ES2646052T3

ES2646052T3 - Ratones transgénicos con un locus endógeno de inmunoglobulina lambda modificado

Info

Publication number: ES2646052T3
Application number: ES14198318.9T
Authority: ES
Inventors: Andrew J. Murphy; Sean Stevens; Cagan Gurer; Lynn Macdonald; Karolina A. Hosiawa
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2011-06-22
Publication date: 2017-12-11
Anticipated expiration: 2031-06-22
Also published as: CY1122877T1; MY195214A; US9006511B2; SI2568049T1; PL2905338T3; HUE044001T2; EP3205726A1; IL282872A; ZA201506598B; ME02444B; KR101934852B1; CN104404050A; IL291301B2; US9150662B2; SG186390A1; JP2018023403A; IL269078B; IL282872B; JP2020128440A; US9066502B2

Abstract

Un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ 1-Jλ 3-Cλ 3-Jλ 1-Cλ 1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ 2 a Jλ 2 del grupo génico Vλ 2-Vλ 3-Jλ 2-Cλ 2-Jλ 4-Cλ 4 de ratón endógeno, en el que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno comprende los segmentos génicos Cλ 2, Jλ 4 y Cλ 4 endógenos.

Description

Ratones transgénicos con un locus endógeno de inmunoglobulina lambda modificado

5 Campo

La invención se refiere a ratones genéticamente modificados, así como a células aisladas de, o que se pueden obtener de, los ratones y a embriones de ratón.

Antecedentes

Los ratones que expresan anticuerpos que son completamente humanos, o parcialmente humanos y parcialmente de ratón, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se ha informado de ratones transgénicos que expresan anticuerpos completamente humanos a partir de transgenes que contienen genes de la región variable de

15 inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana. Los ratones modificados genéticamente que comprenden un remplazo de los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de ratón endógenos (HCVR) y segmentos génicos de la región variable de cadena ligera kappa (κ) (LCVR) con segmentos génicos HCVR y LCVR humanos y que componen anticuerpos quiméricos con una cadena kappa quimérica humana/de ratón también son conocidos.

Las cadenas ligeras de anticuerpo están codificadas por uno de dos loci separados: kappa (κ) y lambda (λ). Las cadenas ligeras de anticuerpo de ratón son principalmente del tipo κ. La relación de uso de cadena ligera κ a λ en

seres humanos es de aproximadamente 60:40, mientras que en ratones es de aproximadamente 95:5. El uso sesgado de cadenas ligeras κ en ratones está supuestamente sostenido en ratones modificados genéticamente

25 capaces de expresar anticuerpos completa o parcialmente humanos. Por tanto, los ratones que expresan anticuerpos completa o parcialmente humanos parecen estar restringidos en el uso de regiones variables lambda.

Existe una necesidad en la técnica de generar regiones variables lambda, sean de ratón o humanas, para su uso en la preparación de proteínas de unión a epítopo. Existe una necesidad en la técnica de ratones que expresen anticuerpos completa o parcialmente humanos, donde los ratones presenten un uso aumentado de región variable λ (Vλ).

Existe una necesidad de la técnica de ratones que expresen anticuerpos completa o parcialmente humanos, donde los ratones presenten un uso aumentado de región variable lambda (Vλ). El documento WO 2010/039900 se refiere

35 a células no humanas y mamíferos genosustituídos que tienen un genoma que codifica cadenas de IgG y anticuerpos quiméricos, y a métodos para producir tales células y mamíferos genosustituídos. Se describen ratones transgénicos genosustituídos que portan ya sea el reemplazo del grupo proximal completo de ratón que comprende los segmentos génicos Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 con un primer BAC (sigla del inglés bacterial artificial chromosome, cromosoma artificial bacteriano) que comprende los segmentos génicos Vλ y Jλ humanos, mientras que el grupo λ de ratón endógeno distal que comprende Vλ2-Vx-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4-3’LCR permanece intacto, o el reemplazo del grupo proximal completo de ratón que comprende los segmentos génicos Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ3 con un primer BAC que comprende los segmentos génicos Vλ-Jλ humanos y el reemplazo del grupo distal de ratón entero que comprende los segmento génicos Vλ2-Vx-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4-3’LCR con un segundo BAC solapante que comprende adicionalmente una Ig λ humana, un segmento génico constante.

Sumario

La invención en su sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones independientes. Se describen ratones modificados genéticamente, embriones, células, tejidos, así como construcciones de ácido nucleico para modificar ratones, y métodos y composiciones para prepararlos y usarlos. Se describen ratones y células que generan regiones variables λ humanas en el contexto de una cadena ligera λ, a partir de un locus de cadena ligera de ratón endógeno. También se describen métodos para preparar anticuerpos que comprenden regiones variables lambda. También se describen métodos para seleccionar cadenas pesadas que se expresan con regiones variables lambda afines.

55 Se describen proteínas de unión a antígeno quiméricas y humanas (por ejemplo, anticuerpos), y ácidos nucleicos que las codifican, que comprenden regiones variables mutadas somáticamente, incluyendo anticuerpos que tienen cadenas ligeras que comprenden un dominio variable derivado de un segmento génico Vλ humano y uno Jλ humano fusionados a un dominio constante de cadena ligera lambda de ratón.

La presente invención proporciona un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ2 a Jλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4Cλ4 de ratón endógeno, donde el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno comprende los segmentos

65 génicos Cλ2, Jλ4 y Cλ4 endógenos.

La invención proporciona adicionalmente:

una célula de ratón que comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una 5 región que abarca de Vλ2 aJλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón endógeno, donde el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno conserva los segmentos génicos Cλ2, Jλ4 yCλ4 endógenos;

una célula aislada de, o que se puede obtener de, el ratón de la invención, donde la célula de ratón comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ2 aJλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón endógeno, donde el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno conserva los segmentos génicos Cλ2, Jλ4 y Cλ4 endógenos; y

un embrión de ratón que comprende, está creado a partir de, o se puede obtener de, una célula ES (sigla del

15 inglés embryonic stem, madre embrionaria) de ratón de la invención, donde el embrión de ratón comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ2 aJλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón endógeno, donde el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno conserva los genes Cλ2, Jλ4 y Cλ4 endógenos.

Se describen anticuerpos que comprenden (a) un domino variable de cadena pesada humana (hVH) fusionado a una región constante de cadena pesada de ratón, y (b) un Vλ humano fusionado a un dominio CL de ratón; donde uno o más de los dominios variables se mutan somáticamente, por ejemplo, durante selección de anticuerpos o células inmunitarias en un ratón de la invención. El hVλ no reordenado y hJλ no reordenado están unidos de forma funcional

25 a una región constante λ (Cλ) de ratón intacta.

También se describe un ratón que comprende en su línea germinal, en un locus de cadena ligera de ratón

endógeno, una secuencia de región variable de cadena ligera λ humana, donde la secuencia de región variable

lambda humana se expresa en una cadena ligera que comprende una secuencia génica de región constante lambda de inmunoglobulina de ratón.

El locus de cadena ligera de ratón endógeno es un locus λ.

El ratón carece de una secuencia variable de cadena ligera endógena en el locus de cadena ligera de ratón 35 endógeno.

En un aspecto, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera de ratón endógenos se remplazan con uno o más segmentos génicos de región variable λ humana.

La secuencia de región variable de cadena ligera λ humana comprende una secuencia Jλ humana. En un aspecto, la secuencia Jλ humana se selecciona del grupo que consiste en Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la secuencia de región variable de cadena ligera λ humana comprende un fragmento del grupo A del locus de cadena ligera humana. En un aspecto específico, el fragmento del grupo A del locus de cadena ligera λ

45 humana se extiende desde hVλ3-27 hasta hVλ3-1.

En un aspecto, la secuencia de región variable de cadena ligera λ humana comprende un fragmento del grupo B del locus de cadena ligera humana. En un aspecto específico, el fragmento del grupo B del locus de cadena ligera λ humana se extiendo desde hVλ5-52 hasta hVλ1-40.

En un aspecto, la secuencia de región variable de cadena ligera λ humana comprende un fragmento genómico del grupo A y un fragmento genómico del grupo B. En un aspecto, la secuencia de región variable de cadena ligera λ

humana comprende al menos un segmento génico del grupo A y al menos un segmento génico del grupo B.

55 En un aspecto, más del 10 % del repertorio virgen de cadena ligera del ratón se obtiene de al menos dos segmentos génicos hVλ seleccionados de 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, y 9-49. En un aspecto, más del 20 % del repertorio virgen de cadena ligera del ratón se obtiene de al menos tres segmentos génicos hVλ seleccionados de 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, y 9-49. En un aspecto, más del 30 % del repertorio virgen de cadena ligera del ratón se obtiene de al menos cuatro segmentos génicos hVλ seleccionados de 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, y 9-49.

También se describe un ratón modificado genéticamente, donde el ratón comprende un segmento génico Vλ y uno Jλ de inmunoglobulina no reordenado unido deforma funcional aun locus de cadena ligera de ratón que comprende un gen Cλ de ratón intacto.

Los segmentos génicos Vλ y Jλ son segmentos génicos humanos.

El locus de cadena ligera de ratón endógeno es un locus de cadena ligera λ.

5 En un aspecto, el ratón comprende adicionalmente un remplazo de uno o más segmento génicos V, D y/o J de cadena pesada con uno o más segmentos génicos V, D y/o J humanos en un locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno.

En un aspecto, el ratón comprende un segmento génico variable de cadena ligera λ de inmunoglobulina humana no reordenado (Vλ) y un segmento génico de unión λ (Jλ) en un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que comprende un gen Cλ de ratón intacto.

15 En un aspecto, el locus génico variable de cadena ligera λ (el "locus λ") comprende al menos un segmento génico hVλ y al menos un segmento génico Jλ humano (hJλ). En otro aspecto, el locus λ comprende hasta cuatro segmentos génicos hJλ.

En un aspecto, el locus Vλ comprende una pluralidad de hVλ. En un aspecto, la pluralidad de hVλ se selecciona de modo que provoque la expresión de un repertorio de región variable de cadena ligera λ que refleje aproximadamente

el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, o aproximadamente el 90 %, o más del uso de Vλ observado en un ser humano. En un aspecto, el locus Vλ comprende segmentos génicos

25 hVλ 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, y una combinación delos mismos.

En un aspecto, los hVλ incluyen 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, y 3-12. En un aspecto específico, el locus Vλ comprende una secuencia contigua del locus de cadena ligera λ humana que abarca desde Vλ3-12 a Vλ3-1. En un aspecto, el locus Vλ comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 hVλ. En un aspecto específico, las hVλ incluyen 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, y 3-12. En un aspecto específico el locus Vλ comprende una secuencia contigua del locus λ humano que abarca desde Vλ3-12 a Vλ3-1. En un aspecto específico, el locus κ endógeno está delecionado en parte o completamente.

En un aspecto, el locus Vλ comprende de 13 a 28 o más hVλ. En un aspecto específico, los hVλ incluyen 2-14, 3-16, 35 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, y 3-27. En un aspecto específico el locus κ endógenos está delecionado en parte

o completamente.

En un aspecto, el locus Vλ comprende de 29 a 40 hVλ. En un aspecto específico, toda o sustancialmente toda la secuencia entre hVλ1-40 y hVλ3-29 en el ratón modificado genéticamente consiste esencialmente en una secuencia λ humana de aproximadamente 959 pb encontrada en la naturaleza (por ejemplo, en la población humana) cadena abajo del segmento génico hVλ1-40 (cadena abajo de la parte no traducida 3'), a un sitio de enzima de restricción (por ejemplo, PI-SceI), seguido por una secuencia λ humana de aproximadamente 3.431 pb cadena arriba del segmento génico hVλ3-29 encontrado en la naturaleza. En un aspecto específico, el locus κ de ratón endógeno está delecionado en parte o completamente.

45 En un aspecto, el locus Vλ comprende al menos un hJλ. En un aspecto, el locus Vλ comprende una pluralidad de hJλ. En un aspecto, el locus Vλ comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, o 7 hJλ. En un aspecto específico, el locus Vλ comprende cuatro hJλ. En un aspecto específico, los cuatro hJλ son hJλ1, hJλ2, hJλ3, y hJλ7. En un aspecto, el locus Vλ comprende un hJλ. En un aspecto específico, el un hJλ es hJλ1. En un aspecto específico, el locus κ endógeno está delecionado en parte o completamente.

En un aspecto, el locus Vλ comprende al menos un, hVλ, al menos un hJλ, y un gen Cλ de ratón intacto. En un aspecto específico, el gen Cλ de ratón intacto es Cλ2.

55 En un aspecto, el ratón comprende un remplazo de los segmentos génicos Vλ de ratón endógenos en el locus λ de ratón endógeno con uno o más segmentos génicos Vλ humanos en el locus λ de ratón endógeno, donde los segmentos génicos hVλ están unidos deforma funcional a un gen de la región Cλ de ratón intacto, de modo que el ratón reordene los segmentos génicos hVλ y exprese una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica inversa que comprenda un dominio hVλ y un Cλ de ratón. El gen Cλ de ratón intacto es Cλ2. En un aspecto específico todos los segmentos génicos Vλ de ratón endógenos se remplazan con al menos un segmento génico hVλ no reordenado. En un aspecto, el remplazo es con al menos 12, al menos 28, o al menos 40 segmentos génicos hVλ no reordenados. En una realización, el remplazo es con al menos 7 segmentos génicos hVλ no reordenados funcionales, al menos 16 segmentos génicos hVλ no reordenados funcionales, o al menos 27 segmentos génicos hVλ no reordenados

65 funcionales. En un aspecto, el ratón comprende un remplazo de todos los segmentos génicos Jλ de ratón con al menos un segmento génico hJλ no reordenado. En un aspecto, el al menos un segmento génico hJλ no reordenado

se selecciona de Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, y una combinación de los mismos. En una realización específica el uno o más segmentos génicos hVλ se seleccionan de un segmento génico hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52, y una combinación de los mismos. En un aspecto específico, el al menos un segmento génico hJλ no reordenado se

5 selecciona de Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, y una combinación de los mismos.

También se describe un ratón modificado genéticamente, donde el ratón comprende no más de dos alelos de cadena ligera, donde los alelos de cadena ligera comprenden (a) un segmento génico Vλ y uno Jλ humano de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera de ratón endógeno que comprende un gen Cλ de ratón

intacto; y, (b) un segmento génico VL y uno JL de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera de ratón endógeno que comprende un gen CL de ratón.

En un aspecto, el locus de cadena ligera de ratón endógeno es un locus κ. En otro aspecto, el locus de cadena ligera de ratón endógeno es un locus λ.

15 En un aspecto, los no más de dos alelos de cadena ligera se seleccionan entre un alelo κ y un alelo λ, y dos alelos λ. En un aspecto específico, uno de los dos alelos de cadena ligera es un alelo λ que comprende un gen Cλ2 intacto.

En un aspecto, el ratón comprende adicionalmente un locus de cadena ligera de inmunoglobulina funcional y un

locus de cadena ligera no funcional, donde el locus de cadena ligera funcional comprende un segmento génico Vλ y uno Jλ humano de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que comprende un gen Cλ de ratón intacto. El gen Cλ intacto es Cλ2.

25 En un aspecto, el ratón comprende adicionalmente al menos un alelo de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, el al menos un alelo de cadena pesada de inmunoglobulina comprende un segmento génico VH humano, un segmento génico DH humano, y un segmento génico JH humano en un locus de cadena pesada de ratón endógeno que comprende un gen de cadena pesada humana que expresa una cadena pesada humana/de ratón. En un aspecto específico, el ratón comprende dos alelos de cadena pesada de inmunoglobulina, y el ratón expresa una cadena pesada humana/de ratón.

[Eliminado]

En un aspecto, el ratón comprende un primer alelo de cadena ligera, que comprende un hVκ no reordenado y un hJκ

35 no reordenado, en un locus κ de ratón endógeno que comprende un gen Cκ endógeno intacto; y un segundo alelo de cadena ligera que comprende un hVλ no reordenado y un hJλ no reordenado, en un locus λ de ratón endógeno que comprende un gen Cλ2 endógeno intacto. En un aspecto específico, el primer y el segundo alelo de cadena ligera son los únicos alelos de cadena ligera funcionales del ratón modificado genéticamente.

En un aspecto, el ratón comprende seis alelos de inmunoglobulina, donde el primer alelo comprende un segmento

génico Vλ y Jλ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno que comprende un gen Cκ de ratón, el segundo comprende un segmento génico Vκ y Jκ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno que comprende un gen Cκ de ratón, el tercero comprende un segmento génico Vλ y Jλ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que comprende

45 un gen Cλ2 de ratón intacto, el cuarto y quinto comprenden cada uno independientemente un segmento génico VH y DH y JH no reordenados en un locus de cadena pesada de ratón endógeno que comprende un gen de cadena pesada de ratón, y el sexto comprende (a) un segmento génico Vλ y Jλ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que comprende un gen Cλ de ratón, (b) un locus λ que es no funcional,

o (c) una deleción en la totalidad o en parte del locus λ.

En un aspecto, el primer alelo comprende un hVλ y hJλ no reordenado. En un aspecto, el segundo alelo comprende un hVκ y hJκ no reordenado. El tercer alelo comprende un hVλ y hJλ no reordenado. En un aspecto, el cuarto y

quinto comprenden cada uno independientemente un hVH y hDH y hJH no reordenado. En un aspecto, el sexto alelo

comprende un locus λ de ratón endógeno que está delecionado en su totalidad o en parte.

55 En un aspecto, el ratón comprende seis alelos de inmunoglobulina, donde el primer alelo comprende un segmento génico Vλ y Jλ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que comprende un gen Cλ de ratón intacto, el segundo comprende un segmento génico Vλ y Jλ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que comprende un gen Cλ de ratón, el tercero comprende un segmento génico Vκ y Jκ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno que comprende un gen Cκ de ratón, el cuarto y quinto comprenden cada uno independientemente un segmento génico VH y DH y JH no reordenado en un locus de cadena pesada de ratón endógeno que comprende un gen de cadena pesada de ratón, y el sexto comprende (a) un segmento génico Vκ y Jκ de inmunoglobulina no reordenado en un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno que comprende un gen Cκ de ratón, (b) un locus κ que es no funcional,

65 o (c) una deleción de uno o más elementos del locus κ.

