 4. 5, 6. 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 hVA. U jednom varijantnom rešenju, hVA obuhvata 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 i 3-12. U specifičnom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog A lokusa koji se prostire od VA3-12 do VA3-1. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni k lokus se briše delimično ili potpuno.
[0030]U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata 13 do 28 ili više hVAs. U specifičnom varijantnom rešenju, hVAobuhvata 2-14, 3-16, 2-18. 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, i 3-27. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeniklokus se briše delimično ili potpuno
[0031]U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata 29 do 40 hVA. Kod specifičnog izvođenja, sve ili pretežno sve sekvence između hVA1-40 i hVA3-29 genetski modifikovanom mišu obuhvataju u suštini ljudsku A sekvencu od približno 959 bp pronađenu u prirodi (npr., u ljudskoj populaciji) nizvodno od hVA1-40 segmenta gena (nizvodno od 3' neprevedenog dela). mesto reakcije enzima (npr., Pl-Scel), posle čega sledi ljudska A sekvenca od približno 3 431 bp uzvodno od hVA.3-29 segmenta gena pronađenog u prirodi. U specifičnom varijantnom rešenju. endrogenikmišji lokus se briše delimično ili potpuno.
[0032]VA lokus obuhvata najmanje jedan hJA. U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata više hJA. U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata najmanje 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 hJA. U specifičnom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata četiri hJA. U specifičnom varijantnom rešenju, četiri hJA su hJA_1, hJA2, hJA.3, i hJA7. U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata jedan hJA U specifičnom varijantnom rešenju, hJA, je hJX1 U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeniklokus se briše delimično ili potpuno.
[0033]VA. lokus obuhvata najmanje jedan hVA, najmanje jedan hJA, i nedirnuti mišji CA gen. U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji CAgenje CA2
[0034]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu endogenih mišjih VA segmenata gena na endogenom mišjemA.iokusu s jednim ili više hVA segmenata gena na endogenmo mišjem A lokusu, pri čemu su hVA segmenti gena funkcionalno povezani na nedirnuti mišji gen CA gen regiona, tako da miš preraspoređuje hVAsegmente gena i ispoljava reverzni himerni laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen i mišji CA. U specifičnom varijantnom rešenju. mišjiCA genje CA2. U jednom varijantnom rešenju, 90-100% nepreraspoređenih mišjih VA segmenata gena se zameni najmanje jednim nepreraspoređenim hVA. segmentom gena. U specifičnom varijantnom rešenju, svi ili pretežno svi endogeni mišji VA segmenti gena se zamene najmanje jednim nepreraspoređenim hVA segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, zamena je sa najmanje 12 najmanje 28. ili najmanje 40 nepreraspoređenih hVA segmenata gena. U jednom izvođenju, zamena je sa najmanje 7 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena, najmanje 16 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena, ili najmanje 27 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena. U jednom izvođenju, miš obuhvata zamenu svih mišjih JA segmenata gena sa najmanje jednim nepreraspoređenim hJA segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, najmanje jedan neprerasporešeni hJA segment gena se bira iz JA1, JA2, JA3, JA4, JA5, JA6, JA7, i njihove kombinacije. U specifičnom izvođenju, jedan ili više hVA segment gena se bira iz 3-1, 4-3. 2-8, 3-9. 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16. 2-18. 3-19. 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44. 5-45, 7-46, 1-47. 5-48. 9-49, 1-50, 1-51, a 5-52 hVA segment gena, i njihove kombinacije. U specifičnom varijantnom rešenju, najmanje jedan neprerasporešeni hJA segment gena se bira iz JA1, JA2, JA3, JA7, i njihove kombinacije.
[0035]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata ne više od dva alela lakog lanca, pri čemu aleli lakog lanca obuhvataju (a) nepreraspoređeni ljudski imunoglobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CA gen; i, (b) nepreraspoređeni Vj_ i JLsegment gena imunoglobulina na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Clgen
[0036]U jednom varijantnom rešenju, endogeni mišji lokus lakog lanca jeklokus. U drugom varijantnom rešenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je A lokus.
[0037]Ujednom varijantnom rešenju, ne više od dva alela lakog lanca se bira iz k alela i A alela, dva alela, i dva A alela. U jednom specifičnom varijantnom rešenju. jedan od dva alela lakog lanca jeAalel koji obuhvata CA2 gen
[0038]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata jedan funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski VA i JA segmenta gena imunoglobulina na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CA gen U jednom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji CAgen je CA2.
[0039]U jednom varijantnom rešenju, miš još obuhvata barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina U jednom varijantnom rešenju, barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina obuhvata ljudski VH segment gena, ljudski DH segment gena, i ljudski JH segment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata ljudski gen teškog lanca koji ispoljava ljudski/mišji teški lanac. U jednom specifičnom izvođenju, miš obuhvata dva alela teškog lanca imunoglobulina, i miš ispoljava ljudski/mišji teški lanac.
[0040]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata prvi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVKi nepreraspoređeni hJk\na endogenom mišjemi<lokusu koji obuhvata endogeni Ck gen; i na drugom alelu lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVA i nepreraspoređeni hJA, na endogenom mišjem A lokusu koji obuhvata nedirnuti endogeni CAgen kako je formulisano u patentnim zahtevima. U specifičnom varijantnom rešenju, prvi i drugi alel lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša. U jednom varijantnom rešenju, endogeni CA gen je CA2.
[0041]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin V/. i Ja segment gena na endogenom mišjem k- lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, drugi obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vki Jk segment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin VAi JA segment gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CA kako je formulisano u patentnim zahtevima. četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni Vhi D|-| i Jhsegment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca, i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunoglobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CAgen, (b) A lokus koji je nefunkcionalan, ili (c) brisanje u celini ili delimično A lokusa
[0042]U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA. U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVK i |-iJk. Treći alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA.. U jednom varijantnom rešenju, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVn i hDHi hJn U jednom varijantnom rešenju. šesti alel obuhvata
endogeni mišji A lokus koji se briše u celini ili delimično
[0043]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni VA i J)t segment gena imunoglobulina na endogenom mišjemAlokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CAgen, drugi obuhvata nepreraspoređeni VA i JA segment gena imumoglobulina na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CAgen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vk i Jksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni Vh i Dhi Jjh segment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunoglobulin Vki Jk segment gena na endogenom mišjem k lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CKgen, (b) k lokus koji je nefunkcionalni, ili (c) brisanje u jednog ili više elemenataklokusa
[0044]U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVAi hJA segment gena. U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA segment gena U jednom varijantnom rešenju, treći alel obuhvata nepreraspoređeni IiVk i hJKsegment gena. U jednom varijantnom rešenju, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVHi hDH1hJHsegment gena. U jednom varijantnom rešenju, šesti alel obuhvata endogeni mišjiklokus koji je funkcionalno neaktivan.
[0045]U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš obuhvata B ćeliju koja obuhvata preraspoređeni gen antitela koji obuhvata preraspoređeni hVA domen funkcionalno povezan na nedirnuti mišji CA domen. U specifičnom izvođenju, mišji CA domen je izveden izCA2gena
[0046]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu VA-JA sekvencu čoveka i mišjuCAsekvencu
[0047]Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CAgena U specifičnom izvođenju, CA region je CA2 U specifičnom varijantnom rešenju, antitelo još obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi domen izveden iz ljudskog V, ljudskog D i ljudskog J segment gena, i konstantni domen teškog lanca izveden iz mišjeg gena konstantnog domena teškog lanca. U jednom varijantnom rešenju, mišjji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata spoj-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CHi-spoj-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca, U drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata ChVChV CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH2-CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca.
[0048]U jednom varijantnom rešenju, miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređeni A promenljivi region lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata ljudskuVA/JA sekvencuizabranu iz 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3. 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1.
[0049]Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata (a) teški lanac koji obuhvata promenljivi domen teškog lanca izveden iz nepreraspoređenog ljudskog segmenta gena promenljivog regiona teškog lanca, pri čemu se promenljivi domen teškog lanca spaja na mišji konstantni region teškog lanca (Ch); i, (b) laki lanac obuhvata promenljivi domen lakog lanca izveden iz nepreraspoređenog hVA i hJA, pri čemu se promenljivi domen lakog lanca spoji na nedirnuti mišji CA region.
[0050]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata (i) lokus teškog lanca koji obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D i J segmenata gena sa svim ili pretežon svim funkcionalnim ljudskim V, D, i J segmentima gena, mišji Chgen, (ii) prvi A lokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih VA i JA segmenata gena sa svim, pretežnom svim, ili više, funkcionalniih hVA i hJA segmenata gena, i nedirnutim mišjim CA genom, (iii) drugo A lokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih VA i JAsegmenata gena sa svim, pretežno svim, ili više, funkcionalnih hVA i hJA segmenata gena, i nedirnutim mišjim CA genom. U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišjiCAgen je CA2.
[0051]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata brisanje Ckgena i/ili Vki/ili Jksegmenta gena. U jednom izvođenju, miš obuhvata nefunkcionalniklokus lakog lanca
[0052]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo. gde je više od 10 % , više od 15%, više od 20%. više od 25%, više od 30%. više od 35%. više od 40%. više od 60%, više od 70%, više od 80%, ili više od 90% ukupnog IgG antitela proizvedenog od strane miša obuhvata A.-izvedeni promenljivi domen, i pri čemu miš ispoljava antitela koja obuhvatajuK-izveden promenljivi domen spojen sa mišjim Ckregionom. U specifičnim varijantnim rešenjima, oko 15-40%, 20-40%, 25-40%, 30-40%, ili 35-40% ukupnog antitela proizvedenog pomoću miša obuhvata/„-izvedeni promenljivi domen.
[0053]U jednom varijantnom rešenju, A-izvedeni promenljivi domen se izvodi iz hVA i hJA. U specifičnom varijantnom rešenju, A-izvedeni promenljivi region je u lakom lancu koji obuhvata mišji CA region. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, CA region je CA2 region Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt koji obuhvata uzvodni homologni krak i nizvodni homologni krak, pri čemu uzvodni i nizvodni homologni kraci ciljaju konstrukt na mišjem k lokusu, i taj konstrukt obuhvata funkcionalni nepreraspoređeni hVA, segment i funkcionalni nepreraspoređeni hJA. segment, i sekvencu odabira ili marker sekvenvcu.
[0054]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeA sekvenceuzvodno od mišjeg VA2, odabir kasete prirubnih 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i ciljajućim krakom za ciljanje mišjeAsekvence 3' mišjeg JA2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed Hyg-TK kaseta U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišji CA2,JA.4. CA4 i mišji pojačavač 2.4.
[0055]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegAlokusa u vezi sa VA1 kasetom odabira prurubnim 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje A sekvence 3' u vezi sa mišjim JA1. U jednom varijantnom rešenju. kaseta odabira je kaseta neomicina u tečnom kiseoniku. U jednom varijantnom rešenju. 3' ciljajući krak obuhvata mišjiX 3'pojačavač i mišjiA3' pojačavač 3.1.
[0056]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5 do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegAlokusa u vezi sa VA1 kasetom odabira prurubnim 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje/.sekvence 3' u vezi sa mišjim JA.2 i 5' u vezi sa mišjim CA.2 U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljni krak obuhvata mišje CA.2-JA.4-C/.4 segmente gena i mišji a, pojačivač 2.4.
[0057]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljni krak za ciljni mišji/. lokus 5' u vezi sa V/.2, kasetom odabira prirubnih 5' i 3' sa mesta prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog /.lokusa lakog lanca od hV7.3-12 nizvodno do kraja hJX1, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišje/.sekvence 3' u vezi sa mišjim Ja.2. U jednom varijantnom rešenju, selekcija kasete je Frt'ed kasete neomicina U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljni krak obuhvata mišjeCa2-J/.4-Ca4segmente gena i mišji/.pojačivač 2.4.
[0058]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog/.lokusa lakog lanca.od hVA.3-12 nizvodno do kraja hV/J,
[0059]Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5 do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg /. lokus 5' u vezi sa Va2, kasetu odabira prirubnu 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskogklokusa lakog lanca od hV/.3-27 nizvodno do kraja hV/.2-8 U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed higromicin kaseta U jednom varijantnom rešenju. ljudski genomski fragment obuhvata 3' ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 53 kb ljudskogklokusa lakog lanca od hVA.3-12 nizvodno do kraja hJA.2-8.
[0060]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog/. lokusa lakog lanca od hVA3-27 donjeg toka do kraja hV/.3-12.
[0061]Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5 do 3' u vezi sa smerom transkripcije, cijajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa V/.2, kasetom odabira prirubnih 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombianze, prvi ljudski genomski fragment obuhvata dodirni region ljudskog A. lokusa lakog lanca od hV/.5-52 nizvodno prema kraju hV/.1-40, mesto ograničenja enzima, i drugi ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskogXlokusa lakog lanca od hVA.3-29 nizvodno prema kraju hVX82K. U jednom varijantnom rešenju, selekcija kasete je Frt'ed kaseta neomicina. U jednom varijantnom rešenju, mesto ograničenja enzima je mesto za homing endonukleazu. U specičnom varijantnom rešenju, homing endonukleaza je Pl-Scel. U jednom varijantnom rešenju, drugi ljudski genomski fragment je 3' ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 27 kb ljudskogXlokusa lakog lanca od hV/.3-29 nizvodno do kraja hVA.82K.
[0062]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog/.lokusa lakog lanca od hV/,5-52 donjeg toka do kraja hV/.1-40
[0063]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa endogenim Vksegmentima gena, dva podređena mesta prepoznavanja rekombinaze, kaseta odabira 3' prema podređenim mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišjeKsekvence 5' u vezi saksegmentima gena promenljivog lakog lanca U jednom varijantnom rešenju, podređena mesta prepoznavanja rekombinaze su suprotno usmereni jedan prema drugom. U specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze su različita. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze su/oxPmesto i /ox511 mesto U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina.
[0064]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa mišjim Jksegmentima gena, kasetom odabira, mestom prepoznavanja rekombinaze 3' a kaseti odabira, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišjeksekvence 3' u vezi sa mišjim Jksegmentima gena i 5' na mišjemkintronskom pojačavaču. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je higromicin-TK kaseta U jednom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je u istom smeru prema transkripciji kao ova kaseta odabera U specifičnom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je! oxPmesto.
[0065]Takođe, opisan je izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3 u vezi sa smerom transkripcije, prvi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 5' endogenih mišjih Vk segmenata gena, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze drugo mesto prepoznavanja rekombinaze, i drugi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 3' endogenih mišjih Jksegmenata gena i 5' mišjegkintronskog pojačavaća.
[0066]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu genetska modifikacija obuhvata modifikaciju sa with jednim ili više DNK konstrukata opisanih iznad ili ovde
[0067]Takođe je opisana, upotreba izolovanog DNK konstrukta da se napravi miš kako je ovde opisano. Takođe je opisana upotreba opisanog DNK konstrukta kako je ovde opisan u postupku za pravljenje proteina koji vezuje antigen.
[0068]Takođe je opisana matična nehumana ćelija koja obuhvata ciljajući vektor koji obuhvata DNK konstrukt kako je opisano gore i ovde. Takođe je opisana matična nehumana ćelija, pri čemu je nehumana matična ćelija izvedena iz mišje ovde opisane.
[0069]U jednom varijantnom rešenju, nehumana matična ćelija je embrionska matična (ES) ćelija. U specifičnom varijantnom rešenju, ova ES ćelija je mišja ES ćelija
[0070]Takođe je opisana upotreba nehumane matične ćelije kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. Takođe je opisana upotreba matične ćelije koja nije ljudska kako je opisano ovde da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0071]Takođe je opisan mišji embrion, pri čemu mišji embrion obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano U jednom varijantnom rešenju, domaćin mišjeg embriona koji obuhvata ES ćeliju donatora je opisan, pri čemu ES ćelija donator obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, mišji embrion je embrion u fazi pre-morule, 't.j. preblastulacije (korak koji pre formiranja embriona). U specifičnom varijantnom rešenju, embrion u fazi pre morule je embrion u fazi od 4-ćelije ili embrion u fazi od 8 ćelija. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mišji embrion je blastocist.
[0072]Takođe je opisana upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisan da se napravi miš kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisana je upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0073]Takođe je opisana nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koji je somatski mutiran.
