RS56589B1 - Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina - Google Patents

Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina

Info

Publication number
RS56589B1
RS56589B1 RS20171091A RSP20171091A RS56589B1 RS 56589 B1 RS56589 B1 RS 56589B1 RS 20171091 A RS20171091 A RS 20171091A RS P20171091 A RSP20171091 A RS P20171091A RS 56589 B1 RS56589 B1 RS 56589B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
human
endogenous
light chain
gene
Prior art date
Application number
RS20171091A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew J Murphy
Sean Stevens
Cagan Gurer
Lynn Macdonald
Karolina A Hosiawa
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS56589B1 publication Critical patent/RS56589B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Position Input By Displaying (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Electrochromic Elements, Electrophoresis, Or Variable Reflection Or Absorption Elements (AREA)

Description

Opis
OBLAST
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na genetski modifikovanog miša, kao i na ćeliju izolovanu od ili dobijenu od, miša i embriona miša.
PRETHODNO STANJE TEHNIKE
[0002] Miševi koji ispoljavaju antitela koja su potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su poznati u ovoj oblasti. Na primer, transgenski miševi koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz transgena koji sadrže ljudske gene promenljivog regiona imunoglobulina lakog i teškog lanca. Genetski modifikovani miševi koji sadrže zamenu endogenih mišjih segmenata gena promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) i promenljivog regiona kapa (κ) lakog lanca (LCVR) segmente gena sa ljudskim HCVR i LCVR segmentima gena i koji prave himerna antitela s himenim ljudskim/mišjim kapa lancem, takođe su poznati.
[0003] Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (κ) i lambda (λ). Laki lanci mišjeg antitela su primarno κ tipa. Odnos κ prema λ upotrebi lakog lanca kod ljudi je oko 60:40, dok je kod miševa oko 95:5. Preferirana upotreba κ lakih lanaca kod miševa je prema izveštajima zadržana kod genetski modifikovanih miševa sposobnih da ispolje potpuno ili delimično ljudska antitela. Dakle, izgleda da su miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela ograničeni u pogledu upotrebe promenljivog lambda lanca.
[0004] Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da se generišu promenljivi regioni lambda lanca, bilo mišjeg ili ljudskog, za upotrebu za pravljenje proteina za vezivanje epitopa. Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike za miševima koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu promenljivu upotrebu lambda (Vλ) lanca.
[0005] Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu upotrebu λ promenljivog (Vλ). WO 2010/039900 se odnosi na nokin (knock-in) nehumane ćelije i sisare koji imaju genom koji kodira himerne Ig lance i antitela i postupke za proizvodnju nokin ćelija i sisara. Otkriveni su transgenski nokin (knock-in) miševi koji nose zamenu čitavog proksimalnog klastera miša koji obuhvata segmente gena Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 sa prvim BAC koji obuhvata humane segmente VL i JL gena, dok distalni endogeni lambda klaster koji sadrži Vλ2-Vλx-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 -3’LCR ostaje netaknut ili zamena čitavog proksimalnog klastera miša koji obuhvata segmente gena Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 sa prvim BAC koji obuhvata humane segmente Vλ i Jλ gena i zamena čitavog distalnog klastera miša koji obuhvata segmente Vλ2-Vx3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 -3’LCR gena sa drugim preklapajućim BAC koji sadrže dalje humani segment konstantnog gena Ig KRATAK OPIS PRONALASKA
[0006] Ovaj je pronalazak u svom najširem smislu kao što je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima. Opisuju se genetski modifikovani miševi, embrioni, ćelije, tkiva, kao i konstrukti nukleinske kiseline za modifikovanje miševa, i postupci i jedinjenja za pravljenje i korišćenje istih. Miševi i ćelije koje generišu ljudske λ promenljive regione u ovom kontekstuλ lakog lanca, od endogenog mišjeg lokusa lakog lanca, su opisana. Takođe su opisani postupci za pravljenje antitela koja obuhvataju lambda promenljive regione. Postupci za odabir teških lanaca koji se ispoljavaju sa poznatim lambda promenljivim regionima se takođe opisuju.
[0007] Opisuju se himerni i ljudski proteini za vezivanje antigena (npr., antitela), i nukleinske kiseline koje ih kodiraju, koji obuhvata somatski mutirane promenljive regione, uključujući antitela koja imaju lake lance koji obuhvataju promenljivi domen izveden iz ljudskog Vλ i ljudskog Jλ segmenta gena spojenog na mišji konstantni domen lambda lakog lanca
[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje genetski modifikovanog miša koji sadrži u svom genomu endogeni lokus imunoglobulina λ lakog lanca koji sadrži uklanjanje endogenog klastera endogenog misjeg Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1klastera gena i uklanjanje regiona koji se proteže od Vλ2 do Jλ2 endogenog klastera gena Vl2-Vl3-Jl2-Cl2-Jl4-Cl4, gde lokus imunoglobulina endogenog l lakog lanca sadrži endogene segmente gena Cl2, Jl4 i Cl4.
[0009] Pronalazak dalje sadrži:
mišiju ćelija koja u svom genomu sadrži endogeni lokus imunoglobulina λ lakog lanca koji sadrži uklanjanje endogenog klastera endogenog glasa Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 i uklanjanje regiona koji se proteže od Vλ2 do Jλ2 endogenog mišjeg Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 klastera gena, pri čemu lokus imunoglobulinskog λ lanca lakog lanca zadržava endogene segmente genova Cλ2, Jλ4 i Cλ4;
izolovanu ćeliju iz, ili dobijenu od, miša prema pronalasku, pri čemu ćelija miša u svom genomu sadrži endogeni lokomotor imunoglobulina λ lakog lanca koji obuhvata uklanjanje endogenog klastera gena Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 klijenta
brisanje regiona koji se proteže od Vλ2do Jλ2 endogenog klastera gena Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4, gde lokus imunoglobulina endogenog lanca λ lanca zadržava endogene segmente gena Cl2, Jl4 i Cl4? i
brisanje regiona koji se proteže od endogenog klastera gena Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4, gde lokus imunoglobulina endogenog lakog λ lanca zadržava endogene segmente gena Cλ2, Jλ4 and Cλ4; i
embrion miša koji sadrži, napravljen od ili koji se može dobiti od mišje ES ćelije prema pronalasku, pri čemu embrion miša u svom genomu sadrži endogeni lokomotor imunoglobulina λ lakog lanca koji sadrži deleciju endogenog mišjeg Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 klaster gena i uklanjanje regiona koji se proteže od Vλ2 to Jλ2 endogenog mišjeg klastera gena Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 klastera gena, pri čemu lokus imunoglobulina λ lakoi lanac zadrži endogeni Cλ2, Jλ4 and Cλ4 gen.
[0010] Opisana su antitela koja obuhvataju (a) promenljivi domen ljudskog teškog lanca (hVH) spojen na mišji konstantni region teškog lanca, i (b) ljudski Vλ spojen na mišji CLdomen; uključujući gde su jedan ili više promenljivih domena somatski mutirani, npr. tokom antitela ili odabira imune ćelije kod miša prema ovom pronalasku. Najvažniji nepreraspoređeni hVλ i nepreraspoređeni hJλ su funkcionalno povezani sa nedirnutim mišjim λ konstantnim regionom (Cλ).
[0011] Takođe je opisan i miš koji sadrži svoju klicinu liniju, na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca, pri čemu se ljudska lambda sekvenca promenljivog regiona ispoljava u lakom lancu koji obuhvata mišju sekvencu gena konstantnog lambda regiona imunoglobulina.
[0012] Endogeni mišji lokus lakog lanca je λ lokus.
[0013] Mišu nedostaje endogena sekvenca promenljivog lakog lanca na endogenom mišjem lokusu lakog lanca.
[0014] U jednom varijantnom rešenju, svi ili pretežno svi endogeni mišji segmenti gena promenljivog regiona lakog lanca se zamene jednim ili više ljudskih λ segmenata gena promenljivog regiona.
[0015] U jednom varijantnom rešenju, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata ljudsku Jλ sekvencu. U jednom varijantnom rešenju, ljudska Jλ sekvenca se bira iz grupe koja se sastoji od Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.
[0016] U jednom varijantnom rešenju, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine A ljudskog lokusa lakog lanca. U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne A ljudskog λ lokusa lakog lanca se proteže od hVλ3-27 kroz hVλ3-1.
[0017] U jednom varijantnom rešenju, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine B ljudskog lokusa lakog lanca. U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne B ljudskog λ lokusa lakog lanca se proteže od hVλ5-52 kroz hVλ1-40.
[0018] U jednom varijantnom rešenju, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata genomski fragment skupine A i genomski fragment skupine B. U jednom varijantnom rešenju, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata najmanje jedan segment gena skupine A i najmanje jedan segment gena skupine B.
[0019] U jednom varijantnom rešenju, više od 10% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje dva hVλ segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 20% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje tri hVλ segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 30% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje četiri hVλ segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49.
[0020] [Brisano]
[0021] [Brisano]
[0022] [Brisano]
[0023] [Brisano]
[0024] [Brisano]
[0025] [Brisano]
[0026] [Brisano]
[0027] [Brisano]
[0028] [Brisano]
[0029] [Brisano]
[0030] [Brisano]
[0031] [Brisano]
[0032] [Brisano]
[0033] [Brisano]
[0034] [Brisano]
[0035] [Brisano]
[0036] Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata nepreraspoređeni Vλ i Jλ segment gena imunoglobulina funkcionalno povezan na mišji lokus lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji Cλgen.
[0037] Vλ i Jλ segmenti gena su segmenti ljudskog gena.
[0038] Endogeni mišji lokus lakog lanca je λ lokus lakog lanca.
[0039] [Brisano]
[0040] [Brisano]
[0041] U jednom aspektu, miš još obuhvata i zamenu jednog ili više teških lanaca, V, D, i/ili J segmenata gena sa jednim ili više ljudskih V, D, i/ili J segmenata gena na enodgenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca.
[0042] [Brisano]
[0043] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata nepreraspoređen ljudski λ segment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (Vλ) i λ spojni segment gena (Jλ) na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji Cλ gen.
[00443] [Brisano]
[0045] [Brisano]
[0046] U jednom varijantnom rešenju ovaj λ lokus promenljivog gena lakog lanca ( "λ lokus") obuhvata najmanje jedan hVλ segment gena i najmanje jedan ljudski Jλ (hJλ) segment gena. U još jednom varijantnom rešenju, λ lokus obuhvata najviše četiri hJλ segmenta gena.
[0047] U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata više hVλ. U jednom varijantnom rešenju, više hVλ se bira tako da se kao rezultat dobije ispoljavanje λ repertoara promenljivog regiona lakog lanca koje odražava oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, ili oko 90% ili više, upotrebe Vλ primećene kod čoveka. U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata segmente gena hVλ 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, i njihovu kombinaciju.
[0048] U jednom varijantnom rešenju, hVλ obuhvata 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. U specifičnom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog λ lakog lanca koja se prostire od Vλ3-12 do Vλ3-1. U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata barem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 hVλ. U jednom varijantnom rešenju, hVλ obuhvata 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. U specifičnom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog λ lokusa koji se prostire od Vλ3-12 do Vλ3-1. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni κ lokus se briše delimično ili potpuno.
[0049] U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata 13 do 28 ili više hVλs. U specifičnom varijantnom rešenju, hVλ obuhvata 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, i 3-27. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni κ lokus se briše delimično ili potpuno.
[0050] U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvatas 29 do 40 hVλ. U jednom specifičnom izvođenju, cela ili pretežno cela sekvenca između hVλ1-40 i hVλ3-29 genetski modifikovanom mišu obuhvataju u suštini ljudsku λ sekvencu od približno 959 bp pronađenu u prirodi (npr., u ljudskoj populaciji) nizvodno od hVλ1-40 segmenta gena (nizvodno od 3’ neprevedenog dela), mesto reakcije enzima (npr., PI-SceI), posle čega sledi ljudska λ sekvenca od približno 3.431 bp uzvodno od hVλ3-29 segmenta gena pronađenog u prirodi. U specifičnom izvođenju, endogeni mišji κ lokus se briše delimično ili potpuno.
[0051] U jednom varijantnom rešenju ovaj Vλ lokus obuhvata najmanje jedan hJλ. U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata više hJλ. U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata najmanje 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 hJλ. U specifičnom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata četiri hJλ. U specifičnom varijantnom rešenju, četiri hJλ su hJλ1, hJλ2, hJλ3, i hJλ7. U jednom varijantnom rešenju, Vλ lokus obuhvata jedan hJλ. U specifičnom varijantnom rešenju, hJλ je hJλ1. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni κ lokus se briše delimično ili potpuno.
[0052] U jednom varijantnom rešenju ovajVλ lokus obuhvata najmanje jedan hVλ, najmanje jedan hJλ, i nedirnuti mišji Cλ gen. U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji Cλ gen je Cλ2.
[0053] [Brisano]
[0054] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu endogenih mišjih Vλ segmenata gena na endogenom mišjem λ lokusu sa jednim ili više ljudskih Vλ segmenata gena na endogenom mišjem λ lokusu, pri čemu su hVλ segmenti gena funkcionalno povezani na nedirnuti mišji Cλ gen regiona, tako da miš preraspoređuje hVλ segmente gena i ispoljava reverzni himerni laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVλ domen i mišji Cλ., Nedirnuti mišji Cλ gen je Cλ2. U specifičnom varijantnom rešenju, svi Vλ segmenti gena se zamene najmanje jednim nepreraspoređenim hVλ segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, zamena je sa najmanje 12, najmanje 28, ili najmanje 40 nepreraspoređenih hVλ segmenata gena. U jednom izvođenju, zamena je sa najmanje 7 funkcionalnih nepreraspoređenih hVλ segmenata gena, najmanje 16 funkcionalnih nepreraspoređenih hVλ segmenata gena, ili najmanje 27 funkcionalnih nepreraspoređenih hVλ segmenata gena. U jednom izvođenju, miš obuhvata zamenu svih mišjih Jλ segmenata gena sa najmanje jednim nepreraspoređenim hJλ segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, najmanje jedan nepreraspoređeni hJλ segment gena se bira iz Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, i njihove kombinacije. U specifičnom izvođenju, jedan ili više hVλ segment gena se bira iz 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 45-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, a 5-52 hVλ segment gena, i njihove kombinacije. U specifičnom varijantnom rešenju, najmanje jedan neprerasporešeni hJλ segment gena se bira iz Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.
[0055] [Brisano]
[0056] [Brisano]
[0057] [Brisano]
[0058] [Brisano]
[0059] [Brisano]
[0060] [Brisano]
[0061] Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata ne više od dva alela lakog lanca, pri čemu aleli lakog lanca obuhvataju (a) nepreraspoređeni ljudski imunoglobulin Vλ i Jλ segment gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cλ gen; i, (b) nepreraspoređeni VLi JLsegment gena imunoglobulina na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CLgen.
[0062] U jednom varijantnom rešenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je κ lokus. U drugom varijanom izvođenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je λ lokus.
[0063] U jednom varijantnom rešenju, ne više od dva alela lakog lanca se bira iz κ alela i λ alela, i dva λ alela.. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, jedan od dva alela lakog lanca je λ alel koji obuhvata Cλ2 gen.
[0064] [Brisano]
[0065] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata jedan funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski imunoglobulin Vλ i Jλ segmenta gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji Cλ gen. Nedirnuti Cλ gen je Cλ2.
[0066] Miš još obuhvata barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina obuhvata ljudski VH segment gena, ljudski DH segment gena i ljudski JH segment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata ljudski gen teškog lanca koji ispoljava ljudski /mišji teški lanac. U specifičnom varijantnom rešenju, miš obuhvata dva alela teškog lanca imunoglobulina, i miš ispoljava ljudski/mišji teški lanac.
[0067] [Brisano]
[0068] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata prvi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVκi nepreraspoređeni hJκ, na endogenom mišjem κ lokusu koji obuhvata nedirnuti endogeni Cκ gen; i na drugom alelu lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVλ i nepreraspoređeni hJλ, na endogenom mišjem λ lokusu koji obuhvata nedirnuti endogeni Cλ2 gen U specifičnom varijantnom rešenju, prvi i drugi alel lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša.
[0069] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni Vλ i Jλ segment gena imunoglobulina na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cκ gen, drugi obuhvata nepreraspoređeni Vκ i Jκ segment gena imunoglobulina na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cκ gen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vλ i Jλ segment gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji Cλ2���. , četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni VHi DHi JHsegment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca, i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunoglobulin Vλ i Jλ segment gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cλ gen, (b) λ lokus koji je nefunkcionalni, ili (c) brisanje u celini ili delimično λ lokusa.
[0070] U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVλ i hJλ. U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVκ i hJκ. Treći alel obuhvata nepreraspoređeni hVλ i hJλ. U jednom varijantnom rešenju, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVHi hDHi hJH. U jednom varijantnom rešenju, šesti alel obuhvata endogeni mišji λ lokus koji je funkcionalno
[0071] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vλ i Jλ segment gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji Cλ gen, drugi obuhvata nepreraspoređeni imumoglobulin Vλ i Jλ segment gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cλ gen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vκ i Jκ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cκ gen, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni VHi DHi JHsegment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunoglobulin Vκ i Jκ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cκ gen, (b) κ lokus koji je nefunkcionalan, ili (c) brisanje jednog ili više elemenata κ lokusa.