En un aspecto, el primer alelo comprende un segmento génico hVλ y hJλ no reordenado. En un aspecto, el segundo alelo comprende un segmento génico hVλ y hJλ no reordenado. En un aspecto, el tercer alelo comprende un segmento génico hVκ y hJκ no reordenado. En un aspecto, el cuarto y quinto comprenden cada uno

independientemente un segmento génico hVH y hDH y hJH no reordenado. En un aspecto, el sexto alelo comprende 5 un locus κ de ratón endógeno que está funcionalmente silenciado.

En un aspecto, el ratón modificado genéticamente comprende una célula B que comprende un gen de anticuerpo

reordenado que comprende un dominio hVλ reordenado unido de forma funcional a un dominio Cλ de ratón intacto. El dominio Cλ de ratón se obtiene de un gen Cλ2.

También se describe un ratón modificado genéticamente que expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia Vλ-Jλ humana reordenada y una secuencia Cλ de ratón.

También se describe un ratón que expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera derivada de un gen hVλ,

15 uno hJλ y uno Cλ de ratón. La región Cλ es Cλ2. En un aspecto específico, el anticuerpo comprende adicionalmente una cadena pesada que comprende un dominio variable derivado de un segmento génico V humano, uno D humano y uno J humano, y un dominio constante de cadena pesada derivado de un gen de la región constante de cadena pesada de ratón. En un aspecto, el gen de la región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia bisagra CH2-CH3 de un dominio constante de cadena pesada. En otro aspecto, el gen de la región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia CH1 bisagra-CH2-CH3 de un dominio constante de cadena pesada. En otro aspecto, el gen de región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia CH1-CH2-CH3-CH4 de un dominio constante de cadena pesada. En otro aspecto, el gen de la región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia CH2-CH3-CH4 de un dominio constante de cadena pesada.

25 En un aspecto, el ratón expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera λ de inmunoglobulina reordenada que comprende una secuencia Vλ/Jλ humana seleccionada de 31/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 140/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 y 1-51/1.

También se describe un ratón que expresa un anticuerpo que comprende (a) una cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada derivado de un segmento génico de la región variable de cadena pesada humana no reordenado, donde el dominio variable de cadena pesada está fusionado a una región constante de cadena pesada (CH) de ratón; y, (b) una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera

35 derivado de un hVλ y un hJλ no reordenado, donde el dominio variable de cadena ligera está fusionado a una región Cλ de ratón intacta.

En un aspecto, el ratón comprende (i) un locus de cadena pesada que comprende un remplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V, D y J de ratón endógenos funcionales con todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V, D y J humanos funcionales, un gen CH de ratón, (ii) un primer locus de cadena ligera

λ que comprende un remplazo de todos los segmentos génicos Vλ y Jλ de ratón endógenos funcionales con todos, sustancialmente todos, o una pluralidad de, segmentos génicos hVλ y hJλ funcionales , y un gen Cλ de ratón intacto,

(iii) un segundo locus de cadena ligera λ que comprende un remplazo de todos los segmentos génicos Vλ y Jλ de

45 ratón endógenos funcionales con todos, sustancialmente todos, o una pluralidad de, segmentos génicos hVλ y hJλ funcionales, y un gen Cλ de ratón intacto. El gen Cλ de ratón intacto es Cλ2.

En un aspecto, el ratón comprende una deleción de un gen Cκ y/o un segmento génico Vκ y/o uno Jκ. En una realización, el ratón comprende un locus de cadena ligera κ no funcional.

También se describe un ratón modificado genéticamente que expresa un anticuerpo, donde más del 10 %, más del 15 %, más del 20 %, más del 25 %, más del 30 %, más del 35 %, más del 40 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, o más del 90 % del anticuerpo IgG total producido por el ratón comprende un dominio variable derivado de

λ, y donde el ratón expresa anticuerpos que comprenden un dominio variable derivado de κ fusionado con una

55 región Cκ de ratón. En aspectos específicos, aproximadamente el 15-40 %, 20-40 %, 25-40 %, 30-40 %, o 35-40 % de anticuerpo total producido por el ratón comprende un dominio variable derivado de λ. En un aspecto, el dominio variable derivado de λ se obtiene de un hVλ y un hJλ. En un aspecto específico, la región variable derivada de λ está en una cadena ligera que comprende una región Cλ de ratón. La región Cλ es una región Cλ2.

También se describe una construcción de ADN aislado que comprende un brazo de homología cadena arriba y un brazo de homología cadena abajo, donde los brazos de homología cadena arriba y cadena abajo dirigen la

construcción a un locus κ de ratón, y la construcción comprende un segmento hVλ no reordenado funcional y un segmento hJλ no reordenado funcional, y una secuencia de selección o marcadora.

65 También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende, de 5' a 3' con respecto a la dirección de

transcripción, un brazo de direccionamiento para dirigir una secuencia λ de ratón cadena arriba de Vλ2 de ratón, un

casete de selección flanqueado 5' y 3' con sitios de reconocimiento por recombinasa, y un brazo de direccionamiento para dirigir una secuencia λ de ratón 3' de Jλ2 de ratón. En un aspecto, el casete de selección es un casete Hyg-TK flanqueado por Frt. En un aspecto, el brazo de direccionamiento 3' comprende Cλ2, Jλ4, Cλ4 de ratón y el potenciador de ratón 2.4.

5 También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende, de 5' a 3' con respecto a la dirección de

transcripción, un brazo de direccionamiento para dirigir el locus λ de ratón 5' con respecto a Vλ1, un casete de

selección flanqueado 5' y 3' con sitios de reconocimiento por recombinasa, y un brazo de direccionamiento 3' para

dirigir una secuencia λ de ratón 3' con respecto a Cλ1 de ratón. En un aspecto, el casete de selección es un casete de neomicina flanqueado por lox. En un aspecto, el brazo de direccionamiento 3' comprende el potenciador 3' λ de ratón y el potenciador 3' λ de ratón 3.1.

También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende de 5' a 3' con respecto a la dirección de

transcripción, un brazo de direccionamiento para dirigir el locus λ de ratón 5' con respecto a Vλ2, un casete de

15 selección flanqueado 5' y 3' con sitios de reconocimiento por recombinasa, y un brazo de direccionamiento 3' para

dirigir una secuencia λ de ratón 3' con respecto a Jλ2 de ratón y 5' con respecto a Cλ2 de ratón. En un aspecto, el

casete de selección es un casete de higromicina-TK flanqueado por Frt. En un aspecto, el brazo de direccionamiento 3' comprende los segmentos génicos Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón y el potenciador λ de ratón 2.4.

También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende, de 5' a 3' con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de direccionamiento para dirigir el locus λ de ratón 5' con respecto a Vλ2, un casete de selección flanqueado 5' y 3' con sitios de reconocimiento por recombinasa, un fragmento genómico humano que comprende una región contigua del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ3-12 cadena abajo hasta el final de hJλ1, y un brazo de direccionamiento 3' para dirigir una secuencia λ de ratón 3' con respecto a Jλ2 de ratón. En un

25 aspecto, el casete de selección es un casete de neomicina flanqueado por Frt. En un aspecto, el brazo de direccionamiento 3' comprende los segmentos génicos Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón y el potenciador λ de ratón 2.4.

También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende una región contigua del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ3-12 cadena abajo hasta el final de hJλ1.

También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende, de 5' a 3' con respecto a la dirección de

selección flanqueado 5' y 3' con sitios de reconocimiento por recombinasa y un fragmento genómico humano que comprende una región contigua del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ3-27 cadena abajo hasta el final de

35 hVλ2-8. En un aspecto, el casete de selección es una casete de higromicina flanqueado por Frt. En un aspecto, el fragmento genómico humano comprende un brazo de direccionamiento 3'. En un aspecto específico, el brazo de direccionamiento 3' comprende aproximadamente 53 kb del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ3-12 cadena abajo hasta el final de hVλ2-8.

También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende una región contigua del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ3-27 cadena abajo hasta el final de hVλ3-12.

45 selección flanqueado 5' y 3' con sitios de reconocimiento por recombinasa, un primer fragmento genómico humano que comprende una región contigua del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ5-52 cadena abajo hasta el final de hVλ1-40, un sitio para enzimas de restricción, y un segundo fragmento genómico humano que comprende una región contigua del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ3-29 cadena abajo hasta el final de hVλ82K. En un aspecto, el casete de selección es un casete de neomicina flanqueado por Frt. En un aspecto, el sitio para enzimas de restricción es un sitio para una endonucleasa constitutiva. En un aspecto específico, la endonucleasa constitutiva es PI-Scel. En un aspecto, el segundo fragmento genómico humano es un brazo de direccionamiento 3'. En un aspecto específico, el brazo de direccionamiento 3' comprende aproximadamente 27 kb del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ3-29 cadena abajo hasta el final de hVλ82K.

55 También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende una región contigua del locus de cadena ligera λ humana desde hVλ5-52 cadena abajo hasta el final de hVλ1-40.

transcripción, un brazo de direccionamiento para dirigir el locus κ de ratón 5' con respecto a los segmentos génicos Vκ endógenos, dos sitios de reconocimiento por recombinasa yuxtapuestos, un casete de selección 3' a los sitios de reconocimientos por recombinasa yuxtapuestos, y un brazo de direccionamiento 3' para dirigir una secuencia κ de ratón 5' con respecto a los segmentos génicos variables de cadena ligera κ. En un aspecto, los sitios de reconocimiento por recombinasa yuxtapuestos están en orientación opuesta con respecto uno del otro. En un aspecto específico, los sitios de reconocimiento por recombinasa son diferentes. En otro aspecto específico, los

65 sitios de reconocimiento por recombinasa son un sitio loxP y un sitio lox511. En un aspecto, el casete de selección es un casete de neomicina.

También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende, de 5' 3' con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de direccionamiento para dirigir el locus κ de ratón 5' con respecto a los segmentos génicos Jκ de ratón, un casete de selección, un sitio de reconocimiento por recombinasa 3' al casete de selección, y un brazo

5 de direccionamiento 3' para dirigir una secuencia κ de ratón 3' con respecto a los segmentos génicos Jκ de ratón y 5' al potenciador intrónico κ de ratón. En un aspecto, el casete de selección es un casete de higromicina-TK. En un aspecto, el sitio de reconocimiento por recombinasa está en la misma dirección con respecto a la transcripción que el casete de selección. En un aspecto específico, el sitio de reconocimiento por recombinasa es un sitio loxP.

10 También se describe una construcción de ADN aislado, que comprende, de 5' a 3' con respecto a la dirección de transcripción, un primer fragmento genómico de ratón que comprende la secuencia 5' de los segmentos génicos Vκ de ratón endógenos, un primer sitio de reconocimiento por recombinasa, un segundo sitio de reconocimiento por recombinasa, y un segundo fragmento genómico de ratón que comprende la secuencia 3' de los segmentos génicos Jκ de ratón endógenos y 5' del potenciador intrónico κ de ratón.

15 También se describe un ratón modificado genéticamente, donde la modificación genética comprende una modificación con una o más de las construcciones de ADN descritas anteriormente o en este documento.

También se describe el uso de una construcción de ADN aislado para crear un ratón como se describe en este

20 documento. También se describe el uso de una construcción de ADN aislado como se describe en este documento en un método para preparar una proteína de unión a antígeno.

También se describe una célula madre no humana que comprende un vector de direccionamiento que comprende una construcción de ADN como se ha descrito anteriormente y en este documento. También se describe una célula

25 madre no humana, donde la célula madre no humana se obtiene de un ratón descrito en este documento.

En un aspecto, la célula madre no humana es una célula madre embrionaria (ES). En un aspecto específico, la célula ES una célula ES de ratón.

30 También se describe el uso de una célula madre no humana como se describe en este documento para crear un ratón como se describe en este documento. También se describe el uso de una célula madre no humana como se describe en este documento para preparar una proteína de unión a antígeno.

También se describe un embrión de ratón, donde el embrión de ratón comprende una modificación genética como se

35 describe en este documento. En un aspecto, se describe un embrión de ratón hospedador que comprende una célula ES donante, donde la célula ES donante comprende una modificación genética como se describe en este documento. En un aspecto, el embrión de ratón es un embrión en fase premórula. En un aspecto específico, el embrión en fase premórula es un embrión en fase de 4 células o un embrión en fase de 8 células. En otro aspecto específico, el embrión de ratón es un blastocisto.

40 También se describe el uso de un embrión de ratón como se describe en este documento para crear un ratón como se describe en ese documento. En un aspecto, se describe el uso de un embrión de ratón como se describe en este documento para preparar una proteína de unión a antígeno.

45 También se describe una célula no humana, donde la célula no humana comprende una secuencia génica de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada derivada de un ratón modificado genéticamente como se describe en este documento. En un aspecto, la célula es una célula B. En un aspecto, la célula es un hibridoma. En un aspecto, la célula codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y/o un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que está mutado somáticamente.

50 También se describe una célula no humana, donde la célula no humana comprende una secuencia génica de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada derivada de un ratón modificado genéticamente como se describe en este documento. En un aspecto, la célula es una célula B. En un aspecto, la célula es un hibridoma. En un aspecto, la célula codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y/o un dominio variable de cadena

55 pesada de inmunoglobulina que está mutado somáticamente.

También se describe el uso de una célula no humana como se describe en este documento para crear un ratón como se describe en este documento. En un aspecto, se describe el uso de una célula no humana como se describe en este documento para preparar una proteína de unión a antígeno.

También se describe una célula B de ratón que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende (a) una región variable derivada de un segmento génico hVλ y un segmento génico hJλ; y, (b) un gen Cλ de ratón. El gen Cλ es Cλ2. En un aspecto, la célula B de ratón expresa adicionalmente una cadena pesada afín que comprende

(c) una región variable derivada de un segmento hVH, uno hDH, y (d) uno hJH. En un aspecto, la célula B no 5 comprende un gen λ reordenado. En otro aspecto, la célula B no comprende un gen κ reordenado.

También se describe un método para preparar un anticuerpo en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde el ratón tiene un genoma que

comprende al menos un hVλ y al menos un hJλ en un locus de cadena ligera endógeno, donde el locus de cadena ligera endógeno comprende un gen Cλ de ratón; (b) permitir que el ratón modificado genéticamente desarrolle una respuesta inmunitaria contra el antígeno; y, (c) aislar del ratón de (b) un anticuerpo que reconoce específicamente el antígeno, o aislar del ratón de (b) una célula que comprende un dominio de inmunoglobulina que reconoce específicamente el antígeno, donde el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de un gen hVλ, uno hJλ y uno Cλ de ratón.

En un aspecto, se describe un método para preparar un anticuerpo en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde el ratón tiene un genoma que

comprende al menos un hVλ en un locus de cadena ligera λ y al menos un Jλ en el locus de cadena ligera λ, donde el locus de cadena ligera λ comprende un gen Cλ de ratón intacto; (b) permitir que el ratón modificado

genéticamente desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno; y, (c) aislar del ratón de (b) un anticuerpo que reconozca específicamente el antígeno, o aislar del ratón de (b) una célula que comprenda un dominio de inmunoglobulina que reconozca específicamente el antígeno, o identificar en el ratón de (b) una secuencia de ácido nucleico que codifique un dominio variable de cadena pesada y/o ligera que se una al antígeno, donde el anticuerpo

25 comprende una cadena ligera derivada de un hVλ, un hJλ y un gen Cλ de ratón.

El gen constante de cadena ligera λ es un gen Cλ de ratón intacto. El gen Cλ de ratón intacto es Cλ2.

También se describe un método para preparar un gen de anticuerpo reordenado en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde la modificación genética comprende un hVλ y un hJλ en un locus de cadena ligera endógeno, donde el locus de cadena ligera endógeno comprende un gen Cλ de ratón intacto; y, (b) identificar un gen de inmunoglobulina

reordenado en dicho ratón, donde el gen de inmunoglobulina reordenado comprende un segmento génico de región variable de cadena ligera λ y un gen Cλ2 o fragmento funcional del mismo.

35 En un aspecto, el método comprende adicionalmente clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y/o ligera del ratón, donde la región variable de cadena pesada y/o ligera es de un anticuerpo que comprende un Vλ humano y un Cλ de ratón.

En un aspecto, se describe un método para preparar un gen de anticuerpo reordenado en un ratón modificado genéticamente, que comprende: (a) exponer un ratón modificado genéticamente a un antígeno, donde la

modificación genética comprende un hVλ y un hJλ en un locus de cadena ligera λ de ratón, donde el locus de cadena ligera λ comprende un gen Cλ2 de ratón intacto; y, (b) identificar un gen de inmunoglobulina reordenado en

45 dicho ratón, donde el gen de inmunoglobulina reordenado comprende un segmento génico de región variable de cadena ligera λ y un gen Cλ2.

El gen constante de cadena ligera λ es un gen Cλ2 de ratón intacto.

En un aspecto, el método comprende adicionalmente clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y/o ligera del ratón, donde la región variable de cadena pesada y/o ligera es de un

anticuerpo que comprende un Vλ humano y un Cλ de ratón.

También se describe un método para preparar un anticuerpo, que comprende exponer un ratón como se describe en

55 este documento a un antígeno, permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria que comprende crear un anticuerpo que se una específicamente al antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico reordenada en el ratón que codifique la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico en el ratón que codifique una secuencia del dominio variable de cadena ligera afín de un anticuerpo, donde el anticuerpo se une específicamente al antígeno, y emplear las secuencias de ácido nucleico de los dominios variables de cadena pesada y ligera fusionados a dominios constantes humanos para crear un anticuerpo deseado, donde el anticuerpo deseado comprende una cadena ligera que comprende un dominio Vλ fusionado a un dominio CL. El dominio Vλ es humano y el dominio CL es un dominio Cλ2 de ratón.

65 En un aspecto, se describe un método para preparar un anticuerpo que comprende exponer un ratón como se describe en ese documento a un antígeno, permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria que comprende

crear un anticuerpo que se une específicamente al antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico reordenada en el ratón que codifique un dominio variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico reordenada que codifique una secuencia de dominio variable de cadena ligera afín de un anticuerpo, donde el anticuerpo se une específicamente al antígeno, y emplear las secuencias de ácido nucleico fusionadas a secuencias de ácido nucleico

5 que codifican un dominio constante de cadena pesada humana y un dominio constante de cadena ligera humana para crear un anticuerpo derivado de secuencias humanas, donde el anticuerpo que se une específicamente al antígeno comprende una cadena ligera que comprende un dominio Vλ humano fusionado a una región Cλ de ratón.