[0074]Takođe je opisana nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koja je somatski mutirana.
[0075]Takođe je opisana upotreba nehumane ćelije kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisuje se upotreba nehumane ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen
[0076]Takođe je opisana mišja B ćelija koja ispoljava lakil lanac imunoglobulina koji obuhvata (a) promenljivi region izveden iz hVA. segmenta gena i hJA. segment gena; i, (b) mišji CAgen. U specifičnom varijantnom rešenju, CAgen je CA.2. U jednom varijantnom rešenju mišja B ćelija još ispoljava poznati teški lanac koji obuhvata (c) promenljivi region izveden iz hV|-|, hDn, i (d) hJn segmenta, U jednom varijantnom rešenju, B ćelija ne obuhvata preraspoređeni A gen. U drugom varijantnom rešenju, B ćelija
ne obuhvata preraspoređenikgen
[0077]Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovnog miša prema antigenu pri čemmu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVAi barem jedan hJAna endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata mišjiCAgen; (b) čime se omogućava da genetski modifikovan miš razvije odgovor imunog sistema prema antigenu; i, (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo prepoznaje laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišji CA gen.
[0078][Brisano]
[0079][Brisano]
[0080]U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVAna A lokusu lakog lanca i barem jedan JA na A lokusu lakog lanca, pr čemuAlokus lakog lanca obuhvata nedirnuti mišji CA gen; (b) što omogućava genetski modifikovanom mišu da razvije imuni odgovor prema antigenu; i, (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje ovaj antigen, ili identifikovanje mišje B sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu ovo antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena
[0081]Konstantni gen A lakog lanca je nedirnuti mišji CAgen U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji CAgen je odabran iz CA1. CA2 i CA3 U još specifičnijem varijantnom rešenju, mišji CAgen je CA2.
[0082]Takođe je opisan, postupak za pravljenje gena preraspoređenog antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVA i hJA, na endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata nedirnuti mišji
CA gen; i,
b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata/.segment gena promenljivog regiona lakog lanca i CAgen ili njegov
funkcionalni fragment.
[0083]U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša. pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje obuhvata ljudski VAi mišji CA.
[0084][Brisano]
[0085][Brisano]
[0086][Brisano]
[0087][Brisano]
[0088JU jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje preraspoređenog gena antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVA i hJA., na mišjem A lokusu lakog lanca, pri čemu A lokus lakog lanca obuhvata nedirnuti mišji CAgen; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina u pomenutom mišu, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata A segment gena promenljivog regiona lakog lanca i CAgena.
[0089]Konstantni gen A lakog lanca je nedirnuti mišji CA gen
[0090]U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje obuhvata ljudski VA i mišji CA
[0091]Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela, obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigen, omogućavanje misu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koji specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira teški lanac i preaspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koja kodira poznatu sekvencu poznatog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline promenljivog domena teškog i lakog lanca spojene na ljudske konstantne domene da se napravi željeno antitelo. pri čemu željeno antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata VA domen spojen na CL domen. V/.. domen je ljudski i Cldomen je mišji CA domen.
[0092][Brisano]
[0093]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisan antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira promenljivi domen teškog lanca i preraspoređenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline spojene na sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski konstantni domen teškog lanca i ljudski konstantni domen lakog lanca da se napravi antitelo izvedeno iz ljudskih sekvenci. pri čemu antitelo koje specifično vezuje ovaj antigen obuhvata laki lanac koji obuhvata ljudski VA domen spojen na mišji CA region
[0094]U specifičnom varijantnom rešenju, mišCA regionse bira iz C/.1, CA2 i CA3 U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CA region je CA2.
[0095]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela, koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano ovde antigenu, (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; (c) određivanje ćelije kod miša koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira preraspoređen ljudsku sekvencu VA domena spojenu sa mišjim CA. domenom, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski Vhdomen i mišji Chdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen i sekvence nukleinske kiseline kodira poznati ljudski Vhdomen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VH domen da se napravi potpuno ljudsko antitelo,
[0096][Brisano]
[0097]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano u ovom opisu antigenu; (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema na antigen; (c) identifikovanje ćelije kod miša koja obuhvata DNK koja kodira preraspoređeni ljudski VA sekvencu domena spojenu na mišji CA domen, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski Vhdomen i mišji Chdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje taj antigen, (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira preraspoređeni ljudski VA domen i sekvenu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski Vhdomen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen i kloniranu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VH domen da se napravi potpuno ljudsko antitelo U jednom varijantnom rešenju, mišji CA domen je mišji CA2
[0098]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava ljudski A-izvedeni laki lanac spojen na endogeni konstantni region lakog lanca (CA), pri čemu miš, posle imunizacije sa antigenom, stvara antitelo koje obuhvata ljudski VA domen spojen na mišji CAdomen U specifičnom varijantnom rešenju, CA domen je CA2.
[0099]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji obuhvata modifikovani endogeni A lokus lakog lanca kako je ovde opisano, koji ispoljava više A lakih lanaca imunoglobulina povezanih sa više teških lanaca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, teški lanac obuhvata ljudsku sekvencu. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, CH-j, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju, više A lakih lanaca imunoglobulina sadrži sekvencu čoveka. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca čoveka se bira iz promenljive sekvence, konstantne sekvence, i njihove kombinacije U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata onemogućeni endogeni lokus imunoglobulina i ispoljava teški lanac iz transgena ili ekstrahromozomnog epizoma. U jednom varijantnom rešenju. miš obuhvata zamenu na endogenom mišjem lokusu nekih ili svih endogenih mišjih segmenata gena teškog lanca (t.j , V, D, J), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence konstantnog teškog lanca (npr,, CH1, zglob, CH2. CH3. ili njihovu kombinaciju), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence lakog lanca (npr, V, J, konstantne, ili njihove kombinacije), sa jednom ili više sekvenci imunoglobulina čoveka
[0100]Takođe je opisan miš pogodan za pravljenje antitela koja imaju ljudski/.-izveden laki lanac pri čemu su sva ili pretežno sva antitela napravljena kod miša ispoljena sa ljudskim/.-izvedenim lakim lancem. U jednom varijantnom rešenju. ljudski A-izveden laki lanac se ispoljava iz endogenog lokusa lakog lanca.
[0101]Takođe je opisan postupak za pravljenje /.-izvedenog lakog lanca za ljudsko antitelo, koje obuvhata dobijanje iz miša, kako je ovde opisano, sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca za pravljenje ljudskog antitela.
[0102]Takođe je opisan, postupak za pravljenje proteina za vezivanje antigena, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; i dobijanje iz miša proteina za vezivanje antigena koji veže antigen, ili dobijanje iz miša sekvence koju treba koristiti za pravljenje proteina za vezivanje antigena koji veže antigen.
[0103]Takođe je opisana ćelija izvedena iz miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija se bira iz embrionske matične ćelije, višestruko jake ćelije, indukovane višestruko jake ćelije, B ćelije, i hibridoma.
[0104]Takođe je opisana ćelija koja obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je mišja ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija se bira iz hibridoma i kvadroma. U jednom varijantnom rešenju, ova ćelija ispoljava laki lanac Imunoglobulina koji obuhvata ljudskuXpromenljivu sekvencu spojenu sa mišjomXkonstantnom sekvencom
[0105]Takođe je opisano tkivo izvedeno iz miša kako je ovde opisano.
[0106]Takođe je opisana upotreba miša ili ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein za vezivanje antigena. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein. U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo
[0107]Takođe se odnosi na protein za vezivanje antigena napravljen pomoću miša. ćelije, tkiva, ili postupka kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo.
[0108][Brisano]
KRATAK OPIS SLIKA
[0109]
SL. 1pokazuje detaljnu ilustraciju, ne u razmeri. ljudskog X lokusa lakog lanca uključujući skupine VA segmenata gena (A, B i C) i paroveJA.i CA regiona (J-C parove)
SL.2 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri. strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenom mišuX lokuslakog lanca
SL.3 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenom mišu k lokus lakog lanca.
SL.2 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenom mišu A lokus lakog lanca sa ljudskim Asekvencama lakog lanca uključujući 12
hVA segmente gena i hJA1 segmente gena(12/1-a ciljajućivektor).
SL. 4Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri četiri prvobitna ciljna vektora za ciljanje endogenom mišu k" lokus lakog
lanca sa ljudskim/^sekvencama lakog lanca koje obuhvataju 12 hVA. segmenata gena i hJX1 segment gena {12/1-k ciljajući vektor), 12 hVA, segmenata gena i hJA.1, 2, 3 i 7 segmenata gena (12/4-k ciljajući vektor), 12 hVA segmenata gena, ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu i hJA1 segment gena (12(k)1-kciljajući vektor) i 12 hVA segmenata gena, ljudsku Vk-Jk- genomsku sekvencu i hJA 1, 2, 3 i 7 segmenata gena (12(k)4-kciljajući vektor).
SL. 5Apokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strategije ciljanja za progresivno umetanje 40 hVA segmenata gena i jedan hJA segment gena u mišji A lokus lakog lancaSL. 5Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljne strategije za progresivno umetanje 40
hVA segmenata gena i jedan hJA segment gena u mišjiklokus.
SL.6 pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljnih koraka i koraka molekularnog inženjeringa korišćenih da se naprave jedinstveni ljudski A-khibridni ciljajući vektori za izgradnju hibridnog lokusa lakog lanca koji sadrži ljudskukintergensku sekvencu, više hJA, segmenata gena ili oba SL,7Apokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri. strukture lokusa za modifikovani mišji A lokus lakog lanca koji sadrži 40 hVA segmente gena i jedan hJA segment gena funkcionalno povezan na endogeni CA2 gen.
SL. 7Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za četiri nezavisna, mofifikovana mišjaklokusa lakog lanca koji sadrže 40 hVA segmenata gena i bilo jedan ili četiri hJA segmenta gena sa ili bez dodirne ljudske Vk-Jkgenomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni Ckgen,
SL. 8Apokazuje skice konture lgA<+>i lgK<+>splenocite usmerene na CD19<+>od miša divljeg tipa (WT), mišjeg homozigota za 12 homozigota za 12 hVA i četiri hJA. segmenta gena koji obuhvataju ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (12hVX-VKJK- 4hJA) i mišji homozigotni za 40 hVA i jedan hJ A. segment gena (40hVA-1hJA).
SL. 8Bpokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 12 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (12hVA-VKJK-4hJA) i mišji homozigot za 40 hVA i jedan hJA segment gena (40hVA-1hJA).SL.9A, na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na singlete i postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA.-VKJK-4hJA). Donji panel pokazuje iscrtane konture splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za lgA+ i lgK + iispoljavanje iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVX-Vk'jK-4hJA).
SL. 9Bpokazuje ukupan broj CD19<+>, CD19<+>lgK<+>i CD19<+>lgA<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA-VKJK-4hJA)
SL. 9Cpokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za imunoglobulin D (IgD) i imunoglobulin M (Iglvl) iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVAi četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA-VKjK-4hJA). Zrele (72 za VVT, 51 za 40hVA-VKJK-4hJ?„) i tranzicione (13 za VVT, 22 za 40hVA-VKjK-4hJA) B ćelije su navedene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 9Dpokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija, tranzicionih B ćelija (CD19+lgMhilgDl°) i zrelih B ćelija (CD19<+>lgM'°l<gDm>) u prikupljenim jetrama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiriJAsegmenta gena uključujući ljudske Vk-Jkgenomske sekvence (40hVA-VicJk-4hJA)
SL. 10A,na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVAi četiri
JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VkJk--4hJA). Panel na dnu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži usmerene na CD19+ i postavljene za ckit<+>i CD43 iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVAi četiri JAsegmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVX,-VKJK-4hJA) Pro i Pre B ćelije se označavaju na iscrtanoj konturi na donjoj ploči.
SL.10Bpokazuje broj Pro (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i Pre (CD19<+>CD43"ckit") B ćelija u koštanoj srži prikupljenoj iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VkJK-4hJA)
SL.10Cpokazuje iscrtanu konturu koštane srži na singletima postavljenim za imunoglobulin M (IgM) i B220 od miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk- Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKJk-4hJA) Nezrele, zrele i pro/pre B ćelije su označene na svakoj od iscrtanih kontura
SL. 10Dpokazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>lgM<+>) i zrelih (B220<ni>lgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanih iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenata gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKJK-4hJA).
SL. 10Epokazuje iscrtane konture koštane srži usmerene na nezrele (B220'<n>lgM<+>) i zrele (B220<n>'lgM<+>) B ćelije postavljene za IgA i Igtc ispoljavanje izolovane iz butnih kostiju miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKjK-4hJA).
SL. 11 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida VA-JA-Ck spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačana iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske A sekvence gena lakog lanca na endogenom mišjemklokusu lakog lanca. A6 - ID BR SEK:57; B6 - ID BR SEK:58; F6 - ID BR SEK:59; B7 - ID BR SEK:60; E7 - ID BR SEK:61; F7 = ID BR SEK 62; C8 - ID BR SEK 63; E12 = ID BR SEK:64; 1-4 = ID BR SEK:65; 1-20 = ID BR SEK66: 3B43 = ID BR SEK 67; 5-8 = ID BR SEK:68; 5-19 - ID BR SEK:69; 1010 = ID BR SEK 70; 11A1 - ID BR SEK:71, 7A8 - ID BR SEK72; 3A3 - ID BR SEK:73; 2-7 - ID BR SEK:74. Baze sa malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FVVR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJA1 i miša Ck2 su označene na dnu poravnanja sekvence
SL.12pokazuje poravnanje sekvence nukleotida VA-JA-Ck spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske A sekvence gena lakog lanca uključujući dodirnu ljudsku Ck-Jk genomsku sekvencu na endogenom mišjemklokusu lakog lanca. 5-2 = ID BR SEK:87; 2-5 = ID BR SEK:88; 1-3 = ID BR SEK:89; 4B-1 = ID BR SEK 90; 3B-5 = ID BR SEK:91; 7A-1 = ID BR SEK:92; 5-1 = ID BR SEK93; 4A-1 = ID BR SEK 94; 11A-1 = ID BR SEK:95; 5-7 = ID BR SEK:96; 5-4 = ID BR SEK:97; 2-3 = ID BR SEK:98
Baze sa malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FVVR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida svakog ljudskog JA i mišjeg Cksu označene sa donje strane poravnanja sekvence.
SL. 13pokazuje poravnanje sekvence nukleotida VA-JA-CA spoj tri nezavisna RT-PCR klona pojačana iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske A sekvence gena lakog lanca na endogenom mišjemX lokusulakog lanca. 2D1 = ID BR SEK:101, 209 = ID BR SEK:102; 3E15 = ID BR SEK103. Baze sa malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJA1 i mišjeg CA2 su označene na dnu poravnanja sekvence.
DETALJAN OPIS
[0110]Ovaj pronalazak u svom najširem smislu je kako je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima
[0111]Pojam "dodirno" obuhvata referencu na pojavu istog molekula nukleinske kisleine;rtpt\,dve sekvence nukleinske kiseline su "dodirne" ako se javljaju na istom nukleinskom molekulu ali su prekiute drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, preraspoređena V(D)J sekvenca je "dodirna" sa sekvencom gena konstantnog regiona, iako finalni kodon V(D)J sekvence nije neposredno praćen prvim kodonom sekvence konstantnog regiona U drugom primeru. dve sekvence V segmenta gena su "dodirne" ako se jave na istom genomskom fragmentu, iako one mogu da budu odvojene sekvencom koja ne kodira kodon V regiona, npr., one mogu da budu odvojene regulatornom sekvencom, npr, promoterom ili drugom nekodirajućom sekvencom. U jednom izvođenju, dodirna sekvenca obuhvata genomski fragment koji obuhvata genomske sekvence raspoređene kako se nalaze u genomu divljeg tipa.
[0112]Fraza "izvedeno iz" kada se koristi u vezi sa promenljivim regionom "izveden iz" navedenog gena ili segmenta gena obuhvata sposobnost da se prati sekvenca nazad do određenog nepreraspoređenog segmenta gena ili segmenata gena koji su preraspoređeni da formiraju gen koji ispoljava promenljivi domen (uzimajući u obzir, gde je pnmenljivo, razlike u spoju i somatskim mutacijama).