[0072] U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVλ i hJλ segment gena. U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVλ i hJλ segment gena. U jednom varijantnom rešenju, treći alel obuhvata nepreraspoređeni hVκ i hJκ segment gena. U jednom varijantnom rešenju, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVHi hDHi hJHsegment gena. U jednom varijantnom rešenju, šesti alel obuhvata endogeni mišji κ lokus koji je funkcionalno neaktivan.
[0073] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš obuhvata B ćeliju koja obuhvata preraspoređeni gen antitela koji obuhvata preraspoređeni hVλ domen funkcionalno povezan na nedirnuti mišji Cλ domen. Mišji Cλ domen je izveden iz Cλ2 gena.
[0074] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređeni ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cλ sekvencu.
[0075] [Brisano]
[0076] [Brisano]
[0077] [Brisano]
[0078] [Brisano]
[0079] [Brisano]
[0080] [Brisano]
[0081] [Brisano]
[0082] [Brisano]
[0083] Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac izveden iz hVλ, hJλ i mišji Cλ gen. Cλ domen je Cλ2. U specifičnom varijantnom rešenju, antitelo još obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi domen izveden iz ljudskog V, ljudski D i ljudski J segment gena, i konstantni domen teškog lanca izveden iz mišjeg gena konstantnog domena teškog lanca. U jednom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata spoj-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom varijantnom rešenju, rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH1-spoj-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH1-CH2-CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH2-CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca.
[0084] [Brisano]
[0085] U jednom varijantnom rešenju, miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređeni λ promenljivi region lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata ljudsku Vλ/Jλ sekvencu izabranu iz 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1.
[0086] Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata (a) teški lanac koji obuhvata promenljivi domen teškog lanca izveden iz nepreraspoređenog segmenta gena promenljivog regiona teškog lanca, pri čemu teški lanac spaja na mišji konstantni region teškog lanca (CH); i, (b) laki lanac obuhvata promenljivi domen lakog lanca izveden iz nepreraspoređenog hVλ i hJλ, pri čemu se promenljivi domen lakog lanca spoji na mišji Cλ region.
[0087] [Brisano]
[0088] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata (i) lokus teškog lanca koji obuhvata zamenu svih ili pretežno svih svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D i J segmenata gena sa svim ili pretežon svim funkcionalnim ljudskim V, D, i J segmentima gena, mišji CHgen, (ii) prvi λ lokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih Vλ i Jλ segmenata gena sa svim, pretežnom svim, ili više, funkcionalniih hVλ i hJλ segmenata gena, i nedirnutim mišjim Cλ genom, (iii) drugo λ lokus lakog lanca obuhvata zamenu svih funkcionalnih endogenih mišjih Vλ i Jλ segmenata gena sa svim, pretežno svim, ili više, funkcionalnih hVλ i hJλ segmenata gena, i nedirnutim mišjim Cλ genom. Nedirnuti mišji Cλ gen je Cλ2.
[0089] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata brisanje Cκ gena i/ili Vκ i/ili Jκ segmenta gena. U jednom izvođenju, miš obuhvata nefunkcionalni κ lokus lakog lanca.
[0090] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo, gde je više 10 % više od 15%, više od 20%, više od 25%, više od 30%, više od 35%, više od 40%, više od 60%, više od 70%, više od 80%, ili više od 90% ukupnog IgG antitela proizvedenog od strane miša obuhvata λ-izvedeni promenljivi domen, i pri čemu miš ispoljava antitela koja obuhvataju κ-izveden promenljivi domen spojen sa mišjim Cκ regionom. U specifičnim varijantnim rešenjima, oko 15-40%, 20-40%, 25-40%, 30-40%, ili 35-40% ukupnog antitela proizvedenog pomoću miša obuhvata λ-izvedeni promenljivi domen.
U jednom varijantnom rešenju, λ-izvedeni promenljivi domen se izvodi iz hVλ i hJλ. U specifičnom varijantnom rešenju, λ-izvedeni promenljivi region je u lakom lancu koji obuhvata mišji Cλ region. Cλ region je Cλ2 region.
[0091] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt koji obuhvata uzvodni homologni krak i nizvodni homologni krak, pri čemu uzvodni i nizvodni homologni kraci ciljaju konstrukt na mišjemκ lokusu, i taj konstrukt obuhvata funkcionalni nepreraspoređeni hVλ, segment i funkcionalni nepreraspoređeni hJλ segment, i sekvencu odabira ili marker sekvenvcu.
[0092] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence uzvodno od mišjeg Vλ2, odabir kasete prirubnih 5’ i 3’ sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i ciljajućim krakom za ciljanje mišje λ sekvence 3’ mišjeg Jλ2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed Hyg-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljajući krak obuhvata mišji Cλ2, Jλ4, Cλ4 i mišji pojačavač 2.4.
[0093] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa u vezi sa Vλ1 kasetom odabira prurubnih 5’ i 3’ sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u vezi sa mišjim Jλ1. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina u tečnom kiseoniku. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljajući krak obuhvata mišji λ 3’ pojačavač i mišji λ 3’ pojačavač 3.1.
[0094] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa u vezi sa Vλ2, kasetu odabira prurubnim 5’ i 3’ sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u vezi sa mišjim Jλ2 i 5’ u vezi sa mišjim Cλ2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljajući krak obuhvata mišje Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmente gena i mišji λ pojačavač 2.4.
[0095] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljajući mišji λ lokus 5’ u vezi sa Vλ2, selekcijom kasete prirubne 5’ i 3’ sa mesta prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno do kraja hJλ1, i 3’ ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u vezi sa mišjim Jλ2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed kaseta neomicina. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljni krak obuhvata mišje Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmente gena i mišji λ pojačavač 2.4.
[0096] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca. od hVλ3-12 nizvodno do kraja hVλ1.
[0097] Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u vezi sa Vλ2, kasetom odabira prirubnu 5’ i 3’ sa mestima prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-27 nizvodno do kraja hVλ2-8 U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed higromicin kaseta. U jednom varijantnom rešenju, ljudski genomski fragment obuhvata 3’ ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 53 kb ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno do kraja hJλ2-8.
[0098] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-27 donjeg toka do kraja hVλ3-12.
[0099] Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, cijajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u vezi sa Vλ2, kaseta odabira je prirubna 5’ i 3’ sa mestima prepoznavanja rekombianze, prvi ljudski genomski fragment obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ5-52 nizvodno prema kraju hVλ1-40, mesto ograničenja enzima, i drugi ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-29 nizvodno prema kraju hVλ82K. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed kaseta neomicina. U jednom varijantnom rešenju, mesto ograničenja enzima je mesto za homing endonukleazu. U specičnom varijantnom rešenju, homing endonukleaza je PI-Scel. U jednom varijantnom rešenju, drugi ljudski genomski fragment je 3’ ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 27 kb ljudskog λ lokusa lakog lanca od hλ3-29 nizvodno do kraja hVλ82K.
[00100] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ5-52 donjeg toka do kraja hVλ1-40.
[0101] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg κ lokusa 5’ u vezi sa endogenim Vκ segmentima gena, dva podređena mesta prepoznavanja rekombinaze, kaseta odabira 3’ prema podređenim mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišje κ sekvence 5’ u vezi sa κ segmentima gena promenljivog lakog lanca. U jednom varijantnom rešenju, suprotstavljena mesta prepoznavanja rekombinaze su suprotno usmerena jedna prema drugim. U specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze su različita. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze su loxP mesto i lox511 mesto. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina.
[0102] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg κ lokusa 5’ u vezi sa mišjim Jκ segmentima gena, kasetom odabira, mestom prepoznavanja rekombinaze 3’ a kaseti odabira, i 3’ ciljajućim krakom za ciljanje mišje κ sekvence 3’ u vezi sa mišjim Jκ segmentima gena i 5’ na mišjem κ intronskom pojačavaču. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je u istom smeru prema transkripciji kao ova kaseta odabira. U specifičnom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je loxP mesto.
[0103] Takođe, opisan je izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, prvi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 5’ endogenih mišjih Vκ segmenata gena, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze drugo mesto prepoznavanja rekombinaze, i drugi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 3’ endogenih mišjih Jκ segmenata gena i 5’ mišjeg κ intronskog pojačavača.
[0104] Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu genetska modifikacija obuhvata modifikaciju sa jednim ili više DNK konstrukata opisanih iznad ili ovde.
[0105] Takođe je opisana, upotreba izolovanog DNK konstrukta da se napravi miš kako je ovde opisano. Takođe je opisana upotreba opisanog DNK konstrukta kako je ovde opisan u postupku za pravljenje proteina koji vezuje antigen.
[0106] Takođe je opisana matična nehumana ćelija koja obuhvata ciljajući vektor koji obuhvata DNK konstrukt kako je opisano gore i ovde. Takođe je opisana matična nehumana ćelija, pri čemu je nehumana matična ćelija izvedena iz mišje ovde opisane.
[0107] U jednom varijantnom rešenju, nehumana matična ćelija je embrionska matična (ES) ćelija. U specifičnom varijantnom rešenju, ova ES ćelija je .mišja ES ćelija.
[0108] Takođe je opisana upotreba nehumane matične ćelije kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. Takođe je opisana upotreba matične ćelije koja nije ljudska kako je opisano ovde da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0109] Takođe je opisan mišji embrion, pri čemu mišji embrion obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisan je domaćin mišjeg embriona koji obuhvata ES ćeliju donatora, pri čemu ES ćelija donator obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, mišji embrion je embrion u fazi pre-morule 't.j. pre-blastulacije (korak koji prethodi formiranju embriona). U specifičnom varijantnom rešenju, embrion u fazi pre morule je embrion u fazi od 4-ćelije ili embrion u fazi od 8 ćelija. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mišji embrion je blastocist.
[0110] Takođe je opisana upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisan da se napravi miš kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisana je upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0111] Takođe je opisana, nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koji je somatski mutiran.
[0112] Takođe je opisana, nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koji je somatski mutiran.
[0113] Takođe je opisana upotreba nehumane ćelije kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisuje se upotreba nehumane ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0114] Takođe je opisana mišja B ćelija koja ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata (a) promenljivi region izveden iz hVλ segmenta gena i hJλ . segment gena; i, (b) mišji Cλ gen. Cλ gen je Cλ2. U jednom varijantnom rešenju, mišja B ćelija još ispoljava poznati teški lanac koji obuhvata (c) promenljivi region izveden iz hVH, hDH, i (d) hJHsegmenta. U jednom varijantnom rešenju, B ćelija ne obuhvata preraspoređeni λ gen. U drugom varijantnom rešenju, B ćelija ne obuhvata preraspoređeni κ gen.
[0115] Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVλ i barem jedan hJλ na endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata mišji Cλ gen; (b) čime se omogućava da genetski modifikovan miš razvije odgovor imunog sistema prema antigenu; i, (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo prepoznaje laki lanac izveden iz hVλ, hJλ i mišje Cλ gena.
[0116] [Brisano]
[0117] [Brisano]
[0118] U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVλ na λ lokusu lakog lanca i barem jedan Jλ na λ lokusu lakog lanca, pri čemu λ lokus lakog lanca obuhvata nedirnuti mišji Cλ gen; (b) što omogućava genetski modifikovanom mišu da razvije imuni odgovor prema antigenu; i, (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje ovaj antigen, ili identifikovanje kod miša B sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu ovo antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVλ, hJλ i mišjeg Cλ gena.
[0119] Konstantni gen λ lakog lanca je nedirnuti mišji Cλ gen. Netaknuti mišji Cλ gen je Cλ2.
[0120] Takođe je opisan, postupak za pravljenje gena preraspoređenog antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVλ i hJλ na endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu lokus lakog lanca obuhvata mišji Cλ gen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata λ segment gena promenljivog regiona lakog lanca i Cλ2 gena ili njegov funkcionalni fragment.
[0121] U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje obuhvata ljudski Vλ i mišji Cλ.
[0122] [Brisano]
[0123] [Brisano]
[0124] [Brisano]
[0125] [Brisano]
[0126] U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje preraspoređenog gena antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVλ i hJλ , na mišjem λ lokusu lakog lanca, pri čemu λ lokus lakog lanca obuhvata nedirnuti mišji Cλ2 gen; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina u pomenutom mišu, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata λ segment gena promenljivog regiona lakog lanca i Cλ2 gena.
[0127] Konstantni gen λ lakog lanca je nedirnuti mišji Cλ2 gen.
[0128] U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje obuhvata ljudski Vλ i mišji Cλ.
[0129] Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela, obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigen, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koji specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira teški lanac i preaspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline promenljivog domena teškog i lakog lanca spojene na ljudske konstantne domene da se napravi željeno antitelo, pri čemu željeno antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata Vλ domen spojen na CLdomen. Vλ domen je ljudski i CLdomen je mišji Cλ domen.
[0130] [Brisano]
[0131] U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisan antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira promenljivi domen teškog lanca i preraspoređenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline spojene na sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski konstantni domen teškog lanca i ljudski konstantni domen lakog lanca da se napravi antitelo izvedeno iz ljudskih sekvenci, pri čemu antitelo koje specifično vezuje ovaj antigen obuhvata laki lanac koji obuhvata ljudski Vλ domen spojen na mišji Cλ region.
[0132] Mišji Cλ region je Cλ2.
[0133] U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela, koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano ovde antigenu, (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; (c) određivanje ćelije kod miša koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira preraspoređen ljudsku sekvencu Vλ domena spojenu sa mišjim Cλ domenom, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski VHdomen i mišji CHdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski Vλ domen i sekvence nukleinske kiseline kodira poznati ljudski VHdomen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski Vλ domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VHdomen da se napravi potpuno ljudsko antitelo.
[0134] [Brisano]
[0135] U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano u ovom opisu antigenu; (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema na antigen; (c) identifikovanje ćelije kod miša koja obuhvata DNK koja kodira preraspoređeni ljudski Vλ sekvencu domena spojenu na mišji Cλ domen, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski VHdomen i mišji CHdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje taj antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira preraspoređeni ljudski Vλ domen i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VHdomen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski Vλ domen i kloniranu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VHdomen da se napravi potpuno ljudsko antitelo. Mišji Cλ domen je mišji Cλ2.
[0136] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava ljudski λ-izvedeni laki lanac spojen na endogeni konstantni region lakog lanca (Cλ), pri čemu miš, posle imunizacije sa antigenom, stvara antitelo koje obuhvata ljudski Vλ domen spojen na mišji Cλ domen. Cλ domen je Cλ2.
[0137] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji obuhvata modifikovani endogeni λ lokus lakog lanca kako je ovde opisano, koji ispoljava više λ lakih lanaca imunoglobulina povezanih sa više teških lanaca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, teški lanac obuhvata ljudsku sekvencu. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju, više λ lakih lanaca imunoglobulina sadrži sekvencu čoveka. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca čoveka se bira iz promenljive sekvence, konstantne sekvence, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata onemogućeni endogeni lokus imunoglobulina i ispoljava teški lanac iz transgena ili ekstrahromozomnog epizoma. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu na endogenom mišjem lokusu nekih ili svih endogenih mišjih segmenata gena teškog lanca (t.j., V, D, J), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence konstantnog teškog lanca (npr., CH1, zglob, CH2, CH3, ili njihovu kombinaciju), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence lakog lanca (npr., V, J, konstantne, ili njihove kombinacije), sa jednom ili više sekvenci imunoglobulina čoveka.
[0138] Takođe je opisan miš pogodan za pravljenje antitela koja imaju ljudski λ-izveden laki lanac pri čemu su sva ili pretežno sva antitela napravljena kod miša ispoljena sa ljudskim λ-izvedenim lakim lancem. U jednom varijantnom rešenju, ljudski λ-izveden laki lanac se ispoljava iz endogenog lokusa lakog lanca.
[0139] Takođe je opisan postupak za pravljenje λ-izvedenog lakog lanca za ljudsko antitelo, koje obuhvata dobijanje iz miša kako je ovde opisano sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca za pravljenje ljudskog antitela.
[0140] Takođe je opisan, postupak za pravljenje proteina za vezivanje antigena, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; i dobijanje iz miša proteina za vezivanje antigena koji veže antigen, ili dobijanje iz miša sekvence koju treba koristiti za pravljenje proteina za vezivanje antigena koji veže antigen.
[0141] Takođe je opisana ćelija izvedena iz miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija se bira iz embrionske matične ćelije, višestruko jake ćelije, indukovane višestruko jake ćelije, B ćelije, i hibridoma.
[0142] Takođe je opisana ćelija koja obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je mišja ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija se bira iz hibridoma i kvadroma. U jednom varijantnom rešenju, ova ćelija ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata ljudsku λ promenljivu sekvencu spojenu sa mišjom λ konstantnom sekvencom.
[0143] Takođe je opisano tkivo izvedeno iz miša kako je ovde opisano.
[0144] Takođe je opisana upotreba miša ili ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein za vezivanje antigena. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein. U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo.
[0145] Takođe se odnosi na protein za vezivanje antigena napravljen pomoću miša, ćelije, tkiva, ili postupka kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein. U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo.
[0146] [Brisano]
KRATAK OPIS SLIKA
[0147]
SL. 1 pokazuje detaljnu ilustraciju, ne u razmeri, ljudskog λ lokusa lakog lanca uključujući skupine Vλ segmenata gena (A, B i C) i parove Jλ i Cλ regiona (J-C parove)
SL. 2 pokazuje opštu opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenom mišu λ lokus lakog lanca.