La región Cλ de ratón es Cλ2.

En un aspecto, se describe un método para preparar una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de anticuerpo reordenada, que comprende (a) exponer un ratón como se describe en este documento a un antígeno;

(b) permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria; (c) identificar una célula en el ratón que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique una secuencia del dominio Vλ humano reordenado fusionada con un

15 dominio Cλ de ratón, donde la célula también codifica una cadena pesada afín que comprende un dominio VH humano y un dominio CH de ratón, y donde la célula expresa un anticuerpo que se une al antígeno; (d) clonar a partir de la célula una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio Vλ humano y una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH humano afín; y, (e) usar la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio Vλ humano y la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VH humano afín para crear un anticuerpo completamente humano.

25 (b) permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria al antígeno; (c) identificar una célula en el ratón que comprenda ADN que codifique una secuencia del dominio Vλ humano reordenado fusionada a un dominio Cλ de ratón, donde la célula también codifica una cadena pesada afín que comprende un dominio VH humano y un dominio CH de ratón, y donde la célula expresa un anticuerpo que se une al antígeno; (d) clonar a partir de la célula una secuencia de ácido nucleico que codifique el dominio Vλ humano reordenado y una secuencia de ácido nucleico que codifique el dominio VH humano afín; y, (e) usar la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio Vλ humano y la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VH humano afín para crear un anticuerpo completamente humano. El dominio Cλ de ratón es Cλ2 de ratón.

También se describe un ratón modificado genéticamente que expresa una cadena ligera derivada de λ humana

35 fusionada a una región constante de cadena ligera endógena (Cλ), donde el ratón, tras inmunización con el antígeno, crea un anticuerpo que comprende un dominio Vλ humano fusionado a un dominio Cλ de ratón. El dominio Cλ es Cλ2.

También se describe un ratón modificado genéticamente que comprende un locus de cadena ligera λ endógeno modificado como se describe en este documento, que expresa una pluralidad de cadenas ligeras λ de

inmunoglobulina asociadas con una pluralidad de cadenas pesadas de inmunoglobulina. En un aspecto, la cadena pesada comprende una secuencia humana. En diversos aspectos, la secuencia humana se selecciona de una secuencia variable, una CH1, una bisagra, una CH2, una CH3, y una combinación de las mismas. En un aspecto, la

pluralidad de cadenas ligeras λ de inmunoglobulina comprende una secuencia humana. En diversos aspectos, la

45 secuencia humana se selecciona entre una secuencia variable, una secuencia constante, y una combinación de las mismas. En un aspecto, el ratón comprende un locus de inmunoglobulina endógeno deshabilitado y expresa la cadena pesada a partir de un transgén o episoma extracromosómico. En un aspecto, el ratón comprende un remplazo en un locus de ratón endógeno de algunos o todos los segmentos génicos de cadena pesada de ratón endógenos (es decir, V, D, J), y/o algunas o todas las secuencias constantes de cadena pesada de ratón endógenas (por ejemplo, CH1, bisagra, CH2, CH3, o una combinación de las mismas), y/o algunas o todas las secuencias de cadena ligera de ratón endógenas (por ejemplo, V, J, constante, o una combinación de las mismas), con una o más secuencias de inmunoglobulina humana.

También se describe un ratón adecuado para preparar anticuerpos que tienen una cadena ligera derivada de λ 55 humana donde todos o sustancialmente todos los anticuerpos preparados en el ratón se expresan con una cadena

ligera derivada de λ humana. En un aspecto, la cadena ligera derivada de λ humana se expresa a partir de un locus

de cadena ligera endógeno.

También se describe un método para preparar una cadena ligera derivada de λ para un anticuerpo humano, que

comprende obtener de un ratón como se describe en este documento una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada, y emplear la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada en la preparación de un anticuerpo humano.

También se describe un método para preparar una proteína de unión a antígeno, que comprende exponer un ratón

65 como se describe en este documento a un antígeno; permitir que el ratón monte una respuesta inmunitaria; y obtener del ratón una proteína de unión a antígeno que se una al antígeno, u obtener del ratón una secuencia a

emplear en la preparación de una proteína de unión a antígeno que se une al antígeno.

También se describe una célula derivada de un ratón como se describe en este documento. En un aspecto, la célula se selecciona entre una célula madre embrionaria, una célula pluripotente, una célula pluripotente inducida, una 5 célula B, y un hibridoma.

También se describe una célula que comprende una modificación genética como se describe en este documento. En un aspecto, la célula es una célula de ratón. En un aspecto, la célula se selecciona entre un hibridoma y un cuadroma. En un aspecto, la célula expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia

variable λ humana fusionada a una secuencia constante λ de ratón.

También se describe un tejido derivado de un ratón como se describe en este documento.

También se describe el uso de un ratón o una célula como se describe en este documento para preparar una 15 proteína de unión a antígeno. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno es una proteína humana. En un aspecto, la proteína humana es un anticuerpo humano.

También se describe una proteína de unión a antígeno creada por un ratón, célula, tejido, o método como se describe en este documento. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno es una proteína humana. En un aspecto, la proteína humana es un anticuerpo humano.

Breve descripción de las figuras

25 La Fig. 1 muestra una ilustración detallada, no a escala, del locus de cadena ligera λ humana que incluye los grupos de segmentos génicos Vλ (A, B y C) y los pares de regiones Jλ y Cλ (pares J-C). La Fig. 2 muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de direccionamiento usada para

inactivar el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno.

La Fig. 3 muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de direccionamiento usada para inactivar el locus de cadena ligera κ de ratón endógeno. La Fig. 4A muestra una ilustración general, no a escala de un vector de direccionamiento inicial para direccionar el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno con secuencias de cadena ligera λ humana incluyendo 12 segmentos génicos hVλ y el segmento génico hJλ1 (vector de direccionamiento 12/1-λ). La Fig. 4B muestra una ilustración general, no a escala, de cuatro vectores de direccionamiento iniciales para

35 direccionar el locus de cadena ligera κ de ratón endógeno con secuencias de cadena ligera λ humana incluyendo 12 segmentos génicos hVλ, y el segmento génico hJλ1 (vector de direccionamiento 12/1-κ), 12 segmentos génicos hVλ y los segmentos génicos hJλ1, 2, 3 y 7 (vector de direccionamiento 12/4-κ), 12 segmentos génicos hVλ, una secuencia genómica Vκ-Jκ humana y el segmento génico hJλ1 (vector de direccionamiento (12(κ)1-κ) y 12 segmentos génicos hVλ, una secuencia genómica Vκ-Jκ humana y los segmentos génicos hJλ1, 2, 3 y 7 (vector de direccionamiento 12(κ)4-κ). La Fig. 5A muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de direccionamiento para la inserción

progresiva de 40 segmentos génicos hVλ y un único segmento génico hJλ en el locus de cadena ligera λ de

ratón. La Fig. 5B muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de direccionamiento para la inserción

45 progresiva de 40 segmentos génicos hVλ y un único segmento génico hJλ en el locus κ de ratón. La Fig. 6 muestra una ilustración general, no a escala, de las etapas de direccionamiento e ingeniería molecular empleadas para preparar vectores de direccionamiento híbridos λ-κ humanos únicos para la construcción de un locus de cadena ligera híbrido que contenga una secuencia intergénica κ humana, múltiples segmentos génicos hJλ o ambos. La Fig. 7A muestra una ilustración general, no a escala, de la estructura del locus para un locus de cadena ligera

λ de ratón modificado que contiene 40 segmentos génicos hVλ y un único segmento génico hJλ unido de forma funcional al gen Cλ2 endógeno. La Fig. 7B muestra una ilustración general, no a escala, de la estructura del locus para cuatro loci de cadena ligera κ de ratón modificados independientes que contienen 40 segmentos génicos hVλ y uno o cuatro

55 segmentos génicos hJλ con o sin una secuencia genómica Vκ-Jκ humana contigua unida de forma funcional al gen Cκ endógeno. La Fig. 8A muestra diagramas de contorno de esplenocitos Igλ+ e Igκ+ sincronizados con CD19+ a partir de un ratón de tipo silvestre (WT), un ratón homocigótico para 12 segmentos génicos hVλ y cuatro hJλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (12hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y uno hJλ (40hVλ-1hJλ). La Fig. 8B muestra la cantidad total de células B CD19+ en bazos recogidos de ratones de tipo silvestre (WT), ratones homocigóticos para 12 segmentos génicos hVλ y cuatro hJλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (12hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ) y ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y uno hJλ (40hVλ-1hJλ). La Fig. 9A, en el panel superior, muestra diagramas de contorno de esplenocitos sincronizados con singletes y

65 teñidos para células B y T (CD19+ y CD3+, respectivamente) de un ratón de tipo silvestre (WT) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana

(40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). El panel inferior muestra diagramas de contorno de esplenocitos sincronizados con CD19+ y teñidos para la expresión de Igλ+ e Igκ+ a partir de un ratón de tipo silvestre (WT) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). La Fig. 9B muestra la cantidad total de células B CD19+, CD19+Igκ+ y CD19+Igλ+ en bazos recogidos de ratones

5 de tipo silvestre (WT) y ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). La Fig. 9C muestra diagramas de contorno de esplenocitos sincronizados con CD19+ y teñidos para inmunoglobulina D (IgD) e inmunoglobulina M (IgM) de un ratón de tipo silvestre (WT) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ4hJλ). Se aprecian células B maduras (72 para WT, 51 para 40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ) y transicionales (13 para WT, 22 para 40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ) en cada uno de los diagramas de contorno. La Fig. 9D muestra la cantidad total de células B CD19+, células B transicionales (CD19+IgMhiIgDlo) y células B maduras (CD19+IgMloIgDhi) en bazos recogidos de ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ).

15 La Fig. 10A, en el panel superior, muestra diagramas de contorno de médula ósea teñida para células B y T (CD19+ y CD3+, respectivamente) a partir de un ratón de tipo silvestre (WT) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). El panel inferior muestra diagramas de contorno de médula ósea sincronizados con CD19+ y teñida para ckit+ y CD43+ a partir de un ratón de tipo silvestre (WT) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). Se observan células Pro y Pre B en los diagramas de contorno del panel inferior. La Fig. 10B muestra la cantidad de células B Pro (CD19+ CD43+ ckit+) y Pre (CD19+ CD43+ ckit+) B en médula ósea recogidas de los fémures de ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ).

25 La Fig. 10C muestra diagramas de contorno de médula ósea sincronizados con singletes teñida para inmunoglobulina M (IgM) y B220 a partir de un ratón de tipo silvestre (WT) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). Se observan células inmaduras, maduras y pro/pre B en cada uno de los diagramas de contorno. La Fig. 10D muestra la cantidad total de células B inmaduras (B220intIgM+) y maduras (B220hiIgM+) en médula ósea aislada de los fémures de ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). La Fig. 10E muestra diagramas de contorno de médula ósea sincronizados con células B inmaduras (B220intIgM+) y maduras (B220hiIgM+) teñidas para la expresión de Igλ e Igκ aisladas de los fémures de un ratón de tipo silvestre (WT) y un ratón homocigótico para 40 segmentos génicos hVλ y cuatro Jλ incluyendo una

35 secuencia genómica Vκ-Jκ humana (40hVλ-Vκ-Jκ-4hJλ). La Fig. 11 muestra una alineación de secuencia de nucleótidos de la unión Vλ-Jλ-Cκ de dieciocho clones de RT-PCR independientes amplificados a partir de ARN de esplenocitos de ratones que albergan secuencias génicas de cadena ligera λ humana en un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno. A6 = SEQ ID NO: 57; B6 = SEQ ID NO: 58; F6 = SEQ ID NO: 59; B7 = SEQ ID NO: 60; E7 = SEQ ID NO: 61; F7 = SEQ ID NO: 62; C8 = SEQ ID NO: 63; E12 = SEQ ID NO: 64; 1-4 = SEQ ID NO: 65; 1-20 = SEQ ID NO: 66; 3B43 = SEQ ID NO: 67; 5-8 = SEQ ID NO: 68; 5-19 = SEQ ID NO: 69; 1010 = SEQ ID NO: 70; 11A1 = SEQ ID NO: 71; 7A8 = SEQ ID NO: 72; 3A3 = SEQ ID NO: 73; 2-7 = SEQ ID NO: 74. Las bases en letra minúscula indican bases no de la línea germinal resultantes de mutación y/o adición de N durante la recombinación. Los aminoácidos consenso dentro de la región flanqueante 4 (FWR4) codificada por la secuencia de nucleótidos de hJλ1 y Cκ de ratón se indican en la

45 parte inferior de la alineación de secuencia. La Fig. 12 muestra una alineación de secuencia de nucleótidos de la unión Vλ-Jλ-Cκ de doce clones de RT-PCR independientes amplificados a partir de ARN de esplenocitos de ratones que albergan secuencias génicas de cadena ligera λ humana incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana contigua en un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno. 5-2=SEQIDNO: 87; 2-5= SEQIDNO: 88; 1-3 =SEQIDNO:89;4B-1=SEQID NO: 90; 3B-5 = SEQ ID NO: 91; 7A-1 = SEQ ID NO: 92; 5-1 = SEQ ID NO: 93; 4A-1 = SEQ ID NO: 94; 11A-1 = SEQ ID NO: 95; 5-7 = SEQ ID NO: 96; 5-4 = SEQ ID NO: 97; 2-3 = SEQ ID NO: 98. Las bases en letra minúscula indican bases no de la línea germinal resultantes de mutación y/o adición de N durante la recombinación. Los aminoácidos consenso dentro de la región flanqueante 4 (FWR4) codificada por la secuencia de nucleótidos de cada Jλ humana y Cκ de ratón se indican en la parte inferior de la alineación de secuencia.

55 La Fig. 13 muestra una alineación de secuencia de nucleótidos de la unión Vλ-Jλ-Cλ de tres clones de RT-PCR independientes amplificados a partir de ARN de esplenocitos de ratones que albergan secuencias génicas de cadena ligera λ humana en un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno. 2D1 = SEQ ID NO: 101; 2D9 = SEQ ID NO: 102; 3E15 = SEQ ID NO: 103. Las bases en letra minúscula indican bases no de la línea germinal resultantes de mutación y/o adición de N durante la recombinación. Los aminoácidos consenso dentro de la región flanqueante 4 (FWR4) codificada por la secuencia de nucleótidos de hJλ1 y Cλ2 de ratón se indican en la parte inferior de la alineación de secuencia.

Descripción detallada

65 La invención en su sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones independientes.

El término "contiguo" incluye referencias a la existencia en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, dos secuencias de ácido nucleico son "contiguas" si aparecen en la misma molécula de ácido nucleico, pero están interrumpidas por otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia V(D)J reordenada es "contigua" con una secuencia génica de región constante, aunque el codón final de la secuencia V(D)J no esté seguida

5 inmediatamente por el primer codón de la secuencia de región constante. En otro ejemplo, dos secuencias del segmento génico V son "contiguas" si aparecen en el mismo fragmento genómico, aunque pueden estar separadas por una secuencia que no codifica un codón de la región V, por ejemplo, pueden estar separadas por una secuencia reguladora, por ejemplo, un promotor u otra secuencia no codificante. En una realización, una secuencia contigua incluye un fragmento genómico que contiene secuencias genómicas ordenadas como se encuentra en un genoma de tipo silvestre.

La expresión "derivado de" cuando se usa con referencia a una región variable "derivada de" un gen o segmento génico citado incluye la capacidad de rastrear la secuencia de vuelta a un segmento génico no reordenado particular

o segmentos génicos que se reordenaron para formar un gen que expresa el dominio variable (justificando, cuando 15 sea aplicable, diferencias de corte y empalme y mutaciones somáticas).

El término "funcional" cuando se usa con referencia a un segmento génico de región variable o segmento génico de unión se refiere al uso en un repertorio expresado de anticuerpos; por ejemplo, en seres humanos, los segmentos génicos 3-1, 4-3, 2-8, etc. son funcionales, mientras que los segmentos génicos Vλ 3-2, 3-4, 2-5, etc. son no funcionales.

Un "locus de cadena pesada" incluye una localización en un cromosoma, por ejemplo, un cromosoma de ratón, donde en un ratón de tipo silvestre se encuentran secuencias de ADN de región variable de cadena pesada (VH), de diversidad de cadena pesada (DH), de unión de cadena pesada (JH), y constante de cadena pesada (CH).

25 Un "locus κ" incluye una locación en un cromosoma, por ejemplo, un cromosoma de ratón, donde en un ratón de tipo silvestre se encuentran secuencias de ADN de la región variable κ (Vk), de unión κ (Jκ) y constante κ (Cκ).

Un "locus λ" incluye una locación en un cromosoma, por ejemplo, un cromosoma de ratón, donde en un ratón de tipo silvestre se encuentran secuencias de ADN de la región variable λ (Vλ), de unión λ (Jλ) y constante λ (Cλ).

El término "no reordenado" incluye el estado de un locus de inmunoglobulina donde los segmentos génicos V y los segmentos génicos J (para cadenas pesadas, también segmentos génicos D) se mantienen por separado pero son capaces de unirse para formar un gen V(D)J reordenado que comprende un único V,(D),J del repertorio V(D)J.

Ratones que expresan dominios variables λ humanos

Se ha informado previamente de ratones que expresan anticuerpos que son completamente humanos, o parcialmente humanos y parcialmente de ratón. Los ratones modificados por ingeniería genética VELOCIMMUNE® comprenden un remplazo de segmentos génicos V(D)J no reordenados en los loci de ratón endógenos con segmentos génicos V(D)J humanos. Los ratones VELOCIMMUNE® expresan anticuerpos quiméricos que tienen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 7.605.237). La mayoría de los demás informes se refieren a ratones que expresan anticuerpos completamente humanos a partir de transgenes completamente humanos en ratones que tienen deshabilitados los loci de

45 inmunoglobulina endógenos.