[0113]Fraza "funkcionalno" kada se koristi u vezi sa segmentom gena promenljivog regiona ili spojnim segmentom gena odnosi se na upotrebu u ispoljenom repertoaru antiteia; npr. kod ljudi VA segmenti gena 3-1, 4-3, 2-8, itd su funkcionalni, za razliku od njih. VA segmenata gena 3-2, 3-4. 2-5,itd.su nefunkcionalni
[0114]"Lokus teškog lanca" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr, mišjem hromczomu, pri čemu su pronađeni promenljivi teški lanac miša divljeg tipa (Vh), raznovrsnost teškog lanca (Dh), spoj teškog lanca (Jh), i sekvence DNK konstantnog regiona teškog lanca (CH)
[0115]"k Lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr . mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipa k promenljivi (Vk),kspojni (Jk). ikkonstantni (Ck) region DNK sekvence.
[0116]"A Lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipaApromenljiv (VA), A spojni (JA), iAkonstantni (CA) region sekvenci DNK.
[0117]Pojam "nepreraspoređeni" obuhvata stanje lokusa imunoglobulina pri čemu se V segmenti gena i J segmenti gena (za teške lance, D segmenti gena takođe) održavaju odvojeno ali mogu da se spoje da formiraju preraspoređeni V(D)J gen koji obuhvata jedan V,(D),J od ovog V(D)J repertoara.
Miševi koji ispoljavaju IjudskeA. promenljive domene
[0118]Miševi koji ispoljavaju antitela koja nisu potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su prethodno već prikazani. VELOCIMMUNE® genetski projektovani miševi obuhvataju zamenu nepreraspoređenih V(D)J segmenata gena na endogenim mišjim lokusima sa ljudskim V(D)J segmentima gena. VELOCIMMUNE® miševi ispoljavaju himema antitela koja imaju ljudske promenljive domene i mišje konstantne domene (videti, npr., US Pat br 7,605,237). Većina drugih izveštaja se odnosi na miševe koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz potpuno ljudskih transgena kod miševa koji imaju onemogućene endogene lokuse imunoglobulina.
[0119]Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (k) i lambda (A). Laki lanci antitela miša su primarno k tipa. Miševi koji prave mišja antitela, i modifikovani miševi koji prave potpuno ljudska ili himerna Ijudsko-mišja antitela, prikazuju neuravnoteženost u pogledu upotrebe lakog lanca. Ljudi takođe ispoljavaju neuravnoteženost lakog lanca, ali ne tako izraženu kao kod miševa, odnosklakih lanaca prema A lakim lancima kod miševa je oko 95 5, pri čemu kod ljudi je oko 60:40. Izraženija neuravnoteženost kod miševa se ne smatra da ozbiljno utiče na raznovrsnost antitela, jer kod miševa/^promenljivi lokus nije tako raznovrstan u prvoj instanci. Ovo nije tako i kod ljudi. Ljudskiklokus lakog lanca obiluje raznovrsnošću.
[0120]Ljudski k lokus lakog lanca se nastavlja preko 1.000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju promenljive (V) ili spojne (J) segmente (SL 1). Unutar ljudskogklokusa lakog lanca preko polovine svih primećenih Va domena se kodira pomoću segmenata gena 1-40.1-44, 2-8, 2-14,i 3-21 Sve u svemu, oko 30 ili tako nešto ljudskih VX segmenata gena se smatra funkcionalnim Ima sedam Ja segmenata gena, samo njih četiri se smatra generalno funkcionalnim Ja segmentima gena, JX1. JX2, Ja3, i JX7.
[0121]Lokus k lakog lanca kod ljudi je slične struktureklokusu kod miševa i ljudi po tome što ljudskik lokuslakog lanca ima nekoliko segmenata gena promenljivog regiona koji su sposobni da se rekombinuju da se formira funkcionalni protein lakog lanca Ljudskiklokus lakog lanca sadrži približno 70 V segmenata gena i 7 parova JX-CX segmenta gena. Samo četiri od ovih Ja-Ca parova segmenta gena se čine funkcionalnim. Kod nekih alela, peti Ja-Ca par segmenta gena je prema izveštajima pseudo gen (C/.6). 70 Va segmenata gena izgleda da sadrže 38 funkcionalnih segmenata gena. 70 Va sekvenci se raspoređuje u tri skupine, a sve sadrže različite članove distinktivnih grupa familije V gena (skupine A, B i C; SL. 1). Postoji potencijalno bogat izvor relativno neiskorišćene raznovrsnosti za generisanje antitela sa ljudskim V regionima kod nehumanih životinja
[0122]Kao oštar kontrast, mišji a lokus lakog lanca sadrži samo dva ili tri (zavisno od soja) mišja segmenta gena Va regiona (SL. 2). Barem iz ovog razloga, ozbiljna i< pnstrasnost kod miševa se ne smatra posebno pogubnom za ukupnu raznovrsnost antitela.
[0123]Prema objavljenim mapama X. mišji lokus lakog lanca, lokus se sastoji u suštini od dve skupine segmenata gena unuar opsega od približno 200 kb (SL 2). Ove dve skupne sadrže dva kompleta V, J, i C gena koji su sposobni za nezavisno preraspoređivanje: VX2-JX2-CX2-JX4-CX4 i Va1-JX3-CX3-JX1-CX1. lako je za VX2 utvrđeno da se rekombinuje sa svim Ja segmentima gena, VX1 se izgleda ekskluzivno rekombinuje sa CX1. Veruje se da je CX4 pseudo gen sa neispravnim mestima spajanja.
[0124]Mišjiklokus lakog lanca je izrazito drugačiji. Struktura i broj segmenata gena koji učestvuju u događajima rekombinacije koji vode funkcionalom proteinu lakog lanca iz mišjegklokusa je mnogo složeniji (SL. 3). Dakle, mišjiklaki lanci ne doprinose u velikoj meri raznovrsnosti populacije antitela kod tipičnog miša.
[0125]Iskorišćavanje obilate raznovrsnosti ljudskih X lokusa lakog lanca kod miševa bi verovatno kao rezultat dalo, između ostalog, izvor za kompletniji ljudski repertoar V domena lakog lanca. Prethodni pokušaji da se dodirne ova raznovrsnost koristio je ljudske transgene koji sadrže blokove ljudskog lokusa a, lakog lanca nasumično inkorporirane u mišji genom (videti, npr., US 6,998,514 i US 7,435,871). Miševi koji sadrže ove nasumično integrisane transgene prema izveštajima ispoljavaju potpuno ljudskek lakelance, međutim, u nekim slučajevima, jedan ili oba endogena lokusa lakog lanca ostaje nedirnut Ova situacija nije poželjna jer se ljudske X sekvence lakog lanca nadmeću sa mišjim lakim lancem (kili X) u ispoljenom repertoaru antitela miša.
[0126]Nasuprot tome, pronalazači opisuju genetski modfikovane miševe koji su sposobni da ispoljavaju jednu ili više X sekvenci nukleinske kiseline lakog lanca direktno iz endogenog mišjeg lokusa lambda lakog lanca. Genetski modifikovani miševi sposobni da ispolje ljudske X sekvence lakog lanca iz endogenog X lokusa mogu još da budu odgajani na miševima koji obuhvataju ljudski lokus teškog lanca i zato se koriste da ispolje antitela koja obuhvataju V regione (teške i X lake) koji su potpuno ljudski. V regioni se ispoljavaju sa mišjim konstantnim regionima. Kod različitih varijantnih rešenja, nema endogenih mišjih segmenata gena imunoglobulina prisutnih i V regioni se ispoljavaju sa ljudskim konstantnim regionima Ova antitela će se pokazati korisna u brojnim primenama, i dijagnostičkim i terapijskim
[0127]Brojne prednosti mogu da se realizuju za različita vanjantna rešenja ispoljavanja proteina za vezivanje izvedenih iz ljudskih VX i JX segmenata gena kod miševa. Prednosti mogu da se realizuju postavljanjem ljudskih X sekvenci na endogenomXlokusu lakog lanca. Antitela napravljena od takvih miševa mogu da imaju lake lance, koji obuhvataju ljudske VA domene spojene na mišji CA region. Miševi će takođe ispoljiti ljudske VA domene koji su pogodni za identifikaciju i kloniranje za upotrebu sa ljudskim C|_ regionima, specifično Cki/ili CA regionima Zato što razvoj B ćelije kod takvih miševa jeste inače normalan, moguće je generisati kompatibilne VA domene (uključujući somatski mutirane VA domene) u kontekstu bilo CA ili Ckregiona.
[0128]Opisuju se genetski modifikovani miševi koji obuhvataju nepreraspoređeni ljudski VA segment gena i nepreraspoređeni ljudski JAna endogenom A lokusu lakog lanca imunoglobulina Opisuju se miševi koji ispoljavaju antitela koja obuhvataju laki lanac koji ima ljudski VA domen spojen na CA region.
Pristupi inženjeringu miševa za ispoljavanje ljudskih VA domena
[0129]Opisuju se različiti pristupi za pravljenje genetski modifikovanih miševa koji prave antitela koja sadrže laki lanac koji ima ljudski VA domen spojen na endogeni CA region. Opisuju se genetske modifikacije koje, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvataju brisanje jednog ili oba endogena lokusa lakog lanca Na primer. da se eliminišu mišji A laki lanci iz repertoara endogenog antitela brisanja prve VA-JA-CA skupine gena i zamena, u celini ili delimično, VA-JA. segmenata gena druge skupine gena sa ljudskim VA-JA segmentima gena može da se izvede kao što je formulisano ovde u patentnim zahtevima. Takođe se opisuju genetski modifikovani mišje ćelije embriona, i ciljni konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija
[0130]Brisanje jedne endogene VA-J/.-CA skupine gena i zamena VA.-JA segmenata gena druge endogene VA-JA.-CA. skupine gena koristi relativno minimalni prekid u prirodnom udruživanju konstantnog regiona antitela i funkcije kod životinje, kod različitih varijantnih rešenja, zbog toga što se endogeni CAgeni ostavljaju nedirnuti i samim tim zadržavaju normalnu funkcionalnost i sposobnost da se udružuju sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca Dakle, kod takvih varijantnih rešenja modifikacija ne utiče na druge konstantne regione teškog lanca zavisne od funkcionalnih konstantnih regiona lakog lanca za sklop funkcionalnog molekula antitela koji sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. Pored toga, kod različitih varijantnih rešenja ova modifikacija ne utiče na sklop funkciolnalnog molekula antitela vezanog membranom koji obuhvata endogeni teški lanac i laki lanac, npr , hVA domen povezan na miši CA region. Zbog toga što se najmanje jedan funkcionalan CAgen zadržava na endogenom lokusu, životinje koje sadrže zamenu VA-JA segmenata gena endogene VA-JA-CA skupine gena sa ljudskim VA-JA. segmentima gena treba da budu u mogućnosti da naprave normalne A lake lance koji su sposobni za vezivanje antigena tokom odgovora imunog sistema putem ljudskih VA-JA segmenata gena prisutnih u repertoaru ispoljenog antitela životinje.
[0131]Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisane endogene mišje VA-JA.-CA skupine gena je data na SL. 2. Kao što je ilustrovano, mišji A. lokus lakog lanca se organizuje u dve skupine gena, i svaka od ove dve skupine sadrži funkcionalne segmente gena koji mogu da se rekombinuju da formiraju funkcionalni mišji A laki lanac. Endogena mišja VA1-JA3-CA3- JA1-CA1 skupina gena se birše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 1) sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću mesta rekombinacije Druga endogena skupina gena (VA2-VA3-JA.2-CA2-JA4-CA4) se birše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 2) sa kasetom higromicin-timidin kinaze prirubno postavljenom pomoću mesta rekombinacije U ovom drugom postupku ciljanja, zadržava se CA2-JA4-CA4 endogenih segmenata gena. Drugi ciljni konstrukt (ciljajući vektor 2) se konstruiše korišćenjem mesta rekombinacije koja su drugačija u odnosu na mesta kod prvog ciljnog konstrukta (ciljajući vektor 1) čime se omogućava selektivno brisanje kasete odabira pošto je ostvareno uspešno ciljanje. Dobijeni dvostrukociljani lokus je funkcionalno utišan u tome da nijedan endogeni A laki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovan lokus može da se koristi za umetanje ljudskih VA i JA segmenata gena da se stvori endogeni mišji A lokus koji obuhvata ljudske VA i JA segmente gena, pomoću kojih, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodi A lake lance koji obuhvataju preraspoređene ljudske VA i
JA segmente gena povezane na endogeni mišji CA segment gena.
[0132]Genetsko modifikovanje miša da da endogene A segmente gena nefunkcionalne, u različitim varijantnim rešenjima, daje kao rezultat miša koji ispoljava isključivo k lake lance u repertoaru antitela, što čini miša korisnim za procenu ulogeAlakih lanaca za odgovor imunog sistema, i korisnim za pravljenje repertoara antiela koji obuhvata Vkdomene ali ne VA domene
[0133]Genetski modifikovan miš koji ispoljava hVA povezan na mišji CAgen koji je rekombinovan na endogeni mišji A lokus lakog lanca može da se pravi bilo kojim postupkom poznatim u ovoj oblasti. Šematska ilustracija (ne u razmeri zamene endogenih mišjih VA2-VA3-JA2 segmenata gena sa ljudskim VAi JA segmentima gena je data na SL. 4A. Kako je ilustrovano. endogeni mišji A lokus lakog lanca koji je učinjen nefunkcionalnim se zameni ciljajućim konstruktom(12/1-Aciljajućivektor) koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću mesta rekombinacije VA2-VA3-JA2 segmenti gena se zamenjuju sa genomskim fragmentom koji sadrži ljudsku A sekvencu koja obuhvata 12 hVA segmente gena i jedan hJA segment gena.
[0134]Dakle, ovaj prvi pristup pozicionira jedan ili više hVA segmenata gena na endogeni A lokus lakog lanca dodiran jednom hJA segmentu gena (SL. 4A)
[0135]Dodatne modifikacije na modifikovani endogeni A lokus lakog lanca mogu da budu ostvarene korišćenjem sličnih tehnika da se ubaci više hVA segmenata gena Na primer, šematske ilustracije dva dodatna ciljna konstrukta (+16-Ai +12-A ciljajući vektori) korišćeni za progresivno umetanje dodavanja ljudskih hVA segmenata gena su dati na SL 5A Kao što je ilustrovano, dodatni genomski fragmenti koji sadrže specifične ljudske hVA. segmente gena se ubacuju u modifikovane endogene A lokuse lakog lanca u uzastopnim koracima korišćenjem homologije obezbeđene prethodnim umetanjem ljudskih A sekvenci lakog lanca. Posle rekombinacije sa svakim ciljnim ilustrovanim konstruktom, na uzastopan način, 28 dodatnih hVA segmenata gena se umeće u modifikovani endogeni A lokus lakog lanca Ovo stvara himerni lokus koji proizvodi A protein lakog lanca koji obuhvata ljudske VA-JA segmente gena povezane na mišji CA gen
[0136]Gornji pristupi ubacivanju ljudskih A segmenata gena lakog lanca na mišjem A lokusu. zadržava pojačavače pozicionirane nizvodno CA.2-JA4-CA4 segmenata gena (naznačene Enh 2.4. Enh i Enh 3.1 SL. 4A i SL. 5A) Ovaj pristup daje kao rezultat jedan modifikovan alel na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca (SL. 7A).
[0137]Takođe su opisana jedinjenja i postupci za pravljenje miša koji ispoljava laki lanac koji obuhvata hVA i JA segmente gena funkcionalno povezane na mišji CA segment gena, uključujući jedinjenja i postupak za pravljenje miša koji ispoljava takve gene iz endogenog mišjeg A lokusa lakog lanca. Postupci obuhvataju selektivno pravljenje jedne endogene mišje VA-JA-CA skupine gena nefunkcionalnom (npr , ciljanjim brisanjem), i korišćenje hVA i JA segmente gena na endogenom mišjem A. lokusu lakog lanca da se ispolji hVA domen kod miša.