SL. 3 pokazuje opštu opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenog mišaκ lokus lakog lanca.
SL. 4A pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenom mišu λ lokus lakog lanca sa ljudskim λ sekvencama lakog lanca uključujući 12 hVλ segmente gena i hJλ1 segmente gena (12/1-λ ciljajući vektor).
SL. 4B pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri četiri prvobitna ciljna vektora za ciljanje endogenog mišjeg κ lokusa lakog lanca sa ljudskim λ sekvencama lakog lanca koje obuhvataju 12 hVλ segmente gena, i hJλ1 segment gena (12/1-κ ciljajući vektor), 12 hVλ segmente gena i hJλ1, 2, 3 i 7 segmente gena (12/4-κ ciljajući vektor), 12 hVλ segmente gena, ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu i hJλ1 segment gena (12(κ)1-κ ciljajući vektor) i 12 hVλ segmente gena, ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu i hJλ1, 2, 3 i 7 segmente gena (12(κ)4-κ ciljajući vektor). SL. 5A pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strategije ciljanja za progresivno umetanje 40 hVλ segmenata gena i jedan hJλ segment gena u mišji λ lokus lakog lanca.
SL. 5B pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljne strategije za progresivno umetanje 40 hVλ segmenata gena i jedan hJλ segment gena u mišji κ lokus.
SL. 6 pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljnih koraka i koraka molekularnog inženjeringa korišćenih da se naprave jedinstveni ljudski λ-κ hibridni ciljajući vektori za izgradnju hibridnog lokusa lakog lanca koji sadrži ljudsku κ intergensku sekvencu, više hJλ segmenata gena ili oba.
SL. 7A pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za modifikovani mišji λ lokus lakog lanca koji sadrži 40 hVλ segmente gena i jedan hJλ segment gena funkcionalno povezan na endogeni Cλ2 gen.
SL. 7B pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za četiri nezavisna, mofifikovana mišja κ lokusa lakog lanca koji sadrže 40 hVλ segmenata gena i bilo jedan ili četiri hJλ segmenta gena sa ili bez dodirne ljudske Vκ-Jκ genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni Cκ gen.
SL. 8A pokazuje skice konture Igλ<+>i Igκ<+>splenocite usmerene na CD19<+>od miša divljeg tipa (WT), mišjeg homozigota za 12 homozigota za 12 hVλ i četiri hJλ segmenta gena koji obuhvataju ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (12hVλ-VJκ- 4Jκ) i mišji homozigotni za 40 hVλ i jedan hJλ segment gena (40hVλ-1hJλ).
SL. 8B pokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 12 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (12hVλ-VκJκ-4hJλ) i mišji homozigot za 40 hVλ i jedan hJλ segment gena (40hVλ-1hJλ).
[0158] SL. 9A, na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na singlete i postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Donji panel pokazuje iscrtane konture splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za Igλ+ i Igκ+ iispoljavanje iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 9B pokazuje ukupan broj CD19<+>, CD19<+>Igκ<+>i CD19<+>Igλ<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 9C pokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za imunoglobulin D (IgD) i imunoglobulin M (IgM) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Zrele (72 za WT, 51 za 40hVλ-VκJκ-4hJλ) i tranzicione (13 za WT, 22 za 40hVλ-VκJκ-4hJλ) B ćelije su navedene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 9D pokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija, tranzicionih B ćelija (CD19<+>IgM<hi>IgD<lo>) i zrelih B ćelija (CD19<+>IgM<lo>IgD<hi>) u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudske Vκ-Jκ genomske sekvence (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 10A, na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Panel na dnu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži usmerene na CD19+ i postavljene za ckit<+>i CD43 iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Pro i Pre B ćelije se označavaju na iscrtanoj konturi na donjoj ploči.
SL. 10B pokazuje broj Pro (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i Pre (CD19<+>CD43<->ckit-) B ćelija u koštanoj srži prikupljenoj iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 10C pokazuje iscrtanu konturu koštane srži na singletima postavljenim za imunoglobulin M (IgM) i B220 od miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ- Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Nezrele, zrele i pro/pre B ćelije su označene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 10D pokazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<hi>IgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanih iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ segmenata gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 10E pokazuje iscrtane konture koštane srži usmerene na nezrele (B220<int>IgM<+>) i zrele (B220<hi>IgM<+>) B ćelije postavljene za Igλ i Igκ ispoljavanje izolovane iz butnih kostiju miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 11 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Vλ-Jλ-Cκ spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske λ sekvence gena lakog lanca na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca. A6 = ID BR SEK:57; B6 = ID BR SEK:58; F6 = ID BR SEK:59; B7 = ID BR SEK:60; E7 = ID BR SEK:61; F7 = ID BR SEK:62; C8 = ID BR SEK:63; E12 = ID BR SEK:64; 1-4 = ID BR SEK:65; 1-20 = ID BR SEK:66; 3B43 = ID BR SEK:67; 5-8 = ID BR SEK:68; 5-19 = ID BR SEK:69; 1010 = ID BR SEK:70; 11A1 = ID BR SEK:71; 7A8 = ID BR SEK:72; 3A3 = ID BR SEK:73; 2-7 = ID BR SEK:74. Baze sa malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJλ1 i miša Cκ 2 su označene na dnu poravnanja sekvence.
SL. 12 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Vλ-Jλ-Cκ spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske λ sekvence gena lakog lanca uključujući dodirnu ljudsku Cκ-Jκ genomsku sekvencu na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca.5-2 = ID BR SEK:87; 2-5 = ID BR SEK:88; 1-3 = ID BR SEK:89; 4B-1 = ID BR SEK:90; 3B-
5 = ID BR SEK:91; 7A-1 = ID BR SEK:92; 5-1 = ID BR SEK:93; 4A-1 = ID BR SEK:94; 11A-1 = ID
BR SEK:95; 5-7 = ID BR SEK:96; 5-4 = ID BR SEK:97; 2-3 = ID BR SEK:98. Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida svakog ljudskog Jλ i mišjeg Cκ su označene sa donje strane poravnanja sekvence.
SL. 13 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Vλ-Jλ-Cκ spoja tri nezavisna RT-PCR klona pojačana iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske λ sekvence gena lakog lanca na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca. 2D1 = ID BR SEK:101; 2D9 = ID BR SEK:102; 3E15 = ID BR SEK:103. Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJλ1 i mišjeg Cλ2 su označene na dnu poravnanja sekvence.
DETALJAN OPIS
[0148] Ovaj pronalazak u svom najširem smislu je kako je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima [0149] Pojam "dodirno" obuhvata referencu na pojavu istog molekula nukleinske kisleine, npr., dve sekvence nukleinske kiseline su "dodirne" ako se javljaju na istom nukleinskom molekulu ali su prekiute drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, preraspoređena V(D)J sekvenca je "dodirna" sa sekvencom gena konstantnog regiona, iako finalni kodon V(D)J sekvence nije neposledno praćen prvim kodonom sekvence konstantnog regiona. U drugom primeru, dve sekvence V segmenta gena su ''dodirne'' ako se jave na istom genomskom fragmentu, iako one mogu da budu odvojene sekvencom koja ne kodira kodon V regiona, npr., one mogu da budu odvojene regulatornom sekvencom, npr., promoterom ili drugom nekodirajućom sekvencom. U jednom izvođenju, dodirna sekvenca obuhvata genomski fragment koji obuhvata genomske sekvence raspoređene kako se nalaze u genomu divljeg tipa.
[0150] Fraza "izvedeno iz" kada se koristi u vezi sa promenljivim regionom "izveden iz" navedenog gena ili segmenta gena obuhvata sposobnost da se prati sekvenca nazad do određenog nepreraspoređenog segmenta gena ili segmenata gena koji su preraspoređeni da formiraju gen koji ispoljava promenljivi domen (uzimajući u obzir, gde je primenljivo, razlike u spoju i somatskim mutacijama).
[0151] Fraza "funkcionalno" kada se koristi u vezi sa segmentom gena promenljivog regiona ili spojnim segmentom gena odnosi se na upotrebu u ispoljenom repertoaru antitela; npr., kod ljudi Vλ segmenti gena 3-1, 4-3, 2-8, itd. su funkcionalni, za razliku od njih, Vλ segmenti gena 3-2, 3-4, 2-5, itd. su nefunkcionalni.
[0152] "Lokus teškog lanca" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišjem hromozomu, pri čemu su pronađeni promenljivi teški lanac miša divljeg tipa (VH), raznovrsnost teškog lanca (DH), spoj teškog lanca (JH), i sekvence DNK konstantnog regiona teškog lanca (CH).
[0153] "κ Lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipa κ promenljivi (Vκ), κ spojni (Jκ), i κ konstantni (Cκ) region DNK sekvence.
[0154] "λ Lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipa λ promenljiv (Vλ), λ spojni (Jλ), i λ konstantni (Cλ) region sekvenci DNK.
[0155] Pojam "nepreraspoređeni" obuhvata stanje lokusa imunoglobulina pri čemu se V segmenti gena i J segmenti gena (za teške lance, D segmenti gena takođe) održavaju odvojeno ali mogu da se spoje da formiraju preraspoređeni V(D)J gen koji obuhvata jedan V,(D),J od ovog V(D)J repertoara.
Miševi koji ispoljavaju ljudske λ promenljive domene
[0156] Miševi koji ispoljavaju antitela koja nisu potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su prethodno već prikazani. VELOCIMMUNE® genetski projektovani miševi obuhvataju zamenu nepreraspoređenih V(D)J segmenata gena na endogenim mišjim lokusima sa ljudskim V(D)J segmentima gena. VELOCIMMUNE® miševi ispoljavaju himerna antitela koja imaju ljudske promenljive domene i mišje konstantne domene (videti, npr., US Pat. br. 7,605,237). Većina drugih izveštaja se odnosi na miševe koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz potpuno ljudskih transgena kod miševa koji imaju onemogućene endogene lokuse imunoglobulina.
[0157] Laki lanci antitela se kodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (κ) i lambda (λ). Laki lanci antitela miša su primarno κ tipa. Miševi koji prave mišja antitela, i modifikovani miševi koji prave potpuno ljudska ili himerna ljudsko-mišja antitela, prikazuju neuravnoteženost u pogledu upotrebe lakog lanca. Ljudi takođe ispoljavaju neuravnoteženost lakog lanca, ali ne tako izraženu kao kod miševa, odnos κ lakih lanaca prema λ lakim lancima kod miševa je oko 95:5, pri čemu je kod ljudi oko 60:40. Izraženija neuravnoteženost kod miševa se ne smatra da ozbiljno utiče na raznovrsnost antitela, jer kod miševa λ promenljivi lokus nije tako raznovrstan u prvoj instanci. Ovo nije tako i kod ljudi. Ljudski λ lokus lakog lanca obiluje raznovrsnošću.
[0158] Ljudski λ lokus lakog lanca se nastavlja preko 1.000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju promenljive (V) ili spojne (J) segmente (SL.1). Unutar ljudskog λ lokusa lakog lanca, preko polovine svih primećenih Vλ domena se kodira pomoću segmenata gena 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, i 3-21. Sve u svemu, oko 30 ili tako nešto ljudskih Vλ segmenata gena se smatra funkcionalnim. Ima sedam Jλ segmenata gena, samo njih četiri se smatra generalno funkcionalnim Jλ segmentima gena, Jλ1, Jλ2, Jλ3, i Jλ7.
[0159] Lokus λ lakog lanca kod ljudi je slične strukture kao κ lokus kod miševa i ljudi po tome što ljudski λ lokus lakog lanca ima nekoliko segmenata gena promenljivog regiona koji su sposobni da se rekombinuju da se formira funkcionalni protein lakog lanca. Ljudski λ lokus lakog lanca sadrži približno 70 V segmenata gena i 7 parova Jλ-Cλ segmenta gena. Samo četiri od ovih Jλ-Cλ parova segmenta gena se čine funkcionalnim. Kod nekih alela, peti Jλ-Cλ par segmenta gena je prema izveštajima pseudo gen (Cλ6). 70 Vλ segmenata gena izgleda da sadrže 38 funkcionalnih segmenata gena. 70 Vλ sekvenci se raspoređuje u tri skupine, a sve sadrže različite članove distinktivnih grupa familije V gena (skupine A, B i C; SL. 1). Postoji potencijalno bogat izvor relativno neiskorišćene raznovrsnosti za generisanje antitela sa ljudskim V regionima kod nehumanih životinja.
[0160] Kao oštar kontrast, mišji λ lokus lakog lanca sadrži samo dva ili tri (zavisno od soja) mišja segmenta gena Vλ regiona (SL . 2). Barem iz ovog razloga, ozbiljna κ pristrasnost kod miševa se ne smatra posebno pogubnom za ukupnu raznovrsnost antitela.
[0161] Prema objavljenim mapama λ mišji lokus lakog lanca, lokus se sastoji u suštini od dve skupine segmenata gena unuar ospega od približno 200 kb (SL.2). Ove dve skupne sadrže dva kompleta V, J, i C gena koji su sposobni za nezavisno preraspoređivanje: Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 i Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1. Iako je za Vλ2 utvrđeno da se rekombinuje sa svim Jλ segmentima gena, Vλ1 se izgleda ekskluzivno rekombinuje sa Cλ1. Veruje se da je Cλ4 pseudo gen sa neispravnim mestima spajanja.
[0162] Mišji κ lokus lakog lanca je izrazito drugačiji. Struktura i broj segmenata gena koji učestvuju u događajima rekombinacije koji vode funkcionalom proteinu lakog lanca iz mišjeg κ lokusa je mnogo složenija (SL. 3). Dakle, mišji λ laki lanci ne doprinose u velikoj meri raznovrsnosti populacije antitela kod tipičnog miša.
[0163] Iskorišćavanje obilate raznovrsnosti ljudskih λ lokusa lakog lanca kod miševa bi verovatno kao rezultat dalo, između ostalog, izvor za kompletniji ljudski repertoar V domena lakog lanca. Prethodni pokušaji da se dodirne ova raznovrsnost koristila je ljudske transgene koji sadrže blokove ljudskog lokusa λ lakog lanca nasumično inkorporirane u mišji genom (videti, npr., US 6,998,514 i US 7,435,871). Miševi koji sadrže ove nasumično integrisane transgene prema izveštajima ispoljavaju potpuno ljudske λ lake lance, međutim, u nekim slučajevima, jedan ili oba endogena lokusa lakog lanca ostaje nedirnut. Ova situacija nije poželjna jer se ljudske λ sekvence lakog lanca nadmeću sa mišjim lakim lancem (κ ili λ) u ispoljenom repertoaru antitela miša.
[0164] Nasuprot tome, pronalazači opisuju genetski modfikovane miševe koji su sposobni da ispoljavaju jednu ili više λ sekvenci nukleinske kiseline lakog lanca direktno iz endogenog mišjeg lokusa lambda lakog lanca. Genetski modifikovanih miševa sposobnih da ispolje ljudske λ sekvence lakog lanca iz endogenog λ lokusa mogu još da budu odgajani na miševima koji obuhvataju ljudski lokus teškog lanca i zato se koriste da ispolje antitela koja obuhvataju V regione (teške i λ lake) koji su potpuno ljudski. V regioni se ispoljavaju sa mišjim konstantnim regionima. Kod različitih varijantnih rešenja, nema prisutnih endogenih mišjih segmenata gena imunoglobulina i V regioni se ispoljavaju sa ljudskim konstantnim regionima. .Ova antitela će se pokazati korisna u brojnim primenama, i dijagnostičkim i terapijskim.
[0165] Brojne prednosti mogu da se realizuju za različita varijantna rešenja ispoljavanja proteina za vezivanje izvedenih iz ljudskih Vλ i Jλ segmenata gena kod miševa. Prednosti mogu da se realizuju postavljanjem ljudskih λ sekvenci na endogenom λ lokusu lakog lanca. Antitela napravljena od takvih miševa mogu da imaju lake lance, koji obuhvataju ljudske Vλ domene spojene na mišji Cλ region. Miševi će takođe ispoljiti ljudske Vλ domene koji su pogodni za identifikaciju i kloniranje za upotrebu sa ljudskim CLregionima, specifično Cκ i/ili Cλ regionima. Zato što razvoj B ćelije kod takvih miševa jeste inače normalan, moguće je generisati kompatibilne Vλ domene (uključujući somatski mutirane Vλ domene) u kontekstu bilo Cλ ili Cκ regiona.
[0166] Opisuju se genetski modifikovani miševi koji obuhvataju nepreraspoređeni ljudski Vλ segment gena i nepreraspoređeni ljudski Jλ na endogenom λ lokusu lakog lanca imunoglobulina. Opisuju se miševi koji ispoljavaju antitela koja obuhvataju laki lanac koji ima ljudski Vλ domen spojen na Cλ region.
[0167] [Brisano]
[0168] [Brisano]
[0169] [Brisano]
[0170] [Brisano]
[0171] [Brisano]
[0172] [Brisano]
Pristupi inženjeringu miševa za ispoljavanje ljudskih Vλ domena
[0173] Opisuju se različiti pristupi za pravljenje genetski modifikovanih miševa koji prave antitela koja sadrže laki lanac koji ima ljudski Vλ domen spojen na endogeni Cλ region. Opisuju se genetske modifikacije koje, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvataju brisanje jednog ili oba endogena lokusa lakog lanca. Na primer, da se eliminišu mišji λ laki lanci iz repertoara endogenog antitlea brisanje prve Vλ-Jλ-Cλ skupine gena i zamena, u celini ili delimično, Vλ-Jλ segmenata gena druge skupine gena sa ljudskim Vλ-Jλ segmentima gena može da se izvede. Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljni konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija.