Las cadenas ligeras de anticuerpo se codifican por uno de dos loci diferentes: kappa (κ) y lambda (λ). Las cadenas ligeras de anticuerpo de ratón son principalmente del tipo κ. Los ratones que crean anticuerpos de ratón, y ratones

modificados que crean anticuerpos completamente humanos o quiméricos humanos-de ratón, presentan una desviación en el uso de cadena ligera. Los seres humanos también muestran una desviación en la cadena ligera,

pero no es tan pronunciada como en ratones; la relación de cadenas ligeras κ a cadenas ligeras λ en ratones es de

aproximadamente 95:5, mientras que en seres humanos la relación es de aproximadamente 60:40. La desviación más pronunciada en ratones no se cree que afecte de forma importante a la diversidad de anticuerpos, porque en ratones el locus variable λ no es tan diverso en primera instancia. Esto no es así en seres humanos. El locus de

55 cadena ligera λ humana es muy diverso.

El locus de cadena ligera λ humano se extiende en más de 1.000 kb y contiene más de 80 genes que codifican segmentos variables (V) o de unión (J) (FIG. 1). Dentro del locus de cadena ligera λ humano, más de la mitad de todos los dominios Vλ observados están codificados por los segmentos génicos 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, y 3-21. Globalmente, aproximadamente 30 segmentos génicos Vλ humanos o así, se cree que son funcionales. Existen siete segmentos génicos Jλ, solo cuatro de los cuales se consideran segmentos génicos Jλ generalmente funcionales, Jλ1, Jλ2¸ Jλ3, y Jλ7.

El locus de cadena ligera λ en seres humanos es similar en estructura al locus κ tanto de ratones como de seres

65 humanos porque el locus de cadena ligera λ humano tiene varios segmentos génicos de región variable que son capaces de recombinarse para formar una proteína de cadena ligera funcional. El locus de cadena ligera λ humano

contiene aproximadamente 70 segmentos génicos V y 7 pares de segmentos génicos Jλ-Cλ. Solamente cuatro de estos pares de segmentos génicos Jλ-Cλ parecen ser funcionales. En algunos alelos, un quinto par de segmentos génicos Jλ-Cλ es supuestamente un pseudogén (Cλ6). Los 70 segmentos génicos Vλ parecen contener 38 segmentos génicos funcionales. Las 70 secuencias Vλ están ordenadas en tres grupos, todos los cuales contienen

5 diferentes miembros de distintos grupos de la familia génica V (grupos A, B y C; FIG. 1). Esta es una fuente potencialmente rica de diversidad relativamente inexplorada para generar anticuerpos con regiones V humanas en animales no humanos.

En marcado contraste, el locus de cadena ligera λ de ratón contiene solamente dos o tres (dependiendo de la cepa) segmentos génicos de la región Vλ de ratón (FIG. 2). Al menos por esta razón, el importante desvío κ en ratones no

se cree que sea particularmente perjudicial para la diversidad total de anticuerpos.

De acuerdo con los mapas publicados del locus de cadena ligera λ de ratón, el locus consiste esencialmente en dos grupos de segmentos génicos con un lapso de aproximadamente 200 kb (FIG. 2). Los dos grupos contienen dos

15 conjuntos de genes V, J, y C que tienen capacidad de reordenamiento independiente: Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 y Vλ1Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1. Aunque se ha descubierto que Vλ2 se recombina con todos los segmentos génicos Jλ, Vλ1 parece recombinarse exclusivamente con Cλ1. Se cree que Cλ4 es un pseudogén con sitios defectuosos de corte y empalme.

El locus de cadena ligera κ de ratón es notablemente diferente. La estructura y cantidad de segmentos génicos que participan en los eventos de recombinación que conducen a una proteína de cadena ligera funcional a partir de un locus κ de ratón es mucho más compleja (FIG. 3). Por tanto, las cadenas ligeras λ de ratón no contribuyen en gran medida a la diversidad de una población de anticuerpos en un ratón típico.

25 Explotar la rica diversidad del locus de cadena ligera λ de ratón en ratones probablemente produciría, entre otras cosas, una fuente para un repertorio humano más completo de dominios V de cadena ligera. Intentos previos por aprovechar esta diversidad usaron transgenes humanos que contenían porciones del locus de cadena ligera λ humano incorporados aleatoriamente en el genoma de ratón (véase, por ejemplo, el documento US 6.998.514 y el documento US 7.435.871). Ratones que contienen estos transgenes integrados aleatoriamente expresan supuestamente cadenas ligeras λ completamente humanas, sin embargo, en algunos casos, uno o ambos loci de cadena ligera endógenos permanecen intactos. Esta situación no es deseable ya que las secuencias de cadena ligera λ humanas compiten con la cadena ligera de ratón (κ o λ) en el repertorio expresado de anticuerpos del ratón.

En contraste, los inventores describen ratones modificados genéticamente que son capaces de expresar una o más

35 secuencias de ácido nucleico de cadena ligera λ directamente a partir de un locus de cadena ligera de ratón λ endógeno. Los ratones modificados genéticamente capaces de expresar secuencias de cadena ligera λ humana a partir de un locus λ endógeno pueden cruzarse adicionalmente con ratones que comprenden un locus de cadena pesada humana y por tanto usarse para expresar anticuerpos que comprenden regiones V (pesada y ligera λ) que son completamente humanas. Las regiones V se expresan con regiones constantes de ratón. En diversos aspectos, no hay segmentos génicos de inmunoglobulina de ratón endógenos presentes y las regiones V se expresan con las regiones constantes humanas. Estos anticuerpos demostrarían ser útiles en numerosas aplicaciones, tanto de diagnóstico así como terapéuticas.

Pueden lograrse muchas ventajas para diversos aspectos de expresión de proteínas de unión derivadas de

45 segmentos génicos Vλ y Jλ humanos en ratones. Las ventajas pueden lograrse colocando secuencias λ humanas en el locus de cadena ligera λ endógeno. Los anticuerpos creados a partir de dichos ratones pueden tener cadenas ligeras que comprenden dominios Vλ humanos fusionados a una región Cλ de ratón. Los ratones también expresarán dominios Vλ humanos que son adecuados para la identificación y clonación para su uso con regiones CL humanas, específicamente regiones Cκ y/o Cλ. Como el desarrollo de células B en dichos ratones por lo demás es normal, es posible generar dominios Vλ compatibles (incluyendo dominios Vλ mutados somáticamente) en el contexto de regiones Cλ o Cκ.

Se describen ratones modificados genéticamente que comprenden un segmento génico Vλ humano no reordenado y un Jλ humano no reordenado en un locus de cadena ligera λ de inmunoglobulina endógeno. Se describen ratones

55 que expresan anticuerpos que comprenden una cadena ligera que tiene un dominio Vλ humano fusionado a una región Cλ.

Enfoques para modificar por ingeniería ratones que expresen dominios Vλ humanos

Se describen diversos enfoques para generar ratones modificados genéticamente que creen anticuerpos que

contengan una cadena ligera que tenga un dominio Vλ humano fusionado a una región Cλ endógena. Se describen

modificaciones genéticas que, en diversos aspectos, comprenden una deleción de uno o ambos loci de cadena ligera endógenos. Por ejemplo, para eliminar cadenas ligeras λ de ratón del repertorio endógeno de anticuerpos 65 puede hacerse una deleción de un primer grupo génico Vλ-Jλ-Cλ y remplazo, en su totalidad o en parte, de los segmentos génicos Vλ-Jλ de un segundo grupo génico con segmentos génicos Vλ-Jλ humanos. También se

describen embriones de ratón modificados genéticamente, células, y construcciones de direccionamiento para generar los ratones, embriones de ratón, y células.

La deleción de un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ endógeno y el remplazo de los segmentos génicos Vλ-Jλ de otro grupo

5 génico Vλ-Jλ-Cλ endógeno emplea una alteración relativamente mínima en la asociación y función de la región constante de anticuerpo natural en el animal, en diversos aspectos, porque los genes Cλ endógenos se dejan intactos y por lo tanto retienen funcionalidad y capacidad normales de asociarse con la región constante de una cadena pesada endógena. Por tanto, en dichos aspectos, la modificación no afecta a otras regiones constantes de cadena pesada endógenas dependientes de las regiones constantes de cadena ligera funcionales para el ensamblaje de una molécula de anticuerpo funcional que contenga dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Además, en diversos aspectos, la modificación no afecta al ensamblaje de una molécula de anticuerpo unida a

membrana funcional que implica una cadena pesada endógena y una cadena ligera, por ejemplo, un dominio hVλ unido a una región Cλ de ratón. Como al menos un gen Cλ funcional se retiene en el locus endógeno, los animales que contienen un remplazo de los segmentos génicos Vλ-Jλ de un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ endógeno con segmentos

15 génicos Vλ-Jλ humanos deben ser capaces de crear cadenas ligeras λ normales que sean capaces de unirse al antígeno durante una respuesta inmunitaria a través de los segmentos génicos Vλ-Jλ humanos presentes en el repertorio expresado de anticuerpos del animal.

Se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ de ratón endógeno delecionado en la FIG. 2. Como se ilustra, el locus de cadena ligera λ de ratón está organizado en dos grupos génicos, ambos cuales contienen segmentos génicos funcionales capaces de recombinarse para formar una cadena ligera λ funcional de ratón. El grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno se deleciona mediante una construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 1) con un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación. El otro grupo génico endógeno (Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4) se deleciona en parte mediante una 25 construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 2) con un casete de higromicina-timidina quinasa flanqueado por sitios de recombinación. En este segundo evento de direccionamiento, se retienen los segmentos génicos endógenos Cλ2-Jλ4-Cλ4. La segunda construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 2) se construye usando sitios de recombinación que son diferentes a los de la primera construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 1) permitiendo de ese modo la deleción selectiva del casete de selección después de que se haya conseguido un direccionamiento satisfactorio. El locus doblemente abordado resultante se silencia funcionalmente porque no puede producir cadena ligera λ endógena. Este locus modificado puede usarse para la inserción de segmentos génicos Vλ y Jλ humanos para crear un locus λ de ratón endógeno que comprenda segmentos génicos Vλ y Jλ humanos, mediante lo cual, tras la recombinación en el locus modificado, el animal produce cadenas ligeras λ que comprenden segmentos génicos Vλ y Jλ humanos reordenados unidos a un

35 segmento génico Cλ de ratón endógeno.

Modificar genéticamente un ratón para hacer que los segmentos génicos λ endógenos sean no funcionales, en diversos aspectos, produce un ratón que muestra exclusivamente cadenas ligeras κ en su repertorio de anticuerpos, haciendo que el ratón sea útil para evaluar el papel de las cadenas ligeras λ en la respuesta inmunitaria, y útil para generar un repertorio de anticuerpos que comprenda dominios Vκ pero no dominios Vλ.

Un ratón modificado genéticamente que expresa un hVλ unido a un gen Cλ de ratón que se ha recombinado en el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno puede generarse por cualquier método conocido en la técnica. Se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) del remplazo de los segmentos génicos Vλ2-Vλ3-Jλ2 de ratón

45 endógenos con segmentos génicos Vλ y Jλ humanos en la FIG. 4A. Como se ilustra, se remplaza un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno que se ha vuelto no funcional por una construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento 12/1-λ) que incluye un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación. Los segmentos génicos Vλ2-Vλ3-Jλ2 se remplazan con un fragmento genómico que contiene la secuencia λ humana que incluye doce segmentos génicos hVλ y un único segmento génico hJλ.

Por tanto, este primer enfoque sitúa uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de cadena ligera λ endógeno contiguo con un segmento génico hJλ único (FIG. 4A).

Pueden conseguirse modificaciones adicionales en el locus de cadena ligera λ endógeno modificado usando

55 técnicas similares para insertar más segmentos génicos hVλ. Por ejemplo, se proporcionan ilustraciones esquemáticas de dos construcciones de direccionamiento adicionales (vectores de direccionamiento +16-λ y +12-λ) usadas para la inserción progresiva de segmentos génicos hVλ humanos adicionales en la FIG. 5A. Como se ilustra, se insertan fragmentos genómicos adicionales que contienen segmentos génicos hVλ humanos específicos en el locus de cadena ligera λ endógeno modificado en etapas sucesivas usando homología proporcionada por la inserción previa de secuencias de cadena ligera λ humanas. Tras la recombinación con cada construcción de direccionamiento ilustrada, de modo secuencial, se insertan 28 segmentos génicos hVλ adicionales en el locus de cadena ligera λ endógeno modificado. Esto crea un locus quimérico que produce una proteína de cadena ligera λ que comprende segmentos génicos Vλ-Jλ humanos unidos a un gen Cλ de ratón.

65 Los enfoques anteriores para insertar segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus λ de ratón, mantienen los potenciadores posicionados cadena abajo de los segmentos génicos Cλ2-Jλ4-Cλ4 (denominados Enh

2.4, Enh y Enh 3.1, FIG. 4A y FIG. 5A). Este enfoque produce un único alelo modificado en el locus de cadena ligera

λ de ratón endógeno (FIG. 7A).

También se describen composiciones y métodos para generar un ratón que exprese una cadena ligera que

5 comprenda segmentos génicos hVλ y Jλ unidos de forma funcional a un segmento génico Cλ de ratón, incluyendo composiciones y métodos para generar un ratón que expresa dichos genes a partir de un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno. Los métodos incluyen volver no funcional, de forma selectiva, un grupo génico Vλ-Jλ-Cλ de ratón endógeno (por ejemplo, mediante deleción dirigida), y emplear segmentos génicos hVλ y Jλ en el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno para expresar un dominio hVλ en un ratón.

También se describe un segundo enfoque donde pueden posicionarse segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus de cadena ligera κ endógeno. La modificación genética, en diversos aspectos, comprende una deleción del locus de cadena ligera κ endógeno. Por ejemplo, para eliminar cadenas ligeras κ de ratón del repertorio endógeno de anticuerpos, puede hacerse una deleción de los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón. También se

15 describen embriones de ratón modificados genéticamente, células, y construcciones de direccionamiento para generar los ratones, embriones de ratón, y células.

Por las razones indicadas anteriormente, la deleción de los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón emplea una

alteración relativamente mínima. Se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de segmentos génicos

Vκ y Jκ de ratón delecionados en la FIG. 3. Los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón endógenos se delecionan

mediante deleción mediada por recombinasa de secuencias de ratón posicionadas entre dos vectores de direccionamiento posicionados de forma precisa que emplean cada uno sitios de recombinación específicos de sitio.

Se emplea un primer vector de direccionamiento (vector de direccionamiento Jκ) en un primer evento de direccionamiento para delecionar los segmentos génicos Jκ de ratón. Se emplea un segundo vector de 25 direccionamiento (vector de direccionamiento Vκ) en un segundo evento de direccionamiento secuencial para delecionar una secuencia localizada 5' del segmento génico Vκ de ratón más distal. Ambos vectores de direccionamiento contienen sitios de recombinación específicos de sitio permitiendo de ese modo la deleción selectiva de ambos casetes de selección y todas las secuencias intermedias de cadena ligera κ de ratón después de haber conseguido un direccionamiento satisfactorio. El locus delecionado resultante se silencia funcionalmente porque no puede producir cadena ligera κ endógena. Este locus modificado puede usarse para la inserción de segmentos génicos hVλ y Jλ para crear un locus κ de ratón endógeno que comprenda segmentos génicos hVλ y Jλ, por lo cual, tras la recombinación en el locus modificado, el animal produce cadenas ligeras λ que comprenden segmentos génicos hVλ y Jλ reordenados unidos de forma funcional a un segmento génico Cκ de ratón endógeno. Pueden usarse diversos vectores de direccionamiento que comprenden secuencias de cadena ligera λ humana junto

35 con este locus κ de ratón delecionado para crear un locus de cadena ligera híbrido que contenga segmentos génicos λ humanos unidos de forma funcional con una región Cκ de ratón.

Por tanto, un segundo enfoque posiciona uno o más segmentos génicos Vλ humanos en el locus de cadena ligera κ de ratón contiguo con un segmento génico Jλ humano único (vector de direccionamiento 12/1-κ, FIG. 4B). Pueden hacerse modificaciones a este enfoque y añadir segmentos génicos y/o secuencias reguladoras para

optimizar el uso de las secuencias de cadena ligera λ humanas desde el locus κ de ratón dentro del repertorio de

anticuerpos de ratón.

También se describe un tercer enfoque donde, se posicionan uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de 45 cadena ligera κ de ratón contiguos con cuatro secuencias génicas hJλ (vector de direccionamiento 12/4-κ, FIG. 4B).

En un tercer enfoque, se posicionan uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de cadena ligera κ de ratón contiguo con una secuencia intergénica κ humana y una única secuencia génica hJλ (vector de direccionamiento 12(κ)1-κ, FIG. 4B).

También se describe un cuarto enfoque, donde se posicionan uno o más segmentos génicos hVλ en el locus de cadena ligera κ de ratón contiguo con una secuencia intergénica κ humana y cuatro secuencias génicas hJλ (vector de direccionamiento 12(κ)4-κ, FIG. 4B).

55 Todos los enfoques anteriores para insertar segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus κ de ratón, mantienen el elemento potenciador intrónico κ cadena arriba del gen Cκ (denominado Eκi, FIG. 4B y FIG. 5B) y el potenciador κ 3' cadena abajo del gen Cκ (denominado Eκ3', FIG. 4B y FIG. 5B). Los enfoques producen cuatro alelos modificados diferentes en el locus de cadena ligera κ de ratón endógeno (FIG. 7B).

Anticuerpos de dominio lambda a partir de ratones modificados genéticamente

Ratones que comprenden secuencias λ humanas en el locus de cadena ligera λ de ratón expresada en una cadena ligera que comprende una región hVλ fusionada a una región Cλ de ratón. Estos se cruzan ventajosamente con 65 ratones que (a) comprenden un locus de cadena ligera funcionalmente silenciado (por ejemplo, una eliminación del locus de cadena ligera κ o λ de ratón endógeno); (b) comprenden un locus de cadena ligera λ de ratón endógeno

que comprende segmentos génicos hV y hJ unidos de forma funcional a un gen Cλ de ratón endógeno; (c) comprenden un locus de cadena ligera κ de ratón endógeno que comprende segmentos génicos hVκ y hJκ unidos de forma funcional a un gen Cκ de ratón endógeno; y, (d) un ratón en que un alelo κ comprende hVκ y hJκ; comprendiendo el otro alelo κ hVλ y hJλ; comprendiendo un alelo λ hVλ y hJλ y un alelo λ silenciado o eliminado, o

5 comprendiendo ambos alelos λ hVλ y hJλ; y, dos alelos de cadena pesada que comprenden cada uno hVH, hDH, y hJH.