[0138]Takođe je opisan drugi pristup gde ljudski A segmenti gena lakog lanca mogu da budu pozicionirani na endogenome lokusu lakog lanca. Genetska modifikacija, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvata brisanje endogenogklokusa lakog lanca. Na primer, da bi se eliminisali mišjiklaki lanci iz repertoara endogenog antitela, moguće je izvesti brisanje mišjih Vk i Jksegmenata gena. Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljajući konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija
[0139]Iz gore navedenih razloga, brisanja mišjih Vki Jksegmenata gena koristi relativno minimalni prekid. Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisanih mišjih Vk i Jksegmenata gena je data na SL. 3, Ovi endogenim mišjim Vki Jksegmentima gena se briše preko rekombinazom posredovane brisanje mišjih sekvenci pozicioniranih između dva precizno pozicionirana ciljna vektora svaki koristi mesta za rekombinaciju specifiičnu za mesto. Prvi ciljajući vektor (Jk ciljajući vektor) se koristi u prvom ciljnom događaju za brisanje mišjih Jksegmenata gena. Drugi ciljajući vektor (Vk ciljajući vektor) se koristi u drugom, uzastopnom ciljajućem procesu za brisanje sekvence smeštene na 5' najudaljenijeg mišjeg Vksegmenta gena. Oba ciljajuća vektora sadrže rekombinaciju specifičnu za mesto čime se omogućava selektivno brisanje obe kasete odabira i sve interventne mišjeksekvence lakog lanca pošto je uspešno izvedeno ciljanje. Dobijeni brisani lokus je funkcionalno utišan tako da nijedan endogeniklaki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovani lokus može da se koristi za umetanje hVA i Ja segmenata gena da se kreira endogeni mišjiklokus koji obuhvata hVA i Ja segmenata gena, pri čemu, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu. životinja proizvodi a lake lance koji obuhvataju preraspoređene hVA i Ja segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cksegment gena. Različiti ciljajući vektori obuhvataju ljudskeXsekvence lakog lanca mogu da se koriste u vezi sa ovim obrisanim mišjimklokusom da se stvori hibridni lokus lakog lanca koji sadrži ljudske A segmente gena funkcionalno povezane sa mišjim Ckregionom.
[0140]Dakle, drugi pristup pozicionira jedan ili više ljudskih Va segmenata gena se pozicionira na mišjem k lokusu lakog lanca dodirnom sa jednim ljudskim JXsegmentom gena (12/1 -k ciljajući vektor, SL. 4B).
[0141]Modifikacije ovog pristupa mogu da budu izvedene da se dodaju segmenti gena i/ili regulatorne sekvence da se optimizuje upotreba ljudskihXsekvenci lakog lanca iz mišjegklokusa unutar repertoara mišjeg antitela
[0142]Takođe je opisan treći pristup gde, jedan ili više hVX segmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa četiri hJX segmenta gena (12/4-kciljajući vektor, SL. 4B)
[0143]U trećem pristupu, jedan ili više hVXsegmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom k intergenskom sekvencom i jednom hJX sekvencom gena (12(k)1-kciljajući vektor, SL. 4B).
[0144]Takođe je opisan četvrti pristup, jedan ili više hV X segmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskomkintergenskom sekvencom četiri hJX sekvence gena (12(k)4-k ciljajući vektor SL, 4B).
[0145]Svi gore navedeni pristupi za ubacivanje ljudskihXsegmenata gena lakog lanca na mišji
k lokus, zadržavajukelement intronskog pojačivača uzvodno od Ckgena (naznačen Eki, SL 4B i SL 58) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (naznačen Ek3', SL. 4B i SL. 5B). Ovaj pristup daje kao rezultat četiri modifikovana alela na endogenom mišjemklokusu lakog lanca (SL 7B).
[0146][Brisano]
Antitela lambda domena iz genetski modifikovamh miševa
[0147]Miševi koji obuhvataju ljudskeX sekvencena bilo mišjem Xili lokusu lakog lanca će ispoljiti laki lanac koji obuhvata hVA. region spojen na mišji CL (CX ili C) region. Oni se kao prednost uzgajaju na miševima koji (a) obuhvataju funkcionalno neaktivni lokus lakog lanca (npr., nokaut (mutirani oblik) endogenog mišaKili X lokus lakog lanca); (b) obuhvataju endogeni mišji X lokus lakog lanca koji obuhvata hV i hJ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji CX gen kako je formulisano u patentnim zahtevima; (c) obuhvata endogeni mišjiklokus lakog lanca koji obuhvata hVK i hJKsegmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Ck-gen; i, (d) miš u kom jedan k alel obuhvata IiVk i IiJk; drugi k alel obuhvata hVX i hJX, jedan X alel obuhvata hVX i hJX i jedan Xalel inaktivni ili mutirani, ili oba X alela koji obuhvataju hVX i hJX; i, dva alela teškog lanca koji svaki obuhvata hV(-), hDH, i hJH-
[0148]Antitela koja obuhvataju hVA domene ispoljene u kontekstu bilo kog od CXse koriste da naprave potpuno ljudska antitela kloniranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju hVA domene u ispoljavanje konstrukata koji nose gene koji kodiraju ljudski CA Konstrukti ispoljavanja dobijeni kao rezultat se transfektuju u pogodne ćelije domaćine za ispoljavanje antitela koja prikazuju potpun hVA. domen spojen na hCX.
PRIMERI
[0149]Sledeći pnmeri su dati da se objasni kako napraviti i konstititi postupke i jedinjenja prema ovom pronalasku, i nisu predviđeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Osim ako nije drugačije navedeno, temperatura je navedena u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog
Primer I
Brisanje mišjih lokusa lakog lanaca imunoglobulina
[0150]Različiti ciljajući konstrukti su napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US Pat br. 6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotech. 21(6) 652-659) za modifikovanje genomskih biblioteka bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) da se inaktiviraju mišjikiX lokusilakog lanca.
[0151] Brisanje mišjegXlokusa lakog lanca.DNK iz mišjeg BAC klona RP23-135k15 (Invitrogen) je modifikovana homolognom rekombinacijom da se inaktivira endogeni mišji /.lokus lakog lanca kroz ciljane brisanje VX.-Ja.-CX skupina gena (SL. 2),
[0152]Ukratko, cela proksimalna skupina obuhvata V/.1-J/.3-C/.3-J/.1-C/.1 segmente gena je brisana u jednom ciljajućem postupku korišćenjem ciljnog vektora koji obuvhata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću loxP mesta sa 5' mišjim homolognim krakom koji sadrži sekvencu 5' V/.1 segmenta gena i 3' mišji homologni krak koji sadrži sekvencu 3' CA1 segmenta gena (SL. 2, ciljajući vektor 1).
[0153]Drugi ciljajući konstrukt je pripremljen da precizno obriše distalnu endogenu mišjuX skupinugena koja obuhvata VA2-JA2-CA2-JA4-CA.4 izuzev što je ciljajući konstrukt sadržao 5' mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5' VA2 segmenta gena i 3' mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5' na endogenom CX2 segmentu gena (SL 2. Ciljajući vektor 2). Dakle, drugi ciljajući konstrukt je precizno obrisan VA2-J/.2, a istovremeno je ostavljen CA2-JA4-CA4 nedirnut na endogenom mišjem A. lokusu. ES ćelije koje su sadržale neaktivirani endogeni /.lokus (kako je gore opisano) su potvrđene putem postupaka karotipovanja i snimanja (npr., TAGMAN®) poznatim u tehnici DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretiranju sa CRE rekombinazom čime je posredovanje brisanje proksimalne ciljne kasete koja je sadržala gen marker neomicina, ostavljajući samo jedno loxP mesto u taćki brisanja (SL. 2, dno).
[0154] Delecija mišjeg k lokusa lakog lanca.Korišćenjem postupaka sličnih gore opisanim postupcima napravljeno je nekoliko ciljnih konstrukata da se modifikuje DNK iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04 (Invitrogen) homolognom rekombnacijom da se inaktivira mišjiklokus lakog lanca u dvostepenom procesu (SL. 3).
[0155]Ukratko, Jksegmenti gena (1-5) endogenog mišjegklokusa lakog lanca su izbrisani u samo jednom procesu ciljanja korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu higromicin-timidin kinaze (hyg-TK) koja sadrži jednoloxPmesto 3' na hyg-TK kaseti (SL 3, Jk ciljajući vektor) Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu 5' i 3' endogenih mišjih Jksegmenata gena. U drugom procesu ciljanja, drugi ciljajući vektor je pripremljen da obriše deo mišje genomske sekvence uzvodno (5') na najudaljenijem endogenom mišjem Vksegmentu gena (SL 3, Vk ciljajući vektor). Ovaj ciljajući vektor je sadržao invertovano lox511 mesto,loxPmesto i kasetu neomicina. Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu uzvodno od najudaljenijih mišjih Vksegmenata gena. Ciljajući vektori su korišćeni uzastopno (t./, Jk zatim Vk) da se cilja DNK u ES ćelijama ES koji nosi dvostruko ciljani hromozom (t.j., jedan endogeni mišjiklokus ciljan sa oba ciljajuća vektora) su potvrđeni postupcima karotipovanja i snimanja
(npr., Taq- man™) poznatim u ovoj oblasti DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretmanu sa Cre rekombinazom čije je posredovano brisanje endogenih mišjih Vksegmenata gena i obe kasete odabira, ostavljajući pritom dva podređena lox mesta suprotno orijentisano jedan u odnosu na drugi (SL. 3, dno; ID BRSEK1),
[0156]Dakle, dva modifikovana endogena lokusa lakog lanca (ki/_) koja sadrže nedirnuti pojačavač i konstantne regione su stovrena za progresivno umetanje nepreraspoređenih Ijudksih/.segmenata gena klicine linije na precizan način korišćenjem ciljnih vektora opisanih dole u tekstu
Primer II
Zamena mišjih lokusa lakog lancasaljudskim /. mini-lokusom lakog lanca
[0157]Više ciljajućih vektora je projektovano za progresivno umetanje ljudskih/.segmenata gena u endogene mišjekikliokusa lakog lanca korišćenjem sličnih postupaka kao što su gore opisani. Višestruke nezavisne početne modifikacije su napravljene na endogenim lokusima lakog lanca proizvodeći himerni lokus lakog lanca koji sadrži hV/. i J?. segmente gena funkcionalno povezane na mišje konstantne gene lakog lanca i pojačavače.
[0158] Ljudski k mini-lokus koji sadrži 12 ljudskiV/,ijedan ljudskiJksegment gena.Serija inicijalnih ciljajućih vektora je projektovana da sadrži prvih 12 uzastopnih ljudskih V/. segmenata gena is kupine A i hJA.1 segment gena ili četiri hJ/. segmenta gena koristeći ljudski BAC klon pod nazivom RP11-729g4 (Invitrogen). SL. 4A
4A i 4B pokazuju ciljajuće vektore koji su konstruisani za pravljenje početnog umetanja ljudskihXsegmenata gena lakog lanca na mišjimX iklokusima lakog lanca, respektivno
[0159]Za prvi komplet početnih ciljajućih vektora, 124,125 bp DNK fragment iz 729g4 BAC klona koji obuhvata 12 hV?. segmenata gena i hJ/J segment gena je projektovan da sadrži Pl-Scel mesto 996 bp nizvodno (3 ) od hJA.1 segmenta gena za povezivanje 3' mišjeg homolognog kraka Korišćena su dva različita kompleta homolognih krakova za ligaciju na ovom ljudskom fragmentu; jedan komplet homolognih krakova je sadržao endogene mišje /. sekvence iz 135k15 BAC klona (SL.4A) i još jedan komplet je sadržao endogenuksekvencu 5' i 3' mišjih Vki Jksegmenata gena iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04, respektivno (SL. 4B)
[0160]Za12/1 - X ciljajućivektor (SL. 4A), Pl-Scel mesto je projektovano na 5' kraju 27,847 bp DNK fragmenta koji sadrži mišji CA.2-JA.4-C/.4 i pojačavač 2 4 modifikovanog mišjeg/.lokusa opisanog u Primeru 1. Korišćen je -28 kb mišji fragment kao 3' homologni krak ligacijom na -124 kb ljudskog X fragmenta, koji je stvorio 3' ukrštanje koje je sadržalo, od 5' do 3', hJ/.1 segmenta gena, 996 bp ljudskeX sekvence3' hJ?.1 segmenta gena, 1229 bp mišjeX sekvence5' na mišjem Ca.2 genu, mišji C/.2 gen i preostali deo -28 kb mišjeg fragmenta. Uzvodno (5 ) od ljudskog V/.3-12 segmenta je bio dodatni 1456 bp ljudske X sekvence pre početka 5' mišjeg homolognog kraka, koji je sadržao 23.792 bp mišje genomske DNK koja odgovara sekvenci 5' endogenog mišjeg/.lokusa. Između 5' homolognog kraka i početka ljudskeXsekvence je bila kaseta neomicina prirubnu Frt mestima.
[0161]Dakle, 12/1-A ciljajući vektor je uključio, od 5' do 3'. 5' homologni krak koji je sadržao -24 kb mišjeXgenomske sekvence 5' endogenog/. lokusa, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto,~123 kb ljudske genomske/.sekvence koja je sadržala prvih 12 uzastopnih hV/. segmenata gena i hJ/.1 segment gena, Pi-Scel mesto, i 3' homologni krak koji obuhvata -28 kb mišje genomske sekvence endogene C?.2-JX.4-C/.4 segmente gena, mišji pojačavač 2 4 sekvence i dodatni mišju genomsku sekvencu nizvodno (3') od pojačavača 2.4 (SL. 4A).
[0162]Na sličan način, 12/1-k ciljajući vektor (SL, 4B) je koristio isti -124 ljudski/.fragment sa izuzetkom da su mišji homologni kraci koji obuhvataju mišju k sekvencu korišćeni tako da ciljanje na endogenom k lokusu može da se ostvari pomoću homologne rekombinacije Dakle, 12/1 -k ciljajući vektor je uključio, od 5' do 3<:>, 5' homologni krak koji je sadržao -23 kb mišje genomske sekvence 5' endogenog k lokusa, l-Ceul mesto, 5 Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, -124 kb ljudske genomske X sekvence koja je sadržala prvih 12 uzastopnih hVA segmenata gena i hJA1 segmenata gena, Pl-Scel mesto, i 3' homologni krak koji sadrži -28 kb mišje genomske sekvence obuhvata endogeni mišji Ckgen, Ek-i i Ek3' i dodatnu mišju genomsku sekvencu u donjem toku (3") od Ek3' (SL. 4B, 12/1-k ciljajući vektor),
[0163] Homologna rekombinacija sa bilo kojim od ova dva inicijalna ciljajuća vektora kreirana sa modifikovanim mišjim lokusom lakog lanca (k iliX)koji obuhvata 12 hVA segmenata gena i hJA1 segment gena funkcionalno povezan na endogeni mišji konstantni gen i pojaćavaće lakog lanca (Ckili CA2 i Eici/Ek-3'ili Enh 2.4/Enh 3.1) gen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernogXlakog lanca,
[0164] LjudskiXmini-lokus sa 12 ljudskih VA i četiri ljudskaIX segmenta gena. U drugom pristupu da bi se dodala raznovrsnost himernom/.lokusu lakog lanca, treći inicijalni ciljajući vektor je projektovan da se ubaci prvih 12 uzastopnih ljudskih V/. segmenata gena iz skupine A i hJA1, 2, 3 i 7 segmenata gena u mišjiklokus lakog lanca (SL. 4B, 12/4-k ciljajući vektor). DNK segment koji sadrži hj/.1, J/.2, J/.3 i JA7 segmenata gena je napravljenade novoDNK sintezom (Integrated DNA Technologies) uključujući svaki JA segment gena i ljudsku genomsku sekvencu 100 bp od i neposrednih 5' i 3' regiona svakog JAsegmenta gena. Pl-Scel mesto je projektovano u 3' kraj ovog -1 kb DNK fragmenta i povezano na kasetu hloroamfenikola. Homologni kraci su PCR pojačani iz ljudske A sekvence na 5' i 3' pozicijama u relativne prema hJA1 segmentu gena ljudskog BAC klona 729g4. Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom intermedijara je izvedena na modifikovanom 729g4 BAC klonu koji je prethodno ciljan uzvodno (5') od ljudskog VA3-12 segmenta gena sa kasetom neomicina prirubnom Frt mestima. koja su takođe sadržala l-Ceul mesto 5' do 5' Frt mesta. Dvostruko ciljani 729g4 BAC klon koji je obuhvatio, od 5' do 3'. I-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto. -123 kb fragmenta sa prvih 12 hVA segmenata gena,~1 kb fragment koji obuhvata ljudske JA1, 2, 3 i 7 segmente gena, Pl-Scel mesto, i kasetu hloroamfenikola. Ovaj ciljajući vektor intermedijara je rastvoren zajedno sa l-Ceul i Pl-Scel i naknadno povezan u modifikovan mišji BAC klon (opisan gore) da se stvori treći ciljajući vektor
[0165] Ova ligacija je dala kao rezultat treći ciljajući vektor za ubacivanje ljudskih A sekvenci u endogeniklokus lakog lanca, koji je obuhvatio, od 5' do 3', 5 mišji homologni krak koji je sadržao~23 kb genomske sekvence 5' endogenog mišjegklokusa, l-Ceul mesto, 5 Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, -123 kb fragment koji sadrži prvih 12 hV7. segmenata gena,~1 kb fragment koji obuhvata hJA.1, 2, 3 i 7 segmenata gena, Pl-Scel mesto, i 3' homologni krak koji sadrži -28 kb mišje genomske sekvence obuhvata endogeni mišji Ckgen, Eki i Ek3' i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3') od Ek3' (SL. 4B, 12/4-k Ciljajući vektor) Homologna rekombinacija ovih ciljajućih vektora nezavisne je stvorila modifikovan mišji A iklokus lakog lanca sa 12 hVA segmenata gena i četiri hJAsegment gena funkcionalno povezan na endogeni mišji Ck gen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog ljudskog >./mišjegklakog lanca.
