ES2575223T3

ES2575223T3 - Ratones que expresan una cadena ligera con las regiones variable lambda humana y constante de ratón

Info

Publication number: ES2575223T3
Application number: ES11728508.0T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; Sean Stevens; Cagan Gurer; Andrew J. Murphy; Karolina A. Hosiawa
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2011-06-22
Publication date: 2016-06-27
Anticipated expiration: 2031-06-22
Also published as: BR112012032991A2; MX2012015300A; SG186391A1; NZ707200A; ME02442B; MX336344B; MY195214A; PL2480676T3; KR20190014576A; RU2016119423A; US9334333B2; EP3034608B1; IL300712B1; RU2013102595A; IL255179B; AU2011271046B2; CY1122877T1; KR101934852B1; HK1170766A1; US10266803B2

Abstract

Un ratón que comprende un alelo de cadena ligera λ (lambda) endógeno que comprende un segmento génico variable lambda humano (hVλ) no reordenado y uno de unión lambda humano (hJλ) no reordenado, donde el ratón comprende una deleción de un primer grupo génico Vλ-Jλ-Cλ de dicho alelo de cadena ligera λ de ratón endógeno y el remplazo, en su totalidad o en parte, de los segmentos génicos Vλ-Jλ del segundo grupo génico Vλ-Jλ-Cλ de dicho alelo con dichos segmentos génicos Vλ y Jλ humanos que están unidos de forma funcional a un gen de región constante λ (Cλ) de ratón intacto de dicho segundo grupo génico Vλ-Jλ-Cλ de modo que el ratón expresa una cadena ligera derivada de un gen hVλ, un hJλ y un Cλ de ratón, donde los potenciadores endógenos Enh 2.4, potenciador 3' lambda de ratón (Enh) y Enh 3.1 se mantienen intactos en dicho alelo de cadena ligera λ.

Description

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También se describe el uso de una célula madre no humana como se describe en este documento para crear un ratón como se describe en este documento. También se describe el uso de una célula madre no humana como se describe en este documento para preparar una proteína de unión a antígeno.

También se describe un embrión de ratón, donde el embrión de ratón comprende una modificación genética como se describe en este documento. En un aspecto, se describe un embrión de ratón hospedador que comprende una célula ES donante, donde la célula ES donante comprende una modificación genética como se describe en este documento. En un aspecto, el embrión de ratón es un embrión en fase premórula. En un aspecto específico, el embrión en fase premórula es un embrión en fase de 4 células o un embrión en fase de 8 células. En otro aspecto específico, el embrión de ratón es un blastocisto.

También se describe el uso de un embrión de ratón como se describe en este documento para crear un ratón como se describe en ese documento. En un aspecto, se describe el uso de un embrión de ratón como se describe en este documento para preparar una proteína de unión a antígeno.

También se describe una célula no humana, donde la célula no humana comprende una secuencia génica de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada derivada de un ratón modificado genéticamente como se describe en este documento. En un aspecto, la célula es una célula B. En un aspecto, la célula es un hibridoma. En un aspecto, la célula codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y/o un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que está mutado somáticamente.

También se describe el uso de una célula no humana como se describe en este documento para crear un ratón como se describe en este documento. En un aspecto, se describe el uso de una célula no humana como se describe en este documento para preparar una proteína de unión a antígeno.

También se describe una célula B de ratón que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende (a) una región variable derivada de un segmento génico hVλ y un segmento génico hJλ; y, (b) un gen Cλ de ratón. En un aspecto específico, el gen Cλ es Cλ2. En un aspecto, la célula B de ratón expresa adicionalmente una cadena pesada afín que comprende (c) una región variable derivada de un segmento hVH, uno hDH, y (d) uno hJH. En un aspecto, la célula B no comprende un gen λ reordenado. En otro aspecto, la célula B no comprende un gen κ reordenado.

También se describe un método para preparar un anticuerpo en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde el ratón tiene un genoma que comprende al menos un hVλ, y al menos un hJλ en un locus de cadena ligera endógeno, donde el locus de cadena ligera endógeno comprende un gen Cλ de ratón; (b) permitir que el ratón modificado genéticamente desarrolle una respuesta inmunitaria contra el antígeno; y, (c) aislar del ratón de (b) un anticuerpo que reconoce específicamente el antígeno, o aislar del ratón de (b) una célula que comprende un dominio de inmunoglobulina que reconoce específicamente el antígeno, donde el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de un gen hVλ, uno hJλ y uno Cλ de ratón.