Los anticuerpos que comprenden los dominios hVλ expresados en el contexto de Cλ se usan para generar anticuerpos completamente humanos por clonación de los ácidos nucleicos que codifican los dominios hVλ en construcciones de expresión que albergan genes que codifican Cλ humano. Las construcciones de expresión

resultantes se transfectan en células hospedadoras adecuadas para expresar anticuerpo que presentas un dominio

hVλ completo fusionado a hCλ.

Ejemplos

15 Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir el modo en que preparar y usar métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Salvo que se indique de otro modo, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es en o cerca de la atmosférica.

Ejemplo I

Deleción de los loci de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón

Se prepararon diversas construcciones de direccionamiento usando tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo,

25 la patente de Estados Unidos n.º 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) para modificar bibliotecas de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) genómico de ratón para inactivar los loci de cadena ligera κ y λ de ratón.

Deleción del locus de cadena ligera λ de ratón. Se modificó ADN del clon BAC de ratón RP23-135k15 (Invitrogen) por recombinación homóloga para inactivar el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno a través de deleción dirigida de los grupos génicos Vλ-Jλ-Cλ (Fig. 2)

En resumen, se delecionó el grupo proximal completo que comprende los segmentos génicos Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 en un único evento de direccionamiento usando un vector de direccionamiento que comprende un casete de

35 neomicina flanqueado por sitios loxP con un brazo de homología de ratón 5' que contenía la secuencia 5' del segmento génico Vλ1 y un brazo de homología de ratón 3' que contenía la secuencia 3' del segmento génico Cλ1 (Fig. 2, vector de direccionamiento 1).

Se preparó una segunda construcción de direccionamiento para delecionar de forma precisa el grupo génico λ de ratón endógeno distal que contenía Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 excepto que la construcción de direccionamiento contenía un brazo de homología de ratón 5' que contenía la secuencia 5' del segmento génico Vλ2 y un brazo de homología de ratón 3' que contenía la secuencia 5' al segmento génico Cλ2 endógeno (Fig. 2, vector de direccionamiento 2). Por tanto, la segunda construcción de direccionamiento delecionaba de forma precisa Vλ2-Jλ2, dejando al mismo tiempo Cλ2-Jλ4-Cλ4 intacto en el locus λ de ratón endógeno. Se confirmaron células ES que contenían un locus λ

45 endógeno inactivado (como se ha descrito anteriormente) por métodos de cariotipado y exploración (por ejemplo, TAQMAN®) conocidos en la técnica. Después se aisló el ADN de las células ES modificadas y se sometió a tratamiento con recombinasa CRE mediando de ese modo la deleción del casete de direccionamiento proximal que contenía el gen marcador de neomicina, dejando solamente un único sitio loxP en el punto de deleción (Fig. 2, parte inferior).

Deleción del locus de cadena ligera κ de ratón. Se prepararon varias construcciones de direccionamiento usando métodos similares descritos anteriormente para modificar el ADN de clones BAC de ratón RP23-302g12 y RP23254m04 (Invitrogen) por recombinación homóloga para inactivar el locus de cadena ligera κ de ratón en un proceso de dos etapas (Fig. 3)

55 En resumen, se delecionaron los segmentos génicos Jκ (1-5) del locus de cadena ligera κ de ratón endógeno en un único evento de direccionamiento usando un vector de direccionamiento que comprendía un casete de higromicinatimidina quinasa (hyg-TK) que contenía un único sitio loxP 3' al casete hyg-TK (Fig. 3, vector de direccionamiento de Jκ). Los brazos de homología usados para preparar este vector de direccionamiento contenían la secuencia genómica de ratón 5' y 3' de los segmentos génicos Jκ de ratón endógenos. En un segundo evento de direccionamiento, se preparó un segundo vector de direccionamiento para delecionar una parte de la secuencia genómica de ratón cadena arriba (5') al segmento génico Vκ de ratón endógeno más distal (Fig. 3, vector de direccionamiento de Vκ). Este vector de direccionamiento contenía un sitio lox511 invertido, un sitio loxP y un casete de neomicina. Los brazos de homología usados para preparar este vector de direccionamiento, contenían la

65 secuencia genómica de ratón cadena arriba del segmento génico Vκ de ratón más distal. Los vectores de direccionamiento e usaron de un modo secuencial (es decir, Jκ después Vκ) para direccionar el ADN en células ES.

Se confirmaron ES que albergaban un cromosoma doblemente abordado (es decir, un único locus κ de ratón endógeno abordado con ambos vectores de direccionamiento) por métodos de cariotipado y exploración (por ejemplo, Taqman™) conocidos en la técnica. Después se aisló el ADN de las células ES modificadas y se sometió a

tratamiento con recombinasa Cre mediando de ese modo la deleción de los segmentos génicos Vκ de ratón

5 endógenos y ambos casetes de selección, dejando al mismo tiempo dos sitios lox yuxtapuestos en orientación opuesta uno con relación al otro (Fig. 3, parte inferior; SEQ ID NO: 1).

Por tanto, se crearon dos loci de cadena ligera endógenos modificados (κ y λ) que contenían regiones potenciadoras y constantes intactas para insertar de forma progresiva segmentos génicos de la línea germinal λ humana no reordenados de un modo preciso usando los vectores de direccionamiento descritos a continuación.

Ejemplo II

Remplazo de loci de cadena ligera de ratón con un minilocus de cadena ligera λ humana

15 Se diseñaron por ingeniería múltiples vectores de direccionamiento para la inserción progresiva de segmentos génicos λ humanos en los loci de cadena ligera κ y λ de ratón endógenos usando métodos similares a los descritos anteriormente. Se hicieron múltiples modificaciones iniciales independientes a los loci de cadena ligera, endógenos produciendo cada uno un locus de cadena ligera quimérico que contenía segmentos génicos hVλ y Jλ unidos de forma funcional a genes constantes de cadena ligera de ratón y potenciadores.

Un minilocus λ humano que contiene 12 segmentos génicos Vλ humanos y uno Jλ humano. Se diseñó una

serie de vectores de direccionamiento iniciales para que contuvieran los primeros 12 segmentos génicos Vλ humanos consecutivos del grupo A y un segmento génico hJλ1 o cuatro segmentos génicos hJλ usando un clon

25 BAC humano llamado RP11-729g4 (Invitrogen). Las Fig. 4A y 4B muestran los vectores de direccionamiento que se construyeron para hacer una inserción inicial de los segmentos génicos de cadena ligera λ humana en los loci de cadena ligera λ y κ de ratón respectivamente.

Para un primer conjunto de vectores de direccionamiento iniciales, se diseñó un fragmento de ADN de 124.125 pb a partir del clon BAC 729g4 que contenía 12 segmentos génicos hVλ y un segmento génico hJλ1 para que contuviera un sitio PI-SceI 996 pb cadena abajo (3') del segmento génico hJλ 1 para el ligamiento de un brazo de homología de ratón 3'. Se usaron dos conjuntos diferentes de brazos de homología para el ligamiento a este fragmento humano; un conjunto de brazos de homología contenía secuencias λ de ratón endógenas del clon BAC 135k15 (Fig. 4A) y otro conjunto contenía la secuencia κ endógena 5' y 3' de los segmentos génicos Vκ y Jκ de ratón de los clones BAC

35 de ratón RP23-302g12 y RP23-254m04, respectivamente (Fig. 4B).

Para el vector de direccionamiento 12/1-λ (Fig. 4A), se diseñó un sitio PI-SceI en el extremo 5' de un fragmento de ADN de 27.847 pb que contenía el Cλ2-Jλ5-Cλ4 de ratón y el potenciador 2.4 del locus λ de ratón modificado descrito en el Ejemplo 1. El fragmento de ratón de ~28 kb se usó como brazo de homología 3' por ligamiento al

fragmento λ humano de ~124 kb, que creó una unión 3' que contenía, de 5' a 3', un segmento génico hJλ1, 996 pb de la secuencia λ humana 3' del segmento génico hJλ1, 1.229 pb de la secuencia λ de ratón 5' al gen Cλ2 de ratón, el gen Cλ2 de ratón y la parte restante del fragmento de ratón de ~28 kb. Cadena arriba (5') del segmento génico Vλ3-12 humano había 1.456 pb adicionales de la secuencia λ humana antes del inicio del brazo de homología de ratón 5', que contenía 23.792 pb del ADN genómico de ratón correspondiente a la secuencia 5' del locus λ de ratón

45 endógeno. Entre el brazo de homología 5' y el inicio de la secuencia λ humana había un casete de neomicina flanqueado por sitios Frt.

Por tanto, el vector de direccionamiento 12/1-λ incluía de 5' a 3', un brazo de homología 5' que contenía ~24 kb de la secuencia genómica λ de ratón 5' del locus λ endógeno, un sitio Frt 5', un casete de neomicina, un sitio Frt 3', ~123 kb de la secuencia λ genómica humana que contenía los 12 primeros segmentos génicos hVλ consecutivos y un segmento génico hJλ1, un sitio PI-SceI, y un brazo de homología 3' que contenía ~28 kb de la secuencia genómica de ratón que incluye los segmentos génicos Cλ2-Jλ4-Cλ4 endógenos, la secuencia del potenciador 2.4 de ratón y la secuencia genómica de ratón adicional cadena abajo (3') del potenciador 2.4 (Fig. 4A).

55 De un modo similar, el vector de direccionamiento 12/1-κ (Fig. 4B) empleó el mismo fragmento λ humano ~124 con la excepción de que se usaron brazos de homología de ratón que contenían la secuencia κ de ratón de modo que pudiera conseguirse direccionamiento al locus κ endógeno por recombinación homóloga. Por tanto, el vector de direccionamiento 12/1-κ incluía, de 5' a 3', un brazo de homología 5' que contenía ~23 kb de la secuencia genómica de ratón 5' del locus κ endógeno, un sitio I-CeuI y, un sitio Frt 5', un casete de neomicina, un sitio Frt 3', ~124 kb de la secuencia λ genómica humana que contenía los 12 primeros segmentos génicos hVλ consecutivos y un segmento génico hJλ1, un sitio PI-SceI, y un brazo de homología 3' que contenía ~28 kb de la secuencia genómica de ratón que incluye el gen Cκ de ratón endógeno, Eκi y Eκ3' y la secuencia genómica de ratón adicional cadena abajo (3') de Eκ3' (Fig. 4B, vector de direccionamiento 12/1-κ).

65 La recombinación homóloga con cualquiera de estos dos vectores de direccionamiento iniciales creó un locus de

cadena ligera de ratón modificado (κ o λ) que contenía 12 segmentos génicos hVλ y un segmento génico hJλ1 unido

de forma funcional al gen constante de cadena ligera de ratón endógeno y los potenciadores (Cκ o Cλ2 y Eκi/Eκ3' o Enh 2.4/Enh 3.1) que, tras la recombinación, conduce a la formación de una cadena ligera λ quimérica.

Un minilocus λ humano con 12 segmentos génicos Vλ humanos y cuatro Jλ humanos. En otro enfoque para

5 añadir diversidad a un locus de cadena ligera λ quimérico, se diseñó un tercer vector de direccionamiento inicial para insertar los doce primeros segmentos génicos Vλ humanos consecutivos del grupo A y los segmentos génicos hJλ1, 2, 3 y 7 en el locus de cadena ligera κ de ratón (Fig. 4B, vector de direccionamiento 12/4-κ). Se preparó un segmento de ADN que contenía los segmentos génicos hJλ1, Jλ2, Jλ3 y Jλ7 por síntesis de ADN de novo (Integrated DNA Technologies) incluyendo cada segmento génico Jλ y la secuencia genómica humana de ~100 pb de las regiones 5' y 3' inmediatas de cada segmento génico Jλ. Se diseñó un sitio PI-SceI en el extremo 3' de este fragmento de ADN de ~1 kb y se ligó a un casete de cloranfenicol. Los brazos de homología se amplificaron por

PCR a partir de la secuencia λ humana en las posiciones 5' y 3' respecto al segmento génico hJλ1 del clon BAC

humano 729g4. Se realizó recombinación homóloga con este vector de direccionamiento intermedio sobre un clon BAC 729g4 modificado que se había abordado previamente cadena arriba (5') del segmento génico Vλ3-12 humano

15 con un casete de neomicina flanqueado por sitios Frt, que también contenía un sitio I-CeuI 5' al sitio Frt 5'. El clon BAC 729g4 doblemente abordado incluía de 5' a 3' un sitio I-CeuI, un sitio Frt 5', un casete de neomicina, un sitio Frt 3', un fragmento de ~123 kb que contenía los 12 primeros segmentos génicos hVλ, un fragmento de ~1 kb que contenía los segmentos génicos Jλ1, 2, 3 y 7 humanos, un sitio PI-SceI, y un casete de cloranfenicol. Este vector de direccionamiento intermedio se digirió junto con I-CeuI y PI-SceI y posteriormente se ligó en el clon BAC de ratón modificado (descrito anteriormente) para crear el tercer vector de direccionamiento.

Este ligamiento provocó un tercer vector de direccionamiento para la inserción de secuencias λ humanas en el locus de cadena ligera κ endógeno, que incluía de 5' a 3', un brazo de homología de ratón 5' que contenía ~23 kb de la secuencia genómica 5' del locus κ de ratón endógeno, un sitio I-CeuI, un sitio Frt 5', un casete de neomicina, un sitio

25 Frt 3', un fragmento de ~123 kb que contenía los 12 primeros segmentos génicos hVλ, un fragmento de ~1 kb que contenía los segmentos génicos hJλ1, 2, 3 y 7, un sitio PI-SceI y un brazo de homología 3' que contenía ~28 kb de la secuencia genómica de ratón que incluye el gen Cκ de ratón endógeno, Eκi y Eκ3' y la secuencia genómica de ratón adicional cadena abajo (3') de Eκ3' (Fig. 4B, vector de direccionamiento 12/4-κ). La recombinación homóloga con este tercer vector de direccionamiento creó un locus de cadena ligera κ de ratón modificado que contenía 12 segmentos génicos hVλ y cuatro segmentos génicos hJλ unidos de forma funcional al gen Cκ de ratón endógeno que, tras la recombinación, conduce a la formación de una cadena ligera quimérica λ humana/κ de ratón.

Un minilocus λ humano con una secuencia de cadena ligera κ humana integrada. De un modo similar, se diseñaron dos vectores de direccionamiento adicionales similares a los diseñados para hacer una inserción inicial de

35 segmentos génicos λ humanos en el locus de cadena ligera κ endógeno (Fig. 4B, vectores de direccionamiento 12/1κ y 12/4-κ) para insertar progresivamente segmentos génicos de cadena ligera λ humana usando vectores de direccionamiento especialmente construidos que contenían secuencias genómicas λ y κ humanas contiguas. Estos vectores de direccionamiento se construyeron para incluir una secuencia genómica κ humana de ~23 kb localizada de forma natural entre los segmentos génicos Vκ4-1 y Jκ1 humanos. Esta secuencia genómica κ humana se posicionó específicamente en estos dos vectores de direccionamiento adicionales entre los segmentos génicos Vλ humano y Jλ humano (Fig. 4B. Vectores de direccionamiento 12(κ)1-κ y 12 (κ)4-κ).

Ambos vectores de direccionamiento que contenían la secuencia genómica κ humana se prepararon usando el clon

BAC RP11-729g4 modificado descrito anteriormente (Fig. 6). Este clon BAC modificado se abordó con un casete de

45 selección de espectinomicina flanqueado por sitios de restricción NotI y AsiSI (Fig. 6, superior izquierda). La recombinación homóloga con el casete de espectinomicina produjo un clon BAC 729g4 doblemente abordado que incluía de 5' a 3', un sitio I-CeuI, un sitio Frt 5', un casete de neomicina, un sitio Frt 3', un fragmento de ~123 kb que contenía los 12 primeros segmentos génicos hVλ, un sitio NotI aproximadamente 200 pb cadena abajo (3') a la secuencia nonamérica del segmento génico hVλ3-1, un casete de espectinomicina y un sitio AsiSI. Se abordó un clon BAC humano diferente que contenía la secuencia κ humana (CTD-2366j12) dos veces independientes para diseñar sitios de restricción en localizaciones entre los segmentos génicos hVκ4-1 y hJκ1 para permitir la posterior clonación de un fragmento de ~23 kb para el ligamiento con los segmentos génicos hVλ contenidos en el clon BAC 729g4 modificado doblemente abordado (Fig. 6, superior derecha).

55 En resumen, el clon BAC 2366j12 es de aproximadamente 132 kb de tamaño y contiene los segmentos génicos hVκ 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, la secuencia genómica κ humana cadena abajo de los segmentos génicos Vκ, los segmentos génicos hJκ1-5, el hCκ y aproximadamente 20 kb de secuencia genómica adicional del locus κ humano. Este clon primero se abordó con un vector de direccionamiento que contenía un casete de higromicina flanqueado por sitios Frt y un sitio NotI cadena abajo (3') del sitio Frt 3'. Los brazos de homología para este vector de direccionamiento contenían la secuencia genómica humana 5' y 3' de los segmentos génicos Vκ dentro del clon BAC de modo que, tras recombinación homóloga con este vector de direccionamiento, se delecionaran los segmentos génicos Vκ y se diseñó un sitio NotI ~133 pb cadena abajo del segmento génico hVκ4-1 (Fig. 6, superior derecha). Este clon BAC 2366j12 modificado se abordó independientemente con dos vectores de direccionamiento en el extremo 3' para delecionar los segmentos génicos hJκ con un casete de cloranfenicol que también contenía un

65 segmento génico hJλ1, un sitio PI-SceI y un sitio AsiSI o un fragmento genómico λ humano que contenía cuatro segmentos génicos hJλ (supra), un sitio PI-SceI y un sitio AsiSI (Fig. 6, superior derecha). Los brazos de homología

para estos dos vectores de direccionamiento similares contenían la secuencia 5' y 3' de los segmentos génicos hJκ.