[0166] Ljudski A mini-lokus sa integrisanom ljudskom k sekvencom lakog lanca. Na sličan način, dva dodatna ciljajuća vektora slična projektovanim za pravljenje za početno umetanje ljudskih A segmenata gena u endogeni k lokus lakog lanca (SL. 4B, 12/1-k i 12/4-k ciljajući vektori) su projektovana progresivno da se ubace ljudski A segmenti gena lakog lanca upotrebom jedinstveno konstruisanih ciljajućih vektora koji su sadržali dodirne ljudskeXikgenomske sekvence Ovi ciljajući vektori su konstruisani da obuhvate~23 kb ljudski k genomsku sekvencu prirodno smeštenu između ljudskog Vk4-1 i Jk1 segmente gena Ova ljudska k genomska sekvenca se specifično pozicionirana u ova dva dodatna ciljajuća vektora između ljudskih VA i ljudskih JA segmenata gena (SL. 4B, 12(k)1-kI 12(k)4-k ciljajući vektori)
[0167] Oba ciljajuća vektora koja sadrže ljudsku< genomskusekvencu su napravljena korišćenjem modifikovanog RP11-729g4 BAC klon opisan gore u tekstu (SL 6). Ovaj modifikovani BAC klon je ciljan sa kasetom odabira spektinomicina prirubnu Noti i AsiSI mesta ograničenja (SL. 6, gore levo). Homologna rekombinacija sa kasetom spektinomicina dala je kao rezutlat dvostruko ciljani 729g4 BAC klon koji je obuhvatio, od 5' do 3', l-Ceui mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto,~123 kb fragmenta sa prvih 12 hVA segmenata gena, Noti mesto oko 200 bp donjeg toka (3') do sekvence nonamera hVX3-1 segmenta gena. kasete spektinomicina i AsiSI mesto. Odvojeni ljudski BAC klon koji je sadržao ljudskuksekvencu (CTD-2366j12) je ciljan dva nezavisna puta da se projektuju mesta ograničenja na lokacijama između hVic4-1 i hJk-1 segmenata gena da se omogući naknadno kloniranje -23 kb fragmenta za povezivanje sa hVA gene segmentima gena sadržanim u dvostruko ciljlanom modifikovanom 729g4 BAC klonu (SL. 6, gore desno).
[0168]Ukratko. 2366j12 BAC klon je oko 132 kb veličine i sadrži hVKsegmente gena 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, ljudskakgenomska sekvenca nizvodno od Vksegmenata gena, hjVsegmenata gena 1-5, the hC*c i oko 20 kb dodatne genomske sekvence ljudskogklokusa Ovaj klon je prvo ciljan sa ciljajućim vektorom koji obuhvata kasetu higromicina bočnu Frt mestima i Noti mesto nizvodno (3') od 3' Frt mesta. Homologni kraci za ovaj ciljajući vektor su sadržali ljudsku genomsku sekvencu 5' i 3' Vk segmenata gena unutar BAC klona tako da posle homologne rekombinacije sa ovim ciljajućim vektorom, Vksegmenti gena su obrisani i Noti mesto je projektovano -133 bp nizvodno od hVk-4-1 segmenta gena (SL. 6, gore desno) Ovaj modifikovani 2366j12 BAC klon je ciljan nezavisno sa dva ciljajuća vektora na 3' kraju da se brišu hJKsegmenti gena sa kasetom hloroamfenikola koja je takođe sadržala bilo hJA1 segment gena, Pl-Scel mesto i AsiSI mesto ili ljudskiAgenomski fragment koji je sadržao četiri hJA segmenta gena( supra),Pl-Scel mesto i AsiSI mesto (SL. 6, gore desno). Homologni kraci za ova dva slična ciljajuća vektora su sadržali sekvencu 5' i 3' hJKsegmenata gena Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima i modifikovan 2366j12 BAC klon je dao prinos dvostruko-ciljanog 2366j12 klona koji je obuhvatio, od 5' do 3'. 5' Frt mesto. kasetu higromicina, 3' Frt meto, Noti mesto, 22,800 bp genomski fragment ljudskogklokusa koji obuhvata intergenski region između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJA.1 segment gena ili ljudskiA genomskifragment koji obuhvata hJA1,JA2,JA3 i JA7, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola (SL.. 6, gore desno). Dva finalna ciljajuća vektora da se naprave dve dodatne modifikacije su izvedene dva koraka ligacije korišćenjem dvostruko-ciljanog 729g4 i 2366j12 klonova.
[0169]Dvostruko ciljani 729g4 i 2366j12 klonovi su rastvoreni sa Noti i AsiSI dajući jedan fragment koji obuhvata kasetu neomicina i hVXsegmente gena i drugi fragment koji obuhvata -23 kb genomski fragment ljudskiklokus koji obuhvata intergenski region između Vk4-1 i Jk1 segmentima gena, bilo hJA1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJA1. JA2, JA.3 i JA7 segmente gena, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola, respektivno. Povezivanje ovih fragmenata je generisalo dva jedinstvena BAC klona koji obuhvataju od 5' do 3' hVA segmenata gena, ljudskukgenomsku sekvencu između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJA1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJA1,JA2,JA3 i JA7 segmente gena, Pl-Scel mesto i kasetu hloramfenikola (SL 6, dno) Ovi novi BAC klonovi su zatim rastvoreni sa l-Ceul i Pl-Scel da ispuste jedinstvene fragmente koji sadrže kasetu neomicina u gornjem toku i dodirne ljudske A iksekvence i povezu se u modifikovani mišji BAC klon 302g12 koji je sadržao od 5' do 3' mišje genomske sekvence 5' endogenogklokusa, l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, hVA segmente gena (3-12 do 3-1), Noti mesto -200 bp nizvodno od VA3-1, -23 kb ljudskeksekvence prirodno se nalazi između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJA1 segment gena ili genomski fragment koji je sadržao hJA1, JA2, JA3 i JA7 segmente gena. mišji Eki, mišji Ck-gen i Ek3' (SL. 4, 12hVA-VKJK-hJA1 i 12hVA-Vk-JK-4hJA ciljajuće vektore). Homologna rekombinacija sa oba ova ciljajuća vektora je stvorila dva odvojena modifikovana mišjaklokusa lakog lanca sa 12 hV?t segmenata gena, ljudskukgenomsku sekvencu, i jedan ili četiri hJA segmenta gena funkcionalno povezana na endogeni mišji Ck-gen koji, posle rekombinacije. vodi formiranju himernog ljudskogA/mišjegklakog lanca
Primer III
Projektovanje dodatnih ljudskih V/. segmenata gena u ljudski X mini-lokus lakog lanca
[0170]Dodatni hVX segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od početnih modifikacija opisanih u Primeru 2 korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka (SL. 5A. +16-X ciljajući vektor i SL. 5B. +16-Kciljajući vektor)
[0171] Uvođenje 16 dodatnih ljudskihVXsegmenata gena.Uzvodni (5) homologni kraci korišćeni u konstruisanju ciljajućih vektora za dodavanje 16 dodatnih hVXsegmenata gena na modifikovane lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 sadržali su mišju genomsku sekvencu 5' bilo endogenogkiliXlokusa lakog lanca. 3' homologni kraci su bili isti za sve ciljanjuće vektore i sadržali su ljudske genomske sekvence koje se preklapaju sa 5' krajem ljudske X sekvence modifikacija kako je opisano u Primeru 2.
[0172]Ukratko, dva ciljajuća vektora su projektovana za uvođenje 16 dodatnih hVX segmenata gena na modifikovane mišje lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 (SL. 5A i 5B, +16-X ili + 16-K ciljajući vektor). A-172 kb DNK fragment iz ljudskog BAC klona RP11-761113 (Invitrogen) koji je sadržao 21 uzastopnih hVX segmenata gena iz skupine A je projektovano sa 5' homolognim krakom koji obuhvata mišju genomsku sekvencu 5' na bilo endogenikili X lokuse lakog lanca i 3' homologni krak koji je sadržao ljudsku genomsku X sekvencu. 5' mišjikili X homologni kraci korišćeni u ovim ciljajućim konstruktima su bili isti 5' homologni kraci opisani u Primeru 2 (SL. 5A i 5B). 3<r>homologni krak je obuhvatio 53.057 bp preklapanja ljudske genomske X sekvence koja odgovara ekvivalentnom 5' kraju -123 kb fragmenta ljudske genomske X. sekvence opisane u Primeru 2 Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5' do 3', 5' mišji homologni krak koji sadrži bilo -23 kb genomske sekvence 5' endogenog mišjegklokusa lakog lanca ili - 24 kb mišje genomske sekvence 5' endogenog X lokusa lakg lanca, 5' Frt mesto, kasetu higromicina, 3' Frt mesto i 171 457 bp ljudsku genomskuXsekvencu koja obuhvata 21 uzastopne hVA segmente gena, -53 kb od tih se preklapa sa 5 krajem ljudskeXsekvence opisane u Primeru 3 i služi kao 3' homologni krak a ovaj ciljajući konstrukt (SL 5A i 5B, +16-Xili + 16-K ciljajuća vektora). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima je stvorila nezavisno modifikovane mišjekiXfokuse lakog lanca svaki sa 28 hVX segmenata gena i hJX1 segment gena funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Ckili CX2) koji, posle rekombinacije, vode formiranju himernog lakog lanca.
[0173]Na sličan način, +16-K ciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 16 dodatnih hVX segmenata gena na druge početne modifikacije opisane u Primeru 2 koje su obuhvatile više hJX segmenata gena sa i bez integrisane ljudskeksekvence (SL. 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjemklokusu koja obuhvata druge inicijalne modifikacije je stvorila mišjeklokuse lakog lanca koji obuhvataju 28 hVXsegmenata gena i hJX1. 2, 3 i 7 segmenata gena sa i bez ljudske Vk-Jkgenomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Ckgen koji, posle rekombinovanja, vodi formiranju himernog X.-k lakog lanca.
[0174] Uvođenje 12 dodatnih ljudskihVA.segmenata gena.Dodatni hVXsegmenti gena su dodati nezavisno na svaku od modifikacija opisanih gore u tekstu korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka. Krajnja struktura lokusa koja je nastala iz homologne rekombinacije sa ciljajućim vektorima je sadržala dodatne hVA, segmente gena su prikazana na SL. 7A i 7B.
[0175]Ukratko, ciljajući vektor je projektovan za uvođenje 12 dodatnih hVXsegmenata gena na modifikovane mišjeki X lokuse lakog lanca opisane gore u tekstu (SL. 5A i 5B, + 12-A ili 12-kciljajuća vektora). A -93.674 kb DNK fragment iz ljudskog BAC klona RP11-22118 (Invitrogen) sa 12 uzastopnih hVA segmenata gena iz skupine B je projektovano sa 5' homolognim krakom koji obuhvata mišju genomsku sekvencu 5' na bilo endogeni mišjikili A lokuse lakog lanca i 3' homologni krak koji obuhvata ljudsku genomskuX sekvencu.5' homologni kraci korišćeni u ovom ciljajućem konstruktu su bili isti 5' homologni kraci korišćeni za dodavanje 16 hVA segmenata gena opisanih gore u tekstu (SL. 5A i 5B). 3' homologni krak je napravljen projektovanjem Pl-Scel mesta -3431 bp 5' na ljudski VA3-29P segment gena sadržan u 27.468 bp genomskom fragmentu ljudske/.sekvence iz BAC klona RP11-761113. Ovo Pl-Scel mesto je služilo kao taćka ligacije da se spoji -94 kb fragmenta dodatne ljudskeXsekvence na - 27 kb fragment ljudske A sekvence koja se preklapa sa 5' krajem ljudskeXsekvence u prethodnoj modifikaciji korišćenjem +16-/. ili +1 S-k ciljajućih vektora (SL 5A i 5B). Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5' do 3', 5' homologni krak koji sadrži bilo --23 kb genomske sekvence 5' endogenog mišjegklokusa lakog lanca ili~24 kb mišje genomske sekvence 5' endogenogAlokusa lakg lanca, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto i 121 188 bp ljudsku genomsku A sekvencu koja obuhvata 16 hVA. segmente gena i Pl-Scel mesto, -27 kb od toga se preklapa sa 5', krajem ljudske/.sekvence od umetanja 16 dodatnih h VA. segmenata gena i služi kao 3' homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL. 5A i 5B, +12-/. ili 12-k ciljajuća vektora). Homologna rekombinacija ovih ciljajućih vektora nezavisno je stvorila modifikovane mišjekiXlokuse lakog lanca sa 40 hVA segmenata gena ljudski JA1 funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Ckili CA2) koje, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog lakog lanca (dno SL. 5A i 5B).
[0176]Na sličan način, +12-K ciljajući vektor je takođe konšćen da uvede 12 dodatnih hV?. segmenata gena na druge početne modifikacije koje su obuhvatile više hJA segmenata gena sa i bez integrisane ljudske k sekvence (SL. 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjemklokusu koji obuhvata druge modifikacije stvorila je mišjiklokus lakog lanca koji obuhvata 40 hVA. segmenata gena i hJA.1, 2, 3 i 7 segmenata gena sa i bez ljudske Vk-Jk genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Ck-gen koji. posle rekombinacije, vodi formiranju himernogA-k lakoglanca
Primer IV
Identifikacija ciljanih ES ćelija koje nose ljudskeAsegmente gena lakog lanca
[0177]Ciljana BAC DNK napravljena prema prethodnim primerima je konšćena na elektroporizovanim mišjim ES ćelijama da se stvore modifikovane ES ćelije za stvaranje himernih miševa koji ispoljaju ljudske A segmenata gena lakog lanca. ES ćelija koje obuhvataju umetanje nepreraspoređenih ljudskih A segmenata gena lakog lanca su identifikovani pomoću kvantitativnog TAQMAN® ogleda. Kompleti i probe specifičnih prajmera su projektovani za umetanje ljudskih A sekvenci i povezanih kaseta odabira (prirast alela, GOA), gubitak endogenih mišjih sekvenci i bilo koje kasete odabira (gubitak alela, LOA) i zadržavanje prirubnih mišjih sekvenci (zadržavanje alela, AR) Za svako dodatno ubacivanje ljudskihAsekvenci, dodatni kompleti i probe prajmera su korišćeni da se potvrdi prisustvo dodatnih ljudskih A sekvenci kao i kompleti i probe prethodnih prajmera korišćenih da se potvrdi zadržavanje prethodno ciljanih ljudskih sekvenci. Tabela 1 prikazuje prajmere i sa njima povezane probe korišćene za oglede kvantitativne PCR analize. Tabela 50 iznosi kombinacije korišćene za potvrdu umetanja svakog odeljka ljudskihX segmenatagena lakog lanca za ES klonove ćelije.