En un aspecto, se describe un método para preparar un anticuerpo en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde el ratón tiene un genoma que comprende al menos un hVλ en un locus de cadena ligera λ y al menos un Jλ en el locus de cadena ligera λ, donde el locus de cadena ligera λ comprende un gen Cλ de ratón intacto; (b) permitir que el ratón modificado genéticamente desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno; y, (c) aislar del ratón de (b) un anticuerpo que reconozca específicamente el antígeno, o aislar del ratón de (b) una célula que comprenda un dominio de inmunoglobulina que reconozca específicamente el antígeno, o identificar en el ratón de (b) una secuencia de ácido nucleico que codifique un dominio variable de cadena pesada y/o ligera que se una al antígeno, donde el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de un hVλ, un hJλ y un gen Cλ de ratón.

El gen constante de cadena ligera λ es un gen Cλ de ratón intacto. En un aspecto específico, el gen Cλ de ratón intacto se selecciona entre Cλ1, Cλ2 y Cλ3. En un aspecto más específico, el gen Cλ de ratón es Cλ2.

También se describe un método para preparar un gen de anticuerpo reordenado en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde la modificación genética comprende un hVλ y un hJλ en un locus de cadena ligera endógeno, donde el locus de cadena ligera endógeno comprende un gen Cλ de ratón intacto; y, (b) identificar un gen de inmunoglobulina reordenado en dicho ratón, donde el gen de inmunoglobulina reordenado comprende un segmento génico de región variable de cadena ligera λ y un gen Cλ o fragmento funcional del mismo.

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En un aspecto, el método comprende adicionalmente clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y/o ligera del ratón, donde la región variable de cadena pesada y/o ligera es de un anticuerpo que comprende un Vλ humano y un Cλ de ratón.

En un aspecto, se describe un método para preparar un gen de anticuerpo reordenado en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde la modificación genética comprende un hVλ y un hJλ, en un locus de cadena ligera λ de ratón, donde el locus de cadena ligera λ comprende un gen Cλ de ratón intacto; y, (b) identificar un gen de inmunoglobulina reordenado en dicho ratón, donde el gen de inmunoglobulina reordenado comprende un segmento génico de región variable de cadena ligera λ y un gen Cλ.

El gen constante de cadena ligera λ es un gen Cλ de ratón intacto.

También se describe un método para preparar un anticuerpo, que comprende exponer un ratón como se describe en este documento a un antígeno, permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria que comprende crear un anticuerpo que se una específicamente al antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico reordenada en el ratón que codifique la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico en el ratón que codifique una secuencia del dominio variable de cadena ligera afín de un anticuerpo, donde el anticuerpo se une específicamente al antígeno, y emplear las secuencias de ácido nucleico de los dominios variables de cadena pesada y ligera fusionados a dominios constantes humanos para crear un anticuerpo deseado, donde el anticuerpo deseado comprende una cadena ligera que comprende un dominio Vλ fusionado a un dominio CL. El dominio Vλ es humano y el dominio CL es un dominio Cλ de ratón.

En un aspecto, se describe un método para preparar un anticuerpo, que comprende exponer un ratón como se describe en ese documento a un antígeno, permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria que comprende crear un anticuerpo que se une específicamente al antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico reordenada en el ratón que codifique un dominio variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico reordenada que codifique una secuencia de dominio variable de cadena ligera afín de un anticuerpo, donde el anticuerpo se une específicamente al antígeno, y emplear las secuencias de ácido nucleico fusionadas a secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio constante de cadena pesada humana y un dominio constante de cadena ligera humana para crear un anticuerpo derivado de secuencias humanas, donde el anticuerpo que se une específicamente al antígeno comprende una cadena ligera que comprende un dominio Vλ humano fusionado a una región Cλ de ratón.

En un aspecto, la región Cλ de ratón se selecciona entre Cλ1, Cλ2 y Cλ3. En un aspecto específico, la región Cλ de ratón es Cλ2.

En un aspecto, se describe un método para preparar una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de anticuerpo reordenada, que comprende (a) exponer un ratón como se describe en este documento a un antígeno;

(b): permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria; (c) identificar una célula en el ratón que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique una secuencia del dominio Vλ humano reordenado fusionada con un dominio Cλ de ratón, donde la célula también codifica una cadena pesada afín que comprende un dominio VH humano y un dominio CH de ratón, y donde la célula expresa un anticuerpo que se une al antígeno; (d) clonar a partir de la célula una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio Vλ humano y una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH humano afín; y, (e) usar la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio Vλ humano y la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VH humano afín para crear un anticuerpo completamente humano.