[0174] Brisanje jedne endogene Vλ-Jλ-Cλ skupine gena i zamena Vλ-Jλ segmenata gena druge endogene Vλ-Jλ-Cλ skupine gena koristi relativno minimalni prekid u prirodnom udruživanju konstantnog regiona antitela i funkcije kod životinje, kod različitih varijantnih rešenja, zbog toga što se endogeni Cλ geni ostavljaju nedirnuti i samim tim zadržavaju normalnu funkcionalnost i sposobnost da se udružuju sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca. Dakle, u takvim varijantnim rešenjima, modifikacija ne utiče na druge konstantne regione teškog lanca zavisne od funkcionalnih konstantnih regiona lakog lanca za sklop funkcionalnog molekula antitela koji sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. Pored toga, kod različitih varijantnih rešenja ova modifikacija ne utiče na sklop funkciolnalnog molekula antitela vezanog membranom koji obuhvata endogeni teški lanac i laki lanac, npr., hVλ domen povezan na mišji Cλ region. Zbog toga što se najmanje jedan funkcionalan Cλ gen zadržava na endogenom lokusu, životinje koje sadrže zamenu Vλ-Jλ segmenata gena endogene Vλ-Jλ-Cλ skupine gena sa ljudskim Vλ-Jλ segmentima gena teba da mogu da naprave normalne λ lake lance koji su sposobni za vezivanje antigena tokom odgovora imunog sistema kroz ljudske Vλ-Jλ segmente gena prisutne u ispoljenom repertoaru antitela životinje.
[0175] Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisane endogene mišje Vλ-Jλ-Cλ skupine gena je data na SL. 2. Kako je ilustrovano, mišji λ lokus lakog lanca se organizuje u dve skupine gena, obe sadrže funkcionalne segmente gena sposobne za rekombinovanje da formiraju funkciju mišjeg λ lakog lanca. Endogena mišja Vλ1-Jλ3-Cλ3- Jλ1-Cλ1 skupina gena se briše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 1) sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću mesta rekombinacije. Druga endogena skupina gena (Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4) se briše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 2) sa kasetom higromicin-timidin kinaze prirubnom pomoću mesta rekombinacije. U ovom drugom postupku ciljanja, zadržava se Cλ2-Jλ4-Cλ4 endogenih segmenata gena. Drugi ciljni konstrukt (ciljajući vektor 2) se konstruiše korišćenjem mesta rekombinacije koja su drugačija u odnosu na mesta kod prvog ciljnog konstrukta (ciljajući vektor 1) čime se omogućava selektivno brisanje kasete odabira pošto je ostvareno uspešno ciljanje. Dobijeni dvostruko ciljani lokus je funkcionalno utišan u tome da nijedan endogeni λ laki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovan lokus može da se koristi za umetanje ljudskih Vλ i Jλ segmenata gena da se stvori endogeni mišji λ lokus koji obuhvata ljudske Vλ i Jλsegmente gena, pomoću kojih, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodi λ lake lance koji obuhvataj preraspoređene ljudske Vλ i Jλ segmente gena povezane na endogeni mišji Cλ segment gena.
[0176] Genetsko modifikovanje miša da se dobiju endogeni λ segmenti gena nefunkcionalni, u različitim varijantnim rešenjima, daje kao rezultat miša koji ispoljava isključivo κ lake lance u repertoaru antitela, što čini miša korisnim za procenu uloge λ lakih lanaca za odgovor imunog sistema, i korisnim za pravljenje repertoara antiela koji obuhvata Vκ domene ali ne Vλ domene.
[0177] Genetski modifikovan miš koji ispoljava hVλ povezan na mišji Cλ gen koji je rekombinovan na endogeni mišji λ lokus lakog lanca može da se napravi pomoću bilo kog postupka poznatog u nauci. Šematska ilustracija (ne u razmeri) zamene endogenih mišjih Vλ2-Vλ3-Jλ2 segmenata gena sa ljudskim Vλ i Jλ segmentima gena datim na SL.4A. Kako je ilustrovano, endogeni mišji λ lokus lakog lanca koji je učinjen nefunkcionalnim se zameni ciljajućim konstruktom (12/1-λ ciljajući vektor) koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću mesta rekombinacije. Ovi Vλ2-Vλ3-Jλ2 segmenti gena se zamenjuju genomskim fragmentom koji sadrži ljudsku λ sekvencu koja obuhvata 12 hVλ segmenata gena i samo jedan hJλ segment gena.
[0178] Dakle, ovaj prvi pristup pozicionira jedan ili više hVλ segmenata gena na endogeni λ lokus lakog lanca dodiran jednom hJλ segmentom gena (SL.4A).
[0179] Dodatne modifikacije na modifikovani endogeni λ lokus lakog lanca mogu da budu ostvarene korišćenjem sličnih tehnika da se ubaci više hVλ segmenata gena. Na primer, šematske ilustracije dva dodatna ciljna konstrukta (+16-λ i 12-λ ciljajući vektori) korišćeni za progresivno umetanje dodavanja ljudskih hVλ segmenata gena su dati na SL. 5A. Kao što je ilustrovano, dodatni genomski fragmenti koji sadrže specifične ljudske hVλ segmente gena se ubacuju u modifikovane endogene λ lokuse lakog lanca u uzastopnim koracima korišćenjem homologije obezbeđene prethodnim umetanjem ljudskih λ sekvenci lakog lanca. Posle rekombinacije sa svakim ciljnim ilustrovanim konstruktom, na uzastopan način, 28 dodatnih hVλ segmenata gena se umeće u modifikovani endogeni λ lokus lakog lanca. Ovo stvara himerni lokus koji proizvodi λ protein lakog lanca koji obuhvata ljudske Vλ-Jλ segmente gena povezane na mišji Cλ gen.
[0180] Gornji pristupi ubacivanju ljudskih λ segmenata gena lakog lanca na mišjem λ lokusu, zadržava pojačavače pozicionirane nizvodno Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmenata gena (naznačene Enh 2.4, Enh i Enh 3.1 SL. 4A i SL. 5A). Ovaj pristup daje kao rezultat jedan modifikovan alel na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca (SL.7A).
[0181] Takođe su opisana jedinjenja i postupci za pravljenje miša koji ispoljava laki lanac koji obuhvata hVλ i Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cλ segment gena, uključujući jedinjenja i postupak za pravljenje miša koji ispoljava takve gene iz endogenog mišjeg λ lokusa lakog lanca. Postupci obuhvataju selektivno pravljenje jedne endogene mišje Vλ-Jλ-Cλ skupine gena nefunkcionalnom (npr., ciljanjim brisanjem), i korišćenje hVλ i Jλ segmente gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca da se ispolji hVλ domen kod miša.
[0182] Takođe je opisan drugi pristup gde ljudski λ segmenti gena lakog lanca mogu da budu pozicionirani na endogenom κ lokusu lakog lanca. Genetska modifikacija, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvata brisanje endogenog κ lokusa lakog lanca. Na primer, da bi se eliminisali mišji κ laki lanci iz repertoara endogenog antitela, moguće je izvesti brisanje mišjih Vκ i Jκ segmenata gena. Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljajući konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija.
[0183] Iz gore navedenih razloga, brisanje mišjih Vκ i Jκ segmenata gena koristi relativno minimalni prekid. Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisanih mišjih Vκ i Jκ segmenata gena je data na SL. 3. Endogeni mišji Vκ i Jκ segmentima gena se briše preko rekombinazom posredovanog brisanja mišjih sekvenci pozicioniranih između dva precizno pozicionirana ciljna vektora svaki koristi mesta za rekombinaciju specifičnu za-mesto. Prvi ciljajući vektor (Jκ ciljajući vektor) se koristi u prvom ciljajućem događaju za brisanje mišjih Jκ segmenata gena. Drugi ciljajući vektor (Vκ ciljajući vektor) se koristi u drugom, uzastopnom procesu ciljanja da briše sekvencu smeštenu 5’ od najudaljenijeg mišjeg Vκ segmenta gena. Oba ciljajuća vektora sadrže mesta za rekombinaciju specifičnu za mesto čime se omogućava selektivno brisanje obe kasete odabira i sve interventne mišje κ sekvence lakog lanca pošto je ciljanje izvedeno uspešno. Dobijeni brisani lokus je funkcionalno utišan tako da nijedan endogeni κ laki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovan lokus može da se koristi za umetanje hVλ i Jλ segmenata gena da se stvori endogeni mišji κ lokus koji obuhvata hVλ i Jλ segmente gena, pomoću kojih, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodi λ lake lance koji obuhvataju preraspoređene hVλ i Jλ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ segment gena. Različiti ciljajući vektori obuhvataju ljudske λ sekvence lakog lanca mogu da se koriste u vezi sa ovim obrisanim mišjim κ lokusom da se stvori hibridni lokus lakog lanca koji sadrži ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane sa mišjim C λ regionom.
[0184] Dakle, treći pristup, jedan ili više ljudskih Vλ segmenata gena se pozicionira na mišjem κ lokusu lakog lanca dodirnom sa jednim ljudskim Jλ segmentom gena (12/1-κ ciljajući vektor SL.4B).
[0185] Modifikacije ovog pristupa mogu da budu izvedene da se dodaju segmenti gena i/ili regulatorne sekvence da se optimizuje upotreba ljudskih λ sekvenci lakog lanca iz mišjeg κ lokusa unutar repertoara mišjeg antitela.
[0186] Takođe je opisan treći pristup gde se, jedan ili više hVλ segmenata gena pozicionira na mišjem κ lokusu lakog lanca dodirnom sa četiri hJλ sekvence gena (12/4-κ ciljajući vektor SL.4B).
[0187] U trećem pristupu, jedan ili više hVλ segmenata gena se pozicionira na mišjem κ lokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom κ intergenskom sekvencom i jednom hJλ sekvencom gena (12(κ)1-κ ciljajući vektor, SL.4B).
[0188] Takođe je opisan četvrti pristup, jedan ili više hVλ segmenata gena se pozicionira na mišjem κ lokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom λ intergenskom sekvencom četiri hJλ sekvence gena (12(κ)4-κ ciljajući vektor, SL.4B).
[0189] Svi gore navedeni pristupi za ubacivanje ljudskih λ segmenata gena lakog lanca na mišji κ lokusu, zadržavaju κ element intronskog pojačavača uzvodno od Cκ gena (naznačen Eκi, SL.4B i SL.
5B) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (naznačen Eκ3’, SL. 4B i SL. 5B). Ovaj pristup daje kao rezultat četiri modifikovana alela na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca (SL.7B).
[0190] [Brisano]
Antitela lambda domena iz genetski modifikovanih miševa
[0191] Miševi koji obuhvataju ljudske λ sekvence na mišjem λ lokusu lakog lanca će ispoljiti laki lanac koji obuhvata hVλ region spojen na mišji Cλ region. Ovo su kao prednost uzgajani miševi koji (a) obuhvataju funkcionalno neaktivni lokus lakog lanca (npr., nokaut (mutirani oblik) endogenog miša κ ili λ lokus lakog lanca); (b) obuhvataju endogeni mišji λ lokus lakog lanca koji obuhvata hVλ i hJλ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cλ gen; (c) obuhvata endogeni mišji κ lokus lakog lanca koji obuhvata hVκ i hJκ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ gen; i, (d) miš u kom jedan κ alel obuhvata hVκ i hJκ; drugiκ alel obuhvata hVλ i hJλ; jedan λ alel obuhvata hVλ i hJλ i jedan λ alel inaktivni ili mutirani, ili oba λ alela koja obuhvataju hVλ I hJλ*, i dva alela teškog lanca koji obuhvataju hVH, hDH, i hJH.
[0192] Antitela koja obuhvataju hVλ domene ispoljene u kontekstu bilo kog od Cλ se koriste da naprave potpuno ljudska antitela kloniranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju hVλ domene u ispoljavanje konstrukata koji nose gene koji kodiraju ljudski Cλ. Konstrukti ispoljavanja koji nastanu kao rezultat se transfektuju u ćelije domaćina pogodne za ispoljavanje antitela koja prikazuju potpuno hVλ domen spojen na hCλ.
PRIMERI
[0193] Dati su sledeći primeri tako da se opiše kako da se napravi upotreba postupaka i jedinjenja prema ovom pronalasku, i nisu predviđeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju da je njihov pronalazak. Osim ako nije drugačije navedeno, temperatura je navedena u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer I
Brisanje mišjih lokusa lakog lanaca imunoglobulina
[0194] Različiti ciljajući konstrukti su napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US Pat. br. 6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech (Inženjering visokog kvaliteta mišjeg genoma spojen sa analizom velike rezolucije ispoljavanja), Nature Biotech. analysis, Nature Biotech.
21(6):652-659) za modifikovanje biblioteka mišjih genomskih bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) da se inaktiviraju mišji κ i λ lokusi lakog lanca.
[0195] Brisanje mišjeg λ lokusa lakog lanca. DNK iz mišjeg BAC klona RP23-135k15 (Invitrogen) je modifikovana homolognom rekombinacijom da se inaktivira endogeni mišji λ lokus lakog lanca putem ciljanog brisanja Vλ-Jλ-Cλ skupina gena (SL.2).
[0196] Ukratko, cela proksimalna skupina obuhvata Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 segmente gena je brisana u jednom ciljnom događaju korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću loxP mesta sa 5’ mišjim homolognim krakom koji sadrži sekvencu 5’ Vλ1 segmenta gena i 3’ mišjeg homolognog kraka koji sadrži sekvencu 3’ Cλ1 segment gena (SL.2, ciljajući vektor 1).
[0197] Drugi ciljajući konstrukt je pripremljen da precizno obriše distalnu endogenu mišju λ skupinu gena koja sadrži Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 izuzev one koju je ciljajućii konstrukt sadržao 5’ mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5’ Vλ2 segmenta gena i 3’ mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5’ na endogenom Cλ2 segmentu gena (SL. 2, Ciljajući vektor 2). Dakle, drugi ciljajući konstrukt je precizno izbrisan Vλ2-Jλ2, pritom ostavlja Cλ2-Jλ4-Cλ4 nedirnut na endogenom mišjem λ lokusu. ES ćelije koje su sadržale neaktivirani endogeni λ lokus (kako je gore opisano) su potvrđene putem u tehnici poznatih postupaka karotipovanja i snimanja (npr., TAQMAN®).. DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretiranju sa CRE rekombinazom čime je posredovala brisanje proksimalne ciljne kasete koja je sadržala gen marker neomicina, ostavljajući samo jedno loxP mesto u tački brisanja (SL.2, dno).
[0198] Brisanje mišjeg κ lokusa lakog lanca. Korišćenjem postupaka sličnih gore opisanim postupcima gore opisanim postupcima, napravljeno je nekoliko ciljnih konstrukata da se modifikuje DNK iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04 (Invitrogen) homolognom rekombnacijom da se inaktivira mišji κ lokus lakog lanca u dvostepenom procesu (SL.3).
[0199] Ukratko, Jκ segmenti gena (1-5) endogenog mišjeg κ lokusa lakog lanca su izbrisani u samo jednom procesu ciljanja korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu higromicin-timidin kinaze (hyg-TK) koja sadrži jedno loxP mesto 3’ na hyg-TK kasetu (SL. 3, Jκ ciljajući vektor). Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu 5’ i 3’ endogenih mišjih Jκ segmenata gena. U drugom procesu ciljanja, drugi ciljajući vektor je pripremljen da obriše deo mišje genomske sekvence uzvodno (5’) na najudaljenijem endogenom mišjem Vκ segmentu gena (SL.
3, Vκ ciljajući vektor). Ovaj ciljajući vektor je sadržao invertovano lox511 mesto, loxP mesto i kasetu neomicina. Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu uzvodno od najudaljenijeg mišjeg Vκ segmenta gena. Ciljajući vektori su korišćeni uzastopno (t.j., Jκ zatim Vκ) da ciljaju DNK u embrionskim matičnim (ES) ćelijama. Embrionske matične (ES) koje nose dvostruko ciljani hromozom (t.j., jedan endogeni mišji κ lokus ciljan sa oba ciljajuća vektora) su potvrđeni postupcima karotipovanja i snimanja (npr., Taqman™) poznat u ovoj oblasti. DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretmanu sa Cre rekombinazom čije je posredovano brisanje endogenih mišjih Vκ segmenata gena i obe kasete odabira, pritom ostavljajući dva suprotstavljena lox mesta suprotno orijentisana jedan u odnosu na drugi (SL.3, dno; ID BR SEK:1).
[0200] Dakle, dva modifikovana endogena lokusa lakog lanca (κ i λ) koja sadrže nedirnuti pojačavač i konstantne regione su stvorena za progresivno umetanje nepreraspoređenih ljudskih λ segmenata gena klicine linije na precizan način korišćenjem ciljajućih vektora opisanih dole u tekstu.