[0178]ES ćelije koje nose ljudske A segmente gena lakog lanca se opciono transfektuje sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonila Frt'ed kaseta neomicina uvedena umetanjem ciljajućeg konstrukta koji sadrži ljudske VA.5-52 - VA1-40 segmente gena (SL. 5A i 5B) Kaseta neomicina može opciono da bude uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoljavaju FLP rekombinazu (npr, US 6,774,279) Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.
Primer V
Generisanje miševa koji ispoljavaju ljudskeXlake lance iz endogenog lokusa lakog lanca
[0179]Ciljane ES ćelije opisane gore u tekstu su korišćene kao ES ćelije donora i uvedene u embrion miša u stadiujumu od 8-ćelija postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr. US Pat br 7,294,754 i Poueymirou etal. (2007) FO generacija miševa koji su u suštini potpuno izvedeni iz gen-ciljanih ES ćelija donora omogućavaju neposredne fenotipne analize. Nature Biotech, 25(1 ):91-99). VELOCIMICE® (FO miševi su u potpunosti razvijeni iz donor ES ćelije) nezavisno noseći ljudske /.segmente gena identifikovane genotipovanjem korišćenjem modifikacije ogleda alela (Valenzuela et aL supra) koji su detektovali prisustvo jedinstvenih ljudskih a. segmenata geja( supra).
[0180] k:a upotreba lakog lanca miševa koji nose ljudske/.segmentegena lakog lanca.
Homozigotni miševi za svaka
tri uzastopna umetanja hVA segmenata gena se jednim hJXsegmentom gena (SL 5B) i miševi homozigotni za prvo umetanje hVA. segmenata gena sa bilo jednim hJA segmentom gena ili četiri ljudska JA segmenta gena uključujući ljudski Vk-Jk genomsku sekvencu (SL 4B) su analizirani za k ikispoljavanje lakog lanca u splenocitima korišćenjem protočne citometrije.
[0181]Ukratko, slezme su prikupljene iz grupa miševa (koje se kreću od tri do sedam životinja po grupi) i samlevene korišćenjem staklenih klizišta. Posle lize (razgradnje) crvenih ćelija krvi (RBCs) sa ACK puferskim sredstvom za razgradnju (Lonza VValkersville), splenociti su postavljeni sa antitelima konjugovanim fluorescentnom bojom specifičnim za mišji CD19 (Clone 1 D3; BD Biosciences), mišji CD3 (17A2; Biolegend), mišji Ig* (187.1; BD Biosciences) i mišji IgA (RML-42; Biolegend) Podaci su prikupljeni korišćenjem BD™ LSR II protočne citometrije (BD Biosciences) i analizirani korišćenjem FLOVVJO™ softvera (Tree Star, Inc.) Tabela 3 iznosi prosečne procenutalne vrednosti za B ćelije (CD19<+>),k lakilanac (CD19<+>lgK<+>lgA_) i A laki lanac (CD19<+>lgK~lgA+) ispoljavanje primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose različite genetske modifikacije.
[0182]U sličnom eksperimentu, sadržaji B ćelije pregrade za jetru iz mišjih homozigota za prvo umetanje 12 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen (dno SL 4B) i mišji homozigot za 40 hVA i jedan hJA segment gena (dno SL ili vrh SL. 7B) su analizirani za IgKi IgA ispoljavanje korišćenjem protočne citometrije (kako je gore opisano). SL. 8A pokazuje IgA i IgK ispoljavanje u CD19<+>B ćelijama za miša predstavnika iz svake grupe. Broj CD19<+>B ćelija po jetri je bio takođe registrovan za svakog miša (SL 8B)
[0183]U drugom eksperimentu, sadržaji B ćelije pregrade za jetru i koštanu srž iz mišjih homozigota za prvo umetanje 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen (dno SL 7B) su analizirani za napredovanje kroz razvoj B ćelije korišćenjem protočne citometrije različitih markera površine ćelije.
[0184]Ukratko, dve grupe (N-3 svaka, 9-12 nedelja stari, muški i ženski) divljeg tipa i miševi homozigotni za 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujućiljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ck gen su žrtvovani i pokupljene su slezine i koštana srž. Koštana srž je prikupljena iz butnih kostiju ispiranjem sa potpunom podlogom RPMImedijum (RPMImedium dopunjen sa serumom telećeg fetusa, natrijum piruvatom, Herpes, 2-merkaptoetanolom, neesencijalnim amino kiselinama, i gentamicinom). RBC preprarati iz slezine i koštane srži su lizovani sa ACK puferskim sredstvom za lizu (Lonza VValkersville), poste čega je usledili pranje sa potpunom RPMI podlogom. 1x10-6 ćelije su inkubirane sa antitelima koja jako reaguju sa antigenima miša CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, posle čega je usledio označavanje sa odabranim panelom antitela tokom 30 min. na ledu.
[0185]Panel koštane srži: anti-mišji FITC-CD43 (1B11, BioLegend). PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-lgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (11-26c2a. BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD) i Pacific Blue-CD3 (17A2. BioLegend).
[0186]Panel koštane srži i slezine: anti-mišji FITC-lg* (187.1, BD). PE-lgA (RML-42, BioLegend), PeCy7-lgM (11/41, ebioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD).
[0187]Posle bojenja, ćelije su oprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka je izvedeno na FACSCANTOII™ protočnoj citometriji (BD Biosciences) i analizirani sa FLOVVJO™ softverom (Tree Star, Inc.), SL. 9A. 9D pokazuju rezultate za slezinsku pregradu jednog miša predstavnika iz svake grupe. SL. 10A - 10E pokazuju rezultate za pregradu koštane srži jednog miša predstavnika za svaku grupu. Tabela 4 iznosi prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>),klakog lanca (CD19+lgA+lgX^) i A. ispoljavanje lakog lanca (CD19+lgk- lg<+>) primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose svaku genetrsku modifikaciju. Tabela 5 prikazuje prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), zrele B ćelije (B220<hi>!gM<+>). nezrele B ćelije (B220<int>lgM<+>). nezrele B ćelije koje ispoljavajuklaki lanac (B220'<n>,lgM<+>lgk<+>) i nezrele B ćelije koje ispoljavaju A laki lanac (B220'nt|glV!+lgA",~) primećene u koštanoj srži divljeg tipa i miševima homozigotnim za 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ck gen. Ovaj eksperiment je ponovljen sa dodatnim grupama miševa opisanih gore i pokazao je slične rezultate (podaci nisu prikazani).
[0188] Upotreba ljudskogVXgena kod miševa koji nose ljudskeXsegmente gena lakog lanca-umetanje ljudskihXsekvenci (hVA3-12-hVA3-1 i hJ/,1, SL. 5B) i homozigotni za treće umetanje ljudskihXsekvenci (hV?,5-52- hVX3-l i hJA.1, SL. 5B) su analizirani za ljudski a gen lakog lanca korišćenjem reverzne lančane reakcije transkriptaze polimeraze (RT-PCR) koršćenjem RNK izolovanih iz splenocita.
[0189]Ukratko, slezine su prikupljene i prelivene sa 10 mL RPMI-1640 (Sigma) sa 5% HI-FBS u sterilnim vrećama za jednokratnu upotrebu. Svaka vreća koja je sadržala jednu slezinu je zatim postavljena u STOMACHER™ (Seward) i homogenizovana na srednjoj postavci tokom 30 sekundi. Homogenizovane slezine su filtrirane korišćenjem 0,7 pm cediljke za ćelije i zatim su peletirane centrigugom (1000 ob./min tokom 10 minuta) i RBCs su lizovane u BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) tokom tri minuta. Splenociti su rastvoreni sa RPMI-1640 i ponovo centnfugirani. posle čega je sledilo vraćanje u suspenziju u 1 mL PBS (Irvine Scientific). RNK je izolovana iz peletiranih splenocita korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici
[0190]RT-PCR jeizveden na RNK splenocita korišćenjem prajmera specifičnih za ljudske hV/. segmente gena i mišji Ckgen (Tabela 6). PCR proivodi su bili prečišćeni gelom i klonirani u pCR2.1-TOPO TA vektor (Invitrogen) i sekvencionirani prajmerima M13 Forvvard (GTAAAACGAC GGCCAG; ID BR SEK: 55) i M13 Reverse (CAGGAAACAG CTATGAC; ID BR SEK:56) su smešteni unutar vektora na lokacijama koje su prirubno postavljene na mesto kloniranja. Ukupno osamdeset četiri klona je izvedeno iz prvog i trećeg umetanja ljudske a sekvence su sekvencionirane da se odredi hV/_ upotreba gena (Tabela 7). Ovi sekvenca nukleotida hvl-hJ/J-mCk- ukrštanje za izabrane RT-PCR klonove je prikazano na SL. 11
[0191]Na sličan način, homozigotni miševi za treće umetanje ljudskih ?. sekvenci gena lakog lanca{ t. j.40 hV?.. segmenata gena i četiri hJ?. segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu, dno SL. 7B) funkcionalno povezano na endogeni mišji Ckgen su analizirani za ljudskikgen lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore u tekstu) Upotreba ljudskogXsegmenta gena lakog lanca za 26 odabranih RT-PCR klonova je prikazana u Tabeli 8. Sekvenca nukleotida hV?.-hJA-mCKukrštanja za odabrane RT-PCR klonove je prikazano na SL. 12.
[0192]Na sličan način, homozigotni miševi za prvo umetanje ljudskiha segmenatagena lakog lanca (12 hV"A segmenata gena i hJA.1, SL. 4A i SL. 5A) funkcionalno povezan na endogeni mišji C/.2 gen su analizirani za upotrebu ljudskog X gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore). Prajmeri specifični za hVA segmente gena (Tabela 6) su spareni sa jednim od dva prajmera specifična za mišji Ca2 gen; C/.2-1 (ID BR SEK;104) ili Ca2-2 (ID BR SEK:105)
[0193]Više hVA. segmenata gena pre raspoređen ih u hX1 je primećeno iz RT-PCR klonova iz miševa koji nose ljudskeX segmentegena lakog lanca na endogenom mišjem a lokusu lakog lanca. Sekvenca nukleotida hVA- hJX-mCX2 ukrštanja za izabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL. 13
[0194]SL 11 pokazuje sekvencu hV/^-hJ/J-mCk- ukrštanja za RT-PCR klonove iz miševa koji nose prvo i treće umetanje hVX segmenata gena sa jednim hJ/„ segmentom gena. Sekvence prikazane na SL. 11 ilustruju jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hV7. segmente gena sa hJX1 rekombinovanom na mišjem Ckgenu. Heterozigotni miševi koji nose samo jedan modifikovani endogeniklokus sa 12 hVA segmenata gena i hJA1 i homozigotne miševe koji nose dva modfikovana endogenaklokusa koji sadrže 40 hVA segmente gena i hJA1 su oba bila sposobna da proizvedu ljudske /.segmente gena funkcionalno povezane na mišji Ckgen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudske A lake lance. Ova preraspoređivanja pokazuju da su himerni lokusi mogli da nezavisno prerasporede ljudskeXsegmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa Dalje, ove modifikacije na endogenomklokusu lakog lanca nisu dale nijedan od hVA segmenata gena kao inoperativan ili sprečile da himerni lokus rekombinuje više hVA i hJA (JA1) segmenata gena tokom razvoja B ćelije kako su potvrdili dokazi pomoću 16 različitih hVA segmenata gena koji su primećeni da se pre raspoređuju sa hJA1 (Tabela 7). Dalje, ovi miševi su napravili funkcionalna antitela koja su sadržala preraspoređene ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišje Ckgene kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0195]SL. pokazuje sekvencu hVA-hJA-mCKspoja za odabrane RT-PCR klonove iz miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu Sekvence prikazane na SL, 12 ilustruju dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju više različitih hVX segmenata gena, koji se prostiru kroz ceo raspon himernog lokusa, sa više različitih hJA segmenata gena raspoređenih i funkcionalno povezanih na mišji Ckgen, Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogeneklokuse koji sadrže 40 hVA i četiri hJA segmenta gena su mogli da proizvedu ljudskeXsegmente gena funkcionalno povezane na mišji Ckgen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudskeXlake lance. Ova preraspoređivanja još pokazuju da su sve faze himernih lokusa mogle da nezavisno prerasporede ljudskeXsegmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Pored toga, ove dodatne modifikacije na endogenomklokusu lakog lanca pokazuju da svako ubacivanje ljudskihX segmenatagena ne daje bilo koji od hVA i/ili JA segmenata gena nefukcionalnim ili sprečava da se himerni lokus rekombinuje hVA i JA. segmente gena tokom razvoja B ćelije kao dokaz pomoću 12 različitih hVA segmenata gena koji su primećeni da se preraspoređuju sa sva četiri hJA segmenta gena (Tabela 8) iz 26 odabranog RT-PCR klena Dalje, ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišje Ckregione kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0196]SL. 13 pokazuje sekvencu hVA.-hJA-mCA2 spoja za tri pojedinačna RT-PCR klona iz mišjih homozigotnih 12 hVA. segmenata gena i hJA1. Sekvence prikazane na SL. ilustruje dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVA segmente gena, u rasponu dužine od prvog umetanja, sa hJA1 preraspoređen i funkcionalno povezan na mišji CA2 gen (2D1 - VA2-8JA1: 2D9 - VA.3-10JA1; 3E15 - VA3-1JA1). Jedan klon je pokazao neproduktivno preraspoređivanje usled N dodavanja na hVA-hJA ukrštanja (2D1, SL.13). Ovo nije neubičajeno za V(D)J rekombinaciju. kao spajanje segmenata gena tokom rekombinacije se pokazala kao neprecizna, lako ovaj klon predstavlja neproduktivni rekombinant prisutan u repertoaru lakog lanca ovih miševa, ovo pokazuje da genetski mehanizam koji doprinosi raznovrsnosti pri ukrštanju među genima antitela radi normalno kod ovih miševa i vodi do repertoara antitela koja sadrže lake lance sa većom raznovrsnošću
[0197]Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogeneAlokuse sa 12 hVA segmenata gena i hJA1 su takođe mogli da proizvedu ljudske A segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji CA gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile reverzne himerne A lake lance sa hVA. regionima povezanim na mišje CA regione. Ova preraspoređivanja još pokazuju da ljudske A segmente gena lakog lanca postavljene na drugom lokusu lakog lanca (t.j., A lokus) su mogli da se nezavisno prerasporede ljudski A segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa Pored toga, modifikacije na endogenomAlokusu lakog lanca pokazuju da ubacivanje ljudskihAsegmenata gena nije učinilo bilo koje hVA i/ili hJA1 segmente gena nefunkcionalnim ili sprečilo da se himerni lokus rekombinuje hVA i hJA1 segmenti gena tokom razvoja B ćelije. Dalje, ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišjiCAregion kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina
[0198]Kao što je prikazano na ovom Primeru, miševi koji nose ljudske X segmente gena lakog lanca na endogenim k i A lokusima lakog lanca lokusima lakog lanca su sposobni da prerasporede ljudskeA segmentegena lakog lanca i ispoljava ih u kontekstu mišjeg Ck i/iliCAregiona kao deo normalnog repertoara antitela miša zato što je funkcionalni laki lanac potreban na različitim kontrolnim tačkama u razvoju 8 ćelije i u slezini i koštanoj srži. Dalje, rani podskupovi B ćelija (npr, pre-, pro- i tranzicione B ćelije) pokazuju normalan fenotip kod ovih miševa u poređenju sa divljim tipom štenaca iz legla (SL. 9D, 10A i 10B), Mali nedostatak u koštanoj srži i perifernih populacija B ćelija je primećen. kojima se mogu pripisati brisanje podskupa auto-reaktivnih nezrelih B ćelija i/ili podoptimalnog udruživanja ljudskog A. lakog lanca sa mišjim teškim lancem Međutim. IgK/lgA upotrebu pnmećenu u ovim prikazuje situaciju koja je više nalik na ispoljavanje ljudskog lakog lanca nego na ono što je pnmećeno kod miševa
Primer VI
Odgajanje mišjeg ispoljavanja ljudskihklakih lanaca iz endogenih lokusa lakog lanca
[0199]Da bi se optimizovala upotreba ljudskih A segmenata gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, miševi koji nose nepreraspoređene ljudskeAsegmente gena se odgajaju na drugom mišu koji sadrži brisanje u suprotsavljenom endogenom lokusu lakog lanca (bilokiliA),Na primer, ljudskiA segmentigena pozicionirani na endogenomk-lokusu bi bili jedini funkcionalni segmenti gena lakog lanca prisutni kod miša koji takođe nose brisanjena endogenom A lokusu lakog lanca Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi ispoljilo samo ljudske A lake lance kako je opisano u prethodnim primerima. Odgajanje je izvedeno standardnim tehnikama priznatim u tehnici i, alternativno pomoću komercijalnih kompanija (npr., The Jackson Laboratory). Mišji sojevi koji nose ljudske sgemente gena lakog lanca na endogenomklokusu i brisanja endogenog A lokusa lakog lanca se skeniraju na prisustvo jedinstvenih reverzno-himernih (Ijudsko-mišjih)Alakih lanaca i odsustvo endogenih mišjihklakih lanaca.