La recombinación homóloga con estos segundos vectores de direccionamiento y el clon BAC 2366j12 modificado produjo un clon 2366j12 doblemente abordado que incluía, de 5' a 3', un sitio Frt 5', un casete de higromicina, un sitio Frt 3', un sitio NotI, un fragmento genómico de 22.800 pb del locus κ humano que contenía la región intergénica

5 entre los segmentos génicos Vκ4-1 y Jκ1, un segmento génico hJλ1 o un fragmento genómico λ humano que contenía hJλ1, Jλ2, Jλ3 y Jλ7, un sitio PI-SceI y un casete de cloranfenicol (Fig. 6, superior derecha). Se consiguieron dos vectores de direccionamiento finales para hacer las dos modificaciones adicionales mediante dos etapas de ligamiento usando los clones doblemente abordados 729g4 y 2366j12.

Se digirieron los clones 729g4 y 2366j12 doblemente abordados con NotI y AsiSI produciendo un fragmento que contenía el casete de neomicina y los segmentos génicos hVλ y otro fragmento que contenía el fragmento genómico de ~23 kb del locus κ humano que contenía la región intergénica entre los segmentos génicos Vκ4-1 y Jκ1, un segmento génico hJλ1 o un fragmento genómico que contenía los segmentos génicos hJλ1, Jλ2, Jλ3 y Jλ7, el sitio

PI-SceI y el casete de cloranfenicol respectivamente. El ligamiento de estos fragmentos generó dos clones BAC

15 únicos que contenían de 5' a 3' los segmentos génicos hVλ, la secuencia genómica κ humana entre los segmentos génicos Vκ4-1 y Jκ1, un segmento génico hJλ1 o un fragmento genómico que contenía los segmentos génicos hJλ1, Jλ2, Jλ3 y Jλ7, un sitio PI-SceI y un casete de cloranfenicol (Fig. 6, parte inferior). Estos nuevos clones BAC después se digirieron con I-CeuI y PI-SceI para liberar los fragmentos únicos que contenían el casete de neomicina cadena arriba y las secuencias λ y κ humanas contiguas y se ligaron en un clon BAC de ratón modificado 302g12 que contenía de 5' a 3' la secuencia genómica de ratón 5' del locus κ endógeno, un sitio I-CeuI, un sitio Frt 5', un casete de neomicina, un sitio Frt 3', los segmentos génicos hVλ (3-12 a 3-1), un sitio NotI ~200 pb cadena abajo de Vλ3-1, -23 kb de la secuencia κ humana encontrada de forma natural entre los segmentos génicos Vκ4-1 y Jκ1 humanos, un segmento génico hJλ1 o un fragmento genómico que contenía los segmentos génicos hJλ1, Jλ2, Jλ3 y Jλ7, el Eκi de ratón, el gen Cκ de ratón y Eκ3' (Fig. 4, vectores de direccionamiento 12hVλ-VκJκ-hJλ1 y 12hVλ-VκJκ

25 4hJλ). La recombinación homóloga con estos dos vectores de direccionamiento creó dos loci de cadena ligera κ de ratón modificados diferentes que contenían 12 segmentos génicos hVλ, la secuencia genómica κ humana, y uno o cuatro segmentos génicos hJλ unidos de forma funcional al gen Cκ de ratón endógeno que, tras recombinación, conduce a la formación de una cadena ligera quimérica λ humana/κ de ratón.

Ejemplo III

Diseño por ingeniería de segmentos génicos Vλ humanos adicionales en un mini-locus de cadena ligera λ humana

35 Se añadieron segmentos génicos hVλ adicionales independientemente a cada una de las modificaciones iniciales descritas en el Ejemplo 2 usando vectores de direccionamiento y métodos similares (FIG. 5A, vector de direccionamiento +16-λ y FIG. 5B, vector de direccionamiento +16-κ).

Introducción de 16 segmentos génicos Vλ humanos adicionales. Los brazos de homología cadena arriba (5') usados en la construcción de vectores de direccionamiento para añadir 16 segmentos génicos hVλ adicionales a los

loci de cadena ligera modificados descritos en el Ejemplo 2 contenían la secuencia genómica de ratón 5' de

cualquiera de los loci de cadena ligera κ o λ endógenos. Los brazos de homología 3' eran iguales para todos los

vectores de direccionamiento y contenían la secuencia genómica humana solapante con el extremo 5' de la

secuencia λ humana de las modificaciones descritas en el Ejemplo 2.

En resumen, se diseñaron dos vectores de direccionamiento para la introducción de 16 segmentos génicos hVλ

adicionales en los loci de cadena ligera de ratón modificados descritos en el Ejemplo 2 (FIG. 5A y 5B, vector de direccionamiento +16-λ o +16-κ). Se diseñó un fragmento de ADN de ~172 kb del clon BAC humano RP11-761I13 (Invitrogen) que contenía 21 segmentos génicos hVλ consecutivos del grupo A con un brazo de homología 5' que contenía la secuencia genómica de ratón 5' a cualquiera de los loci de cadena ligera κ o λ endógenos y un brazo de homología 3' que contenía la secuencia λ genómica humana. Los brazos de homología κ o λ de ratón 5' usados en

estas construcciones de direccionamiento eran los mismos brazos de homología 5' descritos en el Ejemplo 2 (FIG.

5A y 5B). El brazo de homología 3' incluía un solapamiento de 53.057 pb de la secuencia λ genómica humana correspondiente al extremo 5' equivalente del fragmento de aproximadamente ~123 kb de la secuencia λ genómica

55 humana descrita en el Ejemplo 2. Estos dos vectores de direccionamiento incluían, de 5' a 3', un brazo de homología de ratón 5' que contenía ~23 kb de la secuencia genómica 5' del locus de cadena ligera κ de ratón endógeno o ~24 kb de la secuencia genómica de ratón 5' del locus de cadena ligera λ endógeno, un sitio Frt 5', un casete de higromicina, un sitio Frt 3' y 171.457 pb de la secuencia λ genómica humana que contenía 21 segmentos génicos hVλ consecutivos, ~53 kb de los cuales solapan con el extremo 5' de la secuencia λ humana descrita en el Ejemplo 3 y sirve como brazo de homología 3' para esta construcción de direccionamiento (FIG. 5A y 5B, vectores de direccionamiento +16-λ o +16-κ). La recombinación homóloga con estos vectores de direccionamiento creó loci de cadena ligera κ y λ de ratón modificados independientemente que contenían cada uno 28 segmentos génicos hVλ y un segmento génico hJλ1 unidos de forma funcional a genes constantes de ratón endógenos (Cκ o Cλ2) que, tras la recombinación, conduce a la formación de una cadena ligera quimérica.

65 De un modo similar, también se usó el vector de direccionamiento +16-κ para introducir los 16 segmentos génicos

hVλ adicionales a las otras modificaciones iniciales descritas en el Ejemplo 2 que incorporaban múltiples segmentos génicos hJλ con y sin una secuencia κ humana integrada (FIG. 4B). La recombinación homóloga con este vector de direccionamiento en el locus κ de ratón endógeno que contenía las otras modificaciones iniciales creó loci de cadena ligera κ de ratón que contenían 28 segmentos génicos hVλ y los segmentos génicos hJλ1, 2, 3 y 7 con y sin una

5 secuencia genómica Vκ-Jκ humana unida de forma funcional al gen Cκ de ratón endógeno que, tras la recombinación, conduce a la formación de una cadena ligera λ-κ quimérica.

Introducción de 12 segmentos génicos Vλ humanos adicionales. Se añadieron segmentos génicos hVλ

adicionales independientemente a cada una de las modificaciones descritas anteriormente usando vectores de direccionamiento y métodos similares. La estructura final del locus resultante de la recombinación homóloga con vectores de direccionamiento que contenían segmentos génicos hVλ adicionales se muestra en la FIG. 7A y 7B.

En resumen, se diseñó un vector de direccionamiento para la introducción de 12 segmentos génicos hVλ adicionales a los loci de cadena ligera κ y λ de ratón modificados descritos anteriormente (FIG. 5A y 5B, vectores de 15 direccionamiento +12-λ o +12-κ). Se diseñó un fragmento de ADN de 93.674 pb del clon BAC humano RP11-22I18 (Invitrogen) que contenía 12 segmentos génicos hVλ consecutivos del grupo B con un brazo de homología 5' que contenía la secuencia genómica de ratón 5' a cualquiera de los loci de cadena ligera κ o λ de ratón endógenos y un brazo de homología 3' que contenía la secuencia λ genómica humana. Los brazos de homología 5' usados en esta construcción de direccionamiento eran los mismos brazos de homología 5' usados para la adición de 16 segmentos génicos hVλ descritos anteriormente (FIG. 5A y 5B). El brazo de homología 3' se preparó diseñando un sitio PI-SceI ~3431 pb 5' al segmento génico Vλ3-29P humano contenido en un fragmento genómico de 27.468 pb de la secuencia λ humana del clon BAC RP11-761I13. Este sitio PI-SceI sirvió como punto de ligamiento para unir el fragmento de ~94 kb de la secuencia λ humana adicional al fragmento de ~27 kb de la secuencia λ humana que solapa con el extremo 5' de la secuencia λ humana en la modificación previa usando los vectores de 25 direccionamiento +16-λ o +16-κ (FIG. 5A y 5B). Estos dos vectores de direccionamiento incluían, de 5' a 3', un brazo de homología 5' que contenía ~23 kb de la secuencia genómica de ratón 5' del locus de cadena ligera κ endógeno o ~24 kb de la secuencia genómica de ratón 5' del locus de cadena ligera λ endógeno, un sitio Frt 5', un casete de neomicina, un sitio Frt 3' y 121.188 pb de la secuencia λ genómica humana que contenía 16 segmentos génicos hVλ y un sitio PI-SceI, ~27 kb de los cuales solapan con el extremo 5' de la secuencia λ humana desde la inserción de 16 segmentos génicos hVλ adicionales y sirve como brazo de homología 3' para esta construcción de direccionamiento (FIG. 5A y 5B, vectores de direccionamiento +12-λ o +12-κ). La recombinación homóloga con estos vectores de direccionamiento creó independientemente loci de cadena ligera κ y λ de ratón modificados que contenían 40 segmentos génicos hVλ y Jλ1 humano unido de forma funcional a los genes constantes de ratón endógenos (Cκ o Cλ2) que, tras la recombinación, conduce a la formación de una cadena ligera quimérica (parte inferior de la FIG. 5A

35 y 5B).

De un modo similar, también se usó el vector de direccionamiento +12κ para introducir los 12 segmentos génicos hVλ adicionales a las otras modificaciones iniciales que incorporaban múltiples segmentos génicos hJλ con y sin una secuencia κ humana integrada (FIG. 4B). La recombinación homóloga con este vector de direccionamiento en el locus κ de ratón endógeno que contenía las otras modificaciones creó un locus de cadena ligera κ de ratón que contenía 40 segmentos génicos hVλ y los segmentos génicos hJλ1, 2, 3 y 7 con y sin una secuencia genómica Vκ-Jκ humana unida de forma funcional al gen Cκ de ratón endógeno que, tras la recombinación, conduce a la formación de una cadena ligera λ-κ quimérica.

45 Ejemplo IV Identificación de células ES abordadas que albergan segmentos génicos de cadena ligera λ humana

Se usó el ADN de BAC abordado preparado de acuerdo con los Ejemplos anteriores para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas para generar ratones quiméricos que expresen segmentos génicos de cadena ligera λ humana. Se identificaron células ES que contenían una inserción de segmentos génicos de cadena ligera λ humana no reordenados por un ensayo TAQMAN® cuantitativo. Se diseñaron conjuntos de cebadores específicos y sondas para la inserción de secuencias λ humanas y se asociaron casetes de selección (ganancia de

alelo, GOA), pérdida de secuencias endógenas de ratón y cualquier casete de selección (pérdida de alelo, LOA) y 55 retención de secuencias de ratón flanqueantes (retención de alelo, AR). Para cada inserción adicional de secuencias

λ humanas, se usaron conjuntos de cebadores y sondas adicionales para confirmar la presencia de las secuencias λ

humanas adicionales, así como los conjuntos de cebadores y sondas previos usados para confirmar la retención de las secuencias humanas previamente abordadas. La Tabla 1 expone los cebadores y sondas asociadas usados en los ensayos de PCR cuantitativa. La Tabla 2 expone las combinaciones usadas para confirmar la inserción de cada

sección de segmentos génicos de cadena ligera λ humana en clones de células ES.

Las células ES que albergan los segmentos génicos de cadena ligera λ humana se transfectan opcionalmente con una construcción que expresa FLP para retirar el casete de neomicina flanqueado por Frt introducido mediante la inserción de la construcción de direccionamiento que contiene los segmentos génicos Vλ5-52 -Vλ1-40 humanos 65 (FIG. 5A y 5B). El casete de neomicina puede retirarse opcionalmente cruzándolos con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se retiene en los

ratones.

Tabla 1

Cebador: SEQ ID NO: Sonda SEQ ID NO:

hL2F: 2 hL2P 24

hL2R: 3

hL3F: 4 hL3P 25

hL3R: 5

NeoF: 6 NeoP 26

NeoR: 7

61hJ1F: 8 61hJ1P 27

61hJ1R: 9

67hT1F: 10 67hT1P 28

67hT1R: 11

67hT3F: 12 67hT3P 29

67hT3R: 13

HygF: 14 HygP 30

HygR: 15

MKD2F: 16 MKD2P 31

MKD2R: 17

MKP8F: 18 MKP8P 32

MKP8R: 19

MKP15F: 20 MKP15P 33

MKP15R: 21

MK20F: 22 - -

MKP4R: 23

68h2F: 34 68h2P 38

68h2R: 35

68h5F: 36 68h5P 39

68h5R: 37

mL1F: 75 mL1P 83

mL1R: 76

mL2F: 77 mL2P 84

mL2R: 78

mL11F: 79 mL11P 85

mL11R: 80

mL12F: 81 mL12P 86

mL12R: 82

Tabla 2

Modificación Ensayo Conjunto de cebadores directo/inverso Sonda Localización de secuencia

Inserción de 12 hVλ y hJλ 1: GOA hL2F/hL2R hL2P hVλ3-12-hVλ3-1

hL3F/hL3R: hL3P

61hJ1F/61hJ1R: 61hJ1P secuencia hJλ

NeoF/NeoR: NeoP Casete de neomicina

LOA: MK20F/MKP4R - Secuencia lox511/loxP de locus κ inactivado

HygF/HygR: HygP Casete de higromicina de locus λ inactivado

mL1F/mL1R: mL1P Grupo Vλ1-Cλ1 de ratón

mL2F/mL2R: mL2P

mL11F/mL11R: mL11P Grupo Vλ2-Cλ2 de ratón

mL12F/mL12R: mL12P

AR/LOA: MKD2F/MKD2R MKD2P Secuencia de ratón en el locus Vκ 5’

MKP15F/MKP15R: MKP15P Secuencia de ratón en el locus Vκ 3’

Inserción de 16 hVλ: GOA 67hT1F/67hT1R 67hT1P hVλ3-27 -hVλ3-12

67hT3F/67hT3R: 67hT3P

HygF/HygR: HygP Casete de higromicina

LOA: NeoF/NeoR NeoP Casete de neomicina

mL1F/mL1R: mL1P Grupo Vλ1-Cλ1 de ratón

mL2F/mL2R: mL2P

mL11F/mL11R: mL11P Grupo Vλ2-Cλ2 de ratón

mL12F/mL12R: mL12P

AR: hL2F/hL2R hL2P hVλ3-12-hVλ3-1

hL3F/hL3R: hL3P

AR/LOA: MKD2F/MKD2R MKD2P Secuencia de ratón en el locus Vκ 5’

MKP15F/MKP15R: MKP15P Secuencia de ratón en el locus Vκ 3’

Inserción de 12 hVλ: GOA 68h2F/68h2R 68h2P hVλ5-52-hVλ1-40

68h5F/68h5R: 68h5P

NeoF/NeoR: NeoP Casete de neomicina

LOA: HygF/HygR HygP Casete de higromicina

mL1F/mL1R: mL1P Grupo Vλ1-Cλ1 de ratón

mL2F/mL2R: mL2P

mL11F/mL11R: mL11P Grupo Vλ2-Cλ2 de ratón

mL12F/mL12R: mL12P

AR: hL2F/hL2R hL2P hVλ3-12-hVλ3-1

hL3F/hL3R: hL3P

67hT1F/67hT1R: 67hT1P hVλ3-27-hVλ3-12

67hT3F/67hT3R: 67hT3P

AR/LOA: MKD2F/MKD2R MKD2P Secuencia de ratón en el locus Vκ 5’

MKP15F/MKP15R: MKP15P Secuencia de ratón en el locus Vκ 3’

Ejemplo V

Generación de ratones que expresan cadenas ligeras λ humanas a partir de un locus de cadena ligera 5 endógeno

Se usaron células ES abordadas descritas anteriormente como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en fase de 8-células por el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º

7.294.754 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene

10 targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (ratones F0 obtenidos completamente de la célula Es donante) que albergaban independientemente segmentos génicos λ humanos se identificaron por genotipado usando una modificación del ensayo de alelo (Valenzuela et al., supra) que detectaba la presencia de los segmentos génicos λ humanos únicos (supra).

15 Uso de cadena ligera κ:λ de ratones que albergan segmentos génicos de cadena ligera λ humana. Se analizaron ratones homocigóticos para cada una de las tres inserciones sucesivas de segmentos génicos hVλ con un único segmento génico hJλ (FIG. 5B) y ratones homocigóticos para una primera inserción de segmentos génicos hVλ con un único segmento génico hJλ o cuatro segmentos génicos Jλ humanos que incluyen una secuencia genómica Vκ-Jκ humana (FIG. 4B) para la expresión de la cadena ligera κ y λ en esplenocitos usando citometría de

20 flujo.

En resumen, se recogieron bazos de grupos de ratones (que variaban de 3 a 7 animales por grupo) y se trituraron usando portaobjetos de vidrio. Después de la lisis de los glóbulos rojos (RBC) con tampón de lisis ACK (Lonza Walkersville), se tiñeron los esplenocitos con anticuerpos conjugados con colorante fluorescente específicos para

25 CD19 de ratón (clon 1 D3; BD Biosciences), CD3 de ratón (17A2; Biolegend), Igκ de ratón (187.1; BD Biosciences) e Igλ de ratón (RML-42; Biolegend). Los datos se adquirieron un citómetro de flujo BD™ LSR II (BD Biosciences) y se analizaron usando el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). La Tabla 3 expone los valores porcentuales promedio para la expresión de células B (CD19+), cadena ligera κ (CD19+Igκ+Igλ-) y cadena ligera λ (CD19+Igκ-Igλ+) observada en esplenocitos de grupos de animales que albergan cada modificación genética.