Primer II
Zamena mišjih lokusa lakog lanca sa ljudskim λ mini-lokusom lakog lanca
[0201] Višestrki ciljajući vektori su projektovani za progresivno umetanje ljudskih λ segmenata gena u endogene mišje κ i λ lokuse lakog lanca korišćenjem sličnih postupaka kao što je gore opisano. Višestruke nezavisne modifikacije su napravljene na endogenim lokusima lakog lanca proizvodeći himerni lokus lakog lanca koji sadrži hVλ i Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišje konstantne gene lakog lanca i pojačavače.
[0202] Ljudski λ mini-lokus koji sadrži 12 ljudskih Vλ i jedan ljudski Jλ segment gena. Niz inicijalnih ciljajućih vektora je projektovan da sadrži prvih 12 uzastopnih ljudskih Vλ segmenata gena iz skupine A i hJλ1 segmenta gena ili četiri hJλ segmenata gena korišćenjem ljudskog BAC klona pod nazivom RP11-729g4 (Invitrogen). SL. 4A i 4B pokazuju ciljajuće vektore koji su konstruisani za pravljenje početnog umetanja ljudskih λ segmenata gena lakog lanca na mišjim λ i κ lokusima lakog lanca, respektivno.
[0203] Za prvi komplet početnih ciljajućih vektora, 124,125 bp DNK fragment iz 729g4 BAC klona koji je sadržao 12 hVλ segmenata gena i hJλ1 segment gena je projektovan da sadrži PI-Scel mesto 996 bp nizvodno (3’) od hJλ1 segmenta gena za ligaciju 3’ mišjeg homolognog kraka. Korišćena su dva različita kompleta homolognih krakova za ligaciju na ovaj ljudski fragment; jedan komplet homolognih krakova je sadržao endogene mišje λ sekvence iz 135k15 BAC klona (SL.4A) i još jedan komplet je sadržao endogenu κ sekvencu 5’ i 3’ mišjih Vκ i Jκ segmenata gena iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04, respektivno (SL.4B).
[0204] Za 12/1-λ ciljajući vektor (SL. 4A), PI-Scel mesto je projektovano na 5’ kraju 27.847 bp DNK fragmenta koji sadrži mišji Cλ2-Jλ4-Cλ4 i pojačavač 2.4 modifikovanog mišjeg λ lokusa opisanog u Primeru 1. Korišćen je ∼28 kb mišji fragment kao 3’ homologni krak ligacijom na ~-124 kb ljudskog λ fragmenta, koji je stvorio 3’ ukrštanje koje je sadržalo, od 5’ do 3’, hJλ1 segmenta gena, 996 bp ljudske λ sekvence 3’ hJλ1 segmenta gena, 1229 bp mišje λ sekvence 5’ na mišjem Cλ2 genu, mišji Cλ2 gen i preostali deo ∼28 kb mišjeg fragmenta. Uzvodno (5’) od ljudskog Vλ3-12 segmenta je bio dodatni 1456 bp ljudske λ sekvence pre početka 5’ mišjeg homolognog kraka, koji je sadržao 23.792 bp mišje genomske DNK koja odgovara sekvenci 5’ endogenog mišjeg λ lokusa. Između 5’ homolognog kraka i početka ljudske λ sekvence je bila kaseta neomicina prirubna Frt mestima.
[0205] Dakle, 12/1-λ ciljajućí vektor je obuhvatao, od 5’ do 3’, 5’ homologni krak koji je sadržao -24 kb mišje λ genomske sekvence 5’ endogenog λ lokusa, 5’ Frt mesto, kaseta neomicina, 3’ Frt mesto, -123 kb ljudske genomske λ sekvence sadrži prvih 12 uzastopnih hVλ segmenata gena i hJλ1 segmenata gena, PI-Scel mesto, i 3’ homologni krak koji sadrži -28 kb mišju genomsku sekvencu koja obuhvata endogene Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmente gena, mišji pojačavač 2.4 sekvence i dodanu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) od pojačavača 2.4 (SL.4A).
[0206] Na sličan način, 12/1-κ ciljajući vektor (SL. 4B) je koristio isti -124 ljudski λ fragment sa izuzetkom da su mišji homologni kraci koji sadrže mišju sekvencu κ korišćeni tako da ciljanje na endogeni κ lokus može da se ostvari pomoću homologne rekombinacije. Dakle, 12/1-κ ciljajući vektor je obuhvaćen, od 5’ do 3’, 5’ homolognog kraka koji obuhvata ∼23 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog κ lokusa, I-Ceul mesto, 5’ Frt mesto, kaseta neomicina, 3’ Frt mesto, ∼124 kb ljudske genomske λ sekvence koja sadrži prvih 12 uzastopnih hVλ segmenata gena i hJλ1 segment gen, PI-Scel mesto, i 3’ homologni krak koji sadrži -28 kb mišje genomske sekvence obuhvata endogeni mišji Cκ gen, Eκi i Eκ3’ i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) od Eκ3’ (SL. 4B, 12/1-κ ciljajući vektor).
[0207] Homologna rekombinacija sa bilo kojim od ova dva inicijalna ciljajuća vektora kreirana sa modifikovanim mišjim lokusom lakog lanca (κ ili λ) kja sadrži 12 hVλ segmenata gena i hJλ1 segment gena funkcionalno povezan na endogeni mišji konstantni gen lakog lanca i pojačavače (Cκ ili Cκ2 i Eκi/Eκ3’ ili Enh 2.4/Enh 3.1) gen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog λ lakog lanca.
[0208] Ljudski λ mini-lokus sa 12 ljudski Vλ i četiri ljudska Jλ segmenta gena. U drugom pristupu da se doda raznovrsnost himernog λ lakog lanca, treći inicijalni ciljajući vektor je projektovan da se umetne prvih 12 uzastopnih ljudskih Vλ segmenata gena iz skupine A i hJλ1, 2, 3 i 7 segmenata gena u mišji κ lokus lakog lanca (SL. 4B, 12/4-κ ciljajući vektor). DNK segment koji sadrži hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 segmenata gena je napravljena de novo DNK sintezom (Integrated DNA Technologies) uključujući svaki Jλ segment gena i ljudsku genomsku sekvencu ∼100 bp od i neposrednih 5’ i 3’ regiona svakog Jλsegmenta gena. PI-Scel mesto je projektovano u 3’ kraj ovog ∼1 kb DNK fragment i povezan na kasetu hloroamfenikol. Homologni kraci su PCR pojačani iz ljudske λ sekvence na 5’ i 3’ pozicije relativne prema hJλ1 segmentu gena ljudskog BAC klona 729g4. Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom intermedijara je izvedena na modifikovanom 729g4 BAC klonu koji je prethodno ciljan uzvodno (5’) od ljudskog Vλ3-12 segmenta gena sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću Frt mesta, koja su takođe sadržala I-Ceul mesto 5’ do 5’ Frt mesta. Dvostruko ciljani 729g4 BAC klon je obuhvatio od 5’ do 3’ I-Ceul mesto, 5’ Frt mesto, kaseta neomicina, 3’ Frt mestom, ∼123 kb fragment koji sadrži prvih 12 hVλ segmenata gena, ∼1 kb fragment koji sadrži ljudski Jλ1, 2, 3 i 7 segmente gena, PI-Scel mesto, i kaseta hloroamfenikola. Ovaj ciljajući vektor intermedijara je rastvoren zajedno sa I-Ceul i PI-Scel i naknadno povezan u modifikovan mišji BAC klon (opisan gore) da se stvori treći ciljajući vektor.
[0209] Ova ligacija je dala kao rezultat treći ciljajući vektor za ubacivanje ljudskih λ sekvenci u endogeni κ lokus lakog lanca, koji je obuhvatio, od 5’ do 3’, 5’ mišji homologni krak koji je sadržao -23 kb genomske sekvence 5’ endogenog mišjeg κ lokusa, I-Ceul mesto, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto, -123 kb fragment koji obuhvata prvih 12 hVλ segmenata gena, -1 kb fragment koji obuhvata hJλ1, 2, 3 i 7 segmente gena, PI-Scel mesto i 3’ homologni krak koji obuhvata -28 kb mišje genomske sekvence uključujući endogeni mišji Cκ gen, Eκi i Eκ3’ i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) Eκ3’ (SL. 4B, 12/4-κ Ciljajući vektor). Homologna rekombinacija sa ovim trećim ciljajućim vektorom je stvorila modifikovani mišji κ lokus lakog lanca koji obuhvata 12 hVλ segmenta gena i četiri hJλ segmenta gena funkcionalno povezana na endogeni mišji Cκ gen koji, posle rekombinacije, vodi formiraju himernog ljudskog λ/mišjeg κ lakog lanca.
[0210] Ljudski λ mini-lokus sa integrisanom ljudskom κ sekvencom lakog lanca. Na sličan način, dva dodatna ciljajuća vektora slična onima koji su projektovani da se napravi početno umetanje ljudskih λ segmenata gena u endogeni κ lokus lakog lanca (SL. 4B, 12/1-κ i 12/4-κ ciljajući vektori) su projektovani da progresivno ubacuju ljudske λ segmente gena lakog lanca koristeći jedinstveno konstruisane ciljajuće vektore koji sadrže dodirne ljudske λ i κ genomske sekvence. Ovi ciljajući vektori su konstruisani da obuhvate ∼ 23 kb ljudski κ genomsku sekvencu prirodno smeštenu između ljudskih Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena. Ova ljudska κ genomska sekvenca je specifično pozicionirana u ova dva dodatna ciljajuća vektora između ljudskih Vλ i ljudskih Jλ segmenata gena (SL.
4B, 12(κ)1-κ i 12(κ)4-κ ciljajući vektori).
[0211] Oba ciljajuća vektora koja sadrže ljudsku κ genomsku sekvencu su napravljena korišćenjem modifikovanog RP11-729g4 BAC klona opisanog gore (SL. 6). Ovaj modifikovani BAC klon je ciljan sa kasetom odabira spektinomicina prirubno postavljenom pomoću Notl i AsiSI mesta ograničenja (SL. 6, gore levo). Homologna rekombinacija sa kasetom spektinomicina dala je kao rezutlat dvostruko ciljani 729g4 BAC klon koji je obuhvatio, od 5’ do 3’, I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto, ~ 123 kb fragmenta sa prvih 12 hVλ segmenata gena, Notl mesto oko 200 bp donjeg toka (3’) na sekvencu nonamera hVλ3-1 segmenta gena, kasetu spektinomicina i AsiSI mesto. Odvojeni ljudski BAC klon sa ljudskom κ sekvencom (CTD-2366j12) je ciljan dva nezavisna puta da se projektuju mesta ograničenja na lokacijama između hVκ4-1 i hJκ1 segmenata gena da se omogući naknadno kloniranje ∼23 kb fragmenta za povezivanje sa hVλ gene segmentima gena sadržanim u dvostruko ciljanim modifikovanom 729g4 BAC klonu (SL.6, gore desno).
[0212] Ukratko, 2366j12 BAC klon je oko 132 kb veličine i sadrži hVκ segmente gena 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, ljudsku κ genomsku sekvencu nizvodno Vκ segmenata gena, hJκ segmenata gena 1-5, hCκ i oko 20 kb dodatne genomske sekvence ljudskog κ lokusa. Ovaj klon je prvo ciljan sa ciljanim vektorom sa kasetom higromicina prirubnom Frt mestom i NotI mestom nizvodno (3’) 3’ Frt mesta. Homologni kraci za ovaj ciljajući vektor sadržali su ljudsku genomsku sekvencu 5’ i 3’ Vκ segmente gena sa BAC klonom tako da su posle homologne rekombinacije sa ovim ciljajućim vektorom, Vκ segmenti gena su brisani i NotI mesto je projektovano ~-133 bp nizvodno od hVκ4-1 segmenta gena (SL.6, gore desno). Ovaj modifikovan 2366j12 BAC klon je ciljan nezavisno sa dva ciljajuća vektora na 3’ kraju da se brišu hJκ segmenti gena sa kasetom hloroamfenikola koji su takođe sadržali bio hJκ1 segment gena, PI-SceI mesto i AsiSI mesto ili ljudski genomski fragment koji je sadržao četiri hJλ segmenta gena (supra), PI-SceI mesto i AsiSI mesto (SL. 6, gore desno). Homologni kraci za ova dva slična ciljajuća vektora su sadržali sekvencu 5’ i 3’ hJκ segmenata gena. Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima i modifikovan 2366j12 BAC klon je dao prinos dvostruko-ciljanog 2366j12 klona koji je obuhvatio, od 5’ do 3’, 5’ Frt mesto, kasetu higromicina, 3’ Frt meto, NotI mesto, 22,800 bp genomski fragment ljudskog κ lokusa koji obuhvata intergenski region između Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena, bilo hJλ1 segment gena ili ljudski λ genomski fragment koji obuhvata hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7, PI-SceI mesto i kasetu hloroamfenikola (SL. 6, gore desno). Dva finalna ciljajuća vektora da se naprave dve dodatne modifikacije su izvedene u dva koraka povezivanja korišćenjem dvostruko ciljanih 729g4 i 2366j12 klonova.
[0213] Dvostruko ciljani 729g4 i 2366j12 klonovi su rastvoreni sa NotI i AsiSI daje kao prinos jednog fragmenta koji obuhvata kasetu neomicina i hVλ segmenata gena i još jedan fragment koji obuhvata ∼23 kb genomskog fragmenta ljudskog κ lokusa sa intergenskim regionom između Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena, bilo hJλ1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 segmenata gena, PI-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola, respektivno. Povezivanje ovih fragmenata je generisalo dva jedinstvena BAC klona koji obuhvataju od 5’ do 3’ hVλ segmenata gena, ljudsku κ genomsku sekvencu između Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena, bilo hJλ1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJλ1, Jλ2, Jλ3 and Jλ7 segmente gena, PI-SceI mesto i kasetu hloroamfenikola (SL. 6, dno).
Ovi novi BAC klonovi su zatim rastvoreni sa I-Ceul i PI-SceI da ispuste jedinstvene fragmente koji sadrže kasetu neomicina uzvodno i dodirne ljudske λ i κ sekvence i povežu se u modifikovani mišji BAC klon 302g12 koji je sadržao od 5’ do 3’ mišje genomske sekvence 5’ endogenog κ lokusa, I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto, hVλ segmente gena (3-12 do 3-1), NotI mesto 200 bp nizvodno Vλ3-1, ~-23 kb ljudske κ sekvence koja se može prirodno naći između ljudskih Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena, bilo hJλ1 segment gena ili genomski fragment sa hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 segmentima gena, mišji Eκi, mišji Cκ gen i Eκ3’ (SL. 4, 12hλA-VκJκ-hJλ1 i 12hVλ-VκJκ-4hJλ ciljajuće vektore). Homologna rekombinacija sa oba ova ciljajuća vektora je stvorila dva odvojena mišja κ lokusa lakog lanca sa 12 hVλ segmenata gena, ljudsku κ genomsku sekvencu, i jedan ili četiri hJλ segmenta gena funkcionalno povezana na endogeni mišji Cκ gen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog ljudskog λ/mišjeg κ lakog lanca.
Primer III
Projektovanje dodatnih ljudskih V1λ segmenata gena u ljudski λ mini-lokus lakog lanca
[0214] Dodatni hVλ segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od početnih modifikacija opisanih u Primeru 2 korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka (SL.5A, 16-λ ciljajući vektor i SL.5B, 16-κ ciljajući vektor).
[0215] Uvođenje 16 dodatnih ljudskih Vλ segmenata gena. Uzvodno (5') homologni kraci korišćeni za sklapanje ciljajućih vektora za dodavanje 16 dodatnih hVλ segmenata gena na modifikovane lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 su sadržali mišju genomsku sekvencu 5’ bilo endogenih κ ili λ lokusa lakog lanca. 3’ homologni kraci su bili isti za sve ciljajuće vektore i sadržali su ljudske genomske sekvence koje se preklapaju sa 5’ krajem ljudske λ sekvence modifikacija kako je opisano u Primeru 2.
[0216] Ukratko, dva ciljajuća vektora su projektovana za uvođenje 16 dodatnih hVλ segmenata gena na modifikovane mišje lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 (SL.5A i 5B, 16-λ ili 16-κ ciljajući vektor). DNK fragment ∼172 kb iz ljudskog BAC klona RP11-761I13 (Invitrogen) koji je sadržao 21 uzastopnih hVλ segmenata gena iz skupine A je projektovano sa 5’ homolognim krakom koji obuhvata mišju genomsku sekvencu 5’ na bilo endogeni κ ili λ lokuse lakog lanca i 3’ homologni krak koji je sadržao ljudsku genomsku λ sekvencu.5’ mišji κ ili λ homologni kraci korišćeni u ovim ciljajućim konstruktima su bili isti 5’ homologni kraci opisani u Primeru 2 (SL. 5A i 5B). Ovaj 3’ 55’ homologni krak je obuhvatio 53.057 bp preklapanja ljudske genomske λ sekvence koja odgovara ekvivalentnom 5’ kraju ~123 kb fragmenta ljudske genomske λ sekvence opisane u Primeru 2. Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5’ do 3’, 5’ homologni krak koji sadrži bilo ∼23 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog mišjeg κ lokusa lakog lanca ili Dr ∼24 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog λ lokusa lakog lanca, 5’ Frt mesto, kasetu higromicina, 3’ Frt mesto i 171.457 bp ljudske genomske λ sekvence koja obuhvata 21 uzastopnih hVλ segmenata gena, ∼53 kb od tih se preklapa sa 5’ krajem ljudske λ sekvence opisane u Primeru 3 i služi kao 3’ homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL. 5A i 5B, 16-λ ili 16-κ vektora ciljanja). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima je stvorila nezavisno modifikovan mišje κ i λ lokuse lakog lanca svaki sa 28 hVλ segmenata gena i hJλ1 segment gena funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Cκ ili Cλ2) koji, posle rekombinacije, vode formiranju himernog lakog lanca.