(b): permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria al antígeno; (c) identificar una célula en el ratón que comprenda ADN que codifique una secuencia del dominio Vλ humano reordenado fusionada a un dominio Cλ de ratón, donde la célula también codifica una cadena pesada afín que comprende un dominio VH humano y un dominio CH de ratón, y donde la célula expresa un anticuerpo que se une al antígeno; (d) clonar a partir de la célula una secuencia de ácido nucleico que codifique el dominio Vλ humano reordenado y una secuencia de ácido nucleico que codifique el dominio VH humano afín; y, (e) usar la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio Vλ humano y la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VH humano afín para crear un anticuerpo completamente humano. En un aspecto, el dominio Cλ de ratón es Cλ2 de ratón.

También se describe un ratón modificado genéticamente que expresa una cadena ligera derivada de λ humana fusionada a una región constante de cadena ligera endógena (Cλ), donde el ratón, tras inmunización con el antígeno, crea un anticuerpo que comprende un dominio Vλ humano fusionado a un dominio Cλ de ratón. En un

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son completamente humanas. Las regiones V se expresan con regiones constantes de ratón. En diversos aspectos, no hay segmentos génicos de inmunoglobulina de ratón endógenos presentes y las regiones V se expresan con las regiones constantes humanas. Estos anticuerpos demostrarían ser útiles en numerosas aplicaciones, tanto de diagnóstico así como terapéuticas.

Pueden lograrse muchas ventajas para diversos aspectos de expresión de proteínas de unión derivadas de segmentos génicos Vλ y Jλ humanos en ratones. Las ventajas pueden lograrse colocando secuencias λ humanas en el locus de cadena ligera λ endógeno. Los anticuerpos creados a partir de dichos ratones pueden tener cadenas ligeras que comprenden dominios Vλ humanos fusionados a una región Cλ de ratón. Los ratones también expresarán dominios Vλ humanos que son adecuados para la identificación y clonación para su uso con regiones CL humanas, específicamente regiones Cκ y/o Cλ. Como el desarrollo de células B en dichos ratones por lo demás es normal, es posible generar dominios Vλ compatibles (incluyendo dominios Vλ mutados somáticamente) en el contexto de regiones Cλ o Cκ.

Se describen ratones modificados genéticamente que comprenden un segmento génico Vλ humano no reordenado y un Jλ humano no reordenado en un locus de cadena ligera λ de inmunoglobulina endógeno. Se describen ratones que expresan anticuerpos que comprenden una cadena ligera que tiene un dominio Vλ humano fusionado a una región Cλ.

Enfoques para modificar por ingeniería ratones que expresen dominios Vλ humanos

Se describen diversos enfoques para generar ratones modificados genéticamente que creen anticuerpos que contengan una cadena ligera que tenga un dominio Vλ humano fusionado a una región Cλ endógena. Se describen modificaciones genéticas que, en diversos aspectos, comprenden una deleción de uno o ambos loci de cadena ligera endógenos. Por ejemplo, para eliminar cadenas ligeras λ de ratón del repertorio endógeno de anticuerpos puede hacerse una deleción de un primer grupo génico Vλ-Jλ-Cλ y remplazo, en su totalidad o en parte, de los segmentos génicos Vλ-Jλ de un segundo grupo génico con segmentos génicos Vλ-Jλ humanos, como se indica en las reivindicaciones. También se describen embriones de ratón modificados genéticamente, células, y construcciones de direccionamiento para generar los ratones, embriones de ratón, y células.

La deleción de un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ endógeno y el remplazo de los segmentos génicos Vλ-Jλ de otro grupo génico Vλ-Jλ-Cλ endógeno emplea una alteración relativamente mínima en la asociación y función de la región constante de anticuerpo natural en el animal, en diversos aspectos, porque los genes Cλ endógenos se dejan intactos y por lo tanto retienen funcionalidad y capacidad normales de asociarse con la región constante de una cadena pesada endógena. Por tanto, en dichos aspectos, la modificación no afecta a otras regiones constantes de cadena pesada endógenas dependientes de las regiones constantes de cadena ligera funcionales para el ensamblaje de una molécula de anticuerpo funcional que contenga dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Además, en diversos aspectos, la modificación no afecta al ensamblaje de una molécula de anticuerpo unida a membrana funcional que implica una cadena pesada endógena y una cadena ligera, por ejemplo, un dominio hVλ unido a una región Cλ de ratón. Como al menos un gen Cλ funcional se retiene en el locus endógeno, los animales que contienen un remplazo de los segmentos génicos Vλ-Jλ de un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ endógeno con segmentos génicos Vλ-Jλ humanos deben ser capaces de crear cadenas ligeras λ normales que sean capaces de unirse al antígeno durante una respuesta inmunitaria a través de los segmentos génicos Vλ-Jλ humanos presentes en el repertorio expresado de anticuerpos del animal.