30 En un experimento similar, se analizaron los contenidos de células B del compartimento esplénico de ratones homocigóticos para un primera inserción de 12 segmentos génicos hVλ y 4 hJλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana unida de forma funcional al gen Cκ de ratón (parte inferior de la FIG. 4B) y ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y 1 hJλ (parte inferior de la FIG. 5B o parte superior de la FIG. 7B) para la expresión

35 de Igκ e Igλ usando citometría de flujo (como se ha descrito anteriormente). La FIG. 8A muestra la expresión de Igλ e Igκ en células B CD19+ para un ratón representativo de cada grupo. La cantidad de células B CD19+ por bazo también se registró para cada ratón (FIG. 8B).

En otro experimento, se analizaron los contenidos de células B de los compartimentos de bazo y médula ósea de

40 ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y 4 hJλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana unida de forma funcional al gen Cκ de ratón (parte inferior de la FIG. 7B) para la progresión a través del desarrollo de células B usando citometría de flujo de diversos marcadores de superficie celular.

En resumen, se sacrificaron dos grupos (N=3 cada uno, 9-12 semanas de edad, machos y hembras) de ratones de

45 tipo silvestre y homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y 4 hJλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana unida de forma funcional al gen Cκ de ratón y se recogieron los bazos y la médula ósea. La médula ósea se

recogió de los fémures por lavado abundante con medio RPMI completo (medio RPMI suplementado con suero de ternera fetal, piruvato sódico, Hepes, 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, y gentamicina). Se lisaron las RBC de preparaciones de bazo y médula ósea con tampón de lisis ACK (Lonza Walkersville), seguido por lavado con medio RPMI completo. Se incubaron 1 x 106 células con anticuerpo anti-CD16/CD32 de ratón (2.4G2, BD

5 Biosciences) en hielo durante 10 minutos, seguido por marcaje con un panel de anticuerpos seleccionados durante 30 minutos en hielo.

Panel de médula ósea: anticuerpo anti-FITC-CD43 de ratón (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7

10 CD19 (ID3, BD) y Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend).

Panel de médula ósea y bazo: anticuerpo anti-FITC-Igκ de ratón (187.1, BD), PE-Igλ (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, ebioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC-B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD).

15 Después de la tinción, las células se lavaron y fijaron en formaldehído al 2 %. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo FACSCANTOII™ (BD Biosciences) y se analizaron con el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Las FIG. 9A -9D muestran los resultados para el compartimento esplénico de un ratón representativo de cada grupo. Las FIG. 10A -10 E muestran los resultados para el compartimento de médula ósea de un ratón

20 representativo de cada grupo. La Tabla 4 expone los valores porcentuales promedio para la expresión de células B (CD19+), cadena ligera κ (CD19+Igκ+Igλ-) y cadena ligera λ (CD19+Igκ-Igλ+) observada en esplenocitos de grupos de animales que albergan diversas modificaciones genéticas. La Tabla 5 expone los valores porcentuales promedio para las células B (CD19+), células B maduras (B220hiIgM+), células B inmaduras (B220intIgM+), células B inmaduras que expresan cadena ligera κ (B220intIgM+Igκ+) y células B inmaduras que expresan cadena ligera λ

25 (B220intIgM+Igλ+) observadas en médula ósea de ratones de tipo silvestre y homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y 4 hJλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana unida de forma funcional al gen Cκ de ratón. Este experimento se repitió con grupos adicionales de los ratones descritos anteriormente y demostró resultados similares (datos no mostrados).

30 Tabla 3

Genotipo: % células B % Igκ+ % Igλ+

Tipo silvestre: 46,2 91,0 3,6

12 hVλ+hJλ1: 28,3 10,4 62,5

12 hVλ-VκJκ-hJλ1: 12,0 11,0 67,5

12 hVλ-VκJκ-4hJλ: 41,8 17,2 68,4

28 hVλ+hJλ1: 22,0 13,3 51,1

40 hVλ+hJλ1: 28,2 24,3 53,0

Tabla 4

Genotipo: % células B % Igκ+ % Igλ+

Tipo silvestre: 49,8 91,2 3,5

40 hVλ-VκJκ-4hJλ: 33,3 41,6 43,1

Tabla 5

Genotipo: % células B % células B maduras % células B inmaduras % células B Inmaduras Igκ+ % células B inmaduras Igλ+

Tipo silvestre: 62,2 9,2 12,0 79,0 8,84

40hVλ-VκJκ-4hJλ: 60,43 2,59 7,69 38,29 43,29

35 Uso del gen Vλ humano en ratones que albergan segmentos génicos de cadena ligera λ humana. Se analizaron ratones heterocigóticos para una primera inserción de secuencias λ humanas (hVλ3-12 -hVλ3-1 y hJλ1, FIG. 5B) y homocigóticos para una tercera inserción de secuencias λ humanas (hVλ5-52 -hVλ3-1 y hJλ1, FIG. 5B) para el uso del gen de cadena ligera λ humana por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

40 (RT-PCR) usando el ARN aislado de esplenocitos.

En resumen, se recogieron los bazos y se perfundieron con 10 ml de RPMI-1640 (Sigma) con HI-FBS al 5 % en bolsas desechables estériles. Cada bolsa que contenía un único bazo después se colocó en un STOMACHER™ (Seward) y se homogeneizó en un ajuste medio durante 30 segundos. Los bazos homogeneizados se filtraron

45 usando un filtro celular de 0,7 µm y después se sedimentaron con una centrífuga (1000 rpm durante 10 minutos) y se lisaron las RBC en BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) durante tres minutos. Los esplenocitos se diluyeron con RPMI-1640 y se centrifugaron de nuevo, seguido por resuspensión en 1 ml de PBS (Irvine Scientific). El ARN se aisló de esplenocitos sedimentados usando técnicas convencionales conocidas en la técnica.

50 Se realizó RT-PCR sobre el ARN de esplenocitos usando cebadores específicos para los segmentos génicos hVλ

humanos y el gen Cκ de ratón (Tabla 6). Los productos de PCR se purificaron del gel y se clonaron en el vector

pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) y se secuenciaron con los cebadores M13 directo (GTAAAACGACGGCCAG; SEQ ID NO: 55) y M13 inverso (CAGGAAACAGCTATGAC; SEQ ID NO: 56) localizados dentro del vector en localizaciones que flanquean el sitio de clonación. Se secuenciaron ochenta y cuatro clones totales derivados de la primera y 5 tercera inserción de secuencias λ humanas para determinar el uso del gen hVλ (Tabla 7). La secuencia de nucleótidos de la unión hVλ-hJλ1-mCκ para clones de RT-PCR seleccionados se muestra en la FIG. 11.

De un modo similar, se analizaron ratones homocigóticos para una tercera inserción de secuencias génicas de

cadena ligera λ humana (es decir, 40 segmentos génicos hVλ y 4 segmentos génicos hJλ incluyendo una secuencia 10 genómica Vκ-Jκ humana, parte inferior de la FIG. 7B) unidos de forma funcional al gen Cκ de ratón endógeno para el uso del gen de cadena ligera λ humana por RT-PCR usando el ARN aislado de esplenocitos (como se ha descrito anteriormente). El uso del segmento génico de cadena ligera λ humana para 26 clones de RT-PCR seleccionados se muestra en la Tabla 8. La secuencia de nucleótidos de la unión hVλ-hJλ-mCκ para los clones RT-PCR seleccionados se muestra en la FIG. 12. 15 De un modo similar, se analizaron ratones homocigóticos para una primera inserción de los segmentos génicos de cadena ligera λ humana (12 segmentos génicos hVλ y hJλ1, FIG. 4A y FIG. 5B) unidos de forma funcional al gen Cλ2 de ratón endógeno para el uso del gen de cadena ligera λ humana por RT-PCR usando el ARN aislado de esplenocitos (como se ha descrito anteriormente). Los cebadores específicos para los segmentos génicos hVλ 20 (Tabla 6) se emparejaron con uno de dos cebadores específicos para el gen Cλ2 de ratón; Cλ2-1 (SEQ ID NO:104)

o Cλ2-2 (SEQ ID NO:105).

Se observaron múltiples segmentos génicos hVλ reordenados en hλ1 de los clones de RT-PCR de ratones que albergaban segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus de cadena ligera λ de ratón endógeno. La 25 secuencia de nucleótidos de la unión hVλ-hJλ-mCλ2 para los clones de RT-PCR seleccionados se muestra en la FIG. 13.

Tabla 6

Cebador de hVλ 5': Secuencia (5'-3') SEQ ID NO:

VLL-1: CCTCTCCTCC TCACCCTCCT 40

VLL-1n: ATGRCCDGST YYYCTCTCCT 41

VLL-2: CTCCTCACTC AGGGCACA 42

VLL-2n: ATGGCCTGGG CTCTGCTSCT 43

VLL-3: ATGGCCTGGA YCSCTCTCC 44

VLL-4: TCACCATGGC YTGGRYCYCM YTC 45

VLL-4.3: TCACCATGGC CTGGGTCTCC TT 46

VLL-5: TCACCATGGC CTGGAMTCYT CT 47

VLL-6: TCACCATGGC CTGGGCTCCA CTACTT 48

VLL-7: TCACCATGGC CTGGACTCCT 49

VLL-8: TCACCATGGC CTGGATGATG CTT 50

VLL-9: TAAATATGGC CTGGGCTCCT CT 51

VLL-10: TCACCATGCC CTGGGCTCTG CT 52

VLL-11: TCACCATGGC CCTGACTCCT CT 53

Cebador de Cκ de ratón 3': Secuencia (5'-3') SEQ ID NO:

mlgKC3'-1: CCCAAGCTTA CTGGATGGTG GGAAGATGGA 54

30 Tabla 7

hVλ N.º observado de clones

3-1: 2

4-3: 3

2-8: 7

3-9: 4

3-10: 3

2-14: 1

3-19: 1

2-23: 7

3-25: 1

1-40: 9

7-43: 2

1-44: 2

5-45: 8

7-46: 3

9-49: 6

1-51: 3

Tabla 8

Clon: hVλ hJλ

1-3: 1-44 7

1-5: 1-51 3

2-3: 9-49 7

2-5: 1-40 1

2-6: 1-40 7

3b-5: 3-1 7

4a-1: 4-3 7

4a-5: 4-3 7

4b-1: 1-47 3

5-1: 3-10 3

5-2: 1-40 7

5-3: 1-40 7

5-4: 7-46 2

5-6: 1-40 7

5-7: 7-43 3

6-1: 1-40 1

6-2: 1-40 2

6-7: 1-40 3

7a-1: 3-10 7

7a-2: 9-49 2

7a-7: 3-10 7

7b-2: 7-43 3

7b-7: 7-46 7

7b-8: 7-43 3

11 a-1: 5-45 2

11 a-2: 5-45 7

La FIG. 11 muestra la secuencia de la unión hVλ-hJλ1-mCκ para clones de RT-PCR de ratones que albergan una

5 primera y tercera inserción de segmentos génicos hVλ con un único segmento génico hJλ. Las secuencias mostradas en la FIG. 11 ilustran reordenamientos únicos que implican diferentes segmentos génicos hVλ con hJλ1 recombinado con el gen Cκ de ratón. Ratones heterocigóticos que albergaban un único locus κ endógeno modificado que contenía 12 segmentos génicos hVλ y hJλ1 y ratones homocigóticos que albergaban 2 loci κ endógenos modificados que contenían 40 segmentos génicos hVλ y hJλ1 eran ambos capaces de producir segmentos génicos λ

10 humanos unidos de forma funcional al gen Cκ de ratón y producir células B que expresaban cadenas ligeras λ humanas. Estos reordenamientos demuestran que los loci quiméricos eran capaces de reordenar independientemente segmentos génicos λ humanos en múltiples células B independientes en estos ratones. Además, estas modificaciones en el locus de cadena ligera κ endógeno no volvían a ningún segmento génico hVλ no funcional o evitaban que el locus quimérico recombinara con múltiples hVλ y un segmento génico hJλ (Jλ1)

15 durante el desarrollo de células B como se evidencia por los 16 segmentos génicos hVλ diferentes que se observó que se reordenaban con hJλ1 (Tabla 7). Además, estos ratones generaron anticuerpos funcionales que contenían segmentos génicos Vλ-Jλ humanos reordenados unidos de forma funcional a genes Cκ de ratón como parte del repertorio de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno.

20 La FIG. 12 muestra la secuencia de la unión hVλ-hJλ-mCκ para clones de RT-PCR seleccionados de ratones homocigóticos para 40 segmentos génicos hVλ y 4 hJλ incluyendo una secuencia genómica Vκ-Jκ humana. Las secuencias mostradas en la FIG. 12 ilustran reordenamientos únicos adicionales que implican múltiples segmentos génicos hVλ diferentes, que abarcan el locus quimérico completo, con múltiples segmentos génicos hJλ diferentes reordenados y unidos de forma funcional al gen Cκ de ratón. Ratones homocigóticos que albergan loci κ endógenos

25 modificados que contenían 40 segmentos génicos hVλ y 4 hJλ también eran capaces de producir segmentos génicos λ humanos unidos de forma funcional al gen Cκ de ratón y producir células B que expresaban cadenas ligeras λ humanas. Estos reordenamientos demuestran adicionalmente que todas las fases de los loci quiméricos eran capaces de reordenar independientemente segmentos génicos λ humanos en múltiples células B independientes en estos ratones. Además, estas modificaciones adicionales al locus de cadena ligera κ endógeno

30 demuestran que cada inserción de segmentos génicos λ humanos no vuelven a ningunos de los segmentos génicos hVλ y/o Jλ no funcionales o evitan que el locus quimérico recombine los segmentos hVλ y Jλ durante el desarrollo de células B como se evidencia por 12 segmentos génicos hVλ diferentes que se observó que se reordenaban con los 4 segmentos génicos hJλ (Tabla 8) de los 26 clones de RT-PCR seleccionados. Además, estos ratones también generaron anticuerpos funcionales que contenían segmentos génicos Vλ-Jλ humanos unidos de forma funcional a

35 regiones Cκ de ratón como parte del repertorio de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno.

La FIG. 13 muestra la secuencia de la unión hVλ-hJλ-mCλ2 para tres clones de RT-PCR individuales de ratones

homocigóticos para 12 segmentos génicos hVλ y hJλ1. Las secuencias mostradas en la FIG. 13 ilustran reordenamientos únicos adicionales que implican diferentes segmentos génicos hVλ, que abarcan la longitud de la primera inserción, con hJλ1 reordenado y unido de forma funcional al gen Cλ2 de ratón (2D1 = Vλ2-8Jλ1; 2D9 = Vλ3-10Jλ1; 3E15 = Vλ3-1Jλ1). Un clon demostró un reordenamiento no productivo debido a adiciones N en la unión

5 hVλ-hJλ (2D1, FIG. 13). Esto no es infrecuente en la recombinación V(D)J, ya que la unión de segmentos génicos durante la recombinación ha demostrado ser imprecisa. Aunque este clon representa un recombinante no productivo presente en el repertorio de cadena ligera de estos ratones, demuestra que el mecanismo genético que contribuye a la diversidad de unión entre genes de anticuerpo está funcionando de forma normal en estos ratones y conduciendo a un repertorio de anticuerpos que contiene cadenas ligeras con mayor diversidad.

10 Ratones homocigóticos que albergan loci λ endógenos modificados que contienen 12 segmentos génicos hVλ y hJλ1 también eran capaces de producir segmentos génicos λ humanos unidos de forma funcional a un gen Cλ de ratón endógeno y producir células B que expresaban cadenas ligeras λ quiméricas inversas que contenían regiones hVλ unidas a regiones Cλ de ratón. Estos reordenamientos demuestran adicionalmente que segmentos génicos de

15 cadena ligera λ humana colocados en el otro locus de cadena ligera (es decir, el locus λ) eran capaces de reordenar independientemente segmentos génicos λ humanos en múltiples células B independientes en estos ratones. Además, las modificaciones al locus de cadena ligera λ endógeno demuestran que la inserción de segmentos génicos λ humanos no volvían a ninguno de los segmentos génicos hVλ y/o hJλ1 no funcionales o evitaban que el locus quimérico recombinara los segmentos génicos hVλ y hJλ1 durante el desarrollo de células B. Además, estos

20 ratones también generaron anticuerpos funcionales que contenían segmentos génicos Vλ-Jλ humanos unidos de forma funcional a una región Cλ de ratón como parte del repertorio de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno.

Como se muestra en este Ejemplo, ratones que albergaban segmentos génicos de cadena ligera λ humana en los loci de cadena ligera κ y λ endógenos eran capaces de reordenar segmentos génicos de cadena ligera λ humana y 25 de expresarlos en el contexto de una región Cκ y/o Cλ de ratón como parte del repertorio de anticuerpo normal del ratón porque se requería una cadena ligera funcional en diversos puntos de control en el desarrollo de células B tanto en el bazo como en médula ósea. Además, subconjuntos prematuros de células B (por ejemplo, células pre B, pro B y B transicionales) demuestran un fenotipo normal en estos ratones en comparación con compañeros de camada de tipo silvestre (FIG. 9D, 10A y 10B). Se observó un pequeño déficit en poblaciones de células B de

30 médula ósea y periféricas, que puede atribuirse a una deleción de un subconjunto de células B inmaduras autoreactivas y/o una asociación subóptima de cadena ligera λ humana con cadena pesada de ratón. Sin embargo, el uso Igκ/Igλ observado en estos ratones demuestra una situación que es más similar a la expresión de cadena ligera humana que la observada en ratones.