[0200]Miševi koji nose nepreraspoređeni ljudski A lokus lakog lanca se takođe odgajaju sa miševima koji sadrže zamenu endogeniog mišjeg lokusa promenljivg gena teškog lanca sa ljudskim lokusom promenljivog gena teškog lanca (videti US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, the VELOCIMMUNE® genetski projektovani miš). VELOCIMMUNE® miš obuhvata, delimično, koji ima genom koji obuhvata ljudske promenljive regione ljudskog teškog lanca koji su funkcionalno povezani na endogene mišje lokuse konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitela koja obuhvataju ljudski promenljivi region teškog lanca i mišji konstantni region teškog lanca kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca antitela može da bude izoiovana i funkcionalno povezana na DNK koja kodira konstantne regione teškog lanca čoveka. DNK može zatim da se ispolji u ćeliji koja je sposobna da ispolji potpuno ljudski teški lanac Prema odgovarajućem rasporedu odgoja, dobijaju se miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg lokusa lakog lanca sa ljudskim lokusom teškog lanca i nepreraspoređenim ljudskim A lokusom lakog lanca na endogenomklokusu lakog lanca Antitela koja sadrže somatski mutirane ljudske promenljive regione teškog lanca i ljudskeApromenljive regione lakog lanca mogu da se izoluju posle imunizacije sa antigenom od interesa.
Primer VII
Generisanje antitela iz miševa koji ispoljavaju ljudske teške lance i ljudske A lake lance
[0201]Posle uzgajanja miševa koji sadrže nepreraspoređeni ljudskiAlokus lakog lanca na različite željene sojeve koji sadrže modifikacije i brisanje drugih endogenih Ig lokusa (kako je opisano gore), izabrani miševi su imunizovani sa antigenom od interesa
[0202]Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od pojedinačnih preraspoređenih ljudskih regiona lakog lanca klicine linije se izaziva sa antigenom, i limfnim ćelijama (kao što su B ćelije) se oporavljaju iz seruma životinja. Limfne ćelije mogu da se spoje sa ćelijskom linijom mijeloma da se pripreme ćelijske linije besmrtnih hibridoma, i takve ćelijske linije hibridoma se skeniraju i biraju da se utvrde ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela koja sadrže Ijuidski teški lanac i ljudski X laki lanac koji su specifični za antigen korišćen za imunizaciju DNK kodiranje promenljivih regiona teških lanaca iXlakih lanaca može da bude izolovan i povezan na željene izotipne konstantne regione teškog lanca i lakog lanca Zbog prisustva dodatnih hVA. segmenata gena u poređenju sa endogenim mišjim X lokusu, raznovsnost repertoara lakog lanca je dramatično povećana i posle imunizacije daje veću raznovrsnost na antigen-specifičnom repertoaru. Dobijene sekvence kloniranog antitela mogu da budu naknadno proizvedene u ćeliji, kao što je CHO ćelija Alternativno, DNK koja kodira himerna antitela specifična za antigen ili promenljive domene lakog lanca i teškog lanca mogu da budu izolovane direktno iz limfocita specifičnih za antigen (npr., B ćelije).
[0203]U početku, visokoafinitetna himerna antitela se izoluju tako da imaju promenljivi region čoveka i konstantni region miša Kao što je gore opisano, antitela se karakterišu i odabiraju za poželjne karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop. itd Mišji konstantni regioni se zamenjuju sa željenim ljudskim konstantnim regionom da se generiše potpouno ljudsko antitelo koje sadrži somatski mutirani ljudski teški lanac i ljudski X laki lanac izveden iz nepreraspoređenog ljudskog X lokusa lakog lanca ovog pronalaska. Pogodni ljudski konstantni regioni obuhvataju, na primer divlji tip ili modifikovan lgG1, lgG2. lgG3, ili lgG4.

Claims (1)

1 Miš koji obuhvata endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVA) i nepreraspoređeni ljudski spojni (hJA) segment gena. pri čemu miš obuhvata brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegXalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmente gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa ljudskim Va i Ja segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji lambda konstantni (CA) region gena pomenute druge\/ X- JX- CXskupine gena tako da miš ispoljava laki lanac izveden izhVA hJA i mišji CA. gen, pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišjeg lambda 3' pojačivača (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca
2 Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeniA(lambda) alel lakog lanca obuhvata više ljudskih VA segmenata gena.
3. Miš prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata: a) barem 12 nepreraspoređenih VA segmenata gena; ih b) 13 do 28 nepreraspoređenih VA segmenata gena; ili
4. Miš prema patentnom zahtevu 3, pri čemu ljudski VA segmenati gena obuhvataju: (a) hVA3-1, hVA4-3, hVA2-8. hVA3-8, hVA3-10, hVA2-11, i hVA3-12; ili (b) hVA2-14, hVA3-16, hVA2-18, hVA3-19, hVA3-21. hVA3-22, hVA2-23, hVA3-25, i hVA3-27.
5. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata jedan neprerasoređeni JA segmenata gena koji je hJA1.
6. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata jedan neprerasoređeni ljudski JA segmenata gena.
7. Miš prema patentnom zahtevu 6, pri čemu mtš četiri ljudska JA segmenta gena jesu JA1, JA2, JA3, i JA7.
8. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeniA(lambda) alel lakog lanca nema endogeni VA segment gena.
9. Miš prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva 1 do 3, 5 i 8, pri čemu se endogenik(kappa) aiel lakog lanca briše
10. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni mišji A alel lakog lanca obuhvata: a) dodirunu sekvencu ljudskogAlokusa lakog lanca koja ima raspon od VA3-12 do VA3-1; b) dodirunu sekvencu ljudskogAlokusa lakog lanca koja ima raspon od VA3-29 do VA3-1; ili (c) dodirnu sekvencu ljudskog A lokusa lakog lanca koji ima raspon od VA3-29 do VA3-1 i dodirnu sekvencu ljudskogAlokusa lakog lanca koja se prostire od VA5-52 do VA1-40 H.lzolovana ćelija koja ispoljava laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena, pri čemu je ćelija iz, ili može se dobiti iz, miša prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i pri čemu ćelija obuhvata preraspoređeni ljudski V?. i preraspoređeni ljudski Ja segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg a alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA, segmenata gena druge VA.-J/.-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim Va i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji Ca gen konstantnog regiona pomenute druge VA.-JA-CA skupine gena. i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2 4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutomkalelu lakog lanca.
12.Izolovana ćelija prema patentnom zahtevu 11, pri čemu ta ćelija jeste B ćelija
13. !zolovana mišja embrionska matična (ES) ćelija obuhvata endogeni a (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski V/. i nepreraspoređeni ljudski Ja segment gena, pri čemu ćelija obuhvata brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA., segmenata gena drugeVA-JA-CAskupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA. segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CAgen konstantnog regiona pomenute druge VA-JA-CA skupine gena, i pri čemu se endogeni pojačivači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačivač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelulakoglanca.
14. Mišji embrion koji obuhvata, napravljen od. ili koji se može dobiti iz, mišje ES ćelije prema patentnom zahtevu 13, pri čemu mišji embrion obuhvata endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski VA ) i nepreraspoređeni ljudski JA segment gena, gde ćelija obuhvata brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA. gen konstantnog regiona pomenute druge VA-JA-CA skupine gena, pri čemu se endogeni pojačivači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačivač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelulakoglanca.
15. Upotreba B ćelije prema patentnom zahtevu 12 da se napravi hibridom koji ispoljava laki lanac izveden iz hVA hJA i mišjeg CA gen, pri čemu je hibridom iz, ili može da se dobije iz, miša prema jednom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu ćelija obuhvata ljudski VA i preraspoređeni ljudski JA segment gena, i brisanje prve VA- JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena drugeVA-JA-CAskupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA gen konstantnog regiona pomenute druge VA-JA-CA skupine gena i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačivač (Enh) i Enh 3 1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca.
16 Hibridom koji ispoljava laki lanac izveden iz hVAhJA imišjeg CA gena pri čemu je hibridom iz, ili se može dobiti iz, miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu ćelija obuhvata preraspoređeni ljudski VA I preraspoređeni ljudski JA segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg /.alela lakog lanca i zamenu. u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA- CA. skupine gena tog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koje su funkcionalno povezane sa nedirnutim mišjim CA genom konstantog regiona pomenute druge V/.-JA-CA skupine gena, i pri čemu se endogeni pojačivači Enh 2 4, mišji lambda 3' pojačivač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom/. alelu lakog lanca 17.Postupak za pravljenje antitela kod miša koji obuhvata; ajizlaganje miša prema patentnom zahtevu 1 antigenu; bjomogućavanje mišu da razvije imuni odgovor na antigen; i cjizolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, ili izoiovanje iz miša (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, ili identifikovanje kod miša (b) sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu ovo antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVX, hJA t mišjeg C/. gena
RS20160483A 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom RS54891B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35731410P 2010-06-22 2010-06-22
US35731710P 2010-06-22 2010-06-22
PCT/US2011/041366 WO2011163311A1 (en) 2010-06-22 2011-06-22 Mice expressing alight chain with human lambda variable and mouse constant regions
EP11728508.0A EP2480675B1 (en) 2010-06-22 2011-06-22 Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS54891B1 true RS54891B1 (sr) 2016-10-31

Family

ID=44509861

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171091A RS56589B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20160548A RS55042B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka
RS20160483A RS54891B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom
RS20160496A RS55037B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171091A RS56589B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20160548A RS55042B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160496A RS55037B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi

Country Status (30)

Country Link
US (22) US9012717B2 (sr)
EP (7) EP3456832A1 (sr)
JP (16) JP6009441B2 (sr)
KR (16) KR101934852B1 (sr)
CN (4) CN104404050B (sr)
AU (1) AU2011271046B2 (sr)
BR (3) BR122020013427B1 (sr)
CA (2) CA2804311C (sr)
CY (5) CY1117537T1 (sr)
DK (5) DK2480675T3 (sr)
ES (5) ES2646052T3 (sr)
HR (5) HRP20160497T1 (sr)
HU (5) HUE036597T2 (sr)
IL (12) IL313063A (sr)
LT (4) LT3034608T (sr)
ME (5) ME02440B (sr)
MX (6) MX348942B (sr)
MY (6) MY195217A (sr)
NO (1) NO2905338T3 (sr)
NZ (6) NZ707200A (sr)
PL (5) PL2568049T3 (sr)
PT (5) PT2568049T (sr)
RS (5) RS56589B1 (sr)
RU (3) RU2601297C2 (sr)
SG (4) SG10201504568YA (sr)
SI (5) SI2480675T1 (sr)
SM (5) SMT201700506T1 (sr)
TR (1) TR201905992T4 (sr)
WO (2) WO2011163311A1 (sr)
ZA (5) ZA201300062B (sr)

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
KR101987351B1 (ko) * 2008-09-30 2019-06-10 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
RU2011129459A (ru) 2008-12-18 2013-01-27 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
KR101830020B1 (ko) 2010-03-31 2018-02-19 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작
SG10201504568YA (en) 2010-06-22 2015-07-30 Regeneron Pharma Hybrid light chain mice
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
DK2597945T3 (da) 2010-07-26 2020-09-21 Trianni Inc Transgene dyr og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
HRP20192255T1 (hr) 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
JP2014531452A (ja) * 2011-09-19 2014-11-27 カイマブ・リミテッド 動物、レパートリーおよび方法
BR112014006390A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd anticorpos, domínios variáveis e cadeias feitos especialmente para uso humano
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ME03477B (me) 2011-12-20 2020-01-20 Regeneron Pharma Miševi sa humanizovanim lakim lancem
SMT201800395T1 (it) 2012-03-16 2018-09-13 Regeneron Pharma Anticorpi a catena leggera ingegnerizzati con istidina e roditori modificati geneticamente per la generazione degli stessi
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
PT2825037T (pt) 2012-03-16 2019-08-07 Regeneron Pharma Animais não humanos que expressam sequências de imunoglobulinas sensíveis ao ph
RU2014141536A (ru) 2012-03-16 2016-05-10 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Мыши, которые продуцируют антигенсвязывающие белки с зависимыми от величины ph характеристиками связывания
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) * 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
EP2831245A1 (en) 2012-03-28 2015-02-04 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies
LT2840892T (lt) 2013-02-20 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nežmogaus tipo gyvūnai su modifikuotomis imunoglobulino sunkiųjų grandinių sekomis
LT3501272T (lt) * 2013-03-13 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, vykdančios imunoglobulino lengvosios grandinės riboto rinkinio raišką
PL2967012T3 (pl) 2013-03-14 2021-04-19 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgeniczne ssaki inne niż człowiek do wytwarzania przeciwciał
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
KR20200103882A (ko) * 2013-09-18 2020-09-02 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 히스티딘 엔지니어링된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-인간 동물
ES2993142T3 (en) 2013-10-01 2024-12-23 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
TW201532513A (zh) * 2014-01-10 2015-09-01 Alfur Fu-Hsin Hung 能產生比小鼠ＩgＥ量高出許多的人源化ＩgＥ之基因轉殖動物
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
BR112016021679A2 (pt) 2014-03-21 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. proteína de ligação ao antígeno, métodos de produção de uma proteína de ligação ao antígeno e de identificação de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno, hibridoma, ácido nucleico, célula, e, animal não humano geneticamente modificado.
JP6449338B2 (ja) 2014-06-06 2019-01-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用
WO2016044745A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
CA2963470A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
HUE050596T2 (hu) 2014-11-21 2020-12-28 Bristol Myers Squibb Co Antitestek CD73 ellen és azok felhasználásai
AU2015365583B2 (en) 2014-12-19 2021-10-28 Regenesance B.V. Antibodies that bind human C6 and uses thereof
AR103268A1 (es) 2014-12-23 2017-04-26 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra tigit
US10358944B2 (en) 2015-02-05 2019-07-23 Basf Se Solar power plant comprising a first heat transfer circuit and a second heat transfer circuit
HK1250038A1 (zh) 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
UY36687A (es) 2015-05-29 2016-11-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos contra ox40 y sus usos
KR20180021833A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
CN105274116B (zh) * 2015-10-21 2020-09-29 重庆金迈博生物科技有限公司 一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用
CN108738324B (zh) 2015-11-19 2022-06-21 百时美施贵宝公司 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其用途
EP3384030A4 (en) 2015-12-03 2019-07-03 Trianni, Inc. IMPROVED IMMUNOGLULINIVITY
WO2017136734A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
IL261602B2 (en) 2016-03-04 2024-06-01 Univ Rockefeller Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
JP7012665B6 (ja) 2016-05-09 2023-12-14 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｌ１ａ抗体およびその使用
CN109475109B (zh) 2016-05-20 2021-10-29 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
SI3462853T1 (sl) 2016-06-03 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo
WO2017214089A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
US10650241B2 (en) * 2016-06-27 2020-05-12 Facebook, Inc. Systems and methods for identifying matching content
JP7027401B2 (ja) 2016-07-14 2022-03-01 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
WO2018044970A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus k envelope (herv-k) and uses thereof
JP2020500007A (ja) 2016-10-13 2020-01-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ジカウイルスエンベロープタンパク質に結合する抗体およびその使用
CN109906272A (zh) 2016-10-31 2019-06-18 国立大学法人鸟取大学 产生人抗体的非人动物和使用该非人动物的人抗体制作方法
EP3766343B1 (en) 2016-11-04 2022-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
BR112019016374A2 (pt) 2017-02-17 2020-04-07 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos para alfa-sinucleína e usos dos mesmos
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
LT3720279T (lt) 2017-12-05 2022-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, turinčios sukonstruotą imunoglobulino lambda lengvąją grandinę, ir jų panaudojimas
KR20250078626A (ko) 2018-01-12 2025-06-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
BR112020018539A2 (pt) 2018-03-23 2020-12-29 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra mica e/ou micb e usos dos mesmos
HUE070158T2 (hu) 2018-03-24 2025-05-28 Regeneron Pharma Genetikailag módosított egerek vagy patkányok peptid-mhc komplexek elleni terápiás antitestek létrehozásra, ezek elõállítására szolgáló módszerek, valamint alkalmazásuk
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
US12543710B2 (en) * 2018-06-08 2026-02-10 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for producing diversified antibodies that have the same light chain II
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
WO2020085011A1 (ja) 2018-10-26 2020-04-30 ビークルエナジージャパン株式会社 電池制御装置
MY205758A (en) 2018-11-16 2024-11-12 Bristol Myers Squibb Co Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
KR20230128134A (ko) 2019-01-22 2023-09-01 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-7r 알파 서브유닛에 대한 항체 및 이의 용도
SG11202107589PA (en) 2019-02-22 2021-08-30 Regeneron Pharma Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
MX2021014893A (es) * 2019-06-05 2022-03-11 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un repertorio de cadena ligera lambda limitado expresado a partir del locus kappa y usos de estos.