Se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ de ratón endógeno delecionado en la FIG. 2. Como se ilustra, el locus de cadena ligera λ de ratón está organizado en dos grupos génicos, ambos cuales contienen segmentos génicos funcionales capaces de recombinarse para formar una cadena ligera λ funcional de ratón. El grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno se deleciona mediante una construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 1) con un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación. El otro grupo génico endógeno (Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4) se deleciona en parte mediante una construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 2) con un casete de higromicina-timidina quinasa flanqueado por sitios de recombinación. En este segundo evento de direccionamiento, se retienen los segmentos génicos endógenos Cλ2-Jλ4-Cλ4. La segunda construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 2) se construye usando sitios de recombinación que son diferentes a los de la primera construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 1) permitiendo de ese modo la deleción selectiva del casete de selección después de que se haya conseguido un direccionamiento satisfactorio. El locus doblemente abordado resultante se silencia funcionalmente porque no puede producir cadena ligera λ endógena. Este locus modificado puede usarse para la inserción de segmentos génicos Vλ y Jλ humanos para crear un locus λ de ratón endógeno que comprenda segmentos génicos Vλ y Jλ humanos, mediante lo cual, tras la recombinación en el locus modificado, el animal produce cadenas ligeras λ que comprenden segmentos génicos Vλ y Jλ humanos reordenados unidos a un segmento génico Cλ de ratón endógeno.

Modificar genéticamente un ratón para hacer que los segmentos génicos λ endógenos sean no funcionales, en diversos aspectos, produce un ratón que muestra exclusivamente cadenas ligeras κ en su repertorio de anticuerpos, haciendo que el ratón sea útil para evaluar el papel de las cadenas ligeras λ en la respuesta inmunitaria, y útil para

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generar un repertorio de anticuerpos que comprenda dominios Vκ pero no dominios Vλ.

Un ratón modificado genéticamente que expresa un hVλ unido a un gen Cλ de ratón que se ha recombinado en el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno puede generarse por cualquier método conocido en la técnica. Se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) del remplazo de los segmentos génicos Vλ2-Vλ3-Jλ2 de ratón endógenos con segmentos génicos Vλ y Jλ humanos en la FIG. 4A. Como se ilustra, se remplaza un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que se ha vuelto no funcional por una construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 12/1-λ) que incluye un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación. Los segmentos génicos Vλ2-Vλ3-Jλ2 se remplazan con un fragmento genómico que contiene la secuencia λ humana que incluye doce segmentos génicos hVλ y un único segmento génico hJλ.

Por tanto, este primer enfoque sitúa uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de cadena ligera λ endógeno contiguo con un segmento génico hJλ único (FIG. 4A).

Pueden conseguirse modificaciones adicionales en el locus de cadena ligera λ endógeno modificado usando técnicas similares para insertar más segmentos génicos hVλ. Por ejemplo, se proporcionan ilustraciones esquemáticas de dos construcciones de direccionamiento adicionales (vectores de direccionamiento +16-λ y +12-λ) usadas para la inserción progresiva de segmentos génicos hVλ humanos adicionales en la FIG. 5A. Como se ilustra, se insertan fragmentos genómicos adicionales que contienen segmentos génicos hVλ humanos específicos en el locus de cadena ligera λ endógeno modificado en etapas sucesivas usando homología proporcionada por la inserción previa de secuencias de cadena ligera λ humanas. Tras la recombinación con cada construcción de direccionamiento ilustrada, de modo secuencial, se insertan 28 segmentos génicos hVλ adicionales en el locus de cadena ligera λ endógeno modificado. Esto crea un locus quimérico que produce una proteína de cadena ligera λ que comprende segmentos génicos Vλ-Jλ humanos unidos a un gen Cλ de ratón.