[0217] Na sličan način, 16-κ ciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 16 dodatnih hVλ segmenata gena na druge početne modifikacije opisane u Primeru 2 koje su obuhvatile više hJλ segmenata gena sa i bez integrisane ljudske κ sekvence (SL. 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjem κ lokusu sa drugim početnim modifikacijama je stvorila mišje κ lokuse lakog lanca sa 28 hVλ segmenata gena i hJλ1, 2, 3 i 7 segmente gena sa i bez ljudske Vκ-Jκ genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ gen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog λ-κ lakog lanca,
[0218] Uvođenje 12 dodatnih ljudskih Vλ segmenata gena. Dodatni hVλ segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od modifikacija opisanih gore u tekstu korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka. Finalna konstrukcija lokusa koja je nastala iz homologne rekombinacije sa ciljajućim vektorima gde su obuhvaćeni dodatni hVλ segmenti gena su prikazani na SL.7A i 7B.
[0219] Ukratko, ciljajući vektor je projektovan za uvođenje 12 dodatnih hVλ segmenata gena na modifikovani mišji κ i λ lokuse lakog lanca opisane gore u tekstu (SL. 5A i 5B, 12-λ ili 12-κ vektora ciljanja). 93,674 bp DNK fragment iz ljudskog BAC klona RP11-22I18 (Invitrogen) sa 12 uzastopnih hVλ segmenata gena iz skupine B je projektovana sa 5’ homolognim krakom koji sadrži mišju genomsku sekvencu 5’ na bilo endogene mišje κ ili λ lokuse lakog lance i 3’ homologni krak koji obuhvata ljudsku genomsku λ sekvencu.5’ homologni kraci korišćeni u ovom ciljajućem konstruktu su bili isti 5’ homologni kraci korišćeni za dodavanje 16 hVλ segmenata gena opisanih gore u tekstu (SL.5A i 5B).3’ homologni krak je napravljen projektovanjem PI-SceI mesta ∼3431 bp 5’ na ljudski Vλ3-29P segment gena sadržan u 27.468 bp genomskom fragmentu ljudske λ sekvence iz BAC klona RP11-761I13. Ovo PI-SceI mesto je služilo kao tačka spajanja da se pridruži ∼94 kb fragment dodatne ljudske λ sekvence na ∼27 kb fragment ljudske λ sekvence koja se preklapa sa 5’ krajem ljudske λ sekvence u prethodnoj modifikaciji korišćenjem 16-λ ili 16-κ ciljajućih vektora (SL.5A i 5B). Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5’ do 3’, 5’ homologni krak koji sadrži bilo ∼23 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog κ lokusa lakog lanca ili ∼24 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog λ lokusa lakg lanca, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto i 121.188 bp ljudske genomske λ sekvence sa 16 hVλ segmenata gena, PI-SceI mesto; ∼27 kb kojih se preklapa sa 5’ krajem ljudske λ sekvence od umetanja 16 dodatnih hVλ segmenata gena i služi kao 3’ homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL. 5A i 5B, 12-λ ili 12-κ vektora ciljanja). Homologna rekombinacija ovih ciljajućih vektora nezavisno je stvorila modifikovane mišje κ i λ lokuse lakog lanca sa 40 hVλ segmenata gena i ljudski Jλ1 funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Cκ ili Cλ2) koje, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog lakog lanca (dno SL.5A i 5B).
[0220] Na sličan način, 12-κ ciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 12 dodatnih hVλ segmenata gena na druge početne modifikacije koje su obuhvatile više hJλ segmenata gena sa i bez integrisane ljudske κ sekvence (SL. 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjem κ lokusu je sadržala druge modifikacije koje su stvorile mišji κ lokus lakog lanca sa 40 hVλ segmenata gena i hJλ1, 2, 3 i 7 segmenata gena sa i bez ljudske Vκ-Jκ genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ gen koji, posle rekombinovanja, vodi formiranju himernog λ-κ lakog lanca.
Primer IV
Identifikacija ciljanih ES ćelija koje nose ljudske λ segmente gena lakog lanca
[0221] Ciljana BAC DNK napravljena prema prethodnim Primerima je korišćena na elektroporizovanim mišjim ES ćelijama da se stvore modifikovane embrionske matične (ES) ćelije za stvaranje himernih miševa koji ispoljavaju ljudske λ segmenata gena lakog lanca. Embrionske matične (ES) ćelije koje obuhvataju umetanje nepreraspoređenih ljudskih λ segmenata gena lakog lanca su identifikovane pomoću kvantitativnog TAQMAN® ogleda. Kompleti i probe specifičnih prajmera su projektovani za umetanje ljudskih λ sekvenci i udruženih kaseta odabira (prirast alela, GOA), gubitak endogenih mišjih sekvenci i bilo koje kasete odabira (gubitak alela, LOA) i zadržavanje prirubnih mišjih sekvenci (zadržavanje alela, AR). Za svako dodatno ubacivanje ljudskih λ sekvenci, dodatni kompleti i probe prajmera su korišćeni da se potvrdi prisustvo dodatnih ljudskih λ sekvenci kao i kompleti i probe prethodnih prajmera korišćenih da se potvrdi zadržavanje prethodno ciljanih ljudskih sekvenci. Tabela 1 prikazuje prajmere i sa njima povezane probe korišćene za oglede kvantitativne PCR analize. Tabela 2 iznosi kombinacije korišćene za potvrdu umetanja svakog odeljka ljudskih λ segmenata gena lakog lanca za klonove embrionskih matičnih (ES) ćelija.
[0222] ES ćelije koje nose ljudske λ segmente gena lakog lanca se opciono transfektuje sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonila Frt'ed kaseta neomicina uvedena umetanjem ciljajućeg konstrukta koji sadrži ljudske Vλ5-52 - Vλ1-40 segmente gena (SL. 5A i 5B). Kaseta neomicina može opciono da bude uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoljavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.
Tabela 1
Tabela 2
(nastavak)
Primer V
Generisanje miševa koji ispoljavaju ljudske λ lake lance iz endogenog lokusa lakog lanca
[0223] Ciljane ES ćelije opisane gore u tekstu su korišćene kao donor ES celije i uveene u embrion miša u staidujumu od 8-ćelija mišjeg embriona postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr., US Pat. br.
7,294,754 i Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi su u potpunosti razvijeni iz donor ES ćelije) nezavisno noseći ljudske λ segmente gena identifikovane genotipovanjem korišćenjem modifikacije ogleda alela (Valenzuela et al., supra) koji su detektovali prisustvo jedinstvenih ljudskih λ segmenata gena (supra).
[0246] Upotreba mišjeg κ:λ lakog lanca koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca. Homozigotni miševi za svaka tri uzastopna umetanja hVλ segmenata gena se jednim hJλ segmentom gena (SL.5B) i miševi homozigotni za prvo umetanje hVλ segmenata gena sa bilo jednim hJλ segmentom gena ili četiri ljudska Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (SL. 4B) su analizirani za κ i λ ispoljavanje lakog lanca u splenocitima korišćenjem protočne citometrije.
[0224] Ukratko, jetre su prikupljene iz grupa miševa (koje se kreću od tri do sedam životinja po grupi) i samlevene korišćenjem staklenih klizišta. Posle lize (destrukcije; razgradnje) crvenih ćelija krvi (RBCs) sa ACK puferskim sredstvom za razgradnju (Lonza Walkersville), splenociti su postavljeni sa antitelima konjugovanim fluorescentnom bojom specifičnim za mišji CD19 (Clone 1 D3; BD Biosciences), mišji CD3 (17A2; Biolegend), mišji Igκ (187.1; BD Biosciences) i mišji Igλ (RML-42; Biolegend). Podaci su prikupljeni korišćenjem BD™ LSR II protočne citometrije (BD Biosciences) i analizirani korišćenjem FLOWJO™ softvera (Tree Star, Inc.). Tabela 3 iznosi prosečne procenutalne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), κ laki lanac (CD19<+>Igκ<+>Igλ-)h i λ laki lanac (CD19<+>Igκ-Igλ+) ispoljavanje primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose različite genetske modifikacije.
[0225] U sličnom eksperimentu, sadržaji B ćelije pregrade za jetru iz mišjih homozigota za prvo umetanje 12 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen (dno SL. 4B) i mišji homozigot za 40 hVλ i jedan hJλ segment gena (dno SL.
5B ili vrh SL. 7B) su analizirani za Igκ i Igλ ispoljavanje korišćenjem protočne citometrije (kako je gore opisano). SL. 8A pokazuje ispoljavanje Igλ i Igλ u CD19<+>B ćelijama za miša koji je predstavnik za svaku grupu. Broj CD19<+>B ćelija po jetri je takođe zabeležen za svaki mišji (SL.8B).
[0226] U drugom eksperimentu, sadržaji B ćelije pregrade za jetru i koštanu srž iz mišjih homozigota za prvo umetanje 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen (dno SL.7B) su analizirani za napredovanje kroz razvoj B ćelije korišćenjem protočne citometrije različitih markera površine ćelije.
[0227] Ukratko, dve grupe (N=3 svaka, 9-12 nedelja stari, muški i ženski) divljeg tipa i miševi homozigotni za 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen su žrtvovani i pokupljene su jetre i koštana srž. Koštana srž je prikupljena iz butnih kostiju ispiranjem sa potpunom podlogom RPMImedijum (RPMImedium dopunjen sa serumom telećeg fetusa, natrijum piruvatom, Herpes, 2-merkaptoetanolom, neesencijalnim amino kiselinama, i gentamicinom). RBC preprarati iz jetre i koštane srži su lizovani sa ACK puferskim sredstvom za lizu (Lonza Walkersville), posle čega je usledilo pranje sa potpunom RPMI podlogom.
1x10<6>ćelije su inkubirane sa antitelima koja jako reaguju sa antigenima miša CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, posle čega je usledio označavanje sa odabranim panelom antitela tokom 30 min. na ledu.
[0228] Panel koštane srži: anti-mišja FITC-CD43 (1 B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD) i Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend).
[0229] Panel koštane srži i slezine: anti-mišji FITC-Igκ (187,1, BD), PE-Igλ (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41 ebioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD).
[0230] Posle bojenja, ćelije su oprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka je izvedeno na FACSCANTOII™ protočnoj citometriji (BD Biosciences) i analizirani sa FLOWJO™ softverom (Tree Star, Inc.). SL. 9A.- 9D pokazuju rezultate za slezinsku pregradu jednog miša predstavnika iz svake grupe. SL. 10A - 10E pokazuju rezultate za pregradu koštane srži jednog miša predstavnika za svaku grupu. Tabela 4 iznosi prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), κ laki lanac (CD19<+>Igλ<+>Igλ-) i λ laki lanac (CD19+Igκ<->Igλ<+>) ispoljavanje primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose svaku genetsku modifikaciju. Tabela 5 prikazuje prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), zrele B ćelije (B220<hi>IgM<+>), nezrele B ćelije (B220<int>IgM<+>), nezrele B ćelije koje ispoljavaju κ laki lanac (B220<int>IgM<+>Igκ<+>) i nezrele B ćelije koje ispoljavaju λ laki lanac (B220<int>IgM<+>Igλ<+>) primećeno u koštanoj srži divljeg tipa i miševima homozigotnim za 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen. Ovaj eksperiment je ponovljen sa dodatnim grupama miševa opisanim gore i pokazao je slične rezultate (podaci nisu prikazani).
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
[0232] Upotreba ljudskog Vλ gena kod miševa koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca. Miševi heterozigotni za prvo umetanje ljudskih λ sekvenci (hVλ3-12-hVλ3-1 i hJλ1, SL.5B) i homozigotni za treće umetanje ljudskih λ sekvenci (hVλ5-52 - hVλ3-1 i hJλ1, SL.5B) su analizirani za ljudski λ gen lakog lanca korišćenjem reverzne polimerazne lančane reakcije transkriptaze (RT-PCR) koršćenjem RNK izolovanih iz splenocita.
[0233] Ukratko, slezine su prikupljene i prelivene sa 10 mL RPMI-1640 (Sigma) sa 5% HI-FBS u sterilnim vrećama za jednokratnu upotrebu. Svaka vreća koja je sadržala jednu slezinu je zatim postavljena u STOMACHER™ (Seward) i homogenizovana na srednjoj postavci tokom 30 sekundi. Homogenizovane slezine su filtrirane korišćenjem 0,7 µm cediljke za ćelije i zatim su peletirane centrifugom (1000 ob./min tokom 10 minuta) i RBCs su lizovane u BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) tokom tri minuta. Splenociti su rastvoreni sa RPMI-1640 i ponovo centrifugirani, posle čega je sledilo vraćanje u suspenziju u 1 mL PBS (Irvine Scientific). RNK je izolovana iz peletiranih splenocita korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici.
[0234] RT-PCR je izveden na RNK splenocita korišćenjem prajmera specifičnih za ljudske hVλ segmente gena i mišji Cκ gen (Tabela 6). PCR proizvodi su bili prečišćeni gelom i klonirani u pCR2.1-TOPO TA vektor (Invitrogen) i sekvencionirani prajmerima napredni M13 Forward (GTAAAACGAC GGCCAG; ID BR SEK: 55) i reverzni M13 Reverse (CAGGAAACAGCTATGAC; ID BR SEK:56) su smešteni unutar vektora na lokacijama koje su prirubno postavljene na mesto kloniranja. Ukupno osamdeset četiri klona je izvedeno iz prvog i trećeg umetanja ljudske λ sekvence su sekvencionirane da se odredi hVλ upotreba gena (Tabela 7). Sekvenca nukleotida hVλ-hJλ1-mCκ ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL.11.
[0235] Na sličan način, homozigotni miševi za treće umetanje ljudskih λ sekvence gena lakog lanca (t.j. 40 hVλ segmente gena i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu dno SL. 7B) funkcionalno povezano na endogeni mišji Cκ gen su analizirani za upotrebu ljudskog λ gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore u tekstu). Upotreba ljudskog λ segmenta gena lakog lanca za 26 odabranih RT-PCR klonova je prikazana u Tabeli 8. Sekvenca nukleotida hVλ-hJλ-mCκ ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL.12.
[0236] Na sličan način, homozigotni miševi za prvo umetanje ljudskih λ segmenata gena lakog lanca (12 hVλ segmenata gena i hJλ1, SL. 4A i SL. 5A) funkcionalno povezan na endogeni mišji Cλ2 gen su analizirani za upotrebu ljudskog λ gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore). Prajmeri specifični za hVλ segmente gena (Tabela 6) su spareni sa jednim od dva prajmera specifična za mišji Cλ2 gen; Cλ2-1 (ID BR SEK:104) ili Cλ2-2 (ID BR SEK:105).
[0237] Više hVλ segmenata gena preraspoređenih u hλ1 je primećeno iz RT-PCR klonova iz miševa koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca. Sekvenca nukleotida hVλ- hJλ-mCλ2 ukrštanja za izabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL.13.
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
[0238] SL.11 pokazuje sekvencu hVλ-hJλ1-mCκ ukrštanja za RT-PCR klonove iz miševa koji nose prvo i treće umetanje hVλ segmenata gena sa jednim hJλ segmentom gena. Sekvence prikazane na SL. 11 ilustruju jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVλ segmente gena sa hJλ1 rekombinovanom na mišjem Cκ genu. Heterozigotni miševi koji nose samo jedan modifikovani endogeni κ lokus sa 12 hVλ segmenata gena i hJλ1 i homozigotne miševe koji nose dva modfikovana endogena κ lokusa koji sadrže 40 hVλ segmenata gena i hJλ1 su oba bila sposobna da proizvedu ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cκ gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudske λ lake lance. Ova preraspoređivanja pokazuju da su himerni lokusi mogli da nezavisno prerasporede ljudske λ segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove modifikacije na enogenom κ lokusu lakog lanca nisu dale nijedan od hVλ segmenata gena inoperativan ili sprečile da himerni lokus rekombinuje više hVλ i hJλ (Jλ1) segmenata gena tokom razvoja B ćelije kako su potvrdili dokazi pomoću 16 različitih hVλ segmenata gena koji su primećeni da se preraspoređuju sa hJλ1 (Tabela 7). Dalje, ovi miševi su napravili funkcionalna antitela koja su sadržala preraspoređene ljudske Vλ-Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišje Cκ gene kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0239] SL. 12 pokazuje sekvencu hVλ-hJλ-mCκ ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove iz mišjih homozigotnih za 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu. Sekvence prikazane na SL. 12 ilustruju dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju više različitih hVλ segmenata gena, koji se prostiru kroz ceo raspon himernog lokusa, sa više različitih hJλ segmenata gena preraspoređenih i funkcionalno povezanih na mišji Cκ gen. Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene κ lokuse koji sadrže 40 hVλ i četir hJλ segmenata gena su mogli da proizvedu ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cκ gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudske λ lake lance. Ova preraspoređivanja još pokazuju da su sve faze himernih lokusa mogle da nezavisno prerasporede ljudske λ segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove dodatne modifikacije na endogenom κ lokusu lakog lanca pokazuju da umetanje ljudskih λ segmenata gena ne daje nijedan od hVλ i/ili Jλ segmenata gena inoperativnim ili spreče himerni lokus od rekombinovanja hVλ i Jλ segmenata gena tokom razvoja B ćelije kako je potvrđeno pomoću 12 različitih hVλ segmenata gena koji su primećeni da se prerasporede sa sva četiri hJλ segmenta gena (Tabela 8) od 26 odabrana RT-PCR klona. Dalje, ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudske Vλ-Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišje Cκ regione kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0240] SL. 13 pokazuje sekvencu hVλ-hJλ-mCλ2 ukrštanja za tri pojedinačna RT-PCR klona iz mišjih homozigotnih za 12 hVλ segmenata gena i hJλ1. Sekvence prikazane na SL. ilustruje dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVλ segmente gena, u rasponu dužine od prvog umetanja, sa hJλ1 preraspoređenim i funkcionalno povezanim na mišji Cλ2 gen (2D1 = Vλ2-8Jλ1; 2D9 = Vλ3-10Jλ1; 3E15 = Vλ3-1Jλ1). Jedan klon je pokazao neproduktivno preraspoređivanje usled N dodavanja na hVλ-hJλ ukrštanja (2D1, SL.13). Ovo nije neubičajeno za V(D)J rekombinaciju, kao spajanje segmenata gena tokom rekombinacije se pokazala kao neprecizna. Iako ovaj klon predstavlja neproduktivni rekombinant prisutan u repertoaru lakog lanca ovih miševa, ovo pokazuje da genetski mehanizam koji doprinosi raznovrsnosti pri ukrštanju među genima antitela radi normalno kod ovih miševa i vodi do repertoara antitela koji sadrži lake lance sa većom raznovrsnošću.