Ejemplo VI

Cruce de ratones que expresan cadenas ligeras λ humanas a partir de un locus de cadena ligera endógeno

5 Para optimizar el uso de los segmentos génicos λ humanos en un locus de cadena ligera de ratón endógeno, se cruzaron ratones que albergaban los segmentos génicos λ humanos no reordenados con otro ratón que contenía una deleción en el locus de cadena ligera endógeno opuesto (κ o λ). Por ejemplo, los segmentos génicos λ humanos posicionados en el locus κ endógeno serían los únicos segmentos génicos de cadena ligera funcionales presentes en un ratón que también portaría una deleción en el locus de cadena ligera λ endógeno. De este modo, la

10 descendencia obtenida expresaría solamente cadenas ligeras λ humanas como se describe en los ejemplos anteriores. El cruce se realiza por técnicas convencionales reconocidas en la técnica y, como alternativa, por compañías comerciales, por ejemplo, The Jackson Laboratory. Se exploran cepas de ratón que albergan segmentos génicos de cadena ligera λ humana en el locus κ endógeno y una deleción del locus de cadena ligera λ endógeno para la presencia de las cadenas ligeras λ quiméricas inversas únicas (ser humano-ratón) y la ausencia de cadenas

15 ligeras λ de ratón endógenas.

También se cruzaron ratones que albergaban un locus de cadena ligera λ humano no reordenado con ratones que

contenían un remplazo del locus del gen variable de cadena pesada de ratón endógeno con el locus del gen variable de cadena pesada humano (véase, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, el ratón modificado

20 por ingeniería genética VELOCIMMUNE®). El ratón VELOCIMMUNE® incluye, en parte, un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada humana unidas de forma funcional a loci de región constante de ratón endógeno de modo que el ratón produce anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada humana y una región constante de cadena pesada de ratón en respuesta a estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos puede aislarse y unirse de forma funcional

25 a ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada humana. El ADN después puede expresarse en una célula capaz de expresar la cadena pesada completamente humana del anticuerpo. Tras un programa de cruce adecuado, se obtienen ratones que albergan un remplazo del locus de cadena pesada de ratón endógeno con el locus de cadena pesada humana y un locus de cadena ligera λ humana no reordenada en el locus de cadena ligera κ endógena. Pueden aislarse anticuerpos que contienen regiones variables de cadena pesada humana mutadas

30 somáticamente y regiones variables de cadena ligera λ humana tras inmunización con un antígeno de interés.

Ejemplo VII

Generación de anticuerpos a partir de ratones que expresan cadenas pesadas humanas y cadenas ligeras λ 35 humanas

Después de cruzar ratones que contienen el locus de cadena ligera λ humana no reordenado con diversas cepas

deseadas que contienen modificaciones y deleciones de otros loci de Ig endógenos (como se ha descrito anteriormente), se inmunizan los ratones seleccionados con un antígeno de interés.

40 Generalmente, se expone un ratón VELOCIMMUNE® que contiene una de las regiones de cadena ligera de línea germinal humana reordenadas individuales con un antígeno, y se recuperan células linfáticas (tales como células B) del suero de los animales. Las células linfáticas pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para preparar líneas células de hibridoma inmortales, y dichas líneas células de hibridoma se exploran y seleccionan para

45 identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos que contienen cadena pesada humana y cadena ligera λ humana que son específicas para el antígeno usado para la inmunización. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras λ puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Debido a la presencia de los segmentos génicas hVλ adicionales en comparación con el locus λ de ratón endógeno, la diversidad del repertorio de cadena ligera se aumenta

50 drásticamente y confiere mayor diversidad al repertorio específico de antígeno tras inmunización. Las secuencias de anticuerpo clonadas resultantes pueden producirse posteriormente en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente a partir de linfocitos específicos de antígeno (por ejemplo, células B).

55 Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano que

60 contiene una cadena pesada humana mutada somáticamente y una cadena ligera λ humana derivada de un locus de cadena ligera λ humano no reordenado de la invención. Las regiones constantes humanas adecuadas incluyen, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 de tipo silvestre o modificada.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 5 <120> RATONES CON LAMBDA MODIFICADA

<130> N115474D-EP

<140> 14198318.9

<141>

<150> 61/357.314

<151> 15 <150> 61/357.317

<151>

<160> 141

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> ADN 25 <213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 1

35: <210> 2 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 2 agctgaatgg aaacaaggca a: 21

45: <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

55: <400> 3 ggagacaatg ccccagtga <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial 19

<220> <223> sintética

5: <400> 4 tcccataggg ctaggatttc c 21

<210> 5 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia artificial

15: <220> <223> sintética <400> 5 tcccctcaca ctgttcccc 19

<210> 6 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia artificial

25: <220> <223> sintética

<400> 6 ggtggagagg ctattcggc: 19

<210> 7 <211> 17 <212> ADN <213> secuencia artificial

35: <220> <223> sintética

<400> 7 gaacacggcg gcatcag: 17

45: <210> 8 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> sintética

<400> 8 tcaacctttc ccagcctgtc t: 21

55: <210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 9 ccccagagag agaaaacaga tttt: 24

65: <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

5: <400> 10 ccctggtgaa gcatgtttgc 20

10: <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

15: <400> 11 tgtggcctgt ctgccttacg 20

20: <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

25: <220> <223> sintética <400> 12 cacacctaga ccccggaagt c 21

30: <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

35: <220> <223> sintética

<400> 13 tcgctttgcc agttgattct c: 21

40: <210> 14 <211> 17 <212> ADN <213> secuencia artificial

45: <220> <223> sintética

50 55: <400> 14 17 tgcggccgat cttagcc 17 <210> 15 <211> 18 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> sintética

60: <400> 15 18 ttgaccgatt ccttgcgg 18

65: <210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

5: <400> 16 20 gcaaacaaaa accactggcc 20

10: <210> 17 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

15: <400> 17 19 ggccacattc catgggttc 19

20: <210> 18 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial

25: <220> <223> sintética <400> 18 22 ccatgactgg gcctctgtag ac 22

30: <210> 19 <211> 25 <212> ADN <213> secuencia artificial

35: <220> <223> sintética

<400> 19 caagtcaggg tgctaatgct gtatc: 25

40: <210> 20 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia artificial

45: <220> <223> sintética

50 55: <400> 20 cacagcttgt gcagcctcc 19 <210> 21 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> sintética

60: <400> 21 gggcactgga tacgatgtat gg 22

65: <210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

5: <400> 22 tcataggtag gtctcagttt g 21

10: <210> 23 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

15: <400> 23 tgatctgcgc tgtttcatcc t 21

20: <210> 24 <211> 31 <212> ADN <213> secuencia artificial

25: <220> <223> sintética <400> 24 tgacatgaac catctgtttc tctctcgaca a 31

30: <210> 25 <211> 29 <212> ADN <213> secuencia artificial

35: <220> <223> sintética

<400> 25 agagacgctc cgaggtcaag gtgctctag: 29

40: <210> 26 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial

45: <220> <223> sintética

50 55: <400> 26 tgggcacaac agacaatcgg ctg <210> 27 <211> 16 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> sintética 23

60: <400> 27 accctctgct gtccct 16

65: <210> 28 <211> 26 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

5: <400> 28 ccaagcagga ggtgctcagt tcccaa 26

10: <210> 29 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

15: <400> 29 tccacactgt cggctgggag ctca 24

20: <210> 30 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

25: <220> <223> sintética <400> 30 acgagcgggt tcggcccatt c 21

30: <210> 31 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia artificial

35: <220> <223> sintética

<400> 31 ctgttcctct aaaactggac tccacagtaa atggaaa: 37

40: <210> 32 <211> 27 <212> ADN <213> secuencia artificial

45: <220> <223> sintética

50 55: <400> 32 tgccgcttat acaacactgc catctgc <210> 33 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> sintética 27

60: <400> 33 agaagaagcc tgtactacag catccgtttt acagtca 37

65: <210> 34 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

5: <400> 34 gggctacttg aggaccttgc t 21

10: <210> 35 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

15: <400> 35 23 gacagccctt acagagtttg gaa 23

20: <210> 36 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial

25: <220> <223> sintética <400> 36 23 aagaccagga gctctgccta agt 23

30: <210> 37 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial

35: <220> <223> sintética

<400> 37 22 cccatcacga actgaagttg ag: 22

40: <210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

45: <220> <223> sintética

50 55: <400> 38 20 cagggcctcc atcccaggca <210> 39 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> sintética 20

60: <400> 39 28 ccccagtgtg tgaatcactc taccctcc 28

65: <210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 40 5 cctctcctcc tcaccctcct 20

<210> 41

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

15 <220>

<221> variación

<222> (4)..(4)

<223> r= ao g

<220>

<221> variación

<222> (9)..(9)

<223> s = c o g

25 <220>

<221> variación

<222> (11)..(11)

<223> y= c o t

<220>

<221> variación

<222> (12)..(12)

<223> y= c o t

35 <220>

<221> variación

<222> (13)..(13)

<223> y= c o t

<400> 41 atgrccdgst yyyctctcct 20

<210> 42

<211> 18 45 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 42 ctcctcactc agggcaca 18

<210> 43 55 <211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<220>

<221> variación

<222> (18)..(18) 65 <223> s= co g

<400> 43 atggcctggg ctctgctsct: 20

5: <210> 44 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

15: <220> <221> variación <222> (11)..(11) <223> y = c o t

<220> <221> variación <222> (13)..(13) <223> s = c o g

<400> 44 atggcctgga ycsctctcc: 19

25: <210> 45 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

35: <220> <221> variación <222> (11)..(11) <223> y = c o t

<220> <221> variación <222> (15)..(15) <223> r = a o g

45: <220> <221> variación <222> (16)..(16) <223> y = c o t

<220> <221> variación <222> (18)..(18) <223> y = c o t

55: <220> <221> variación <222> (20)..(20) <223> m = a o c

<220> <221> variación <222> (21)..(21) <223> y = c o t

65: <400> 45 tcaccatggc ytggrycycm ytc <210> 46 23

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial

5 <220>

<223> sintética

<400> 46 tcaccatggc ctgggtctcc tt 22

<210> 47

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial 15

<220>

<223> sintética

<220>

<221> variación

<222> (16)..(16)

<223> m = a o c

<220> 25 <221> variación

<222> (19)..(19)

<223> y= c o t

<400> 47 tcaccatggc ctggamtcyt ct 22

<210> 48

<211> 26

<212> ADN 35 <213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 48 tcaccatggc ctgggctcca ctactt 26

<210> 49

<211> 20 45 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 49 tcaccatggc ctggactcct 20

<210> 50 55 <211> 23

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 50 tcaccatggc ctggatgatg ctt 23

65 <210> 51

<211> 22

<212> ADN <213> secuencia artificial

5: <220> <223> sintética

<400> 51 taaatatggc ctgggctcct ct: 22

<210> 52 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial

15: <220> <223> sintética

<400> 52 tcaccatgcc ctgggctctg ct: 22

25: <210> 53 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> sintética

<400> 53 tcaccatggc cctgactcct ct: 22

35: <210> 54 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 54 cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga: 30

45: <210> 55 <211> 16 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 55 gtaaaacgac ggccag: 16

55: <210> 56 <211> 17 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 56 caggaaacag ctatgac: 17

65: <210> 57 <211> 440

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 57

10

<210> 58

<211> 441

<212> ADN

<213> secuencia artificial

15

<220>

<223> sintética

<400> 58

20

<210> 59

<211> 441 25 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética 30

<400> 59

<210> 60

<211> 438 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética 10

<400> 60

15 <210> 61

<211> 438

<212> ADN

<213> secuencia artificial

20 <220>

<223> sintética

<400> 61

<210> 62

<211> 441

<212> ADN

<213> secuencia artificial

5

<220>

<223> sintética

<400> 62

10

<210> 63

<211> 442 15 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética 20

<400> 63

25 <210> 64

<211> 428

<212> ADN

<213> secuencia artificial

30 <220>

<223> sintética

<400> 64

<210> 65

<211> 441 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética 10

<400> 65

15 <210> 66

<211> 441

<212> ADN

<213> secuencia artificial

20 <220>

<223> sintética

<400> 66

<210> 67

<211> 345 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética 10

<400> 67

15 <210> 68

<211> 432

<212> ADN

<213> secuencia artificial

20 <220>

<223> sintética

<400> 68

<210> 69

<211> 426

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 69

<210> 70

<211> 331

<212> ADN 15 <213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

20 <400> 70

25 <210> 71

<211> 417

<212> ADN

<213> secuencia artificial

30 <220>

<223> sintética

<400> 71

<210> 72

<211> 393 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética 10

<400> 72

15 <210> 73

<211> 417

<212> ADN

<213> secuencia artificial

20 <220>

<223> sintética

<400> 73

<210> 74

<211> 348

<212> ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

10 <400> 74

15: <210> 75 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> sintética

<400> 75 aacaaccgag ctccaggtgt: 20

25: <210> 76 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> sintética

35 40: <400> 76 agggcagcct tgtctccaa 19 <210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sintética

45: <400> 77 cctgccagat tctcaggctc 20

50: <210> 78 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sintética

55: <400> 78

catcacaggg gcacagactg: 20

5: <210> 79 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 79 gatttgctga gggcagggt: 19

15: <210> 80 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 80 ccccaagtct gatccttcct t: 21

25: <210> 81 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sintética

35: <400> 81 gctgaccaac gatcgcctaa <210> 82 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial 20

<220> <223> sintética

45: <400> 82 taagcgccac actgcacct 19

<210> 83 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sintética

55: <400> 83 cctgccagat tctcaggctc cctg 24

<210> 84 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

65: <220> <223> sintética <400> 84

ctgattggag acaaggctgc cct 23

<210> 85

<211> 30 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 85 ccttcatact cttgcatcct cccttctcca 30

<210> 86 15 <211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 86 ttccttctct tctgtgactc aattatttgt ggaca 35

25 <210> 87

<211> 159

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 87

<210> 88

<211> 159

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética

45 <400> 88

<210> 89

<211> 159

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 89

<210> 90 5 <211> 159

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> sintética

<400> 90

15

<210> 91

<211> 153

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> sintética

<400> 91

25

<210> 92

<211> 156 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética 35

<400> 92

40 <210> 93

<211> 159

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> sintética

<400> 93

5 <210> 94

<211> 159

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> sintética

<400> 94

<210> 95

<211> 159

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética

25 <400> 95

<210> 96 30 <211> 153

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> sintética

<400> 96

40

<210> 97

<211> 153

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

45

<220>

<223> sintética

<400> 97

5

<210> 98

<211> 165

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> sintética

<400> 98

15

<210> 99

<211> 164 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética 25

<400> 99

<210> 100 30 <211> 22800

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> sintética

<400> 100

<210> 101

<211> 154 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética 10

<400> 101

15 <210> 102

<211> 156

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> sintética

<400> 102

<210> 103

<211> 150

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> sintética

35 <400> 103 <210> 107

<210> 104 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 104 aggtggaaac acggtgagag t: 21

<210> 105 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 105 ccactcgggg aaaagttgga a: 21

<210> 106 <211> 77 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sintética

<400> 106

<211> 77

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 107

<210> 108

<211> 77

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 108

<210> 109

<211> 77

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 109

<210> 110

<211> 74

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 110

<210> 111

<211> 77

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 111

<210> 112

<211> 78

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 112 <210> 113

<211> 78

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 113

<210> 114

<211> 77

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 114

<210> 115

<211> 77

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 115

<210> 116

<211> 78

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 116

<210> 117

<211> 78

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 117

<210> 118

<211> 78

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 118

<210> 119

<211> 78

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 119

<210> 120

<211> 69

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 120

<210> 121

<211> 72

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 121

<210> 122

<211> 75

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 122

<210> 123

<211> 63

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 123

<210> 124

<211> 21

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 124

<210> 125

<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 125

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<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 126

<210> 127

<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 127

<210> 128

<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 128

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<211> 76

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 129 <210> 130

<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 130

<210> 131

<211> 82

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 131

<210> 132

<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 132

<210> 133

<211> 76

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 133

<210> 134

<211> 82

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 134

<210> 135

<211> 82

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 135

<210> 136

<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 136

<210> 137

<211> 20

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 137

<210> 138

<211> 79

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 138

<210> 139

<211> 81

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 139

<210> 140

<211> 75

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 140

<210> 141

<211> 19

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sintética

<400> 141

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ2 a Jλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón endógeno, en el que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno comprende los segmentos génicos Cλ2, Jλ4 y Cλ4 endógenos.
2.

El ratón genéticamente modificado de la reivindicación 1, en el que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno comprende el potenciador 2.4 de ratón endógeno o el potenciador 3’ de ratón endógeno.
3.

El ratón genéticamente modificado de la reivindicación 1, en el que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno comprende adicionalmente segmentos génicos Vλ y Jλ humanos no reordenados unidos operativamente al segmento génico Cλ2 endógeno.
4.

El ratón genéticamente modificado de la reivindicación 1, en el que el ratón comprende adicionalmente en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera κ endógeno que comprende un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos con segmentos génicos Vλ y Jλ humanos no reordenados, y en el que los segmentos génicos Vλ y Jλ humanos están unidos operativamente a un gen Cκ de ratón endógeno, de forma que el ratón expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una región variable λ humana fusionada con una región constante κ de ratón.
5.

El ratón genéticamente modificado de la reivindicación 4, en el que el ratón comprende adicionalmente una secuencia de región intergénica Vκ-Jκ humana emplazada entre los segmentos génicos Vλ humanos y los segmentos génicos Jλ humanos.
6.

Una célula de ratón que comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ2 a Jλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón endógeno, en el que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno conserva los segmentos génicos Cλ2, Jλ4 y Cλ4 endógenos.
7.

La célula de ratón de la reivindicación 6, en la que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno comprende el potenciador 2.4 de ratón endógeno o el potenciador 3’ de ratón endógeno.
8.

La célula de ratón de la reivindicación 6, en la que la célula es una célula B, un hibridoma o una célula ES.
9.

Una célula aislada de, o que se puede obtener de, el ratón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la célula comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ2 a Jλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón endógeno, en el que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno conserva los segmentos génicos Cλ2, Jλ4 y Cλ4 endógenos.
10.

La célula aislada de la reivindicación 9, en la que la célula es una célula B o un hibridoma.
11.

Un embrión de ratón que comprende, está creado a partir de o se puede obtener de, la célula ES de ratón de la reivindicación 8, en el que el embrión de ratón comprende en su genoma un locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno que comprende una deleción del grupo génico Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 de ratón endógeno y una deleción de una región que abarca de Vλ2 a Jλ2 del grupo génico Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 de ratón endógeno, en el que el locus de inmunoglobulina de cadena ligera λ endógeno conserva los segmentos génicos Cλ2, Jλ4y Cλ4 endógenos.

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