Los enfoques anteriores para insertar segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus λ de ratón, mantienen los potenciadores posicionados cadena abajo de los segmentos génicos Cλ2-Jλ4-Cλ4 (denominados Enh 2.4, Enh y Enh 3.1, FIG. 4A y FIG. 5A). Este enfoque produce un único alelo modificado en el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno (FIG. 7A).

También se describen composiciones y métodos para generar un ratón que exprese una cadena ligera que comprenda segmentos génicos hVλ y Jλ unidos de forma funcional a un segmento génico Cλ de ratón, incluyendo composiciones y métodos para generar un ratón que expresa dichos genes a partir de un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno. Los métodos incluyen volver no funcional, de forma selectiva, un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ de ratón endógeno (por ejemplo, mediante deleción dirigida), y emplear segmentos génicos hVλ y Jλ en el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno para expresar un dominio hVλ en un ratón.

También se describe un segundo enfoque donde pueden posicionarse segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus de cadena ligera κ endógeno. La modificación genética, en diversos aspectos, comprende una deleción del locus de cadena ligera κ endógeno. Por ejemplo, para eliminar cadenas ligeras κ de ratón del repertorio endógeno de anticuerpos, puede hacerse una deleción de los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón. También se describen embriones de ratón modificados genéticamente, células, y construcciones de direccionamiento para generar los ratones, embriones de ratón, y células.

Por las razones indicadas anteriormente, la deleción de los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón emplea una alteración relativamente mínima. Se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón delecionados en la FIG. 3. Los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón endógenos se delecionan mediante deleción mediada por recombinasa de secuencias de ratón posicionadas entre dos vectores de direccionamiento posicionados de forma precisa que emplean cada uno sitios de recombinación específicos de sitio. Se emplea un primer vector de direccionamiento (vector de direccionamiento Jκ) en un primer evento de direccionamiento para delecionar los segmentos génicos Jκ de ratón. Se emplea un segundo vector de direccionamiento (vector de direccionamiento Vκ) en un segundo evento de direccionamiento secuencial para delecionar una secuencia localizada 5' del segmento génico Vκ de ratón más distal. Ambos vectores de direccionamiento contienen sitios de recombinación específicos de sitio permitiendo de ese modo la deleción selectiva de ambos casetes de selección y todas las secuencias intermedias de cadena ligera κ de ratón después de haber conseguido un direccionamiento satisfactorio. El locus delecionado resultante se silencia funcionalmente porque no puede producir cadena ligera κ endógena. Este locus modificado puede usarse para la inserción de segmentos génicos hVλ y Jλ para crear un locus κ de ratón endógeno que comprenda segmentos génicos hVλ y Jλ, por lo cual, tras la recombinación en el locus modificado, el animal produce cadenas ligeras λ que comprenden segmentos génicos hVλ y Jλ reordenados unidos de forma funcional a un segmento génico Cκ de ratón endógeno. Pueden usarse diversos vectores de direccionamiento que comprenden secuencias de cadena ligera λ humana junto con este locus κ de ratón delecionado para crear un locus de cadena ligera híbrido que contenga segmentos génicos λ humanos unidos de forma funcional con una región Cκ de ratón.

Por tanto, un segundo enfoque posiciona uno o más segmentos génicos Vλ humanos en el locus de cadena ligera κ de ratón contiguo con un segmento génico Jλ humano único (vector de direccionamiento 12/1-κ, FIG. 4B).

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Pueden hacerse modificaciones a este enfoque y añadir segmentos génicos y/o secuencias reguladoras para optimizar el uso de las secuencias de cadena ligera λ humanas desde el locus κ de ratón dentro del repertorio de anticuerpos de ratón.

También se describe un tercer enfoque donde, se posicionan uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de cadena ligera κ de ratón contiguos con cuatro secuencias génicas hJλ (vector de direccionamiento 12/4-κ, FIG. 4B).

En un tercer enfoque, se posicionan uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de cadena ligera κ de ratón contiguo con una secuencia intergénica κ humana y una única secuencia génica hJλ (vector de direccionamiento 12(κ)1-κ, FIG. 4B).

También se describe un cuarto enfoque, donde se posicionan uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de cadena ligera κ de ratón contiguo con una secuencia intergénica κ humana y cuatro secuencias génicas hJλ (vector de direccionamiento 12(κ)4-κ, FIG. 4B).