[0241] Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene λ lokuse sa 12 hVλ segmente gena i hJλ1 su takođe mogli da proizvedu ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cλ gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile reverzne himerne λ lake lance koji obuhvataju hVλ povezane na mišje Cλ regione. Ova preraspoređivanja još pokazuju za ljudske λ segmente gena lakog lanca postavljene na drugom lokusu lakog lanca (t.j., λ lokus) da su mogli da se nezavisno prerasporede ljudski λ segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, modifikacije na endogenom λ lokusu lakog lanca pokazuju da je umetanje ljudskih λ segmenata gena ne daje nijedan od hVλ i/ili hJλ1 segmenata gena inoperativnim ili spreče himerni lokus od rekombinovanja hVλ i hJλ1 segmenata gena tokom razvoja B ćelije. Pored toga, ovi miševi takođe prave funkcionalna antitela koja obuhvataju ljudske Vλ-Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cλ region kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0242] Kao što je prikazano na ovom primeru, miševi koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca na endogenim κ i λ lokusima lakog lanca su sposobni za preraspoređivanje ljudskih κλ segmenata gena lakog lanca i njihovo ispoljavanje u kontekstu mišjeg Cκ i/ili Cλ regiona kao deo normalnog repertoara antitela miša zato što je funkcionalni laki lanac neophodan na različitim kontrolnim tačkama u razvoju B ćelije za jetru i koštanu srž. Dalje, rani podskupovi B ćelija (npr., pre-, pro- i tranzicione B ćelije) pokazuju normalan fenotip kod ovih miševa u poređenju sa leglom štenaca divljeg tipa (SL. 9D, 10A i 10B). Primećen je mali nedostatak u koštanoj srži i perifernih populacija B ćelija, kojima se mogu pripisati deleciji podskupa auto-reaktivnih nezrelih B ćelija i/ili podoptimalnog udruživanja ljudskog λ lakog lanca sa mišjim teškim lancem. Međutim, Igκ/Igλ upotrebu primećenu u ovim prikazuje situaciju koja je više nalik na ispoljavanje ljudskog lakog lanca nego na ono što je primećeno kod miševa.
Primer VI
Odgajanje mišjeg ispoljavanja ljudskih λ lakih lanaca iz endogenih lokusa lakog lanca
[0243] Da se optimizuje upotreba ljudskih λ segmenata gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, miševi koji nose nepreraspoređene ljudske λ segmente gena su odgajani na drugom mišjem koji obuhvata brisanje u suprotnom endogenom lokusu lakog lanca (bilo κ ili λ). Na primer, ljudski λ segmenti gena pozicionirani na endogenom κ lokusu bi bili jedini funkcionalni segmenti gena lakog lanca prisutni kod miša koji takođe nose brisanje na endogenom λ lokusu lakog lanca. Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi ispoljilo samo ljudske λ lake lance kako je opisano u prethodnim primerima. Odgajanje je izvedeno standardnim tehnikama priznatim u tehnici i, alternativno, pomoću komercijalnih kompanija (npr., The Jackson Laboratory). Mišji sojevi koji nose ljudske sgemente gena lakog lanca na endogenom κ lokusu i brisanje endogenog λ lokusa lakog lanca se skeniraju na prisustvo jedinstvenih reverznohimernih (ljudsko-mišjih) λ lakih lanaca i odsustvo endogenih mišjih λ lakih lanaca.
[0244] Miševi koji nose nepreraspoređeni ljudski λ lokus lakog lanca se takođe odgajaju sa miševima koji sadrže zamenu endogeniog mišjeg lokusa promenljivg gena teškog lanca sa ljudskim lokusom promenljivog gena teškog lanca (videti US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, the VELOCIMMUNE® genetski projektovani miš). VELOCIMMUNE® miš obuhvata, delimično, koji ima genom koji obuhvata ljudske promenljive regione ljudskog teškog lanca koji su funkcionalno povezani na endogena mišje lokuse konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitela koja obuhvataju ljudski promenljivi region teškog lanca i mišji konstantni region teškog lanca kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca antitela može da bude izolovana i funkcionalno povezana na DNK koja kodira konstantne regione teškog lanca čoveka. DNK može zatim da se ispolji u ćeliji koja je sposobna da ispolji potpuno ljudski teški lanac. Prema odgovarajućem rasporedu odgoja, dobijaju se miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg lokusa lakog lanca sa ljudskim lokusom teškog lanca i nepreraspoređenim ljudskim λ lokusom lakog lanca na endogenom κ lokusu lakog lanca. Antitela koja sadrže somatski mutirane ljudske promenljive regione teškog lanca i ljudske λ promenljive regione lakog lanca mogu da se izoluju posle imunizacije sa antigenom od interesa.
Primer VII
Generisanje antitela iz miševa koji ispoljavaju ljudske teške lance i ljudske λ lake lance
[0245] Posle uzgajanja miševa koji sadrže nepreraspoređeni ljudski λ lokus lakog lanca na različite željene sojeve koji sadrže modifikacije i brisanja drugih endogenih Ig lokusa (kako je opisano gore), izabrani miševi su imunizovani sa antigenom od interesa.
[0246] Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od pojedinačnih preraspoređenih ljudskih regiona lakog lanca klicine linije se izaziva sa antigenom, i limfnim ćelijama (kao što su B ćelije) se oporavljaju iz seruma životinja. Limfne ćelije mogu da se spoje sa ćelijskom linijom mijeloma da se pripreme ćelijske linije besmrtnih hibridoma, i takve ćelijske linije hibridoma se skeniraju i biraju da se utvrde ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela koja sadrže ljudski teški lanac i ljudski λ laki lanac koji su specifični za antigen korišćen za imunizaciju. DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca i λ lakih lanaca može da bude izolovana i povezana na željene izotipne konstantne regione teškog lanca i lakog lanca. Zbog prisustva dodatnih hVλ segmenata gena u poređenju sa endogenim mišjim λ lokusom, raznovrsnost repertoara lakog lanca je dramatično povećana i posle imunizacije daje veću raznovrsnost na antigen-specifičnom repertoaru. Dobijene sekvence kloniranog antitela mogu da budu naknadno proizvedene u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira himerna antitela specifična za antigen ili promenljive domene lakog lanca i teškog lanca može da bude izolovana direktno iz limfocita specifičnih za antigen (npr., B ćelije).
[0247] U početku, visokoafinitetna himerna antitela su izolovana tako da imaju promenljivi region čoveka i konstantni region miša. Kao što je gore opisano, antitela se karakterišu i odabiraju za poželjne karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni se zamenjuju sa željenim ljudskim konstantnim regionom da se generiše potpouno ljudsko antitelo koje sadrži somatski mutirani ljudski teški lanac i ljudski λ laki lanac izveden iz nepreraspoređenog ljudskog λ lokusa lakog lanca ovog pronalaska. Pogodni ljudski konstantni regioni obuhvataju, na primer divlji tip ili modifikovan IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4.
LISTA SEKVENCI
[0248]

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Genetski modifikovani miš koji u svom genomu sadrži lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca koji sadrži deleciju endogenog mišjeg Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 klastera gena i deleciju regiona koji se pruža od Wλ2 do Jλ2 mišjeg endogenog Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 klastera gena, naznačen time što lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži segmente endogenih Cλ2, Jλ4 i Cλ4 gena.
2. Genetski modifikovani miš prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time što lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži mišji endogeni pojačivač 2.4 ili endogeni mišji 3’ pojačivač.
3. Genetski modifikovani miš prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time što lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca dodatno sadrži nerearanžirane segmente humanih Vλ i Jλ gena operativno vezane za segment endogenog Cλ2 gena.
4. Genetski modifikovani miš prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time što miš u svom genomu dodatno sadrži lokus endogenog imunoglobulinskog κ lakog lanca koji sadrži zamenjene segmente endogenih Vκ i Jκ gena sa nerearanžiranim segmentima humanih Vλ i Jλ gena, i naznačen time što su segmenti humanih Vλ i Jλ gena operativno vezani sa mišjim endogenim Cκ genom tako da miš eksprimira imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani λ varijabilni region fuzionisan sa mišjim κ konstantnim regionom.
5. Genetski modifikovani miš prema patentnom zahtjevu 4, naznačen time što miš dodatno sadrži sekvencu humanog Vκ-Jκ intergenskog regiona koja se nalazi između segmenata humanog Vκ gena i segmenata humanog Jκ gena.
6. Ćelija miša koja u svom genomu sadrži lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca koji sadrži deleciju mišjeg endogenog Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 klastera gena i deleciju regiona koji se pruža od Vλ2 do Jλ2 mišjeg endogenog Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 klastera gena, gde lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca zadržava segmente endogenih Cλ2, Jλ4 i Cλ4 gena.
7. Ćelija miša prema patentnom zahtjevu 6, naznačena time što lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži mišji endogeni pojaćivač 2.4 ili mišji endogeni 3’ pojačivač.
8. Ćelija miša prema patentnom zahtjevu 6, naznačena time što ćelija je B ćelija, hibridom, ili ES ćelija.
9. Ćelija izolovana iz, ili koja se može dobiti od, miša prema bilo kom od patentnih zahtjeva 1 do 5, naznačena time što ćelija u svom genomu sadrži lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca koji sadrži deleciju mišjeg endogenog Vλ1-Jλ3-Cλ3-JλI-Cλ1 klastera gena i deleciju regiona koji se pruža od Vλ2 do Jλ2 mišjeg endogenog Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-JX4-CX4 klastera gena, naznačena time što lokus endogenog imunoglobulinskog λ lakog lanca zadržava segmente endogenih Cλ2, Jλ4 i Cλ4 gena.
10. Izolovana ćelija prema patentnom zahtjevu 9, naznačena time što ćelija je B ćelija ili hibridom.
11. Embrion miša koji sadrži, koji je stvoren od, ili koji se može dobiti od, mišje ES ćelije prema patentnom zahtjevu 8, naznačen time što embrion miša u svom genomu sadrži lokus endogenog imunoglobulinskog λ lanca koji sadrži deleciju mišjeg endogenog VλI-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 klastera gena i deleciju regiona koji se pruža od od Vλ2 do Jλ2 mišjeg endogenog Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 klastera gena, naznačen time što endogeni imunoglobulinski λ laki lanac zadržava segmente endogenih Cλ2, Jλ4 i Cλ4 gena.
RS20171091A 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina RS56589B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35731410P 2010-06-22 2010-06-22
US35731710P 2010-06-22 2010-06-22
EP14198318.9A EP2905338B8 (en) 2010-06-22 2011-06-22 Transgenic mice with a modified endogenous lambda immunoglobulin locus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56589B1 true RS56589B1 (sr) 2018-02-28

Family

ID=44509861

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171091A RS56589B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20160548A RS55042B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka
RS20160483A RS54891B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom
RS20160496A RS55037B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20160548A RS55042B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka
RS20160483A RS54891B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom
RS20160496A RS55037B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi

Country Status (30)

Country Link
US (22) US9012717B2 (sr)
EP (7) EP3456832A1 (sr)
JP (16) JP6009441B2 (sr)
KR (16) KR101934852B1 (sr)
CN (4) CN104404050B (sr)
AU (1) AU2011271046B2 (sr)
BR (3) BR122020013427B1 (sr)
CA (2) CA2804311C (sr)
CY (5) CY1117537T1 (sr)
DK (5) DK2480675T3 (sr)
ES (5) ES2646052T3 (sr)
HR (5) HRP20160497T1 (sr)
HU (5) HUE036597T2 (sr)
IL (12) IL313063A (sr)
LT (4) LT3034608T (sr)
ME (5) ME02440B (sr)
MX (6) MX348942B (sr)
MY (6) MY195217A (sr)
NO (1) NO2905338T3 (sr)
NZ (6) NZ707200A (sr)
PL (5) PL2568049T3 (sr)
PT (5) PT2568049T (sr)
RS (5) RS56589B1 (sr)
RU (3) RU2601297C2 (sr)
SG (4) SG10201504568YA (sr)
SI (5) SI2480675T1 (sr)
SM (5) SMT201700506T1 (sr)
TR (1) TR201905992T4 (sr)
WO (2) WO2011163311A1 (sr)
ZA (5) ZA201300062B (sr)

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
KR101987351B1 (ko) * 2008-09-30 2019-06-10 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
RU2011129459A (ru) 2008-12-18 2013-01-27 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
KR101830020B1 (ko) 2010-03-31 2018-02-19 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작
SG10201504568YA (en) 2010-06-22 2015-07-30 Regeneron Pharma Hybrid light chain mice
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
DK2597945T3 (da) 2010-07-26 2020-09-21 Trianni Inc Transgene dyr og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
HRP20192255T1 (hr) 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
JP2014531452A (ja) * 2011-09-19 2014-11-27 カイマブ・リミテッド 動物、レパートリーおよび方法
BR112014006390A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd anticorpos, domínios variáveis e cadeias feitos especialmente para uso humano
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ME03477B (me) 2011-12-20 2020-01-20 Regeneron Pharma Miševi sa humanizovanim lakim lancem
SMT201800395T1 (it) 2012-03-16 2018-09-13 Regeneron Pharma Anticorpi a catena leggera ingegnerizzati con istidina e roditori modificati geneticamente per la generazione degli stessi
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
PT2825037T (pt) 2012-03-16 2019-08-07 Regeneron Pharma Animais não humanos que expressam sequências de imunoglobulinas sensíveis ao ph
RU2014141536A (ru) 2012-03-16 2016-05-10 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Мыши, которые продуцируют антигенсвязывающие белки с зависимыми от величины ph характеристиками связывания
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) * 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
EP2831245A1 (en) 2012-03-28 2015-02-04 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies
LT2840892T (lt) 2013-02-20 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nežmogaus tipo gyvūnai su modifikuotomis imunoglobulino sunkiųjų grandinių sekomis
LT3501272T (lt) * 2013-03-13 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, vykdančios imunoglobulino lengvosios grandinės riboto rinkinio raišką
PL2967012T3 (pl) 2013-03-14 2021-04-19 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgeniczne ssaki inne niż człowiek do wytwarzania przeciwciał
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
KR20200103882A (ko) * 2013-09-18 2020-09-02 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 히스티딘 엔지니어링된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-인간 동물
ES2993142T3 (en) 2013-10-01 2024-12-23 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
TW201532513A (zh) * 2014-01-10 2015-09-01 Alfur Fu-Hsin Hung 能產生比小鼠ＩgＥ量高出許多的人源化ＩgＥ之基因轉殖動物
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
BR112016021679A2 (pt) 2014-03-21 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. proteína de ligação ao antígeno, métodos de produção de uma proteína de ligação ao antígeno e de identificação de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno, hibridoma, ácido nucleico, célula, e, animal não humano geneticamente modificado.