ES3027509T3 (en) * 2019-07-01 2025-06-16 Zoetis Services Llc Transgenic rodents and methods of use thereof
AU2020395122A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-MHC II protein constructs and uses thereof
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
KR20230024822A (ko) * 2020-06-25 2023-02-21 주식회사 휴맵 이형접합성 형질전환 동물
EP4211155A1 (en) 2020-09-11 2023-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
CA3199879A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
US20240317849A1 (en) 2020-12-23 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
JP2024501796A (ja) 2020-12-23 2024-01-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 膜貫通タンパク質に結合する抗体、および抗体を産生する細胞を取得する方法
WO2023199655A1 (ja) 2022-04-13 2023-10-19 日本精工株式会社 軸受装置の状態の検出方法、検出装置、およびプログラム
USD999969S1 (en) * 2022-04-29 2023-09-26 Shenzhen Intellirocks Tech. Co., Ltd. Lamp
EP4658687A1 (en) 2023-01-31 2025-12-10 University of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
EP4705342A2 (en) 2023-05-04 2026-03-11 Novasenta, Inc. Anti-cd161 antibodies and methods of use thereof
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2078539C (en) * 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
EP2305027B1 (en) * 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
GB9823930D0 (en) * 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
RU2262511C2 (ru) * 2000-05-18 2005-10-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) * 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
GB0031284D0 (en) * 2000-12-21 2001-01-31 Ks Biomedix Ltd High affinity antibodies
CN1789416B (zh) * 2001-05-11 2011-11-16 协和发酵麒麟株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
GB0115256D0 (en) * 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
EP3269235B1 (en) 2001-11-30 2022-01-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic mice bearing human ig lambda light chain genes
US20030217171A1 (en) 2002-05-17 2003-11-20 Von Stuermer Wolfgang R. Self-replicating and self-installing software apparatus
CN1852925A (zh) * 2003-07-15 2006-10-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
CN1605628A (zh) * 2003-09-03 2005-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Cho细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体
AU2005267720B2 (en) * 2004-08-05 2012-02-23 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
US7645450B2 (en) * 2004-12-29 2010-01-12 Yuhan Corporation Humanized antibody specific for tumor necrosis factor-alpha
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
WO2008022391A1 (en) * 2006-08-22 2008-02-28 G2 Inflammation Pty Ltd Method for producing antibodies
WO2008054606A2 (en) 2006-10-02 2008-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human il-4 receptor
US7864492B2 (en) 2006-10-31 2011-01-04 Siemens Industry, Inc. Systems and methods for arc fault detection
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
EP2271758B1 (en) * 2008-04-14 2018-09-12 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
EP2669298A3 (en) * 2008-05-23 2014-02-26 Ablexis, LLC Single variable immunoglobulin domain comprising VL-DH-JL
KR101987351B1 (ko) * 2008-09-30 2019-06-10 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
RU2011129459A (ru) * 2008-12-18 2013-01-27 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение
CN102638971B (zh) * 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US10143186B2 (en) * 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
AU2011266843C9 (en) 2010-06-17 2018-03-01 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
SG10201504568YA (en) * 2010-06-22 2015-07-30 Regeneron Pharma Hybrid light chain mice

Also Published As

Publication number Publication date
CY1122877T1 (el) 2021-05-05
MY195214A (en) 2023-01-11
US9006511B2 (en) 2015-04-14
SI2568049T1 (sl) 2016-10-28
PL2905338T3 (pl) 2018-01-31
HUE044001T2 (hu) 2019-09-30
EP3205726A1 (en) 2017-08-16
IL282872A (en) 2021-06-30
ZA201506598B (en) 2017-03-29
ME02444B (me) 2016-09-20
KR101934852B1 (ko) 2019-01-04
CN104404050A (zh) 2015-03-11
IL291301B2 (en) 2023-07-01
US9150662B2 (en) 2015-10-06
SG186390A1 (en) 2013-01-30
JP2018023403A (ja) 2018-02-15
IL269078B (en) 2021-05-31
IL282872B (en) 2022-04-01
JP2020128440A (ja) 2020-08-27
US9066502B2 (en) 2015-06-30
JP2022066449A (ja) 2022-04-28
JP2016010417A (ja) 2016-01-21
MX348942B (es) 2017-07-04
US9399683B2 (en) 2016-07-26
AU2011271046B2 (en) 2015-10-01
ES2721749T3 (es) 2019-08-05
HK1168384A1 (zh) 2012-12-28
KR102506001B1 (ko) 2023-03-07
US20150089680A1 (en) 2015-03-26
JP2025027148A (ja) 2025-02-26
NO2905338T3 (sr) 2017-12-30
RU2013102596A (ru) 2014-07-27
HUE029691T2 (en) 2017-03-28
RS55042B1 (sr) 2016-12-30
CA2804311C (en) 2017-09-12
MX2012015298A (es) 2013-05-01
US9206263B2 (en) 2015-12-08
US9206261B2 (en) 2015-12-08
ES2575223T3 (es) 2016-06-27
IL264634B (en) 2019-09-26
ME02442B (me) 2016-09-20
KR102462042B1 (ko) 2022-11-03
CY1118126T1 (el) 2017-06-28
EP3034608A1 (en) 2016-06-22
IL255179A0 (en) 2017-12-31
CN104404050B (zh) 2018-06-08
US9206262B2 (en) 2015-12-08
US20150246976A1 (en) 2015-09-03
KR20190014576A (ko) 2019-02-12
RU2016119423A (ru) 2018-11-07
CY1117692T1 (el) 2017-05-17
IL300712A (en) 2023-04-01
MX347322B (es) 2017-04-21
CN104342455A (zh) 2015-02-11
IL223719A (en) 2016-10-31
AU2011271043B2 (en) 2015-10-01
KR20180135996A (ko) 2018-12-21
IL291301A (en) 2022-05-01
JP6073441B2 (ja) 2017-02-01
HK1183321A1 (en) 2013-12-20
DK2480675T3 (en) 2016-08-01
EP2905338B8 (en) 2018-01-24
KR20190014578A (ko) 2019-02-12
PT2480676E (pt) 2016-06-09
ME02440B (me) 2016-09-20
NZ605751A (en) 2014-10-31
IL269078A (en) 2019-11-28
US9540452B2 (en) 2017-01-10
ZA201300062B (en) 2014-09-25
KR20200143511A (ko) 2020-12-23
ES2576928T3 (es) 2016-07-12
DK3034608T3 (da) 2019-05-06
US20240327785A1 (en) 2024-10-03
US10266803B2 (en) 2019-04-23
US20180064078A1 (en) 2018-03-08
MY165287A (en) 2018-03-21
EP2480675A1 (en) 2012-08-01
KR101970944B1 (ko) 2019-04-23
IL223720A (en) 2017-05-29
SG10201504324UA (en) 2015-07-30
MY195212A (en) 2023-01-11
CA2804311A1 (en) 2011-12-29
ME02902B (me) 2018-04-20
KR102001430B1 (ko) 2019-07-18
KR20130121814A (ko) 2013-11-06
LT2568049T (lt) 2016-10-10
EP2568049A1 (en) 2013-03-13
US20140137275A1 (en) 2014-05-15
NZ605758A (en) 2014-08-29
WO2011163314A1 (en) 2011-12-29
US9850462B2 (en) 2017-12-26
JP6963542B2 (ja) 2021-11-10
JP2019033765A (ja) 2019-03-07
JP2018201527A (ja) 2018-12-27
EP2480676B1 (en) 2016-04-06
IL247386A (en) 2017-07-31
SMT201600212B (it) 2016-08-31
NZ626979A (en) 2015-05-29
IL259965B (en) 2019-02-28
EP2480675B1 (en) 2016-04-06
US20130326647A1 (en) 2013-12-05
EP3034608B1 (en) 2019-01-30
KR102266097B1 (ko) 2021-06-18
PL2568049T3 (pl) 2017-03-31
KR101991234B1 (ko) 2019-06-20
AU2011271043A9 (en) 2015-10-01
KR20210013376A (ko) 2021-02-03
BR112012033248A2 (pt) 2017-11-28
PT2905338T (pt) 2017-11-10
US20170107484A1 (en) 2017-04-20
NZ707198A (en) 2016-04-29
RU2016119423A3 (sr) 2019-11-19
IL300712B2 (en) 2024-11-01
KR102193823B1 (ko) 2020-12-22
BR112012032991A2 (pt) 2015-10-06
ME03386B (me) 2020-01-20
JP2016010415A (ja) 2016-01-21
PT3034608T (pt) 2019-05-28
SMT201600229B (sr) 2016-08-31
KR20210134424A (ko) 2021-11-09
ZA201300063B (en) 2014-09-25
US9035128B2 (en) 2015-05-19
JP2018201528A (ja) 2018-12-27
US20120070861A1 (en) 2012-03-22
JP2017006152A (ja) 2017-01-12
JP2013532974A (ja) 2013-08-22
HRP20160865T1 (hr) 2016-10-07
US9029628B2 (en) 2015-05-12
DK2905338T3 (da) 2017-11-06
NZ627119A (en) 2015-05-29
HRP20160794T1 (hr) 2016-08-12
JP2020062061A (ja) 2020-04-23
HUE036597T2 (hu) 2018-07-30
US20150246977A1 (en) 2015-09-03
MX347318B (es) 2017-04-21
US20150176002A1 (en) 2015-06-25
CN103068993A (zh) 2013-04-24
JP2013531501A (ja) 2013-08-08
IL244450A0 (en) 2016-04-21
ZA201404600B (en) 2015-09-30
SI2905338T1 (sl) 2017-12-29
US9844212B2 (en) 2017-12-19
IL244450A (en) 2017-11-30
SG186391A1 (en) 2013-01-30
RU2724736C2 (ru) 2020-06-25
US20150173332A1 (en) 2015-06-25
SI2480675T1 (sl) 2016-08-31
MY195217A (en) 2023-01-11
MX2012015300A (es) 2013-05-01
JP2021061863A (ja) 2021-04-22
EP2905338A1 (en) 2015-08-12
MX336344B (es) 2016-01-15
US9226484B2 (en) 2016-01-05
EP2568049B1 (en) 2016-04-13
ZA201404601B (en) 2016-02-24
HRP20171666T1 (hr) 2017-12-15
JP5988969B2 (ja) 2016-09-07
US20170258059A1 (en) 2017-09-14
KR101975884B1 (ko) 2019-05-10
LT3034608T (lt) 2019-05-27
US20150320023A1 (en) 2015-11-12
KR102118565B1 (ko) 2020-06-03
IL291301B1 (en) 2023-03-01
KR20200064166A (ko) 2020-06-05
SMT201600213B (it) 2016-08-31
HRP20190807T1 (hr) 2019-08-23
ES2570131T3 (es) 2016-05-17
JP2023133554A (ja) 2023-09-22
RS58736B1 (sr) 2019-06-28
CY1119478T1 (el) 2018-03-07
LT2905338T (lt) 2017-12-27
RU2601297C2 (ru) 2016-10-27
AU2011271046A1 (en) 2013-01-31
MY194456A (en) 2022-11-30
BR112012032991A8 (pt) 2020-09-29
JP6009441B2 (ja) 2016-10-19
KR20190073584A (ko) 2019-06-26
CN103068993B (zh) 2016-01-06
JP6341972B2 (ja) 2018-06-13
JP7236409B2 (ja) 2023-03-09
PT2480675T (pt) 2016-07-11
KR20230036157A (ko) 2023-03-14
IL300712B1 (en) 2024-07-01
US20160057979A1 (en) 2016-03-03
DK2568049T3 (en) 2016-08-01
KR102211911B1 (ko) 2021-02-05
ES2646052T3 (es) 2017-12-11
HRP20160497T1 (hr) 2016-07-15
US20150173331A1 (en) 2015-06-25
IL313063A (en) 2024-07-01
MY157477A (en) 2016-06-15
BR122020013427B1 (pt) 2021-08-03
EP2905338B1 (en) 2017-08-02
TR201905992T4 (tr) 2019-05-21
CN104342455B (zh) 2017-05-31
KR20210073609A (ko) 2021-06-18
KR20180135997A (ko) 2018-12-21
LT2480675T (lt) 2016-10-10
US20120073004A1 (en) 2012-03-22
WO2011163311A1 (en) 2011-12-29
KR101945352B1 (ko) 2019-02-07
BR112012032991B1 (pt) 2021-08-10
PL2480675T3 (pl) 2017-03-31
PT2568049T (pt) 2016-07-11
US9163092B2 (en) 2015-10-20
US9012717B2 (en) 2015-04-21
RS55037B1 (sr) 2016-12-30
US20150351371A1 (en) 2015-12-10
PL3034608T3 (pl) 2019-08-30
RS56589B1 (sr) 2018-02-28
SMT201900241T1 (it) 2019-05-10
KR20190142436A (ko) 2019-12-26
EP3456832A1 (en) 2019-03-20
KR20130027555A (ko) 2013-03-15
JP6545773B2 (ja) 2019-07-17
HUE029692T2 (en) 2017-03-28
IL255179B (en) 2018-06-28
HUE030285T2 (en) 2017-05-29
MX2022002117A (es) 2022-03-17
DK2480676T3 (en) 2016-06-20
US20160060359A1 (en) 2016-03-03
JP2017012204A (ja) 2017-01-19
HK1226766A1 (en) 2017-10-06
KR20190049932A (ko) 2019-05-09
CN103068994B (zh) 2016-01-20
JP6243384B2 (ja) 2017-12-06
CA2803864A1 (en) 2011-12-29
IL259965A (en) 2018-07-31
RU2013102595A (ru) 2014-07-27
US20190203171A1 (en) 2019-07-04
AU2011271043A8 (en) 2016-01-21
US20190153384A1 (en) 2019-05-23
HK1170766A1 (zh) 2013-03-08
KR102320944B1 (ko) 2021-11-04
SI3034608T1 (sl) 2019-06-28
US9334333B2 (en) 2016-05-10
EP2480676A1 (en) 2012-08-01
US9394373B2 (en) 2016-07-19
US20200239837A1 (en) 2020-07-30
US20130323790A1 (en) 2013-12-05
CA2803864C (en) 2017-05-16
SG10201504568YA (en) 2015-07-30
KR102059909B1 (ko) 2019-12-27
KR20220150430A (ko) 2022-11-10
SMT201700506T1 (it) 2018-01-11
SI2480676T1 (sl) 2016-10-28
CY1117537T1 (el) 2017-04-26
AU2011271043A1 (en) 2013-01-31
CN103068994A (zh) 2013-04-24
RU2590594C2 (ru) 2016-07-10
PL2480676T3 (pl) 2016-10-31
NZ707200A (en) 2016-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS54891B1 (sr) Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom
RS58709B1 (sr) Miševi koji čine antitela teškog lanca
HK40010621A (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain
HK1242732A1 (en) Mice with humanised lambda variable gene segments
HK1226766B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region
AU2015275242A1 (en) Hybrid light chain mice
HK1170766B (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions
AU2015275243A1 (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions
HK1168384B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain
HK1183321B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region