Todos los enfoques anteriores para insertar segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus κ de ratón, mantienen el elemento potenciador intrónico κ cadena arriba del gen Cκ (denominado Eκi, FIG. 4B y FIG. 5B) y el potenciador κ 3' cadena abajo del gen Cκ (denominado Eκ3', FIG. 4B y FIG. 5B). Los enfoques producen cuatro alelos modificados diferentes en el locus de cadena ligera κ de ratón endógeno (FIG. 7B).

Anticuerpos de dominio lambda a partir de ratones modificados genéticamente

Ratones que comprenden secuencias λ humanas en el locus de cadena ligera λ de ratón expresada en una cadena ligera que comprende una región hVλ fusionada a una región Cλ de ratón. Estos se cruzan ventajosamente con ratones que (a) comprenden un locus de cadena ligera funcionalmente silenciado (por ejemplo, una eliminación del locus de cadena ligera κ o λ de ratón endógeno); (b) comprenden un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que comprende segmentos génicos hV y hJ unidos de forma funcional a un gen Cλ de ratón endógeno como se indica en las reivindicaciones; (c) comprenden un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno que comprende segmentos génicos hVκ y hJκ unidos de forma funcional a un gen Cκ de ratón endógeno; y, (d) un ratón en que un alelo κ comprende hVκ y hJκ; comprendiendo el otro alelo κ hVλ y hJλ; comprendiendo un alelo λ hVλ y hJλ y un alelo λ silenciado o eliminado, o comprendiendo ambos alelos λ hVλ y hJλ; y, dos alelos de cadena pesada que comprenden cada uno hVH, hDH, y hJH.

Los anticuerpos que comprenden los dominios hVλ expresados en el contexto de Cλ se usan para generar anticuerpos completamente humanos por clonación de los ácidos nucleicos que codifican los dominios hVλ en construcciones de expresión que albergan genes que codifican Cλ humano. Las construcciones de expresión resultantes se transfectan en células hospedadoras adecuadas para expresar anticuerpo que presentas un dominio hVλ completo fusionado a hCλ.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir el modo en que preparar y usar métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Salvo que se indique de otro modo, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es en o cerca de la atmosférica.

Ejemplo I

Deleción de los loci de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón

Se prepararon diversas construcciones de direccionamiento usando tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) para modificar bibliotecas de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) genómico de ratón para inactivar los loci de cadena ligera κ y λ de ratón.

Deleción del locus de cadena ligera λ de ratón. Se modificó ADN del clon BAC de ratón RP23-135k15 (Invitrogen) por recombinación homóloga para inactivar el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno a través de deleción dirigida de los grupos génicos Vλ-Jλ-Cλ (Fig. 2)

En resumen, se delecionó el grupo proximal completo que comprende los segmentos génicos Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 en un único evento de direccionamiento usando un vector de direccionamiento que comprende un casete de neomicina flanqueado por sitios loxP con un brazo de homología de ratón 5' que contenía la secuencia 5' del segmento génico Vλ1 y un brazo de homología de ratón 3' que contenía la secuencia 3' del segmento génico Cλ1 (Fig. 2, vector de direccionamiento 1).

Se preparó una segunda construcción de direccionamiento para delecionar de forma precisa el grupo génico λ de ratón endógeno distal que contenía Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 excepto que la construcción de direccionamiento contenía

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un brazo de homología de ratón 5' que contenía la secuencia 5' del segmento génico Vλ2 y un brazo de homología de ratón 3' que contenía la secuencia 5' al segmento génico Cλ2 endógeno (Fig. 2, vector de direccionamiento 2). Por tanto, la segunda construcción de direccionamiento delecionaba de forma precisa Vλ2-Jλ2, dejando al mismo tiempo Cλ2-Jλ4-Cλ4 intacto en el locus λ de ratón endógeno. Se confirmaron células ES que contenían un locus λ endógeno inactivado (como se ha descrito anteriormente) por métodos de cariotipado y exploración (por ejemplo, TAQMAN®) conocidos en la técnica. Después se aisló el ADN de las células ES modificadas y se sometió a tratamiento con recombinasa CRE mediando de ese modo la deleción del casete de direccionamiento proximal que contenía el gen marcador de neomicina, dejando solamente un único sitio loxP en el punto de deleción (Fig. 2, parte inferior).