JP6449338B2 (ja) 2014-06-06 2019-01-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用
WO2016044745A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
CA2963470A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
HUE050596T2 (hu) 2014-11-21 2020-12-28 Bristol Myers Squibb Co Antitestek CD73 ellen és azok felhasználásai
AU2015365583B2 (en) 2014-12-19 2021-10-28 Regenesance B.V. Antibodies that bind human C6 and uses thereof
AR103268A1 (es) 2014-12-23 2017-04-26 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra tigit
US10358944B2 (en) 2015-02-05 2019-07-23 Basf Se Solar power plant comprising a first heat transfer circuit and a second heat transfer circuit
HK1250038A1 (zh) 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
UY36687A (es) 2015-05-29 2016-11-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos contra ox40 y sus usos
KR20180021833A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
CN105274116B (zh) * 2015-10-21 2020-09-29 重庆金迈博生物科技有限公司 一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用
CN108738324B (zh) 2015-11-19 2022-06-21 百时美施贵宝公司 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其用途
EP3384030A4 (en) 2015-12-03 2019-07-03 Trianni, Inc. IMPROVED IMMUNOGLULINIVITY
WO2017136734A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
IL261602B2 (en) 2016-03-04 2024-06-01 Univ Rockefeller Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
JP7012665B6 (ja) 2016-05-09 2023-12-14 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｌ１ａ抗体およびその使用
CN109475109B (zh) 2016-05-20 2021-10-29 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
SI3462853T1 (sl) 2016-06-03 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo
WO2017214089A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
US10650241B2 (en) * 2016-06-27 2020-05-12 Facebook, Inc. Systems and methods for identifying matching content
JP7027401B2 (ja) 2016-07-14 2022-03-01 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
WO2018044970A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus k envelope (herv-k) and uses thereof
JP2020500007A (ja) 2016-10-13 2020-01-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ジカウイルスエンベロープタンパク質に結合する抗体およびその使用
CN109906272A (zh) 2016-10-31 2019-06-18 国立大学法人鸟取大学 产生人抗体的非人动物和使用该非人动物的人抗体制作方法
EP3766343B1 (en) 2016-11-04 2022-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
BR112019016374A2 (pt) 2017-02-17 2020-04-07 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos para alfa-sinucleína e usos dos mesmos
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
LT3720279T (lt) 2017-12-05 2022-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, turinčios sukonstruotą imunoglobulino lambda lengvąją grandinę, ir jų panaudojimas
KR20250078626A (ko) 2018-01-12 2025-06-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
BR112020018539A2 (pt) 2018-03-23 2020-12-29 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra mica e/ou micb e usos dos mesmos
HUE070158T2 (hu) 2018-03-24 2025-05-28 Regeneron Pharma Genetikailag módosított egerek vagy patkányok peptid-mhc komplexek elleni terápiás antitestek létrehozásra, ezek elõállítására szolgáló módszerek, valamint alkalmazásuk
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
US12543710B2 (en) * 2018-06-08 2026-02-10 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for producing diversified antibodies that have the same light chain II
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
WO2020085011A1 (ja) 2018-10-26 2020-04-30 ビークルエナジージャパン株式会社 電池制御装置
MY205758A (en) 2018-11-16 2024-11-12 Bristol Myers Squibb Co Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
KR20230128134A (ko) 2019-01-22 2023-09-01 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-7r 알파 서브유닛에 대한 항체 및 이의 용도
SG11202107589PA (en) 2019-02-22 2021-08-30 Regeneron Pharma Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
MX2021014893A (es) * 2019-06-05 2022-03-11 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un repertorio de cadena ligera lambda limitado expresado a partir del locus kappa y usos de estos.
ES3027509T3 (en) * 2019-07-01 2025-06-16 Zoetis Services Llc Transgenic rodents and methods of use thereof
AU2020395122A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-MHC II protein constructs and uses thereof
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
KR20230024822A (ko) * 2020-06-25 2023-02-21 주식회사 휴맵 이형접합성 형질전환 동물
EP4211155A1 (en) 2020-09-11 2023-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
CA3199879A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
US20240317849A1 (en) 2020-12-23 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
JP2024501796A (ja) 2020-12-23 2024-01-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 膜貫通タンパク質に結合する抗体、および抗体を産生する細胞を取得する方法
WO2023199655A1 (ja) 2022-04-13 2023-10-19 日本精工株式会社 軸受装置の状態の検出方法、検出装置、およびプログラム
USD999969S1 (en) * 2022-04-29 2023-09-26 Shenzhen Intellirocks Tech. Co., Ltd. Lamp
EP4658687A1 (en) 2023-01-31 2025-12-10 University of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
EP4705342A2 (en) 2023-05-04 2026-03-11 Novasenta, Inc. Anti-cd161 antibodies and methods of use thereof
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2078539C (en) * 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
EP2305027B1 (en) * 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
GB9823930D0 (en) * 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
RU2262511C2 (ru) * 2000-05-18 2005-10-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) * 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
GB0031284D0 (en) * 2000-12-21 2001-01-31 Ks Biomedix Ltd High affinity antibodies
CN1789416B (zh) * 2001-05-11 2011-11-16 协和发酵麒麟株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
GB0115256D0 (en) * 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
EP3269235B1 (en) 2001-11-30 2022-01-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic mice bearing human ig lambda light chain genes
US20030217171A1 (en) 2002-05-17 2003-11-20 Von Stuermer Wolfgang R. Self-replicating and self-installing software apparatus
CN1852925A (zh) * 2003-07-15 2006-10-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
CN1605628A (zh) * 2003-09-03 2005-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Cho细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体
AU2005267720B2 (en) * 2004-08-05 2012-02-23 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
US7645450B2 (en) * 2004-12-29 2010-01-12 Yuhan Corporation Humanized antibody specific for tumor necrosis factor-alpha
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
WO2008022391A1 (en) * 2006-08-22 2008-02-28 G2 Inflammation Pty Ltd Method for producing antibodies
WO2008054606A2 (en) 2006-10-02 2008-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human il-4 receptor
US7864492B2 (en) 2006-10-31 2011-01-04 Siemens Industry, Inc. Systems and methods for arc fault detection
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
EP2271758B1 (en) * 2008-04-14 2018-09-12 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
EP2669298A3 (en) * 2008-05-23 2014-02-26 Ablexis, LLC Single variable immunoglobulin domain comprising VL-DH-JL
KR101987351B1 (ko) * 2008-09-30 2019-06-10 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
RU2011129459A (ru) * 2008-12-18 2013-01-27 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение
CN102638971B (zh) * 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US10143186B2 (en) * 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
AU2011266843C9 (en) 2010-06-17 2018-03-01 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
SG10201504568YA (en) * 2010-06-22 2015-07-30 Regeneron Pharma Hybrid light chain mice

Also Published As

Publication number Publication date
CY1122877T1 (el) 2021-05-05
MY195214A (en) 2023-01-11
US9006511B2 (en) 2015-04-14
SI2568049T1 (sl) 2016-10-28
PL2905338T3 (pl) 2018-01-31
HUE044001T2 (hu) 2019-09-30
EP3205726A1 (en) 2017-08-16
IL282872A (en) 2021-06-30
ZA201506598B (en) 2017-03-29
ME02444B (me) 2016-09-20
KR101934852B1 (ko) 2019-01-04
CN104404050A (zh) 2015-03-11
IL291301B2 (en) 2023-07-01
US9150662B2 (en) 2015-10-06
SG186390A1 (en) 2013-01-30
JP2018023403A (ja) 2018-02-15
IL269078B (en) 2021-05-31
IL282872B (en) 2022-04-01
JP2020128440A (ja) 2020-08-27
US9066502B2 (en) 2015-06-30
JP2022066449A (ja) 2022-04-28
JP2016010417A (ja) 2016-01-21
MX348942B (es) 2017-07-04
US9399683B2 (en) 2016-07-26
AU2011271046B2 (en) 2015-10-01
ES2721749T3 (es) 2019-08-05
HK1168384A1 (zh) 2012-12-28
KR102506001B1 (ko) 2023-03-07
US20150089680A1 (en) 2015-03-26
JP2025027148A (ja) 2025-02-26
NO2905338T3 (sr) 2017-12-30
RU2013102596A (ru) 2014-07-27
HUE029691T2 (en) 2017-03-28
RS55042B1 (sr) 2016-12-30
CA2804311C (en) 2017-09-12
MX2012015298A (es) 2013-05-01
US9206263B2 (en) 2015-12-08
US9206261B2 (en) 2015-12-08
ES2575223T3 (es) 2016-06-27
IL264634B (en) 2019-09-26
ME02442B (me) 2016-09-20
KR102462042B1 (ko) 2022-11-03
CY1118126T1 (el) 2017-06-28
EP3034608A1 (en) 2016-06-22
IL255179A0 (en) 2017-12-31
CN104404050B (zh) 2018-06-08
US9206262B2 (en) 2015-12-08
US20150246976A1 (en) 2015-09-03
KR20190014576A (ko) 2019-02-12
RU2016119423A (ru) 2018-11-07
CY1117692T1 (el) 2017-05-17
IL300712A (en) 2023-04-01
MX347322B (es) 2017-04-21
CN104342455A (zh) 2015-02-11
IL223719A (en) 2016-10-31
AU2011271043B2 (en) 2015-10-01
KR20180135996A (ko) 2018-12-21
IL291301A (en) 2022-05-01
JP6073441B2 (ja) 2017-02-01
HK1183321A1 (en) 2013-12-20
DK2480675T3 (en) 2016-08-01
EP2905338B8 (en) 2018-01-24
KR20190014578A (ko) 2019-02-12
PT2480676E (pt) 2016-06-09
ME02440B (me) 2016-09-20
NZ605751A (en) 2014-10-31
IL269078A (en) 2019-11-28
US9540452B2 (en) 2017-01-10
ZA201300062B (en) 2014-09-25
KR20200143511A (ko) 2020-12-23
ES2576928T3 (es) 2016-07-12
DK3034608T3 (da) 2019-05-06
US20240327785A1 (en) 2024-10-03
US10266803B2 (en) 2019-04-23
US20180064078A1 (en) 2018-03-08
MY165287A (en) 2018-03-21
EP2480675A1 (en) 2012-08-01
KR101970944B1 (ko) 2019-04-23
IL223720A (en) 2017-05-29
SG10201504324UA (en) 2015-07-30
MY195212A (en) 2023-01-11
CA2804311A1 (en) 2011-12-29
ME02902B (me) 2018-04-20
KR102001430B1 (ko) 2019-07-18
KR20130121814A (ko) 2013-11-06
LT2568049T (lt) 2016-10-10
EP2568049A1 (en) 2013-03-13
US20140137275A1 (en) 2014-05-15
NZ605758A (en) 2014-08-29
WO2011163314A1 (en) 2011-12-29
US9850462B2 (en) 2017-12-26
JP6963542B2 (ja) 2021-11-10
JP2019033765A (ja) 2019-03-07
JP2018201527A (ja) 2018-12-27
EP2480676B1 (en) 2016-04-06
IL247386A (en) 2017-07-31
SMT201600212B (it) 2016-08-31
NZ626979A (en) 2015-05-29
IL259965B (en) 2019-02-28
EP2480675B1 (en) 2016-04-06
US20130326647A1 (en) 2013-12-05
EP3034608B1 (en) 2019-01-30
KR102266097B1 (ko) 2021-06-18
PL2568049T3 (pl) 2017-03-31
KR101991234B1 (ko) 2019-06-20
AU2011271043A9 (en) 2015-10-01
KR20210013376A (ko) 2021-02-03
BR112012033248A2 (pt) 2017-11-28
PT2905338T (pt) 2017-11-10
US20170107484A1 (en) 2017-04-20
NZ707198A (en) 2016-04-29
RU2016119423A3 (sr) 2019-11-19
IL300712B2 (en) 2024-11-01
KR102193823B1 (ko) 2020-12-22
BR112012032991A2 (pt) 2015-10-06
ME03386B (me) 2020-01-20
JP2016010415A (ja) 2016-01-21
PT3034608T (pt) 2019-05-28
SMT201600229B (sr) 2016-08-31
KR20210134424A (ko) 2021-11-09
ZA201300063B (en) 2014-09-25
US9035128B2 (en) 2015-05-19
JP2018201528A (ja) 2018-12-27
US20120070861A1 (en) 2012-03-22
JP2017006152A (ja) 2017-01-12
JP2013532974A (ja) 2013-08-22
HRP20160865T1 (hr) 2016-10-07
US9029628B2 (en) 2015-05-12
DK2905338T3 (da) 2017-11-06
NZ627119A (en) 2015-05-29
HRP20160794T1 (hr) 2016-08-12
JP2020062061A (ja) 2020-04-23
HUE036597T2 (hu) 2018-07-30
US20150246977A1 (en) 2015-09-03
MX347318B (es) 2017-04-21
US20150176002A1 (en) 2015-06-25
CN103068993A (zh) 2013-04-24
JP2013531501A (ja) 2013-08-08
IL244450A0 (en) 2016-04-21
ZA201404600B (en) 2015-09-30
SI2905338T1 (sl) 2017-12-29
US9844212B2 (en) 2017-12-19
IL244450A (en) 2017-11-30
SG186391A1 (en) 2013-01-30
RU2724736C2 (ru) 2020-06-25
US20150173332A1 (en) 2015-06-25
SI2480675T1 (sl) 2016-08-31
MY195217A (en) 2023-01-11
MX2012015300A (es) 2013-05-01
JP2021061863A (ja) 2021-04-22
EP2905338A1 (en) 2015-08-12
MX336344B (es) 2016-01-15
US9226484B2 (en) 2016-01-05
EP2568049B1 (en) 2016-04-13
ZA201404601B (en) 2016-02-24
HRP20171666T1 (hr) 2017-12-15
JP5988969B2 (ja) 2016-09-07
US20170258059A1 (en) 2017-09-14
KR101975884B1 (ko) 2019-05-10
LT3034608T (lt) 2019-05-27
US20150320023A1 (en) 2015-11-12
KR102118565B1 (ko) 2020-06-03
IL291301B1 (en) 2023-03-01
KR20200064166A (ko) 2020-06-05
SMT201600213B (it) 2016-08-31
HRP20190807T1 (hr) 2019-08-23
ES2570131T3 (es) 2016-05-17
JP2023133554A (ja) 2023-09-22
RS58736B1 (sr) 2019-06-28
CY1119478T1 (el) 2018-03-07
LT2905338T (lt) 2017-12-27
RU2601297C2 (ru) 2016-10-27
AU2011271046A1 (en) 2013-01-31
MY194456A (en) 2022-11-30
BR112012032991A8 (pt) 2020-09-29
JP6009441B2 (ja) 2016-10-19
KR20190073584A (ko) 2019-06-26
CN103068993B (zh) 2016-01-06
JP6341972B2 (ja) 2018-06-13
JP7236409B2 (ja) 2023-03-09
PT2480675T (pt) 2016-07-11
KR20230036157A (ko) 2023-03-14
IL300712B1 (en) 2024-07-01
US20160057979A1 (en) 2016-03-03
DK2568049T3 (en) 2016-08-01
KR102211911B1 (ko) 2021-02-05
RS54891B1 (sr) 2016-10-31
ES2646052T3 (es) 2017-12-11
HRP20160497T1 (hr) 2016-07-15
US20150173331A1 (en) 2015-06-25
IL313063A (en) 2024-07-01
MY157477A (en) 2016-06-15
BR122020013427B1 (pt) 2021-08-03
EP2905338B1 (en) 2017-08-02
TR201905992T4 (tr) 2019-05-21
CN104342455B (zh) 2017-05-31
KR20210073609A (ko) 2021-06-18
KR20180135997A (ko) 2018-12-21
LT2480675T (lt) 2016-10-10
US20120073004A1 (en) 2012-03-22
WO2011163311A1 (en) 2011-12-29
KR101945352B1 (ko) 2019-02-07
BR112012032991B1 (pt) 2021-08-10
PL2480675T3 (pl) 2017-03-31
PT2568049T (pt) 2016-07-11
US9163092B2 (en) 2015-10-20
US9012717B2 (en) 2015-04-21
RS55037B1 (sr) 2016-12-30
US20150351371A1 (en) 2015-12-10
PL3034608T3 (pl) 2019-08-30
SMT201900241T1 (it) 2019-05-10
KR20190142436A (ko) 2019-12-26
EP3456832A1 (en) 2019-03-20
KR20130027555A (ko) 2013-03-15
JP6545773B2 (ja) 2019-07-17
HUE029692T2 (en) 2017-03-28
IL255179B (en) 2018-06-28
HUE030285T2 (en) 2017-05-29
MX2022002117A (es) 2022-03-17
DK2480676T3 (en) 2016-06-20
US20160060359A1 (en) 2016-03-03
JP2017012204A (ja) 2017-01-19
HK1226766A1 (en) 2017-10-06
KR20190049932A (ko) 2019-05-09
CN103068994B (zh) 2016-01-20
JP6243384B2 (ja) 2017-12-06
CA2803864A1 (en) 2011-12-29
IL259965A (en) 2018-07-31
RU2013102595A (ru) 2014-07-27
US20190203171A1 (en) 2019-07-04
AU2011271043A8 (en) 2016-01-21
US20190153384A1 (en) 2019-05-23
HK1170766A1 (zh) 2013-03-08
KR102320944B1 (ko) 2021-11-04
SI3034608T1 (sl) 2019-06-28
US9334333B2 (en) 2016-05-10
EP2480676A1 (en) 2012-08-01
US9394373B2 (en) 2016-07-19
US20200239837A1 (en) 2020-07-30
US20130323790A1 (en) 2013-12-05
CA2803864C (en) 2017-05-16
SG10201504568YA (en) 2015-07-30
KR102059909B1 (ko) 2019-12-27
KR20220150430A (ko) 2022-11-10
SMT201700506T1 (it) 2018-01-11
SI2480676T1 (sl) 2016-10-28
CY1117537T1 (el) 2017-04-26
AU2011271043A1 (en) 2013-01-31
CN103068994A (zh) 2013-04-24
RU2590594C2 (ru) 2016-07-10
PL2480676T3 (pl) 2016-10-31
NZ707200A (en) 2016-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240327785A1 (en) Human lambda light chain mice
RS58709B1 (sr) Miševi koji čine antitela teškog lanca
HK1242732A1 (en) Mice with humanised lambda variable gene segments
HK1226766B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region
HK1170766B (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions
HK1183321B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region