Deleción del locus de cadena ligera κ de ratón. Se prepararon varias construcciones de direccionamiento usando métodos similares descritos anteriormente para modificar el ADN de clones BAC de ratón RP23-302g12 y RP23254m04 (Invitrogen) por recombinación homóloga para inactivar el locus de cadena ligera κ de ratón en un proceso de dos etapas (Fig. 3)

En resumen, se delecionaron los segmentos génicos Jκ (1-5) del locus de cadena ligera κ de ratón endógeno en un único evento de direccionamiento usando un vector de direccionamiento que comprendía un casete de higromicinatimidina quinasa (hyg-TK) que contenía un único sitio loxP 3' al casete hyg-TK (Fig. 3, vector de direccionamiento de Jκ). Los brazos de homología usados para preparar este vector de direccionamiento contenían la secuencia genómica de ratón 5' y 3' de los segmentos génicos Jκ de ratón endógenos. En un segundo evento de direccionamiento, se preparó un segundo vector de direccionamiento para delecionar una parte de la secuencia genómica de ratón cadena arriba (5') al segmento génico Vκ de ratón endógeno más distal (Fig. 3, vector de direccionamiento de Vκ). Este vector de direccionamiento contenía un sitio lox511 invertido, un sitio loxP y un casete de neomicina. Los brazos de homología usados para preparar este vector de direccionamiento, contenían la secuencia genómica de ratón cadena arriba del segmento génico Vκ de ratón más distal. Los vectores de direccionamiento e usaron de un modo secuencial (es decir, Jκ después Vκ) para direccionar el ADN en células ES. Se confirmaron ES que albergaban un cromosoma doblemente abordado (es decir, un único locus κ de ratón endógeno abordado con ambos vectores de direccionamiento) por métodos de cariotipado y exploración (por ejemplo, Taqman™) conocidos en la técnica. Después se aisló el ADN de las células ES modificadas y se sometió a tratamiento con recombinasa Cre mediando de ese modo la deleción de los segmentos génicos Vκ de ratón endógenos y ambos casetes de selección, dejando al mismo tiempo dos sitios lox yuxtapuestos en orientación opuesta uno con relación al otro (Fig. 3, parte inferior; SEQ ID NO: 1).

Por tanto, se crearon dos loci de cadena ligera endógenos modificados (κ y λ) que contenían regiones potenciadoras y constantes intactas para insertar de forma progresiva segmentos génicos de la línea germinal λ humana no reordenados de un modo preciso usando los vectores de direccionamiento descritos a continuación.

Ejemplo II

Remplazo de loci de cadena ligera de ratón con un minilocus de cadena ligera λ humana

Se diseñaron por ingeniería múltiples vectores de direccionamiento para la inserción progresiva de segmentos génicos λ humanos en los loci de cadena ligera κ y λ de ratón endógenos usando métodos similares a los descritos anteriormente. Se hicieron múltiples modificaciones iniciales independientes a los loci de cadena ligera, endógenos produciendo cada uno un locus de cadena ligera quimérico que contenía segmentos génicos hVλ y Jλ unidos de forma funcional a genes constantes de cadena ligera de ratón y potenciadores.

Un minilocus λ humano que contiene 12 segmentos génicos Vλ humanos y uno Jλ humano. Se diseñó una serie de vectores de direccionamiento iniciales para que contuvieran los primeros 12 segmentos génicos Vλ humanos consecutivos del grupo A y un segmento génico hJλ1 o cuatro segmentos génicos hJλ usando un clon BAC humano llamado RP11-729g4 (Invitrogen). Las Fig. 4A y 4B muestran los vectores de direccionamiento que se construyeron para hacer una inserción inicial de los segmentos génicos de cadena ligera λ humana en los loci de cadena ligera λ y κ de ratón respectivamente.

Para un primer conjunto de vectores de direccionamiento iniciales, se diseñó un fragmento de ADN de 124.125 pb a partir del clon BAC 729g4 que contenía 12 segmentos génicos hVλ y un segmento génico hJλ1 para que contuviera un sitio PI-SceI 996 pb cadena abajo (3') del segmento génico hJλ 1 para el ligamiento de un brazo de homología de ratón 3'. Se usaron dos conjuntos diferentes de brazos de homología para el ligamiento a este fragmento humano; un conjunto de brazos de homología contenía secuencias λ de ratón endógenas del clon BAC 135k15 (Fig. 4A) y otro conjunto contenía la secuencia κ endógena 5' y 3' de los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón de los clones BAC de ratón RP23-302g12 y RP23-254m04, respectivamente (Fig. 4B).

Para el vector de direccionamiento 12/1-λ (Fig. 4A), se diseñó un sitio PI-SceI en el extremo 5' de un fragmento de ADN de 27.847 pb que contenía el Cλ2-Jλ5-Cλ4 de ratón y el potenciador 2.4 del locus λ de ratón modificado descrito en el Ejemplo 1. El fragmento de ratón de ~28 kb se usó como brazo de homología 3' por ligamiento al fragmento λ humano de ~124 kb, que creó una unión 3' que contenía, de 5' a 3', un segmento génico hJλ1, 996 pb

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Tabla 2

Modificación: Ensayo Conjunto de cebado directo/inverso Sonda Localización de secuencia

Inserción de 12 hVλ y hJλ 1: GOA hL2F/hL2R hL2P hVλ3-12-hVλ3-1

hL3F/hL3R: hL3P

61hJ1F/61hJ1R: 61hJ1P secuencia hJλ

NeoF/NeoR: NeoP Casete de neomicina

LOA: MK20F/MKP4R - Secuencia lox511/loxP de locus κ inactivado

HygF/HygR: HygP Casete de higromicina de locus λ inactivado

mL1F/mL1R: mL1P Grupo Vλ1-Cλ1 de ratón

mL2F/mL2R: mL2P

mL11 F/mL11 R: mL11P Grupo Vλ2-Cλ2 de ratón

mL12F/mL12R: mL12P

AR/LOA: MKD2F/MKD2R MKD2P Secuencia de ratón en el locus Vκ 5’

MKP15F/MKP15R: MKP15P Secuencia de ratón en el locus Vκ 3’

Inserción de 16 hVλ: GOA 67hT1 F/67hT1 R 67hT1P hVλ3-27 -hVλ3-12

67hT3F/67hT3R: 67hT3P

HygF/HygR: HygP Casete de higromicina

LOA: NeoF/NeoR NeoP Casete de neomicina

mL1 F/mL1 R: mL1P Grupo Vλ1-Cλ1 de ratón

mL2F/mL2R: mL2P

mL11F/mL11R: mL11P Grupo Vλ2-Cλ2 de ratón

mL12F/mL12R: mL12P

AR: hL2F/hL2R hL2P hVλ3-12-hVλ3-1

hL3F/hL3R: hL3P

AR/LOA: MKD2F/MKD2R MKD2P Secuencia de ratón en el locus Vκ 5’

MKP15F/MKP15R: MKP15P Secuencia de ratón en el locus Vκ 3’

Inserción de 12 hVλ: GOA 68h2F/68h2R 68h2P hVλ5-52-hVλ1-40

68h5F/68h5R: 68h5P

NeoF/NeoR: NeoP Casete de neomicina

LOA: HygF/HygR HygP Casete de higromicina

mL1F/mL1R: mL1P Grupo Vλ1-Cλ1 de ratón

mL2F/mL2R: mL2P

mL11F/mL11R: mL11P Grupo Vλ2-Cλ2 de ratón

mL12F/mL12R: mL12P

AR: hL2F/hL2R hL2P hVλ3-12-hVλ3-1

hL3F/hL3R: hL3P

67hT1F/67hT1R: 67hT1P hVλ3-27-hVλ3-12

67hT3F/67hT3R: 67hT3P

AR/LOA: MKD2F/MKD2R MKD2P Secuencia de ratón en el locus Vκ 5’

MKP15F/MKP15R: MKP15P Secuencia de ratón en el locus Vκ 3’

Ejemplo V

5

Generación de ratones que expresan cadenas ligeras λ humanas a partir de un locus de cadena ligera endógeno

Se usaron células ES abordadas descritas anteriormente como células ES donantes y se introdujeron en un embrión 10 de ratón en fase de 8-células por el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º

7.294.754 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor genetargeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (ratones F0 obtenidos completamente de la célula Es donante) que albergaban independientemente segmentos génicos λ humanos se identificaron por genotipado usando una modificación del ensayo de alelo (Valenzuela et al., supra) que

15 detectaba la presencia de los segmentos génicos λ humanos únicos (supra).

Uso de cadena ligera κ:λ de ratones que albergan segmentos génicos de cadena ligera λ humana. Se analizaron ratones homocigóticos para cada una de las tres inserciones sucesivas de segmentos génicos hVλ con un único segmento génico hJλ (FIG. 5B) y ratones homocigóticos para una primera inserción de segmentos génicos

20 hVλ con un único segmento génico hJλ o cuatro segmentos génicos Jλ humanos que incluyen una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (FIG. 4B) para la expresión de la cadena ligera κ y λ en esplenocitos usando citometría de flujo.

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Claims

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